專利名稱：穩定轉化家蠶細胞株滴定BmNPV法及報告基因構建法的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術中利用基因工程方法構建穩定轉化細胞株并測定病毒滴度的技術領域。
背景技術：
昆蟲桿狀病毒載體表達系統表達的蛋白質產物具有類似于哺乳動物細胞一樣的翻譯后修飾和加工作用，因而該表達系統得到普遍應用。然而，利用桿狀病毒能否高效穩定地表達目的蛋白與接種的病毒滴度有很大關系。傳統的方法是利用空斑法測定病毒滴度。后來，又相繼發展出終點稀釋法測定病毒滴度和基于特異抗體的滴度測定法。這些方法通常要求操作者具有相當程度的專業知識和熟練的細胞培養操作技術，并且需要通過顯微鏡觀察空斑或者細胞病變情況；或者，購買昂貴的特異抗體檢測試劑盒。以BmNPV病毒為載體的家蠶桿狀病毒表達系統不僅可以家蠶培養細胞作為宿主，而且還可以家蠶幼蟲和蛹作為生物反應器大量表達目的蛋白，即家蠶生物反應器。相對于AcMNPV病毒細胞培養系統而言,家蠶生物反應器因家蠶幼蟲易于飼養、技術成熟、成本低和可規模化而更有產業化的前景。但目前家蠶BmNPV病毒仍然主要采用經典的空斑法或者終點稀釋法測定滴度，尚未有改良的快速測定方法。通常采用這兩種方法滴定病毒時，通過相差顯微鏡肉眼觀察病毒感染細胞形成的空斑或者病變效應來判斷病毒的感染情況，從接種病毒到觀察到明顯的空斑或者細胞病變現象約需6-7天，因而比較耗時。另外，肉眼通過相差顯微鏡觀察細胞的空斑或者病變效應時，需要仔細觀察細胞的形態變化來判斷細胞是否被感染。尤其是對于無多角體的低滴度重組病毒來說，產生的細胞病變效應不易判斷。故，這種觀察比較費力，且不易。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種利用多角體基因啟動子驅動報告基因穩定轉化的家蠶細胞株作為宿主測定BmNPV滴度。這種方法便于肉眼通過普通熒光顯微鏡直接觀察，無需借助昂貴的特定儀器，可在接種病毒后3 4天內測定病毒滴度，從而實現BmNPV病毒滴度的快速測定。為了解決上述技術問題，本發明提供一種報告基因轉化載體的構建方法，包括如下步驟:1)、構建報告基因轉移載體；2)、PCR合成含多角體啟動子及多聚腺苷酸加尾序列的報告基因表達盒；以報告基因轉移載體為模板，擴增上游為多角體啟動子(Polyhedrin Promoter,Ppolh)下游為多聚腺苷酸加尾序列(PolyA)的報告基因表達盒；3)、獲得報告基因轉化載體:通過雙酶切轉化載體pIZT/V5-His制備0pIE2啟動子(0pIE2 promoter)和0pIE2多聚腺苷酸加尾序列(0pIE2 polyadenylation sequence)兩個元件之外的轉化載體；在丁4DNA連接酶的作用下，將步驟2)所得的報告基因表達盒PCR產物經同樣雙酶切后連接到所述轉化載體中，篩選鑒定克隆有報告基因表達盒的重組轉化載體。作為本發明的報告基因轉化載體的構建方法的改進:報告基因為紅色熒光蛋白基因(DsRed)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)。作為本發明的報告基因轉化載體的構建方法的進一步改進:步驟I)為:將報告基因的PCR產物用BamHI和EcoRI雙酶切后，通過T4 DNA連接酶連接至同樣經BamHI和EcoRI雙酶切的pBacPAK8轉移載體上，所得的重組質粒為報告基因轉移載體。本發明還同時提供了一種報告基因穩定轉化家蠶細胞的篩選方法，包括如下步驟:I)、將作為報告基因轉化載體的重組質粒轉染家蠶BmN細胞；2)、穩定轉化細胞株的篩選:按照培養基中博來霉素(Zeocin)終濃度為300 μ g/mL的條件進行培養篩選，符合穩定發出綠色熒光條件的為報告基因穩定轉化的家蠶細胞，簡稱家蠶穩轉細胞；最終篩選獲得比例達99%的家蠶穩轉細胞即為該報告基因的穩定轉化細胞系。本發明還同時提供了一種利用報告基因穩定轉化家蠶細胞株測定家蠶BmNPV病毒滴度的方法，包括如下步驟:I)、細胞培養:將家蠶穩轉細胞進行培養；2)、病毒樣品的制備:將待測BmNPV樣品進行10倍系列的梯度稀釋；3)、病毒接種:在步驟I)所得的家蠶穩轉細胞中加入步驟2)所得的梯度稀釋后的病毒樣品進行培養，每個稀釋度設置若干個重復；4)、統計細胞感染率:根據步驟3)所得的病毒接種后家蠶穩轉細胞被BmNPV感染的情況；統計每個稀釋度的陽性孔數和陰性孔數；5)、計算病毒滴度:根據各稀釋度的陽性孔數和陰性孔數，按Reed-Muench法計算該病毒的TCID5tl值。具體而言，本發明首先構建報告基因轉移載體，以此載體為模板，擴增上游為多角體啟動子(Polyhedrin Promoter, Pptjlh)下游為多聚腺苷酸加尾序列(PolyA)的報告基因表達盒；再通過雙酶切轉化載體pIZT/V5-His制備0pIE2啟動子(0pIE2 promoter)和0pIE2多聚腺苷酸加尾序列(0pIE2 polyadenylation sequence)兩個元件之外的載體大片段；在T4 DNA連接酶的作用下，將報告基因表達盒連接到轉化載體中，篩選鑒定克隆有報告基因表達盒的重組轉化載體。本發明還提供了 報告基因穩定轉化家蠶細胞株的篩選方法。本發明還提供了報告基因穩定轉化家蠶細胞株測定家蠶BmNPV病毒滴度的方法。本發明的技術原理是利用桿狀病毒極晚期基因啟動子驅動報告基因表達來指示病毒的感染。桿狀病毒基因的表達是一種級聯調控模式，即早期基因先表達，然后晚期基因表達，最后極晚期基因表達，先表達的基因調控后表達的基因。通常，極晚期基因的表達可以表明病毒復制周期的完成。故，極晚期基因啟動子驅動的報告基因表達可以指示病毒的感染。對于基因組整合有極晚期基因啟動子驅動的報告基因表達盒的細胞來說，一旦受到病毒的感染就會表達報告基因，通過檢測報告基因的表達產物就可以知道細胞受到病毒感染。本發明的技術優勢在于紅色熒光易于觀察，且耗時短。綜上所述，本發明涉及一種報告基因穩定轉化家蠶細胞株的篩選和滴定BmNPV方法。本發明構建了一種報告基因轉化載體，轉染家蠶細胞，經篩選獲得報告基因穩定轉化的家蠶細胞株。所述細胞 株可應用于滴定BmNPV。本發明所述的滴定方法能快速測定BmNPV病毒滴度，成本低，操作方便，測定結果準確。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1為DsRed紅色熒光蛋白基因的克隆圖；Ml:DL2000,1 =DsRed 的 PCR 產物。圖2為重組轉移載體pBacPAK8_DsRed的構建圖；Ml:DL2000,1 =DsRed 的 PCR 產物，2:pBacPAK8_DsRed 質粒 BamHI 和 EcoRI 雙酶切產物，M2:DL15000o圖3為Ppolh-DsRed-PolyA表達盒的合成圖；Ml:DL2, 000 ； I =Ppolh-DsRed-PolyA 的 PCR 產物。圖4為pIZT-DsRed的構建圖；M3:GeneRuler DNA Ladder Mix ；I: pIZT-DsRed PCR產物；2: pIZT-DsRed PstI酶切產物;3: pIZT-DsRed BamHI酶切產物。圖5是穩定轉化家蠶細胞株BmN-RFP的篩選圖；A:pIZT_DsRed 轉染 BmN48 小時后；B:Zeocin 篩選 I 個月后；C:Zeocin 篩選 3 個月后。
具體實施例方式實施例1.紅色熒光蛋白(DsRed)轉移載體pBacPAK8_DsRed的構建本發明中報告基因僅以紅色熒光蛋白基因(DsRed)為例，但不限于此，可以是其他的報告基因，如LacZ等等。(I) PCR克隆紅色熒光蛋白基因(DsRed)根據紅色突光蛋白基因(DsRed)完整的ORF序列(Clontech公司pDsRed-Monomer載體)設計正向引物(Fl:5’-ACGGGATCCATGGACAACACCGAGGA-3’)和反向引物(Rl:5’-GGGAATTCCTACTGGGAGCCGGAGTG-3’ )。以pDsRed-Monomer (Clontech公司)載體質粒為模板，擴增目的片段。PCR反應體系如下:
權利要求
1.報告基因轉化載體的構建方法，其特征是包括如下步驟: 1)、構建報告基因轉移載體； 2)、PCR合成含多角體啟動子及多聚腺苷酸加尾序列的報告基因表達盒； 以報告基因轉移載體為模板，擴增上游為多角體啟動子(Polyhedrin Promoter, Ppolh)下游為多聚腺苷酸加尾序列(PolyA)的報告基因表達盒； 3)、獲得報告基因轉化載體: 通過雙酶切轉化載體pIZT/V5-His制備0pIE2啟動子(0pIE2 promoter)和0pIE2多聚腺苷酸加尾序列(0pIE2 polyadenylation sequence)兩個元件之外的轉化載體；在T4DNA連接酶的作用下，將步驟2)所得的報告基因表達盒PCR產物經同樣雙酶切后連接到所述轉化載體中，篩選鑒定克隆有報告基因表達盒的重組轉化載體。
2.根據權利要求1所述的報告基因轉化載體的構建方法，其特征是: 所述報告基因為紅色熒光蛋白基因(DsRed)、β -半乳糖苷酶基因(LacZ)。
3.根據權利要求1或2所述的報告基因轉化載體的構建方法，其特征是: 所述步驟I)為: 將報告基因的PCR產物用BamHI和EcoRI雙酶切后，通過T4 DNA連接酶連接至同樣經BamHI和EcoRI雙酶切的pBacPAK8轉移載體上，所得的重組質粒為報告基因轉移載體。
4.報告基因穩定轉化家蠶細胞的篩選方法，其特征是包括如下步驟: 1)、將作為報告基因轉化載體的重組質粒轉染家蠶BmN細胞； 2)、穩定轉化細胞株的篩選: 按照培養基中博來霉素(Zeocin)終濃度為300 μ g/mL的條件進行培養篩選,符合穩定發出綠色熒光條件的為報告基因穩定轉化的家蠶細胞，簡稱家蠶穩轉細胞；最終篩選獲得比例達99%的家蠶穩轉細胞即為該報告基因的穩定轉化細胞系。
5.利用報告基因穩定轉化家蠶細胞株測定家蠶BmNPV病毒滴度的方法，其特征是包括如下步驟: 1)、細胞培養: 將家蠶穩轉細胞進行培養； 2)、病毒樣品的制備: 將待測BmNPV樣品進行10倍系列的梯度稀釋； 3)、病毒接種: 在步驟I)所得的家蠶穩轉細胞中加入步驟2)所得的梯度稀釋后的病毒樣品進行培養，每個稀釋度設置若干個重復； 4)、統計細胞感染率: 根據步驟3)所得的病毒接種后家蠶穩轉細胞被BmNPV感染的情況；統計每個稀釋度的陽性孔數和陰性孔數； 5)、計算病毒滴度: 根據各稀釋度的陽性孔數和陰性孔數，按Reed-Muench法計算該病毒的TCID5tl值。
全文摘要
本發明公開了一種報告基因轉化載體的構建方法，包括構建報告基因轉移載體；PCR合成含多角體啟動子及多聚腺苷酸加尾序列的報告基因表達盒；獲得報告基因轉化載體。本發明還同時公開了一種利用報告基因穩定轉化家蠶細胞株測定家蠶BmNPV病毒滴度的方法，包括如下步驟1)細胞培養；2)病毒樣品的制備；3)病毒接種在步驟1)所得的家蠶穩轉細胞中加入步驟2)所得的梯度稀釋后的病毒樣品進行培養；4)統計細胞感染率；5)計算病毒滴度。本發明的方法便于肉眼通過普通熒光顯微鏡直接觀察，無需借助昂貴的特定儀器，可在接種病毒后3~4天內測定病毒滴度，從而實現BmNPV病毒滴度的快速測定。
文檔編號C12Q1/02GK103114101SQ20131007084
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者陳健, 陳琴, 陳和, 于威, 張耀洲 申請人:浙江理工大學