專利名稱：一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的rt-lamp快速檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬于農業科學技術領域，涉及西瓜、黃瓜和葫蘆等葫蘆科植物上黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測技術及其在病害診斷上的應用，具體涉及一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreen mottle mosaic virus, CGMMV)屬番爺叢矮病毒科(Tombusviridae)、煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員。該病嚴重為害葫蘆科作物，為我國的檢疫性有害生物。黃瓜綠斑駁花葉病毒苗期染病幼苗頂尖部的2 3片葉子現亮綠或暗綠色斑駁，葉片較平，產生暗綠色斑駁的病部隆起，新葉濃綠，后期葉脈透化，葉片變小，引起植株矮化，葉片斑駁扭曲，呈系統性傳染。瓜條染病現濃綠色花斑，有的也產生瘤狀物，致果實成為畸形瓜，影響商品價值，嚴重的減產25%左右。自然界主要侵染甜瓜、西瓜、黃瓜、南瓜及瓠瓜等多種葫蘆科作物，通過種子和土壤傳播，此外也可通過汁液，農事操作及葉片接觸等方式進行傳播。帶毒種子傳播是該病毒遠距離傳播的主要途徑。該病自1935年被發現以來，曾先后在英國、德國、丹麥、荷蘭、俄羅斯、印度、日本、韓國以及我國臺灣發生并造成嚴重危害。黃瓜綠斑駁病毒病以前在我國大陸沒有發生記載，2006年國內個別地方發現西瓜綠斑駁病毒病，2006年12月份中國農業部發布788號公告，將其列為全國植物檢疫性有害生物。目前在植物病毒鑒定識別上常采用的方法有:生物學實驗，血清學檢測，電鏡觀察及分子生物學檢測。由于傳統的植物病毒監測方法，如電鏡觀察、傳統的生物學接種鑒定等這些方法很難分別出是否是黃瓜綠斑駁花葉病毒，因此需要一個快速準確的方法來檢測該病毒。環介導恒溫核酸擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),是由Notomi等在2000年發明 的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，他是一種高靈敏度的鏈置換技術，一種新型的PCR替代技術。LAMP特點是針對靶基因的6個區域設計了 4個特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶一Bst DNA polymerase在恒溫的條件下反應60min就可以完成核酸擴增反應，通過熒光染色后在紫外光下觀察可以清晰的觀察到反應結果。不需要長時間的溫度循環，不需要昂貴的PCR儀，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。目前已廣泛應用于人類和動植物各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病監測和快速診斷。但是，目前尚沒有將RT-LAMP技術應用在黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)的檢測上。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用于黃瓜綠斑駁花葉病毒快速檢測的RT-LAMP引物組。本發明的另一目的在于提供一種黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測試劑盒。本發明又一目的在于提供一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測方法。該方法用于快速檢測西瓜、黃瓜和葫蘆等葫蘆科上黃瓜綠斑駁花葉病毒，通過該方法可以快速診斷出疑似病株是否攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒。本發明的目的可以通過以下技術方案實現:一種用于黃瓜綠斑駁花葉病毒快速檢測的RT-LAMP引物組，其在于所述的RT-LAMP引物組包含一對外引物和一對內引物，所述外引物對F3、B3的序列分別為SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示，所述內引物對FIP、BIP的序列分別為SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示。上述的引物組在制備黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。一種含有上述的引物組的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測試劑盒。上述的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測試劑盒，其在于所述的試劑盒包含主要由植物病毒RNA快速提取液、RT-LAMP反應液、DEPC水和熒光染料SYBR Green I檢測液組成的檢測體系。上述的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測試劑盒，其在于所述植物病毒RNA快速提取液包含0.5M NaOH和Tris-HCL (pH8.0);采用植物病毒RNA快速提取液提取樣品粗提總RNA，將提取的樣品粗提總RNA加入到RT-LAMP反應液中混合，建立擴增體系；以反應總體積IOyL為例，所述擴增體系中各組分的含量為:樣品粗提總RNA
0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 Bst DNAPolymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ, 0.2 μ M 的 F3 和 0.2 μ M的B3，補充DEPC水至10 μ L0`一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測方法，其在于使用上述的引物組對待測樣品進行RT-LAMP擴增，利用電泳檢測或熒光染料技術鑒定出待檢測樣本中是否含有黃瓜綠斑駁花葉病毒。上述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測方法，具體包括以下步驟:(I)提取樣品粗提總RNA ；(2)取步驟(I)提取的樣品粗提總RNA加入到RT-LAMP反應液中混合，建立擴增體系;(3)在63 64°C恒溫水浴中反應6(T75min ；(4)結果診斷:取熒光染料檢測液SYBR Green I加入到步驟(3)擴增反應產物中進行診斷，在紫外光下觀察，呈陽性即顯綠色的表示樣本中含有黃瓜綠斑駁花葉病毒，呈陰性即保持染料橙色的表示樣本不含有黃瓜綠斑駁花葉病毒。步驟(I)所述樣本粗提總RNA的提取方法為:用剛采集的病葉在0.5M NaOH溶液中快速研磨制成研磨液，將研磨液加入到Tris-HCL (pH8.0)中制成樣品粗提總RNA提取液。
所述的病葉和0.5M NaOH溶液的質量體積比g:mL為1:4 ;所述混合液和Tris-HCL(pH8.0)的體積比為I:49o步驟(2)中所述反應總體積IOyL為例，擴增體系中各組分的含量為:樣品粗提總 RNA 0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 BstDNA Polymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ，0.2 μ M 的 F3 和
0.2 μ M 的 B3,補充 DEPC 水至 10 μ L。
本發明所提供的快速檢測病株上黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法，具體包括以下詳細步驟:I)根據NCBI已報道的黃瓜綠斑駁花葉病毒核苷酸序列，通過軟件DNAstar分析后找出該病核酸外殼蛋白基因保守區域序列作為模板參考序列使用在線LAMP引物設計軟件Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設計弓I物；2)快速提取法提取植株樣品粗提總RNA ；3)設置不同Mg2+濃度、dNTP濃度、內外引物濃度比例、Betaine濃度、確定最佳反應體系；分別改變反應時間和溫度進行RT-LAMP擴增反應，確定最佳反應條件。4)通過紫外光或肉眼判斷SYBR Green I染色對RT-LAMP產物進行可視化處理。5)在最佳反應參數條件下，與RT-PCR方法進行比較，驗證RT-LAMP的靈敏度；6)以CMV和TMV為對照驗證這一反應的特異性；本發明提供的引物序列如下:
權利要求
1.一種用于黃瓜綠斑駁花葉病毒快速檢測的RT-LAMP引物組，其特征在于所述的RT-LAMP引物組包含一對外引物和一對內引物，所述外引物對F3、B3的序列分別為SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示，所述內引物對FIP、BIP的序列分別為SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4所示。
2.權利要求1所述的引物組在制備黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。
3.一種含有權利要求1所述的引物組的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測試劑盒。
4.根據權利要求3所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含主要由植物病毒RNA快速提取液、RT-LAMP反應液、DEPC水和熒光染料SYBR Green I檢測液組成的檢測體系。
5.根據權利要求4所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒RT-LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于所述植物病毒RNA快速提取液包含0.5M NaOH和Tris-HCL (pH8.0);采用植物病毒RNA快速提取液提取樣品粗提總RNA，將提取的樣品粗提總RNA加入到RT-LAMP反應液中混合，建立擴增體系；以反應總體積10 μ L為例，所述擴增體系中各組分的含量為:樣品粗提總RNA0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 Bst DNAPolymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ, 0.2 μ M 的 F3 和 0.2 μ M的B3，補充DEPC水至10 μ L0
6.一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測方法，其特征在于使用權利要求1所述的引物組對待測樣品進行RT-L AMP擴增，利用電泳檢測或熒光染料技術鑒定出待檢測樣本中是否含有黃瓜綠斑駁花葉病毒。
7.根據權利要求6所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)提取樣品粗提總RNA； (2)取步驟(I)提取的樣品粗提總RNA加入到RT-LAMP反應液中混合，建立擴增體系； (3)在63 64°C恒溫水浴中反應6(T75min； (4)結果診斷:取熒光染料檢測液SYBRGreen I加入到步驟(3)擴增反應產物中進行診斷，在紫外光下觀察，呈陽性即顯綠色的表示樣本中含有黃瓜綠斑駁花葉病毒，呈陰性即保持染料橙色的表示樣本不含有黃瓜綠斑駁花葉病毒。
8.根據權利要求7所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測方法，其特征在于步驟(I)所述樣本粗提總RNA的提取方法為:用剛采集的病葉在0.5M NaOH溶液中快速研磨制成研磨液，將研磨液加入到Tris-HCL (pH8.0)中制成樣品粗提總RNA提取液。
9.根據權利要求8所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測方法，其特征在于所述的病葉和0.5M NaOH溶液的質量體積比g:mL為1:4 ;所述混合液和Tris_HCL(pH8.0)的體積比為1:49。
10.根據權利要求7所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述反應總體積IOyL為例，擴增體系中各組分的含量為:樣品粗提總RNA·0.8 μ L,I X ThermoPol Buffer,4mM MgCl2,0.8mM dNTP,0.8M Betaine,3.2U 的 Bst DNAPolymerase, 0.5U 的 AMV Polymerase, I μ M 的 FIP 和 I μ M 的 ΒΙΡ, 0.2 μ M 的 F3 和 0.2 μ M的B3，補充DEPC水至10 μ L0
全文摘要
本發明一種黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP快速檢測試劑盒及檢測方法，其中該方法包括植物病毒總RNA的提取，RT-LAMP反應和電泳檢測或熒光染料檢測，確定植物是否帶病。本發明根據CGMMV的外殼蛋白基因保守區域設計了RT-LAMP引物，采用RT-LAMP技術建立了一種快速、靈敏、高度特異性的檢測黃瓜、西瓜和葫蘆等葫蘆科植物植株上CGMMV的檢測技術及其在病害診斷上的應用方法。本發明可以利用快速抽提RNA和常規RNA抽提作為RNA模板用于RT-LAMP實驗。利用這一方法可以快速鑒定出黃瓜綠斑駁花葉病毒植株樣本，進而采取針對性的檢疫性保護措施，減少病害帶來的損失。
文檔編號C12R1/94GK103146847SQ201310093869
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月22日 優先權日2013年3月22日
發明者陶小榮, 李靖玉, 衛其巍, 張雯娜, 吳鑒艷 申請人:南京農業大學