專利名稱：一種多頭帶絳蟲抗原基因及其重組蛋白與用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種寄生蟲的基因，確切講是一種多頭帶絳蟲抗原基因，以及其重組蛋白與用途。
背景技術：
腦多頭蝴病(Cerebral coenurosis)俗稱腦包蟲病，又稱眩倒病或蹣跚病(gidor sturdy),是多頭帶絳蟲STaenia mu I ticeps)的中絳期幼蟲腦多頭蝴iGjemiruscerebral is )寄生于綿羊和山羊等有蹄類反芻動物的腦內引起的一種嚴重致死性的寄生蟲病，人也可作為中間宿主感染。其成蟲寄生于犬科肉食獸的小腸。腦多頭蝴病的致死率可達100%，給畜牧業生產造成了巨大的經濟損失。該病呈全球性分布，是一種重要的人畜共患寄生蟲病(參見 Sharma DK and Chauhan PPS.Coenurosis status in Afro-Asian region:a review [J].Small Rumin Res, 2006, 64:197-202.另參見 Scala A and VarcasiaA.Updates on morphobiology, epidemiology and molecular characterization ofcoenurosis in sheep [J].Parassitologia, 2006，48 (1-2):61-63.)。目前，腦多頭蝴病的診斷及治療仍面臨技術挑戰(參見Scott PR.Diagnosis and treatment of coenurosisin sheep [J].Vet Parasitol, 2012, 189 (I):75-78.)。目前已研制成功的的帶科絳蟲重組疫苗，包括羊帶絳蟲、牛帶絳蟲、豬帶絳蟲、細粒棘球絳蟲等。眾所周知，這些疫苗抗原都來自于六鉤蝴蛋白45W、16K、18K、Eg95中的一種或多種簇族，而且這些蛋白在不同的絳蟲種間具有一定的相似性(Lightowlers MW, Cestode vaccines: origins, current statusand future prospects [J].Parasitology, 2006，133: 27-42.)。盡管這些宿主保護性抗原間的DNA或蛋白序列間僅僅有很低的同源性，但它們的氨基酸序列都有一些共同的特性:一是都具有預測的信號肽序列，二是都具有一個或兩個拷貝的保守型的基序(參見Lightowlers MWj Flisser A, Gauci CGj et al.Vaccination against cysticercosisand hydatid disease [J].Parasitol Today, 2000，16: 191-196.)，把這個基序定義為纖維結合蛋白區域 III (Fn III) `(Bork P，Doolittle RF.Fibronectin type IIImodules in the receptorphosphatase CD45 and tapeworm antigens[J].Protein Scij1993，2:1185 -1187.)0上世紀八十年代，已經有腦多頭蚴病的免疫預防的報道，免疫抗原常釆用多頭帶絳蟲六鉤蝴體外培養物或蟲體粗抗原(參見Edwards GT and Herbert IV.Preliminaryinvestigations into the immunization of lambs against infection with Taeniamu I ticeps metacestodes [J].Vet Parasitol, 1982，9 (3-4): 193-199.另參見 VersterA, Tustin RC.Preliminary report on the stimulation of immunity to the larvalstage of Taenia mu I ticeps [J].JS Afr Vet Assoc, 1982，53(3): 175-176.另參見 Verster A and Tustin RC.1mmunization of sheep against the larval stage ofTaenia mu I ticeps [J\.0nderstepoort J Vet Res, 1987，54 (2): 103-105.另參見張文寶，哈江，蔡宏，等.另參見多頭帶絳蟲六鉤蚴代謝物對綿羊腦包蟲病的免疫效果觀察[J].中國獸醫科技，1991,21 (12): 35-36.另參見竇蘭清，付寶權，柴忠威，等.多頭帶絳蟲抗原特性的研究一囊液和囊壁粗抗原的免疫原性[J].中國獸醫技，1996,26(12):5-7.另參見竇蘭清，付寶權，柴忠威，等.另參見多頭帶絳蟲抗原特性的研究一原頭節及其排泄分泌抗原的免疫原性[J].中國獸醫科技，1997，27(8):9-11.)。近年，多頭帶絳蟲Tml6和Tml8重組疫苗綿羊攻蟲試驗也顯示了它們的有效性(參見Gauci C，Vural G, Oncel T, etal.Vaccination with recombinant oncosphere antigens reduces the susceptibilityof sheep to infection with Taenia mu I ticeps [J].1nt J Parasitol, 2008, 38(8-9): 1041-1050.另參見 Varcasia A, Tosciri G, Coccone GN, et al.Preliminaryfield trial of a vaccine against coenurosis caused by Taenia multiceps [J].Vet Parasitol, 2009, 162(3-4):285-289.)D通過構建cDNA文庫從中篩選基因是獲取抗原性基因行之有效的手段，國外學者從羊帶絳蟲六鉤蝴cDNA文庫中篩選到保護性抗原基因45W,成功地研制了羊囊尾蝴基因重組疫苗(Johnson KS, Harrison GB, LightowlersMW, et al.Vaccination against ovine cysticercosis using a defined recombinantantigen [J].Nature，1989，338，585-587.)。近年來國內學者成功構建了豬帶絳蟲、亞洲帶絳蟲cDNA質粒文庫并進行了 EST測序分析，獲得了成蟲表達基因數據(黃江,胡旭初，包懷恩，等.亞洲帶絳蟲成蟲全長cDNA質粒文庫的構建及EST測序[J].熱帶醫學雜志，2007,7(2):116-118.另參見黃江，胡旭初，徐勁，等.豬帶絳蟲成蟲cDNA質粒文庫的構建及EST測序[J],中國人獸共患病學報，2008，24 (12):1126-1128.)。
發明內容
本發明提供一種多頭帶絳蟲抗原性基因，以及這一基因所編碼蛋白的制備方法和可能的用途。本發明的一種多頭帶絳蟲綿羊腦多頭蝴抗原基因為Tm82，其氨基酸序列為SEQ Na I，其核苷酸序列為SEQ Na 2.本發明的多頭帶絳蟲綿羊腦多頭蝴抗原基因Tm82是對腦多頭蝴cDNA文庫的EST(Expression sequence Tag,表達序列標簽)進行測序分析,發現標號為Tm82的基因序列與多頭帶絳蟲已知抗原性基因Tml6編碼的蛋白具有相似性，然后通過去除載體序列及polyA尾巴，得到具有完整ORF編碼框的Tm82序列。本發明的Tm82重 組基因的制備方法是以以腦多頭蝴cDNA表達文庫為模板，用SEQ Na 3和SEQ Na 4為引物進行PCR擴增后進行純化處理，再將經純化處理后的產物與PGEX-4T-1質粒分別用I ,Xho I進行雙酶切，回收產物以T4 DNA連接酶連接，轉化DH5a感受態細胞，獲得重組表達質粒pGEX-Tm82，再轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，挑取單個菌落接種于含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB液體培養基培養，收集菌體進行SDS-PAGE將大量增菌誘導表達的菌體離心富集細菌培養物沉淀，用pH7.4 PBS緩沖液懸浮，反復凍融3次后超聲裂解表達菌，分別收集裂解液的上清及沉淀，用SDS-PAGE分析重組蛋白的表達形式后用GST瓊脂糖樹脂純化，得目標蛋白。本發明的多頭帶絳蟲抗原基因Tm82可用于制備腦多頭蝴的免疫疫苗。相關的實驗表明，本發明的基因為多頭帶絳蟲的抗原性基因。用本發明的Tm82重組蛋白受試羊只進行免疫后，可對羊腦多頭蝴病感染產生一定的保護作用。
圖1是實施例一 Tm82基因所編碼蛋白的跨膜區預測結果
ProtScale分析蛋白親疏水性分析(窗口大小默認值為9)時，結果表明該蛋白質存在2個高分值(Scare>l.5，當Scare>0時表示疏水性)分別分布在5 15，85 95域；而低分值(Scare < O)表示親水性峰則位于20、40、50、70、100、130氨基酸位點附近，表明該蛋白總體親水性較高，ProtScale圖形輸出見圖1。圖2是Tm82基因所編碼蛋白序列的信號肽預測
SignalP分析表明Tm82蛋白第I位到第17位氨基酸殘基的信號肽分值為0.762 (域值為0.450)，說明該蛋白含有信號肽序列，見圖2。圖3是Tm82蛋白結構域預測及與其它已知絳蟲保護性抗原的結構域比對 SMART分析可以看出，Tm82蛋白與Tml6蛋白的結構域最為相似，見圖3。圖4至圖6是實施例中Tm82基因在不同發育時期的轉錄情況核酸電泳圖，其中: 圖4是提取的總RNA。圖中M: DL2000 DNA Marker ;1:成蟲；2:腦多頭蝴；3:六鉤
蝴；
圖5是Tm82基因的RT-PCR電泳圖。圖中M: DL2000 DNA Marker ;1:成蟲；2:腦多頭蝴；3:六鉤蝴；4:陰性對照；
圖6是actin基因的RT-PCR電泳圖。圖中M: DL2000 DNA Marker ; 1:成蟲；2:腦多頭蝴；3:六鉤蝴；4:陰性對照。圖7是實施例三去除信號肽序列后Tm82基因序列的PCR擴增電泳圖 圖中M: DNA分子質量標準；1: Tm82基因PCR ; 2:陰性對照。圖8是實施例三Tm82重組蛋白的表達
圖中M:蛋白質標準分子量標準，1:空載體菌誘導前；2 3:空載體菌誘導后；4:空載體菌表達純化后；5: Tm82重組菌誘導前；6 7: Tm82重組菌誘導后；8: Tm82重組菌表達純化后。
具體實施例方式本發明以下結合實施例作進一步詳述。一、Tm82基因序列分析 1.Tm82基因編碼蛋白的大小
Tm82基因組成的長度為402 bp開放閱讀框，共編碼133個氨基酸，其氨基酸序列見SEQ Na 1，堿基序列見SEQ Na 2。2.Tm82蛋白理化性質分析
應用ProtParam分析，Tm82基因編碼133個氨基酸殘基組成的多肽的理論分子質量為14834.3 ku，理論等電點為9.37，原子組成是C67tlHltl79N183O186S5。該蛋白由19種氨基酸組成，其中Ala最為豐富，Cys和Gln含量最少。負電荷殘基(Asp，Glu) 16個，正電荷殘基(Arg，Lys) 20個。不穩定系數(instability index)為40.69 (大于40為不穩定),表明該蛋白狀態不穩定。ProtScale分析蛋白親疏水性分析(窗口大小默認值為9)時，結果表明該蛋白質存在2個高分值(Scare>l.5，當ScareX)時表示疏水性)分別分布在5 15，85 95域；而低分值(Scare < O)表示親水性峰則位于20、40、50、70、100、130氨基酸位點附近，表明該蛋白總體親水性較高。
3.跨膜區及信號肽預測
TMHMM預測Tm82不產生跨膜螺旋。SignalP分析表明Tm82蛋白第I位到第17位氨基酸殘基的信號肽分值為0.762 (域值為0.450)，說明該蛋白含有信號肽序列。4.Tm82結構域的預測及與其它已知絳蟲保護性抗原的比對
從SMART分析圖可以看出，Tm82蛋白與Tml6蛋白的結構域最為相似。SMART分析Tm82蛋白與其它已知帶科絳蟲宿主保護性抗原均含有纖維結合蛋白III型結構域(fibronectin type III domain, Fn III ),且大多數也都含有信號肽序列,詳見表1:
表I Tm82蛋白結構域與其它已知絳蟲保護性抗原的結構域比對
權利要求
1.一種多頭帶絳蟲綿羊腦多頭蝴抗原基因Tm82，其特征在于Tm82氨基酸序列為SEQNa I。
2.權利要求1所述的多頭帶絳蟲綿羊腦多頭蝴抗原基因Tm82的制備方法，其特征是以腦多頭蝴cDNA表達文庫為模板，用SEQ Na 3和SEQ Na 4為引物進行PCR擴增后進行純化處理，再將經純化處理后的產物與PGEX-4T-1質粒分別用I ,Xho I進行雙酶切，回收產物以T4 DNA連接酶連接，轉化DH5 α感受態細胞，獲得重組表達質粒pGEX_Tm82，再轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，挑取單個菌落接種于含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB液體培養基培養，收集菌體進行SDS-PAGE將大量增菌誘導表達的菌體離心富集細菌培養物沉淀，用PH7.4 PBS緩沖液懸浮，反復凍融3次后超聲裂解表達菌，分別收集裂解液的上清及沉淀，用SDS-PAGE分析重組蛋白的表達形式后用GST瓊脂糖樹脂純化，得目標蛋白。
3.權利要求1所述的 多頭帶絳蟲抗原基因Tm82用于制備腦多頭蝴的免疫疫苗。
全文摘要
本發明公開一種多頭帶絳蟲抗原基因及其重組蛋白與用途。本發明的一種多頭帶絳蟲綿羊腦多頭蚴抗原基因是氨基酸序列為SEQ№1的Tm82。本發明的多頭帶絳蟲抗原基因Tm82可用于制備腦多頭蚴的免疫疫苗。
文檔編號C12N15/70GK103184225SQ20131007626
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月11日 優先權日2013年3月11日
發明者李文卉, 付寶權, 曲自剛, 蓋文燕, 謝志宙, 劉靜宜 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所