專利名稱：一種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法，屬于獸用生物制品技術領域。
背景技術：
2010年4月以來，我國主要蛋鴨養(yǎng)殖區(qū)福建、山東、浙江、上海、江蘇等地陸續(xù)暴發(fā)一種以蛋鴨、種鴨產(chǎn)蛋驟然大幅下降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性傳染病。在疫病流行初期，根據(jù)主要病變和臨床特點，將該流行性疾病稱為鴨出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DH0)。隨著病原學研究的深入,該病被確診是由一種新型黃病毒(Duck Flavivirus)-鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)引起。2011年中國畜牧獸醫(yī)學會第一屆水禽疫病防控研討會將該病名稱統(tǒng)一為“鴨坦布蘇病毒病”(朱麗萍，顏世敢.鴨坦布蘇病毒研究進展.中國預防獸醫(yī)學報，2012，1，第34卷，第I期:79-82.)。我們從某大型鴨場的發(fā)病種鴨群中分離到一株病毒，經(jīng)初步鑒定該病毒為有囊膜的RNA病毒。RT-PCR擴增測序顯示該病毒與黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇病毒親緣關系最近，隨將該原稱為黃病毒(Duck Flavivirus)的病毒稱為鴨坦布蘇病毒。
鴨坦布蘇病毒病的發(fā)生在我國為首次報道，截至目前，許多單位對其已經(jīng)進行了為期2年的研究，主要包括病原分離、生物學特性分析、檢測方法建立等。疫苗的研制開發(fā)仍被列為控制該疾病的首選措施。
目前鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的研制主要以雞胚、鴨胚、轉瓶培養(yǎng)細胞作為病毒擴繁和抗原制備材料，申請人已經(jīng)于2011年8月31日提交了滅活疫苗的發(fā)明專利申請，申請?zhí)枮?01110254517.X。由于這些原材料及生產(chǎn)方法雖然操作技術要求低、工藝成熟穩(wěn)定，但操作勞動強度較大，生產(chǎn)效率低，疫苗批間差異大，不適應當前疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。利用攪拌式生物反應器進行鴨坦布蘇病毒滅活疫苗大規(guī)模生產(chǎn)，是一個新的研究方向。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種應用生物反應器培養(yǎng)敏感細胞，生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法。本發(fā)明所用的生物反應器為攪拌式生物反應器，培養(yǎng)方式是向生物反應器內(nèi)接種種子細胞，培養(yǎng)到一定密度后，接種病毒，收獲病毒液。本發(fā)明的優(yōu)點是使鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的生產(chǎn)過程機械化、易于自動控制，該生產(chǎn)方法效率高、副產(chǎn)物少，疫苗的副反應小，與傳統(tǒng)的轉瓶工藝相比，毒液病毒含量高，病毒滴度可提高0.5 1.0TCID5cZml，疫苗質量穩(wěn)定。
本發(fā)明的技術方案
1.一種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法是將VeiO細胞或BHK細胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料，采 用生物反應器培養(yǎng)至致密單層或3X 106/ml時，接種鴨坦布蘇病毒強毒株逐級放大培養(yǎng)后經(jīng)過滅活、乳化制備出一種鴨坦布蘇病毒滅活疫苗。
2.本發(fā)明涉及到一種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法，選擇鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusuvirus,)強毒W(wǎng)FG36株作為生產(chǎn)用毒種，該病毒株，即為原黃病毒(DuckFlavivirUS)WFG36株，該病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為:CGMCCN0.4718。
具體實施方式
1.一種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟:
(I)用微載體培養(yǎng)細胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料
將微載體和生物反應器滅菌后，加入細胞生長液。其中，微載體為Cytodex系列微載體(GE公司生產(chǎn))，使用密度為2 25g/L ;接種制苗用細胞進行懸浮培養(yǎng)，待微載體上的細胞形成致密單層后，接種鴨坦布蘇病毒生產(chǎn)毒株，病毒接種量為0.1 1.0Μ0Ι，并繼續(xù)培養(yǎng)，制苗用細胞為對鴨坦布蘇病毒病毒株敏感的細胞，VeiO細胞和BHK細胞。其中，制苗用細胞采用5L 30L或5L 30L 150L逐級放大的培養(yǎng)模式，于30L或150L生物反應器培養(yǎng)鴨坦布蘇病毒。
培養(yǎng)過程中每天觀察細胞病變情況，待細胞病變達到80%以上時，收獲病毒液，保存于-20°C。
生物反應器設定參數(shù)為:pH:7.0 7.4、溫度:36.5 37°C、溶氧:30% 60%、攪拌速度:30 90r/min。
(2)用純懸浮培養(yǎng)細胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料在滅菌的生物反應器內(nèi)加入細胞生長液，接入制苗用細胞進行懸浮培養(yǎng)，待細胞密度達到3 X 106/ml，細胞活力在93%以上時，接種鴨坦布蘇病毒病毒株，病毒接種量為0.1 1.0MOI(感染復數(shù))，并繼續(xù)培養(yǎng)，制苗用細胞為對鴨坦布蘇病毒病毒株敏感的懸浮培養(yǎng)BHK細胞。其中，制苗用細胞采用5L 30L或5L 30L 150L逐級放大的培養(yǎng)模式，于30L或150L生物反應器培養(yǎng)鴨坦布蘇病毒。
培養(yǎng)過程中每天觀察細胞活力變化情況，待細胞活力下降到20%以下時，收獲全懸浮病毒液，保存于_20°C。
生物反應器設定參數(shù)為:pH:7.0 7.4、溫度:36.5 37°C、溶氧:30 60%、攪拌速度:30 90r/min。
(3)病毒液抗原含量
制備的抗原應按《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明簡稱《中國獸藥典》)附錄逐瓶作無菌檢驗，并抽樣I份測定病毒含量(TCID5tl),應無菌生長，每0.1ml病毒含量應> IO6 0TCID500
(4)病毒液滅活
向檢驗合格的病毒液中加入甲醛溶液(或丙內(nèi)酯或二乙烯亞胺)，搖勻后置于37 °C進行滅活。
(5)油乳劑滅活疫苗制備
將配苗用的油相(注射用白油94份、加司本-806份、硬脂酸鋁2份)和水相(滅活抗原96份、吐溫-804份)制備完成后，按油相與水相2: I份的配比比例置于乳化罐中進行乳化，乳化后，取8 IOml以3000r/min離心15分鐘,應不出現(xiàn)分層。乳化完成后進行無菌分裝，即可得到成品疫苗。
2.鴨出血性卵巢炎滅活疫苗檢驗標準
(I)性狀:外觀乳白色乳劑。
劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第I滴外，均應不擴散。
穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應不多于0.5ml。
黏度用Iml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，應在8秒以內(nèi)。
(2)無菌檢驗:按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進行，應無菌生長。
(3)安全檢驗:取I 2周齡SPF鴨10只，分別頸背皮下或肌肉注射疫苗1ml，觀察14天，應不出現(xiàn)由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應。
(4)效力檢驗:取10只7 10日齡SPF雛鴨，平均分為兩組，5只作為試驗組，5只作為空白對照組，試驗組每只頸背皮下注射疫苗0.3ml，接種后21天，用鴨黃病毒強毒攻毒，點眼、滴鼻0.2ml/只，肌注0.3ml/只。攻毒后第7天，采集每只鴨的抗凝血，分離血漿，分別經(jīng)卵黃囊接種7日齡易感雞胚5枚，0.2ml/胚，接種后觀察7天，試驗組應至少4只病毒分離陰性，對照組應至少4只病毒分離陽性。
(5)甲醛、汞類防腐劑殘留量測定:分別按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進行，應符合獸用生物制品通則的規(guī)定。
本發(fā)明涉及的微生物資源信息
選擇鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusuvirus, DTMUV)強毒W(wǎng)FG36株作為生產(chǎn)用毒種，該病毒株，即為原黃病毒(Duck Flavivirus) WFG36株,該病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為:CGMCCN0.4718。
本發(fā)明的積極意義
—種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法。本發(fā)明米用生物反應器培養(yǎng)技術進行細胞的高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗，與傳統(tǒng)的轉瓶生產(chǎn)工藝相比，自動化控制程度高，生產(chǎn)可實時監(jiān)控，保證了產(chǎn)品質量的均一、穩(wěn)定；生產(chǎn)中可節(jié)省人力、物力，降低生產(chǎn)成本；生產(chǎn)的毒液病毒 含量較高，批間差異小，副反應減少。實施例
以下實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實施例1
鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的制備
生物反應器:14L和40L攪拌式生物反應器，生物反應器設定參數(shù)為:pH:7.0、溫度:36.5°C、溶氧:50%、攪拌速度:60r/min ；
微載體:Cytodexl (GE公司生產(chǎn))
鴨坦布蘇病毒:WFG36株，一株鴨黃病毒(Duck Flavivirus)WFG36株，該病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為:CGMCCN0.4718 ；
細胞生長液:含10%胎牛血清的DMEM/F12 (GIBC0公司生產(chǎn))
病毒維持液:含5%胎牛血清的DMEM (GIBC0公司生產(chǎn))
細胞培養(yǎng):
(I)在14L生物反應器中按照15g/L的濃度加入Cytodex-Ι，滅菌；
(2)加入Vero細胞進行培養(yǎng)，每天觀察；
(3)待14L生物反應器細胞密度達3.0X 106/ml時，將長滿細胞的微載體收集到密閉容器中，接種到40L生物反應器；
(4)待40L生物反應器細胞密度達2.5X 106/ml時，接種鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株，病毒接種量為0.5M0I，繼續(xù)培養(yǎng)；
(5)待細胞病變達到80%以上時，收獲病毒液，保存于_20°C。
病毒液抗原含量測定:制備的抗原抽樣I份測定病毒含量(TCID5tl),每0.1ml病毒含量為 IO6-65TCID500
病毒液滅活:向檢驗合格的病毒液中加入0.2%的甲醛溶液，搖勻后置于37°C進行滅活。
油乳劑滅活疫苗制備:
將配苗用的油相·(注射用白油94份、加司本-806份、硬脂酸鋁2份)和水相(滅活抗原96份、吐溫-804份)制備完成后，按油相與水相2: I份的配比比例置于乳化罐中進行乳化，乳化后，取IOml以3000r/min離心15分鐘,未出現(xiàn)分層。乳化完成后進行無菌分裝，即可得到成品疫苗。
實施例2
鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的制備
生物反應器:14L和40L攪拌式生物反應器，生物反應器設定參數(shù)為:pH:7.0 7.4、溫度:36.5 37°C、溶氧:30 60%、攪拌速度:30 90r/min ；
微載體:Cytodexl；
鴨坦布蘇病毒:WFG36株；
細胞生長液:含10%胎牛血清的DMEM/F12 ()
病毒維持液:含5%胎牛血清的DMEM (購自GIBCO公司)
細胞培養(yǎng):
(I)在14L生物反應器中按照15g/L的濃度加入Cytodex-1，滅菌；
(2)加入BHK細胞進行培養(yǎng)，每天觀察；
(3)待14L生物反應器細胞密度達3.0X 106/ml時，將長滿細胞的微載體收集到密閉容器中，接種到40L生物反應器；
(4)待40L生物反應器細胞密度達2.5X 106/ml時，接種鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株，病毒接種量為0.5M0I，繼續(xù)培養(yǎng)；
(5)待細胞病變達到80%以上時，收獲病毒液，保存于_20°C。
病毒液抗原含量測定:制備的抗原抽樣I份測定病毒含量(TCID5tl),每0.1ml病毒含量為 IO6-68TCID500
病毒液滅活:向檢驗合格的病毒液中加入0.2%的甲醛溶液，搖勻后置于37°C進行滅活。
油乳劑滅活疫苗制備:
將配苗用的油相(注射用白油94份、加司本-806份、硬脂酸鋁2份)和水相(滅活抗原96份、吐溫-804份)制備完成后，按油相與水相2: I份的配比比例置于乳化罐中進行乳化，乳化后，取IOml以3000r/min離心15分鐘,未出現(xiàn)分層。乳化完成后進行無菌分裝，
即可得到成品疫苗。
實施例3
鴨出血性卵巢炎滅活疫苗成品檢驗
本例中檢驗的疫苗是按本發(fā)明提供的技術方案制備的。
性狀外觀疫苗均為乳白色乳劑。
劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第I滴外，均不擴散。
穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底均無水相析出。
黏度用Iml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，均在8秒以內(nèi)。
無菌檢驗按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進行，均無菌生長。
安全檢驗取2周齡SPF鴨10只，分別頸背皮下或肌肉注射疫苗1ml，觀察14天，均無由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應，具體結果見表I。
表I疫苗安全檢驗結果
權利要求
1.一種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法，其特征在于是將Vero細胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料，采用生物反應器培養(yǎng)至致密單層或3X 106/ml時，接種鴨坦布蘇病毒強毒株逐級放大培養(yǎng)后經(jīng)過滅活、乳化制備出一種鴨坦布蘇病毒滅活疫苗。
2.如權利要求1所述一種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法，其特征在于生產(chǎn)用毒種是選擇鴨坦布蘇病毒強毒株WFG36株，該病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為:CGMCCN0.4718。
3.如權利要求1所述一種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法，其特征在于生產(chǎn)用BHK細胞作為病毒繁殖及抗原 制備用材料。
全文摘要
一種大規(guī)模生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的方法。本發(fā)明采用生物反應器培養(yǎng)技術進行細胞的高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)鴨坦布蘇病毒滅活疫苗，與傳統(tǒng)的轉瓶生產(chǎn)工藝相比，自動化控制程度高，生產(chǎn)可實時監(jiān)控，保證了產(chǎn)品質量的均一、穩(wěn)定；生產(chǎn)中可節(jié)省人力、物力，降低生產(chǎn)成本；生產(chǎn)的毒液病毒含量較高，批間差異小，副反應減少。
文檔編號C12R1/93GK103143009SQ20131007235
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權日2013年3月7日
發(fā)明者鮑海忠, 王蕾, 徐龍濤, 張青嬋, 吳昊, 鞏志宏, 李曉靜, 彭建云, 張中波, 陳茹, 張丹 申請人:齊魯動物保健品有限公司