專利名稱：一種鴨坦布蘇病毒活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒活疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2010年4月以來，我國主要蛋鴨養(yǎng)殖區(qū)福建、山東、浙江、上海、江蘇等地陸續(xù)暴發(fā)一種以蛋鴨、種鴨產(chǎn)蛋驟然大幅下降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性傳染病。在疫病流行初期，根據(jù)主要病變和臨床特點，將該流行性疾病稱為鴨出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis,DH0)。隨著病原學研究的深入,該病被確診是由一種新型黃病毒——鴨坦布蘇病毒(DuckTembusuvirus，DTMUV)引起。2011年中國畜牧獸醫(yī)學會第一屆水禽疫病防控研討會將該病名稱統(tǒng)一為“鴨坦布蘇病毒病”。我們從某大型鴨場的發(fā)病種鴨群中分離到一株病毒，經(jīng)初步鑒定該病毒為有囊膜的RNA病毒。RT-PCR擴增測序顯示該病毒與黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇病毒親緣關(guān)系最近，隨將該病毒稱為鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36 株。由于對該新型流行疾病無特效治療方法，疫苗的研制開發(fā)是控制該疾病的首選措施。 目前已有滅活疫苗的研究報道，此前，申請人已經(jīng)于2011年8月31日提交了滅活疫苗的發(fā)明專利申請，申請?zhí)枮?01110254517.X。但在實際應(yīng)用中，活疫苗相比滅活疫苗有著產(chǎn)生抗體快、副反應(yīng)小等優(yōu)勢，目前，申請人通過人工馴化，獲得了鴨坦布蘇病毒的弱毒株，可用于制備鴨坦布蘇病毒活疫苗的制備。申請人將鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株，在CEF細胞(雞胚成纖維細胞)上經(jīng)人工連續(xù)傳代培養(yǎng)，病毒對實驗鴨的致病力顯著降低，并保持了良好的免疫原性和遺傳穩(wěn)定性，命名為“鴨坦布蘇病毒W(wǎng)F100株”。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用本發(fā)明人自行分離、鑒定、保存的一株鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株，在CEF細胞上連續(xù)傳代致弱而篩選出具有良好免疫保護率的弱毒疫苗株WF100株，用該弱毒疫苗株所制備的疫苗對目前中國流行鴨坦布蘇病毒的攻擊提供良好免疫保護效力。本發(fā)明技術(shù)方案1..本發(fā)明所涉及的鴨坦布蘇病毒活疫苗，含有經(jīng)人工致弱的鴨坦布蘇病毒(DuckTembusu virus)病毒株WF100株,該病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCN0.7306。2.鴨坦布蘇病毒活疫苗的制備方法是將鴨坦布蘇病毒W(wǎng)F100株接種生長良好的CEF細胞、VERO細胞和BHK21細胞中任一種細胞單層繁殖，連續(xù)觀察72 96小時，當細胞病變達80%左右時，收獲感染的細胞病毒液，加入凍干保護劑，經(jīng)真空冷凍干燥，制備成鴨坦布蘇病毒活疫苗。
3.一種鴨坦布蘇病毒活疫苗的應(yīng)用是給鴨接種有效劑量的一種鴨坦布蘇病毒活疫苗能使接種鴨獲得對鴨坦布蘇病毒產(chǎn)生有效預(yù)防的免疫力。
具體實施例方式1.疫苗生產(chǎn)用弱毒株的培育使用9 10日齡活力良好的SPF雞胚制備CEF細胞，待細胞長成單層后，用鴨坦布蘇病毒(DTMUV)WFG36強毒株·按照5%接種量接種細胞，觀察細胞病變情況，72 96小時后，無菌收集細胞懸液，進行下一次傳代。連續(xù)傳至100代，進行致弱評價試驗，如下:將WFG36株P(guān)40、P60、P80、P100代毒分別接種230日齡左右產(chǎn)蛋鴨(產(chǎn)蛋率85% 90%)，每只肌肉注射1ml，并設(shè)置生理鹽水對照組。自接種之日起，每日觀察、記錄接種鴨群的發(fā)病情況、采食量和產(chǎn)蛋量。WFG36株P(guān)40、P60代毒接種產(chǎn)蛋鴨后第2天，采食量明顯下降，第7 8天采食開始恢復(fù)，第11 12天采食恢復(fù)正常水平，產(chǎn)蛋率在接種后第9日降至30%，此后開始回升，21日時恢復(fù)至約60%。P60代毒接種產(chǎn)蛋鴨后第2天，采食量下降約50%，第6 7天采食基本恢復(fù)正常水平，產(chǎn)蛋率在接種后第6日降至約42.5%，第7天又開始回升，21日時恢復(fù)至約80%。P40、P60代毒接種產(chǎn)蛋鴨后有部分鴨只表現(xiàn)走路搖晃、站立不穩(wěn)，排綠色稀便。剖檢可見卵泡膜充血、出血，卵泡變形、變性，輸卵管炎性病變等病理變化。P80、P100代毒接種產(chǎn)蛋鴨后，采食量無明顯下降，產(chǎn)蛋量僅表現(xiàn)一過性下降，4天后恢復(fù)正常。剖檢未見卵泡膜充血、出血，卵泡變形、變性，輸卵管炎癥等特征性病理變化，與對照鴨一致。說明P80、P100代毒已經(jīng)致弱，對產(chǎn)蛋鴨沒有致病性。選取PlOO代毒作為疫苗研制的候選毒株，命名為鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus)WF100株(簡稱DTMUV WF100株),該病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCN0.7306。2.病毒株特性(I)病毒培養(yǎng)將DTMUVWF100株病毒樣品按5%比例接種CEF細胞單層，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天觀察CPE，72 96小時后，當細胞出現(xiàn)病變達80%時收獲，置_20°C保存。傳代毒液作毒價測定。病毒含量穩(wěn)定維持在106_ 5TCID5cZml 107_°TCID5(l/ml。(2)免疫原性取20只I日齡SPF鴨隨機分成2組，每組10只，于負壓隔離器中隔離飼養(yǎng)。5日齡時，其中一組肌肉注射DTMUVWF100株細胞毒0.5ml, IO4-5TCID50/只，另一組作為對照，每只肌肉注射生理鹽水0.5ml。14日后以相同途徑和劑量進行二次免疫，自接種之日起，每天觀察記錄鴨群發(fā)病情況。二免后21天，將2組雛鴨用鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36強毒株進行攻毒，肌注0.5ml/只。攻毒后第5天，剖殺，采集每只鴨的脾臟組織，適當處理后，脾臟研磨濾液分別經(jīng)卵黃囊接種6 7日齡易感雞胚5枚，0.2ml/胚，進行病毒再分離。免疫組1/10只鴨病毒分離陰性，對照組10只鴨病毒分離陽性。以上實驗經(jīng)過2次重復(fù)，結(jié)果一致。說明WF100株毒具有良好的免疫保護性。(3)純凈性按現(xiàn)行《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011)附錄進行，0了11爪^^100株毒種無細菌、霉菌、支原體和外源病
毒污染。(4)特異性將毒種用DMEM液稀釋100倍(DTMUVWF100株毒種病毒含量為:106 0TCID50/1.0ml)，與等量抗鴨坦布蘇病毒特異性血清混合后，37°C中和I小時，接種已長成單層的CEF細胞24孔細胞培養(yǎng)板，共接種12孔，每孔0.5ml。另設(shè)病毒感染對照和正常細胞對照，各接種6孔，每孔0.5ml。將細胞培養(yǎng)板置37°C、含5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察120 144小時。中和組和正常細胞對照組未出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)(CPE)。病毒對照孔全部出現(xiàn)CPE。3.鴨坦布蘇病毒活疫苗的制備將DTMUVWF100株 接種良好細胞單層，連續(xù)觀察72 96小時，當細胞病變達80%左右時，收獲感染的細胞病毒液，加入凍干保護劑，用最適合此毒株的凍干曲線進行凍干，制備鴨坦布蘇病毒活疫苗。具體有以下制備步驟:( I)選擇鴨坦布蘇病毒W(wǎng)F100株作為疫苗生產(chǎn)用種毒；(2)選擇CEF細胞或Vero細胞或BHK21細胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料；(3)抗原的制備，可通過以下3種途徑實現(xiàn):I)選擇CEF細胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料將DTMUVWF100株生產(chǎn)用種毒用DMEM稀釋后，按5%接種到單層CEF細胞，放置于轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)；接毒后每12h觀察一次，當細胞典型病變時，繼續(xù)培養(yǎng)至72 96h，至細胞病變達到80%左右，收獲毒液，置于_20°C保存。2)選擇VeiO細胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料將DTMUVWF100株生產(chǎn)用種毒用DMEM稀釋后，接種到單層的Vero細胞上，并將細胞瓶置于轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)，接毒后每12h觀察一次,培養(yǎng)至72 96h,收獲毒液,將接毒細胞置于-20。。。3)用BHK21細胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料將DTMUVWF100株生產(chǎn)用種毒用DMEM稀釋后，接種到單層BHK細胞上，并將細胞瓶置于轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)，接毒后每12h觀察一次，培養(yǎng)至72 96h，細胞病變達到80%左右，收獲毒液，置于_20°C保存。(4)制備的抗原(收獲的病毒液)，應(yīng)按《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2010，本發(fā)明簡稱《中國獸藥典》)附錄逐瓶作無菌檢驗和外源病毒，并抽樣I份測定病毒含量(TCID5tl),應(yīng)無菌生長，無外源病毒污染，每0.1ml病毒含量應(yīng)> IO5'0TCID50O(5)疫苗制備經(jīng)無菌檢驗和病毒含量測定合格的細胞毒液與牛奶凍干保護劑按1:1配苗。配苗過程中應(yīng)使凍干保護劑和病毒液充分混勻。疫苗原液無菌定量分裝，迅速冷凍真空干燥，加蓋密封。4.鴨坦布蘇病毒活疫苗的檢驗(I)性狀:疫苗呈微黃白色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
(2)無菌檢驗:按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。(3)支原體檢驗:按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無支原體生長。(4)鑒別檢驗:將疫苗用含1%新生牛血清的維持液稀釋至I羽份/ml后再做10倍稀釋，與等量抗鴨坦布蘇病毒特異性血清混合后，37°C中和I小時，接種已長成單層的CEF細胞24孔細胞培養(yǎng)板，共接種12孔，每孔0.5ml。同時設(shè)不中和對照組(將疫苗稀釋至I羽份/ml后再做10倍稀釋，與等量含1%新生牛血清的維持液混合)和正常細胞對照組，各接種6孔，每孔0.5ml。將細胞培養(yǎng)板置37°C、含5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察120 144小時。中和組和細胞對照組應(yīng)不出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)(CPE)，不中和對照組應(yīng)全部出現(xiàn)CPE。(5)外源病毒檢驗:按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無外源病毒污染。(6)安全檢驗:取I 2周齡SPF鴨(購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心)10只，分別頸背皮下或肌肉注射疫苗I頭份，觀察14天，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。(7)效力檢驗:將疫苗用滅菌生理鹽水稀釋至0.5ml含I羽份，肌肉接種3 7日齡健康易感鴨或SPF鴨10只，每只0.5ml,同時設(shè)對照鴨10只。一免后14日，按照同樣劑量和接種途徑對免疫鴨進行二次免疫，二免后21日每只肌肉注射lmlWFG36株強毒(約含10X104 °ELD50)o攻毒后觀察5日，剖殺，取脾臟進行病毒分離。對照組應(yīng)至少8只病毒分離陽性，免疫組應(yīng)至少7只病毒分離陰性。本發(fā)明涉及微生物的資源信息本發(fā)明人將自行分離鑒定獲得的鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FG36株(CGMCCN0.4718)，通過在CEF細胞(雞胚成纖維細胞)上經(jīng)人工連續(xù)傳代培養(yǎng)，病毒對實驗鴨的致病力顯著降低，并保持了良好的免疫原性和 遺傳穩(wěn)定性，命名為“鴨坦布蘇病毒W(wǎng)F100株”經(jīng)人工致弱的鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus)病毒株WF100株,該病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCN0.7306。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒活疫苗及其制備方法。本發(fā)明利用一株人工致弱的鴨坦布蘇病毒W(wǎng)F100株(保藏號是CGMCCN0.7306)作為生產(chǎn)病毒株，制備一種安全、有效的預(yù)防和控制鴨坦布蘇病毒病的活疫苗。相比滅活疫苗具有免疫后動物副反應(yīng)更小及可用于動物發(fā)生鴨出血性卵巢炎時的緊急免疫等優(yōu)點。實施例以下實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1免疫攻毒對比試驗疫苗A:鴨坦布蘇病毒活疫苗(WF100株)疫苗B:鴨坦布蘇病毒滅活疫苗(WFG36株)取2周齡SPF鴨30只，平均分為三組，一組、二組分別頸部皮下注射疫苗A、疫苗B各I頭份，三組為對照組不注射疫苗。14日后以相同途徑和劑量進行二次免疫，二免后14日，三個組各取5只用鴨坦布蘇病毒強毒W(wǎng)FG36株攻毒，肌注0.5ml/只；免疫后21天，將三個組各剩余的5只用鴨坦布蘇病毒強毒W(wǎng)FG36株攻毒，肌注0.5ml/只，攻毒保護結(jié)果見表。表I鴨坦布蘇病毒活疫苗(WF100株)和滅活疫苗(WFG36株)攻毒對比試驗
權(quán)利要求
1.一種鴨坦布蘇病毒活疫苗，其特征該疫苗中含有經(jīng)人工致弱的鴨坦布蘇病毒W(wǎng)FlOO株，該病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCN0.7306。
2.如權(quán)利要求1所述的一種鴨坦布蘇病毒活疫苗的制備方法，其特征是，其特征將鴨坦布蘇病毒W(wǎng)F100株接種生長良好的CEF細胞、VERO細胞和BHK21細胞中任一種細胞單層繁殖，連續(xù)觀察72 96小時，當細胞病變達80%左右時，收獲感染的細胞病毒液，加入凍干保護劑，經(jīng)真空冷凍干燥，制備成鴨坦布蘇病毒活疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述的一種鴨坦布蘇病毒活疫苗的制備方法，其特征在于其中用于鴨坦布蘇病毒W(wǎng)F100株繁殖的細胞是CEF細胞、VERO細胞和BHK21細胞中任一種細胞。
4.如權(quán)利要求1所述的一種鴨坦布蘇病毒活疫苗的應(yīng)用，其特征在于給鴨接種有效劑量的一種鴨坦布蘇病 毒活疫苗能使接種鴨獲得對鴨坦布蘇病毒產(chǎn)生有效預(yù)防的免疫力。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒活疫苗及其制備方法。本發(fā)明利用一株人工致弱的鴨坦布蘇病毒W(wǎng)F100株(保藏號是CGMCCNo.7306)作為生產(chǎn)病毒株，制備一種安全、有效的預(yù)防和控制鴨坦布蘇病毒病的活疫苗。相比滅活疫苗具有免疫后動物副反應(yīng)更小及可用于動物發(fā)生鴨出血性卵巢炎時的緊急免疫等優(yōu)點。
文檔編號C12N7/00GK103143008SQ20131007196
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者鮑海忠, 王蕾, 徐龍濤, 張青嬋, 李曉靜, 彭建云, 張中波, 陳茹, 薛原, 鞏志宏 申請人:齊魯動物保健品有限公司