一種蛋白酶k及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種蛋白酶K及其應用，所述的一種蛋白酶K的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2，氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。本發明篩選出的蛋白酶K切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，可以用來制備脈沖電泳的染色體DNA,蛋白印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶，也可以用于提取組織中非蛋白成份降解含有蛋白質的雜志，比如DNA疫苗和肝素的制備等，具有工業生產應用價值。而且篩選出的蛋白酶K基因可以用來轉化工程菌，從而獲得具有表達蛋白酶K的重組菌。
【專利說明】-種蛋白酶K及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于酶基因工程【技術領域】，具體涉及一種蛋白酶Κ及其應用。
【背景技術】
[0002] 蛋白酶 K(E. C. 3. 4. 21. 64)是真菌 Tritirachium album Limber 合成的胞外內膚 酶，它是具有典型催化三元組Asp39-His69-Ser 224的絲氨酸蛋白酶類中的一員。蛋白酶K具 有高于30U/mg的特異活性，是已知的內肽酶中最有活性的之一，并且非特異性水解天然的 和變性的蛋白質。
[0003] 成熟蛋白酶K由279個氨基酸組成，兩個二硫橋和兩個鍵合的鈣離子使得緊密結 構穩定。所以，與其他枯草桿菌蛋白酶相比，蛋白酶K對極端pH值、高溫、離液劑和去污劑 具有高得多的穩定性，蛋白酶K在高溫(達65°C)和寬pH范圍（pH 7. 5 -12.0)具有高穩定 性。在變性劑例如脲或SDS存在下其活性得以提高。上述性質使得蛋白酶K在要求非特異 性蛋白質降解的生物【技術領域】中具有很好的應用，特別是從粗提取液中分離核酸（DNA或 RNA)以及在DNA分析中預制備樣品，另外蛋白酶K也可應用于蛋白質分析領域，例如結構釋 析。
[0004] 但因為目前的Tritirachium album Limber基因的核苷酸序列不適合大規模發 酵，而且難以進行基因操作，之前曾進行過在其它宿主細胞中過量表達的重組蛋白酶K的 嘗試，但存在著不表達、產生失活"包涵體"或者與復性有關的問題，在這些試驗中沒有檢測 到顯著活性。因此，需要對其序列進行相應的改造，以滿足工業生產的要求。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種蛋白酶K及其應用，即一種具有工業應用價值的新型蛋 白酶K，以彌補現有技術的不足。
[0006] 本發明一個方面涉及一種蛋白酶K，包括有：
[0007] a)序列為 SEQ ID N0 :1 的酶；
[0008] b)在a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有a中所述 酶的活性的，由a衍生的酶。
[0009] 編碼上述蛋白酶K的核苷酸，其優化的序列為SEQ ID N0 :2。
[0010] 本發明還提供用于表達上述蛋白酶K的重組表達質粒，是將序列為SEQ ID NO ：2 的核苷酸片段插入到原核表達載體中構建的。
[0011] 本發明還涉及攜帶有表達上述蛋白酶κ的重組表達質粒的重組菌。
[0012] 本發明篩選出的蛋白酶K能切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，可以 用來制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶，也可以用 于提取組織中非蛋白成份降解含有蛋白質的雜志，比如DNA疫苗和肝素的制備等，具有工 業生產應用價值。而且篩選出的蛋白酶K基因可以用來轉化工程菌，從而獲得具有表達蛋 白酶K的重組菌。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1 :本發明的蛋白酶K在黑曲霉宿王中的pH穩定性；
[0014] 圖2 :本發明的蛋白酶K在黑曲霉宿主中的溫度穩定性。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合實例對本發明的方法做進一步說明。但實例僅限于說明，并不限于此。下 列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook) 等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。
[0016] 1、蛋白酶K基因的合成
[0017] 將Tritirachium album Limber的序列進行改造，形成新的核酸序列ProK，使 ProK不被Xho I和Xba I兩個酶切位點切斷，獲得的新的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0: 2,其編碼的蛋白酶K的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。在ProK序列兩端加 Xho I和Xba I酶 切位點，將文本序列送至生物公司（上海生工)合成，合成的ProK被連接在載體PSG-TS上， 插入位點為t-a克隆，受體菌為大腸桿菌DH5 α菌株。
[0018] 2、蛋白酶Κ基因重組載體的構建
[0019] 將連在PSG-TS載體上的ProK基因用Xho I和Xba I雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳， 切膠回收酶切產物片段，與同樣用Xho I和Xba I雙酶切并切膠回收的質粒pGm連接，轉化 感受態大腸桿菌（E. coli)DH5a后，涂于含有Amp的LB固體培養基上。37°C培養14-16小 時，進行菌落PCR驗證，有正確條帶的，挑取單克隆轉接到4 ml LB液體培養基中進行培養 (含Amp)，培養14-16小時后，提取質粒，將重組質粒pGm-Pr〇K轉入表達宿主黑曲霉G1，含 有該重組質粒的重組菌株命名為Gl-pGm-ProK。
[0020] 其中的酶切及連接反應均參照表1。
[0021]
【權利要求】
1. 一種蛋白酶K，包括有： a) 序列為SEQ ID NO :1的酶； b) 在a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2. -種編碼權利要求1所述的蛋白酶K的核苷酸，其序列為SEQ ID NO :2。
3. -種重組表達質粒，所述的重組表達質粒用于表達權利要求1所述的蛋 白酶K。
4. 如權利要求3所述的重組表達質粒，其特征在于所述的重組表達質粒是 將序列為SEQ ID NO :2的核苷酸片段插入到原核表達載體中構建的。
5. -種重組菌，所述的重組菌攜帶有權利要求3所述的重組表達質粒。
【文檔編號】C12N15/57GK104059900SQ201310088128
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月19日 優先權日:2013年3月19日
【發明者】王華明, 林艷梅 申請人:中國科學院天津工業生物技術研究所