一種產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因與應用的制作方法

一種產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因與應用。該脂肪酸合酶由RtFAS1亞基和RtFAS2亞基組成，所述RtFAS1亞基是如下(a)或(b)的蛋白質：(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將SEQ?ID?NO：1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基1功能的由SEQ?ID?NO：1所衍生的蛋白質；所述RtFAS2亞基是如下(c)或(d)的蛋白質：(c)由SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)將SEQ?ID?NO：2的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基2功能的由SEQ?ID?NO：2所衍生的蛋白質。
【專利說明】一種產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種產油酵母脂肪酸合酶及其基因與應用。具體地，所述產油酵母脂肪酸合酶以及編碼其的核苷酸來源于圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)。本發明還提供一種構建油脂生產重組細胞的方法。
【背景技術】
[0002]油脂是一種氧含量低、能量密度高、碳鏈長度適中的可再生資源，可以代替化石資源作為化學工業和可再生能源產業的基本加工原料，是人類從碳氫經濟向碳氫氧經濟過渡的重要鏈接，其市場潛力巨大。自然界中一部分微生物在特定條件下(如氮源缺乏)能在胞內貯存超過其細胞干重20%的油脂，其中以甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)為主，具有這種表型的微生物稱為產油微生物，包括細菌、酵母、霉菌、藻類等，其中產油酵母包括Rhodotorula, Candida, Cryptococcus, Rhizopus, Trichosporon 和 Yarrowia 屬中的某些菌株[Ratledge C,ffynn J P.Adv Appl Microb1l 2002,51,1-51]。利用微生物轉化生物質資源生產油脂，可發展成基本不依賴耕地、可連續生產、降低農業污染、資源綜合利用的新技術，形成化學品的石化資源替代品生產新途徑[趙宗保.中國生物工程雜志2005，25 (2)，8-11]。
[0003]半個世紀以來，國內外微生物油脂研究的重點集中在菌株篩選、馴化和發酵工藝優化等領域，取得了重大進展。隨著生物技術的快速發展，單純的菌種篩選和培養工藝的優化已不能滿足產油微生物性狀改良的需要。做為某一化學品的天然生產菌株，其特定的生產性能往往并非最優。如何優化或改變工業菌株的代謝網絡和表達調控網絡，以提高生物基產品的積累速度或定向控制靶產品的質量，是當今生物【技術領域】研究的熱點和難點。油脂發酵研究需要油脂代謝途徑的重構和強化，賦予重組菌株生產新型脂肪酸衍生物的性能。由于優良土著生產菌株的遺傳背景目前仍不清楚，油脂積累代謝調控相關基因克隆有限，尋找更多的油脂積累代謝調控相關基因，是目前微生物油脂研究的重要方向之一。
[0004]研究人員發現，來源于產油微生物(圓紅冬孢酵母和斯氏油脂酵母)的異檸檬酸脫氫酶(IDH)和蘋果酸酶(ME)的編碼基因在土著菌油脂積累過程中有表達差異，釀酒酵母功能互補分析也證明這些基因可增加重組菌株的油脂含量，但并沒能將一個非產油菌株成功改造成一個產油菌株[Yang F, Zhang SF, Zhou YJ, Zhu Zff, Lin XP, Zhao ZK.Appl.Microb1l.B1technol.2012,94(4)，1095-1105]。實驗結果暗示，微生物油脂積累代謝調控可能涉及更多的基因及其間的相互調節和相互作用。
[0005]從乙酰CoA和丙二酸單酰CoA從頭合成短鏈和中長鏈飽和脂肪酸，需要一系列的克萊森縮合反應并脫羧，是由幾種酶活介導催化的復雜過程。在大多數細菌和植物中，這些酶活性是由離散的單功能多肽組成的酶系來完成(脂肪酸合酶類型II);而在哺乳動物和真菌中，這些酶活性則由一個或兩個多功能多肽組成的寡聚酶來行使(脂肪酸合酶類型I)。在脂肪酸合成過程中，底物和中間產物分子在各個功能結構域(可以位于同一酶分子，也可以位于不同酶分子)中傳遞直到完成脂肪酸的整個合成過程[stoops JK,Arslanian MJ, Oh YH, Aune KC, Vanaman TC, Wakil SJ.Proc Natl Acad Sci USA.1975,72(5)，1940-1944]。
[0006]哺乳動物中的脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase, FAS)是一個同源二聚體,含有兩個相同的多功能亞基(亞基分子量為272kDa)，每一個亞基的N端區域含有三個催化結構域:酮酯-酸基 ACP 合酶(ketoacyl synthase, KS)、單酸 / 乙酸轉移酶(acyltransferase,AT)和脫水酶(dehydratase, DH), C端區域則含有四個結構域:烯酰ACP還原酶(enoylreductase, ER)、酮脂酸還原酶(ketoacyl reductase, KR)、酸基載體蛋白(acyl carrierprotein, ACP)和硫酯酶(th1esterase, TE);這兩個區域被中間600個氨基酸殘基組成的核心區域所分隔。在子囊菌門酵母中，ACP和其它6個酶活性結構域分別定位于兩個不同亞基上，其一具有ACP、KR、KS和磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(phosphopantetheinyltransferase, PPT)結構域，另一亞基則含有AT、ER、DH和丙二酰/棕櫚酰轉移酶(malonyl/palmitoyl transferase, MPT)結構域。
[0007]最近,我們在圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)中發現一種新穎的脂肪酸合酶，該酶與別的真菌中存在的脂肪酸合酶的不同在于，其beta亞基(FASl)只含有AT(單酰/乙酰轉移酶)結構域和ER(烯酰ACP還原酶)結構域，而其余的結構域均在alpha亞基(FAS2)上；同時，該脂肪酸合酶上存在兩個前后串聯的ACP結構域。截止專利提交日，NCBI上未檢索到關于圓紅冬孢酵母(R.toruloides)脂肪酸合酶的任何序列信息。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因與應用。
[0009]本發明提供的產油酵母脂肪酸合酶，名稱縮寫為RtFAS(R.toruloides FattyAcid Synthase),來源于 圓紅冬孢酵母(R.toruloides) CGMCC 2.1389,所述產油酵母脂肪酸合酶由RtFASl亞基和RtFAS2亞基組成，其中所述RtFASl亞基是如下(a)或(b)的蛋白質:
[0010](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0011 ] (b)將SEQ ID NO:1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白質；
[0012]所述RtFAS2亞基是如下(C)或(d)的蛋白質:
[0013](c)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0014](d)將SEQ ID NO:2的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白質。
[0015]其中所述“脂肪酸合酶亞基I功能”具體是指單酰/乙酰轉移酶(AT)活性和烯酰ACP還原酶(ER)活性的加合；其中所述“脂肪酸合酶亞基2功能”具體是指脫水酶(DH)活性、丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)活性、第一酰基載體蛋白(ACP)活性、第二酰基載體蛋白(ACP)活性、酮脂酰還原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)活性的加合。
[0016]本發明還涉及產油酵母脂肪酸合酶(RtFAS)的生物活性多肽片段(在本文中，也稱為結構域)，其氨基酸序列為選自如下片段中的任何一個或者任意兩個或更多個片段的組合:[0017]SEQ ID NO:1的位置190-599 (其具有單酰/乙酰轉移酶(AT)活性)，
[0018]SEQ ID NO:1的位置611-1142 (其具有烯酰ACP還原酶(ER)活性)，
[0019]SEQ ID NO:2的位置60-490 (其具有脫水酶(DH)活性)，
[0020]SEQ ID NO: 2的位置493-885 (其具有丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)活性)，
[0021]SEQ ID NO:2的位置1021-1186 (其具有第一酰基載體蛋白(ACP)活性)，
[0022]SEQ ID NO:2的位置1212-1378 (其具有第二酰基載體蛋白(ACP)活性)，
[0023]SEQ ID NO:2的位置1725-1983 (其具有酮脂酰還原酶(KR)活性)，
[0024]SEQ ID NO: 2的位置2066-2716 (其具有酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性)，和
[0025]SEQ ID NO: 2的位置2815-2926 (其具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)活性)。
[0026]所述的RtFAS的生物活性多肽片段(結構域)，其生物活性選自單酰/乙酰轉移酶(AT)活性、烯酰ACP還原酶(ER)活性、脫水酶(DH)活性、丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)活性、第一酰基載體蛋白(ACP)活性、第二酰基載體蛋白(ACP)活性、酮脂酰還原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)活性中的任一種或者任兩種或更多種的組合。
[0027]在基因工程生 產該脂肪酸合酶用于體外合成脂肪酸及其衍生物方面，為了使所述的RtFASl亞基和(/或)RtFAS2亞基分泌到細胞周質或培養基中或使其功能穩定，可在所述RtFASl亞基和(/或)RtFAS2亞基的氨基端連接上信號肽序列；為了使RtFAS蛋白或其亞基或其生物活性多肽片段(結構域)便于純化，可在RtFASl亞基或RtFAS2亞基或其生物活性多肽片段(結構域)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽或GST標簽(谷胱甘肽S-轉移酶標簽)。
[0028]表1標簽及其序列
[0029]
S I氨基酸殘基個數~[Fm
Poly-Arg~ 5-6 (通常為 5 個)RRRRR
FLAG8DYKDDDDK
[0030]
Poly-His|2-10(通常為 6 個)lHHHHHH
C-myc10EQKLISEEDL
Strep-tag II~8WSHPQFEK
Poly-PheTlFFFFFFFFFFF
[0031]上述加標簽重組RtFAS蛋白或其生物活性多肽片段(結構域)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行常規蛋白質表達得到。上述加標簽重組RtFAS蛋白或其生物活性多肽片段(結構域)的編碼基因可能通過將SEQ ID NOs:3-13任何一項所示的DNA序列中缺失I個或幾個編碼氨基酸的密碼子，和/或進行I個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5’端和3’端連上表1所示的標簽的編碼序列而獲得。[0032]所述產油酵母脂肪酸合酶兩個亞基RtFASl和RtFAS2的編碼核苷酸序列(例如，rtfasl和rtfas2)也屬于本發明的保護范圍。
[0033]因此，本發明還提供一種編碼本發明的產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
[0034]優選地，所述RtFAS蛋白的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的DNA分子。
[0035]此外，所述RtFAS的生物活性多肽片段(結構域)的編碼核苷酸序列也屬于本發明的保護范圍。
[0036]優選地，所述RtFAS的生物活性多肽片段(結構域)的編碼核苷酸序列為SEQ IDNOs:5-13所示的DNA分子。
[0037]并且，含有本發明所述的核苷酸序列的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌株均屬于本發明的保護范圍。
[0038]因此，本發明還提供包含編碼本發明的產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列的表達盒或重組載體，優選是重組表達載體；提供導入了(例如，通過轉化或轉染技術導入)所述重組載體的重組細胞。
[0039]本領域技術人員應該理解，將編碼產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列或包含編碼產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列的重組載體導入宿主細胞可以按照本領域的常規技術進行，例如，可以通過轉化、轉染(例如，農桿菌介導的轉染)或電穿孔等常規技術進行。 [0040]可用現有的擔子菌表達載體和釀酒酵母表達載體構建含有所述編碼核苷酸序列(例如，rtfasl和/或rtfas2，RtFAS生物活性多肽片段(結構域)編碼核苷酸序列)的重組表達載體。
[0041]所述的擔子菌表達載體包括根瘤農桿菌介導的基因重組載體和可用于擔子菌微彈轟擊的載體等。所述的擔子菌表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可以引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、圓紅冬孢酵母基因(如R.toruloides的G3PDH基因)3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。所述的釀酒酵母表達載體包括釀酒酵母游離型表達載體(攜帶2μπι復制子或自主復制序列(ARS)，如pYX212、pYES2C/T等可自行購買的現有通用載體)和整合型表達載體(攜帶整合位點基因重組臂)。
[0042]使用rtfasl和/或rtfas2或RtFAS生物活性多肽片段(結構域)編碼核苷酸序列構建重組酵母表達載體時，在其起始核苷酸前可以加上任何一種誘導型啟動子或組成型啟動子，如三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子PG3TOH、半乳糖誘導啟動子pGallO，啟動子可單獨使用或與其它啟動子結合使用。
[0043]本領域技術人員應該理解，為了便于編碼本發明的產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列在宿主細胞中的表達，取決于所選用的宿主細胞品系，可以適當地對所述核苷酸序列進行密碼子優化；為了便于對轉基因細胞系或重組菌株進行鑒定及篩選，可對所用載體進行修飾，如引入可以在酵母細胞中表達的編碼產生顏色變化的酶(如綠色熒光蛋白)或發光化合物的基因(如GUS基因、突光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記基因(如卡那霉素標記基因、博萊霉素標記基因、潮霉素標記基因)或抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)、以及營養篩選標記基因(如LEU2、URA3)等；為了便于純化，可以在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端連接純化標簽的編碼序列。
[0044]本發明的另一個目的是提供一種構建油脂生產重組細胞的方法，所述方法包括將編碼本發明的產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列或其活性片段導入宿主細胞中，得到油脂生產重組細胞，或者將包含編碼本發明的產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列或其活性片段的表達盒或重組表達載體導入宿主細胞中，得到油脂生產重組細胞。其中所述宿主細胞優選酵母細胞。
[0045]利用任何一種可以啟動外源基因在釀酒酵母中表達的載體，將本發明所提供的rtfasl和/或rtfas2或RtFAS生物活性多肽片段(結構域)編碼核苷酸序列導入酵母細胞中，得到油脂生產重組酵母細胞。在一個優選的實施方案中，利用任何一種可以啟動外源基因在圓紅冬孢酵母中表達的載體，增加本發明所提供的rtfasl和/或rtfas2或RtFAS生物活性多肽片段(結構域)編碼核苷酸序列的拷貝數，得到重組圓紅冬孢酵母。
[0046]實驗證明，本發明提供的產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因可顯著提高重組細胞的油脂含量。
[0047]綜上所述，本發明提供下述:
[0048]1.一種產油酵母脂肪酸合酶，其由RtFASl亞基和RtFAS2亞基組成，其中所述RtFASl亞基是如下(a)或(b)的蛋白質:
[0049](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0050](b)將SEQ ID NO:1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白質；
[0051]所述RtFAS2亞基是如下(C)或(d)的蛋白質:
[0052](c)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0053](d)將SEQ ID NO:2的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白質。
[0054]2.根據第I項所述的產油酵母脂肪酸合酶，其中所述RtFASl亞基的氨基酸序列為SEQ ID N0:1，所述RtFAS2亞基的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
[0055]3.一種來源于第I項所述的產油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或結構域，所述多肽片段或結構域的氨基酸序列為選自如下片段中的任意一個或者任意兩個或更多個片段的組合:
[0056]SEQ ID NO:1 的位置 190-599，
[0057]SEQ ID NO:1 的位置 611-1142，
[0058]SEQ ID NO:2 的位置 60-490，
[0059]SEQ ID NO:2 的位置 493-885，
[0060]SEQ ID NO:2 的位置 1021-1186，
[0061]SEQ ID NO:2 的位置 1212-1378，
[0062]SEQ ID NO:2 的位置 1725-1983，
[0063]SEQ ID NO:2 的位置 2066-2716，和
[0064]SEQ ID NO:2 的位置 2815-2926。
[0065]4.根據第3項所述的產油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或結構域，其生物活性選自單酰/乙酰轉移酶(AT)活性、烯酰ACP還原酶(ER)活性、脫水酶(DH)活性、丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)活性、第一酰基載體蛋白(ACP)活性、第二酰基載體蛋白(ACP)活性、酮脂酰還原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)活性中的任一種或者任兩種或更多種的組合。
[0066]5.編碼第I項所述的產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
[0067]6.根據第5項所述的核苷酸序列，其中編碼所述產油酵母脂肪酸合酶的RtFASl亞基的核苷酸序列為SEQ ID NO:3 ;編碼所述產油酵母脂肪酸合酶的RtFAS2亞基的核苷酸序列為 SEQ ID NO:4o
[0068]7.編碼第3項所述的產油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或結構域的核苷酸序列，其選自如下核苷酸序列中的任意一個或者任意兩個或更多個序列的組合:
[0069](a)如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，其編碼RtFASl亞基的AT結構域；
[0070](b)如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，其編碼RtFASl亞基的ER結構域；
[0071](c)如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的DH結構域；
[0072](d)如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的MPT結構域；
[0073](e)如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的第一 ACP結構域；
[0074](f)如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的第二 ACP結構域；
[0075](g)如SEQ ID NO : 11所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的KR結構域；
[0076](h)如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的KS結構域；
[0077](i)如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的PPT結構域。
[0078]8.含有第5-7項中任何一項所述的核苷酸序列的表達盒或重組表達載體。
[0079]9.含有第5-7項中任何一項所述的核苷酸序列的細胞。
[0080]10.一種構建油脂生產重組細胞的方法，所述方法包括將第3-7項中任何一項所述的核苷酸序列或者第8項的表達盒或重組表達載體導入宿主細胞中，得到油脂生產重組細胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0081]圖1為RtFAS與其它特種來源FAS的結構域組成比較分析圖。
[0082]圖2 為 rtfasl 和 rtfas2 基因 RT-PCR 擴增結果，泳道 l，rtfas2 ;泳道 2 ,rtfasl。擴增條帶堿基長度分別為8.8kb和3.8kb。
[0083]圖3為構建的RtFAS原核表達質粒pACYC-RtFASl+2的圖譜。
[0084]圖4為RtFAS原核表達產物的SDS-PAGE分析。M:蛋白分子量標準；C:誘導菌體全細胞；s:誘導菌體裂解液上清；P:誘導菌體裂解液沉淀。
[0085]圖5為RtFAS的PPT結構域和ACP結構域原核表達產物Ni柱親和純化后的SDS-PAGE 分析。
[0086]圖6為PPT結構域催化酰基載體蛋白(ACP)發生4’ -磷酸泛酰巰基乙胺修飾的Tricine-SDS-PAGE分析。純化的GST-PPT可以催化GST-ACP發生4’ -磷酸泛酰巰基乙胺修飾，由于ACP被修飾后分子量增加340Dalton，通過Tricine-SDS-PAGE可以在16%聚丙烯酰胺凝膠上分離Apo-ACP和Holo-ACP。圖6A為GST-ACP1，圖6B為GST-ACP2。
[0087]圖7是RtFAS的酵母表達載體構建的模塊組裝策略示意圖。
[0088]圖8是RtFAS酵母表達質粒圖譜。【具體實施方式】
[0089]以下實施例便于更好地理解本發明，但并不限定并本明。本發明的范圍由權利要求及其等價體限定。
[0090]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑公司購買得到的。
[0091]圓紅冬孢酵母(R.toruloides)CGMCC 2.1389:購自中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，該酵母菌株源自東京大學應用微生物研究所(IF0 8766)，由IFO 0559和IFO0880經配合而成的二倍體，等同于CBS 6016或NBRC 8766或NRRL Y-6987。
[0092]圓紅冬孢酵母(R.toruloides)ATCC 10788:美國典型培養物保藏中心(ATCC)，該菌株源自 CB S-KNAff fungal b1diversity centre，等同于 IFO 0559 或 JCM 3792 或 CCRC20306 或 DBVPG 6740 或 IAM 13469 或 IGC4416 或 MUCL 30249 或 NCYC 921 或 NRRL Y-1091或 VKM Y-334 或 PYCC4416。
[0093]以下實施例中所涉及的培養基配方及用途如下:
[0094](I) YEH)培養基:酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，pH6.0,固體培養基則再加入瓊脂粉15g/L ;用于菌種活化培養、種子液制備和菌種短期保藏。
[0095](2)限氮培養基:葡萄糖 70g/L，酵母粉 0.75g/L，(NH4)2SO4 0.lg/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4.7H20 1.5g/L，pH5.6，并補加 I % (V/V)的痕量元素液體(4.0g/L CaCl2.2H20，0.55g/L FeSO4.7H20，0.52g/L citric acid.H2O, 0.lOg/L ZnSO4.7H20，0.076g/LMnSO4.H2O和100 μ I 18M H2SO4)，用于菌株油脂積累和富含油脂菌體的培養。
[0096](3)非限氮人工合成培養基(簡寫為MM):葡萄糖25g/L，(NH4) 2S045g/L,MgSO4.7H200.5g/L，KH2PO4 3g/L)，用于圓紅冬孢酵母的富營養恒化培養以及差異轉錄組學分析菌體樣品的制備。
[0097](4)限氮人工合培養基(簡稱 MM-N):葡萄糖 25g/L，(NH4)2SO4 0.2g/L, MgSO4.7Η20
0.5g/L，KH2PO4 3g/L，K2SO4 6.3g/l，用于圓紅冬孢酵母的限氮恒化培養以及差異轉錄組學分析菌體樣品的制備。
[0098]實施例1:圓紅冬孢酵母的多組學研究
[0099]圓紅冬孢酵母(R.toruloides)全基因組從頭測序:在YETO培養基中培養R.toruloides ATCC 10788，溫度為30°C，轉速200rpm，培養時間48h。收集菌體，按標準基因組DNA提取方法[精編分子生物學實驗指南(第四版)，奧斯伯等著，顏子穎等譯，科學出版社出版]制備基因組DNA，委托華大基因利用solexa測序儀進行分析，最終獲得94個基因組構架，基因組全長20.2Mb。
[0100]圓紅冬孢酵母(R.toruloides)轉錄組測序:在2L發酵罐中(初始培養基量
1.7L)，溫度為30。。，pH為5.6的條件下恒化培養R.toruloides ATCC10788，通氣速率為100L/h，溶氧保持為73%飽和(溶氧與攪拌聯動)，YEH)培養基流加速率為0.828L/h (稀釋率為0.53)(反應器工作體積為1.7L)。約10個工作體積后取樣，離心收集菌體，立即于液氮中速凍，-70°C保存，干冰低溫保存運輸至華大基因(全名:北京六合華大基因科技股份有限公司深圳分公司)。采用液氮研磨-RNAiso法提取總RNA，RNA-Seq樣品庫的制備使用 mRNA_Seq8Sample Preparat1n Kit(購自 Illumina, San Diego, CA, USA),具體步驟參考產品使用說明。之后經Illumina HiSeq2000測序得到90bp的雙末端序列。
[0101]基于R.toruloides全基因組從頭測序和轉錄組測序數據，組合基因從頭預測，共注釋了 8171個蛋白編碼基因。利用B1edit軟件建立R.toruloides本地基因組數據庫和蛋白質組數據庫。基因和蛋白命名規則如下:根據注釋基因所在scaffold(基因組構架)由大到小進行編碼，編號前統一加上R.toruloides的兩個單詞前兩個字母縮寫，轉錄本和蛋白質后分別加.tl和.tip的后綴。比如，scaffoldl上5’端起第一個編碼基因命名為RHT0_00001，對應的轉錄本為RHT0_00001.tl，相應編碼的蛋白質序列為RHT0_00001.tip。數據庫包含94個scaffold(基因組構架)，8171個編碼基因及相應8171個蛋白。
[0102]實施例2:圓紅冬孢酵母脂肪酸合酶的發現
[0103]R.toruloides ATCC 10788于YEPD固體培養基上復蘇，30°C倒置培養48h，挑單菌落接種于50ml YEPD液體培養基(裝液于250ml容量的三角瓶)，30°C，200rpm培養28h。培養液分別以1: 50 (V/V)比例轉接于自動補料的2L連續發酵罐(工作體積1.7L)，培養基分別為麗和MM-N。恒化培養溫度為30°C，pH通過滴加10.0M NaOH或2M HCl自動控制在5.6，轉速保持為600rpm，通氣速率為100L/h (約0.98VVM)，溶氧保持為85%飽和，稀釋率為0.085。約15個工作體積后取樣，樣品經4°C，8000rpm離心5min收集，每45ml培養物能收集到約0.7g濕菌體，麗和MM-N菌體樣品均立即于液氮中速凍，-70°C保存。菌體樣品用于數字基因表達譜分析，以及胞內油脂含量分析，培養上清用于殘氮分析[沈宏偉，靳國杰，胡翠敏，龔志偉，白鳳武，趙宗保.生物工程學報2012，28 (I)，57-65]。
[0104]在實施例1基礎上，菌體樣品委托華大基因提取RNA后進行R.toruloides在限氮和非限氮培養條件下的數字基因表達譜分析。樣品重復分析三次，數據分析基于三次重復分析中鑒定到的差異表達基因累加。
[0105]結果顯示，R.toruloides npll使用MM和MM-N這兩種培養基進行恒化培養時，油脂含量有顯著的差別，限氮培養(MM-N培養)條件下，細胞積累的油脂量為33.3%，比非限氮培養(MM培養)條件下提高了 22.8%0通過檢測培養液上清中氮的濃度表明非限氮條件下氮濃度為46.97mM，而限氮(MM-N)條件下，其氮的濃度已經低于檢測限，表明菌體培養時采用了一種穩定的限氮與非限氮環境。
[0106]剔除含N堿基和低質量數據后，數字基因表達譜分析得到119192 (MM-N)和92644條(MM)條差異的clean Tag。在這些clean Tag的基礎下進行了下面的分析,將Tag定位匹配到參考基因上，以獲得基因的表達量，無法定位匹配到基因上的Tag，則將其定位匹配到基因組上，最后均不能匹配的Tag則認為是未知的Tag。過濾后得到56846個MM Tag (總數3454492個)和60010個MM-N Tag (總數為3600362個)。經過歸一化處理，和統計檢驗，選取表達豐度比≥2，控制假陽性FDRS 0.001最終得到表達上調基因1176個，其中有兩個表達豐度比≥ 10 的 Tag:CATGCCGCACTCGCCGGCCCC,和 CATGCAGGACATCGAGGTCGT,分別來源于兩個核苷酸序列長度為3.8kb和8.8kb的轉錄本(R.toruloides本地轉錄組數據庫中編號為RHT0_02032.tl和RHT0_02139.tl)，分別編碼脂肪酸合酶beta亞基和alpha亞基。綜合胞內油脂分析發現，RHT0_02032.tl和RHT0_02139.tl表達量隨脂滴內油脂含量增加而增加，其編碼的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，分別命名為RtFASl (RHT0_02032.tip)和 RtFAS2(RHT0_02139.tip)。
[0107]RtFASl由1266個氨基酸殘基組成，分子量137kDa，理論等電點為6.2 ;沒有信號肽標識，為胞內酶；歸屬于酵母脂肪酸合酶[EC 2.3.1.86] ；RtFASl結構域組成和子囊酵母脂肪酸合酶相差較大，僅含單酰/乙酰轉移酶(AT)、烯酰ACP還原酶(ER)兩個結構域，而子囊酵母脂肪酸合酶還攜帶有脫水酶(DH)和丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)結構域(圖1)。
[0108]RtFAS2由2928個氨基酸殘基組成，分子量318kDa ;理論等電點為6.65 ;沒有信號肽標識，為胞內酶；歸屬于酵母脂肪酸合酶[EC 2.3.1.86] ；RtFAS2結構域組成和子囊酵母脂肪酸合酶相差較大，除含有酮脂酰還原酶(KR)、酮酯-酰基ACP合酶(KS)和磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)等典型酵母脂肪酸合酶alpha亞基的共有結構域外，還攜帶有脫水酶(DH)、丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)、以及前后串聯的第一酰基載體蛋白(ACP)和第二酰基載體蛋白(ACP)結構域，前兩個結構域在其它酵母脂肪酸合酶的beta亞基上，前后串聯的雙ACP結構域(2 X ACP)則為RtFAS2所特有的(圖1)。
[0109]將RtFASl和RtFAS2的編碼基因分別命名為rtfasl (或RHT0_02032.tl)和rtfas2 (或 RHT0_02139.tl)，rtfasl 的 mRNA 序列如 SEQ ID NO:3 所示，rtfas2 的 mRNA 序列如SEQ ID NO:4所示。
[0110]實施例3:圓紅冬孢酵母rtfasl和rtfas2基因的克隆
[0111]根據rtfasl和 tfas2的核苷酸序列設計基因特異性引物如下:
[0112]rtfasl-Fw:atgaacggccgagcgacgcggagcgtgact
[0113]rtfasl-Rv:tcagagcccgccgaagacgtcgagcttgag
[0114]rtfas2~Fw:atggtcgcggcgcaggacttgccgctcg
[0115]rtfas2-Rv:ctacttctgggcgatgacgacggcgcaagc
[0116]利用液氮研磨加RNaiso 方法[Yang F, Tan HD, Zhou YJ, Lin XP, Zhang SF.Mo 1.B1technol.2010,47(2):144-151]提取 R.toruloides CGMCC 2.1389 總 RNA。RNA 進行
1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用熒光-紫外分析儀觀察鑒定，可見清晰的兩條帶。用紫外/可見光光譜儀分析總RNA樣品，測得0D260/0D280 = 2.0，表明總RNA質量很好。總RNA樣品凍存于_80°C備用。
[0117]利用High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit(購自 Takara)合成 cDNA第一鏈。20 μ I 反應體系，首先，將2 μ I 總 RNA(~I μ g)，Oligo (dT)和Random6mer)各 ΙΟΟηΜ，2.0 μ IDEPC處理水(焦碳酸二乙酯處理水，購自大連TaKaRa公司)，加入到PCR管中混勻，于65°C保溫 5min,立即置于冰上冷卻 2min,加入酶 Mix (High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit自帶反轉錄酶，購自Takara)，DEPC處理水補齊20μ 1，42°C 30min進行反轉錄，70°C 15min滅活酶。
[0118]以反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板，進行rtfasl和rtfas2基因的PCR擴±1,5 XPCR 緩沖液(TakaRa) 10.0 μ 1，dNTPs(10mM, TaKaRa) 1.0 μ 1，引物 rtf as 1-Fw (/rtfas2-Fw)(50mM)和 rtfasl-Rv(/rtfas2_Rv)(50mM)各 1.0 μ I, PrimeSTar (大連TakaRa) 0.5 μ 1，合成的cDNA第一鏈模板1.0 μ LddH2O補齊至50 μ 1，于94°C保溫3min,然后于98°C 10s, 68°C 5min (用于擴增rtfasl)或9min (用于擴增rtfas2), 30個循環,之后再加入Taq DNA聚合酶(TakaRa) 1.0 μ I進行擴增產物的3’末端加A，72°C 20min，4°C結束反應。擴增產物進行0.8% (質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到3.8kb (rtfasl)和8.8kb(rtfas2)左右的兩條預期大小的條帶(圖2)，利用DNA回收試劑盒(購自北京舟鼎國，貨號:NEP013-2)，按照供應商建議步驟(NEP013-2說明書)純化PCR產物。PCR產物參照TaKaRa公司提供的方法(D102A說明書)克隆到pMD19_T載體，轉化入E.coli DH5 α感受態細胞，挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取(碧云天質粒小量提取試劑盒，貨號:D0003)。重組質粒樣品送至TaKaRa公司測序，測序結果表明，所擴增到的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，分別編碼氨基酸序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的蛋白質。將SEQ ID NO:1所示的蛋白命名為RtFASl，將克隆得到的SEQ ID NO:3所示的核苷酸命名為rtfasl ^fSEQ ID NO:2所示的蛋白命名為RtFAS2，將克隆得到的SEQ ID NO:4所示的核苷酸命名為rtfas2。陽性重組質粒分別命名為pMD19T-RtFASl和pMD19T_RtFAS2。
[0119]RtFASl結構域組成和子囊酵母脂肪酸合酶beta亞基相差較大，僅含AT和ER兩個結構域，而子囊酵母脂肪酸合酶還攜帶有DH和MPT結構域(圖1)。RtFAS2的結構域組成和子囊酵母脂肪酸合酶alpha亞基相差較大，除含KR)、KS和PPT等典型酵母脂肪酸合酶alpha亞基的共有結構域外，還攜帶有DH、MPT、以及前后串聯的第一酰基載體蛋白(ACP)和第二酰基載體蛋白(ACP)結構域，這種前后串聯的雙ACP結構域(2XACP)為RtFAS2所特有的(圖1)。
[0120]實施例4:圓紅冬孢酵母脂肪酸合酶的原核表達、蛋白純化以及重組菌株產油性能分析
[0121]根據rtfasl核苷酸序列設計加相應酶切位點的引物(引物rtfasl-Nco1-F的下劃線部分為NcoI酶切位點，引物rtfasl-Hindlll-R的下劃線部分為HindIII酶切位點)，序列如下:
[0122]rtfasl-Nco1-F:ctctccat￡gatgaacggccgagcgacgcggagcgt
[0123]rtfas1-HindII1-R:tctaagctttcagagcccgccgaagacgtcgagct [0124]根據rtfas2核苷酸序列設計加相應酶切位點的引物(引物rtfas2-NdeI_F的下劃線部分為NdeI酶切位點，引物rtfas2-AvrI1-R的下劃線部分為AvrII酶切位點)，序列如下:
[0125]rtfas2_NdeI_F:ctctcatat￡gtcgcggcgcaggacttgccgct
[0126]rtfas2-AvrI1-R:tctcctaggctacttctgggcgatgacgacggcgc
[0127]以先前構建的克隆載體pMD19T-RtFASl和pMD19T_RtFAS2為模板，利用兩對引物rtfas1-Nco1-F/rtfas1-HindII1-R 和 rtfas2-Nde1-F/rtfas2-AvrI1-R 分別擴增 rtfasl和rtfas2編碼區序列。rtfasl的PCR擴增產物經Ncol/Hindlll雙酶切，連入同樣雙酶切的pACY⑶uet-l (雙表達載體,購自Novagen)載體(回收酶切大片段用于連接)，轉化E.coli DH5a化學感受態細胞，經Ncol/Hindlll雙酶切和測序驗證正確的重組質粒命名為pACYC-RtFASl。Rtfas2 的 PCR 擴增產物經 Ndel/Avrll 雙酶切，連入同樣 Ndel/Avrll 雙酶切的已構建的pACYC-RtFASl載體(回收酶切大片段用于連接)，轉化E.coliDH5a化學感受態細胞，經Ncol/Hindlll和Ndel/Avrll酶切和測序雙重驗證正確的重組質粒命名為pACYC-RtFASl+2。(圖 3)。
[0128]將pACYC-RtFASl+2 質粒轉化 E.coli B121 (DE3)宿主，得到表達菌株 BL21/pACYC-RtFASl+2。挑單菌落接種于1ml Chl-LB培養基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l，并含氯霉素30 μ g/ml)，37 V培養4_6h至OD600nm為0.6-0.8，加入終濃度為0.1mMIPTG進行誘導，30°C培養過夜。誘導表達結束后，取1ml菌液，于4°C，8000rpm離心5min收集菌體，菌體沉淀用 200 μ I NBP 緩沖液(50mM Na2HP04/NaH2P04,pH = 8.0,0.5M NaCl,20mM咪唑，ImM beta-巰基乙醇，ImM PMSF)中，利用超聲破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，超細探頭，功率為60W，脈沖2s，間歇2s，總時間lmin)，至菌液變澄清；16000Xg，4°C離心10min，取上清為可溶性蛋白部分，利用等體積的裂解緩沖液重懸沉淀；利用SDS-PAGE分析蛋白的表達情況(10%丙烯酰胺凝膠)。結果如圖4所示，0.1mM IPTG誘導條件下，重組RtFAS的兩個亞基RtFASl和RtFAS2幾乎完全可溶表達，重組RtFASl的分子量大約為138kDa (RtFASl理論分子量為137kDa，加標簽(Str印-tag II)后融合蛋白分子量為138kDa);重組RtFAS2的分子量大約為319kDa(RtFAS2理論分子量為318kDa，加標簽(6XHis)后融合蛋白分子量為 319kDa)。
[0129]重組RtFAS2亞基攜帶6XHis Tag，由于RtFAS2和RtFASl亞基間的蛋白相互作用，可利用鎳親和層析一步純化重組RtFAS2和重組RtFASl兩個亞基。蛋白純化過程按照Invitrogen N1-NTA purificat1n system指導說明進行，以鎳離子做為親和離子，依靠咪唑濃度梯度(30-100mM咪唑)洗脫目的蛋白。BL21/pACYC-RtFASl+2進行100ml體積誘導表達(100mlChl-LB培養基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，并含氯霉素3(^8/!111)，371:培養4-611至00為0.5-0.8，加入終濃度為ImM IPTG進行誘導，30°C培養過夜)，離心收集菌體,加入 50ml NBP 緩沖液(50mMNa2HP04/NaH2P04，pH = 8.0,0.5M NaCl,20mM咪唑，ImM beta-巰基乙醇，ImM PMSF)中，超聲破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，功率為60W，脈沖2s，間歇3s，總時間30min)，至菌液變澄清;16000 X g，4。。離心10min，取上清可溶性蛋白，利用0.22 μ m低蛋白結合的濾膜過濾后，上樣至鎳親和層析柱(體積1ml)，靜置結合15min，然后依次用20倍柱體積的含20mM、40mM、60mM和80mM咪唑的洗滌緩沖液(50mMNa2HP04/NaH2P04, pH = 8.0,0.5M NaCl, ImM beta-巰基乙醇，相應濃度的咪唑)依次洗滌，最后用含 250mM 咪唑的洗脫緩沖液(50mMNa2HP04/NaH2P04，pH = 8.0,0.5M NaCl, ImMbeta-巰基乙醇，250mM咪唑)洗脫目的蛋白。所有純化操作均在4°C進行，并保證預冷所有的相關緩沖液。純化得到的蛋白保存于20%甘油中，分裝后在-70°C保存。蛋白純度由SDS-PAGE (10%丙烯酰胺凝膠)分析，結果顯示，洗脫組分中重組RtFASl亞基和RtFAS2亞基純度均大于90%。
[0130]將重組大腸桿菌BL21/pACYC-RtFASl+2接種M9-N培養基(M9限氮培養基:2%葡萄糖，0.6% Na2HPO4,0.3% KH2PO4,0.05 % NaCl, ImMMgSO4,0.1mM CaCl2,0.1% (v/v) 1000X微量元素混合液；1000X微量元素混合液成分:2.7% FeCl3.6H20,0.2% ZnCl2.4H20，0.2% CaCl2.2H20,0.2 % Na2MoO4.2H20,1.9% CuSO4.5H20,0.5% H3BO3)，37 °C，200rpm振蕩培養24h,每隔6h取樣，留做油脂含量分析[Rude M A, SchirmerA.Curr.0pin.Microb1l.2009，12，274-281]。結果發現，發酵終點時，與對照菌株BL21/pACYC Duet-1相比，BL21/pACYC-RtFASl+2胞內油脂含量由10%增加到19.2%，可見，胞內油脂含量提高了92%。證明RtFASl和RtFAS2基因共表達可促進重組大腸桿菌油脂積累，增加其胞內油脂含量。
[0131]實施例5 =RtFAS結構域PPT、ACP的原核表達和蛋白純化
[0132]步驟一 RtFAS結構域PPT、ACP的原核表達和蛋白純化
[0133]利用RF 克隆[Van den Ent F, Lowe J.J.B1chem.B1phys.Methods 2006,67,67-74 ；Yang F, Zhang S, Tang ff, Zhao Z.Yeast2008.25(9):623-630]方法構建 RtFAS 結構域PPT、ACP的原核表達載體。根據RtFAS的PPT結構域、ACPI結構域和ACPII結構域的編碼基因核苷酸序列設計以下RF克隆引物:
[0134]41-GST-ACP 工-F:
[0135]TGGTGGCTCCGGTGATGACGACGACAAGGTCGCCGACGAGCCGCTCAAGG
[0136]41-GST-ACP 工-R:
[0137]ATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCGAGATGCCAGCCATCGAGG
[0138]41-GST-ACP 工工-F:
[0139]TGGTGGCTCCGGTGATGACGACGACAAGGTCCCCGACGAGCCGCTCAAGG
[0140]41-GST-ACP 工工-R:
[0141]ATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGGTGATGCCAGCCTGCGAG
[0142]41-GST-PPT-F:
[0143]GGTGGCTCCGGTGATGACGACGACAAGGGTGCTTTCGGCGTCGGCACG
[0144]41-GST-PPT-R:
[0145]ATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTCTGGGCGATGACGACGGCG
[0146]1、RFI 反應:5 XPrimeSTAR Buffer (TakaRa) 10.0 μ I, dNTPs (1mM,TaKaRa) 1.0 μ 1，ACPI 引物 41-GST-ACP1-F 和 41-GST-ACP1-R 各 1.0 μ I (或 ACPII 引物 41-GST-ACPI1-F 和 41-GST-ACPI1-R，或 PPT 引物 41-GST-PPT-F 和 41-GST-PPT-R，各L O μ 1，均 1mM)，PrimeSTAR(TakaRa)0.5 μ 1，實施例 3 中構建的 pMD19T_RtFAS2 載體作為模板(50ng/y 1)2.0μ I, ddH20 補齊至 50 μ 1，于 94°C保溫 3min，然后于 98°C 10s，62。。10s，72°C lmin，30個循環，再72°C lOmin，4°C結束反應。擴增產物進行1.2% (質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳，觀察到預期大小的目的條帶(ACPI和ACPII目的條帶預期大小均為0.5kb左右，PPT目的條帶預期大小0.33kb左右)，利用DNA回收試劑盒(購自北京舟鼎國，貨號:NEP013-2)，按照供應商建議步驟(NEP013-2說明書)純化PCR產物。
[0147]2、RFII 反應:模板 pET41a 質粒 DNA(購自 Novagen, 10ng/ μ I) I μ I,上述步驟I (RFI 反應)產物 8 μ I (約 600ng)，5XPrimeSTAR Buffer (TaKaRa) 10.0 μ I, dNTPs (1mM,TaKaRa) 1.Ομ I, PrimeSTAR (TakaRa) 0.5 μ l，ddH20 補齊至 50 μ 1，于 95°C 預變性 3min,95°Clmin，55°C lmin，68°C 7min，25個循環，4°C結束反應，得到約6.6kb左右的RFII產物(即，帶缺口的插入目的基因片段的重組質粒)。
[0148]3、上述步驟 2 (RFII 反應)的 PCR 產物用 DpnI (購自 New England B1labs) I μ I于37°C消化lh，去除甲基化的模板質粒DNA，取5μ1電擊轉化E.coli DH5 α感受態細胞[分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版]，電擊轉化參數:2200-2500ν，400Ω，25μ F。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取和測序分析[Van den EntF, Lowe J.J.B1chem.B1phys.Methods 2006,67,67-74]。正確構建的重組質粒分別命名為 pET41a-ACPl、pET41a-ACP2 和 pET41a_PPT。
[0149]4、將上述步驟 3 中構建的 pET41a_ACPl、pET41a_ACP2 和 pET41a_PPT 重組載體分別轉化E.coli B121(DE3)感受態細胞，得到表達菌株BL21/pET41a_ACPl、BL21/pET41a-ACP2和BL21/pET41a-PPT。分別挑單菌落接種于10ml Kan-LB培養基(胰蛋白胨 10g/l，酵母粉 5g/l，NaCl 10g/l，并含卡那霉素 50 μ g/ml)，37°C 培養 4_6h 至 OD6tltol 為0.6-0.8，加入終濃度為0.1mM IPTG進行誘導，30°C培養過夜。誘導表達結束后，取Iml菌液，于4°C，8000rpm離心5min收集菌體，菌體沉淀用200 μ I細菌裂解緩沖液(10mM1^8-!1(:1，20%甘油，21111 EDTA, 1.5mM DTT, pH7.5)重懸，利用超聲破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，超細探頭，功率為60W，脈沖2s，間歇2s，總時間lmin)，至菌液變澄清；16000X g，4°C離心10min，取上清為可溶性蛋白部分，利用等體積的裂解緩沖液重懸沉淀；利用SDS-PAGE分析蛋白的表達情況(12% (Μ/V)丙烯酰胺凝膠)。結果顯示，0.1mM IPTG誘導條件下，攜帶GST Tag的RtFAS-ACPl、RtFAS_ACP2和RtFAS-PPT三個重組蛋白(分別簡寫為GST-wACPl、GST-wACP2和GST_wPPT)幾乎完全可溶表達，分子量分別為50kDa、50kDa和45kDa(RtFAS-ACP1、RtFAS-ACP2和 RtFAS-PPT 的理論分子量分別為 20kDa、20kDa、和 15kDa，GST標簽蛋白分子量為30kDa)。
[0150]5、蛋白純化過程按照 Invitrogen N1-NTA purificat1n system 指導說明進行，以鎳離子做為親和離子，依靠咪唑濃度梯度(30-100mM咪唑)洗脫目的蛋白。BL21/pET4Ia-ACP1、BL21/pET41a_ACP2 和 BL21/pET4la-PPT 分別進行 100ml 體積誘導表達(1000ml Kan-LB培養基(含卡那霉素50 μ g/ml)，37 °C培養4_6h至OD為0.6-0.8，加入終濃度為0.1mM IPTG進行誘導，30°C培養過夜)，離心收集菌體，加入50ml NBP緩沖液(50mMNa2HP04/NaH2P04, pH = 8.0,0.5M NaCl，20mM 咪唑，ImM beta-巰基乙醇，ImM PMSF)中，超聲破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，功率為60W，脈沖2s，間歇3s，總時間1min)，至菌液變澄清；16000Xg，4°C離心10min，取上清可溶性蛋白，利用0.22μπι低蛋白結合的濾膜過濾后，上樣至鎳親和層析柱(體積5ml)，靜置結合15min，然后依次用20倍柱體積的含 20mM、40mM、60mM 和 80mM 咪唑的洗滌緩沖液(50mMNa2HP04/NaH2P04，pH = 8.0,0.5MNaCl, ImM beta-巰基乙醇，相應濃度的咪唑)依次洗滌，最后用含250mM咪唑的洗脫緩沖液(50mMNa2HP04/NaH2P04，pH = 8.0,0.5M NaCl，ImM beta-巰基乙醇，250mM 咪唑)洗脫目的蛋白。所有純化操作均在4°C進行，并保證預冷所有的相關緩沖液。純化得到的蛋白保存于20%甘油中，分裝后在-70°C保存。所有純化操作均在4°C進行，并保證預冷所有的相關緩沖液。純化得到的蛋白保存于20%甘油中，分裝后在-70°C保存。蛋白純度由SDS-PAGE (12% (Μ/V)丙烯酰胺凝膠)分析，結果如圖5所示，洗脫組分中重組GSTiACPl、GST-wACP2和GST-wPPT蛋 白純度均大于90%。
[0151]6、鎳親和純化后的重組蛋白 GST-wACPl、GST_wACP2 和 GST-wPPT 使用 MilliporeAmicon Ultra-15超濾管(購自Millipore，截留分子量為10kD，貨號:UFC201024PL)濃縮蛋白，并將原洗脫緩沖液置換為酶反應緩沖液(20mM Tris-HCl, 10mM NaCl, 10mM KCl,5mM MgCl2, 1mM CaCl2, ImM beta-巰基乙醇，0.5mM DTT, 15% (w/v)甘油，ρΗ7.5)。操作按UFC201024PL說明書進行，首先將前面純化的蛋白濃縮至體積約為1ml，加入1ml酶反應緩沖液，再次離心濃縮至體積為1ml，如此重復3次，最后將蛋白定容于2-3ml酶反應緩沖液，此時已經將鎳親和純化時的洗脫緩沖液中的咪唑降低至1mM以下。測定蛋白濃度，蛋白-20°C保存。
[0152]步驟二 PPT結構域對ACP結構域的4-磷酸泛酰巰基乙胺修飾
[0153]圓紅冬孢酵母脂肪酸合酶PPT結構域具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶活性，可催化新生的ACP(apo-ACP，無活性形式)與輔酶A反應，生成3’，5’-二磷酸腺苷(3’，5’_ADP)和活化的ACP (ho1-ACP, 36位絲氨酸殘基的羥基上通過磷脂鍵連接一個來自輔酶A的4’
磷酸泛酰基巰基乙胺)。
[0154]20 μ g GST-ACP、2yg GST-PPT 和 0.3mM CoA (輔酶 A，購自上海生工生物)混合于 20μ I 酶反應緩沖液(20mM Tris-HCl, pH = 7.5, 10mM NaCl, 10mM KCl,5mM MgCl2,1mM CaCl2, ImM beta-巰基乙醇，0.5mM DTT, 15 % (w/v)甘油)中，30 °C 溫育 3 小時。10μ I樣品-20°C保存，用于質譜鑒定。剩余10μ I樣品中加入1μ 1(?υ/μ I)腸激酶(enterokinase，購自生工生物)，稀釋體積至12.5 μ 1，25 °C反應16小時，加入48.5μ IddH20 和 20 μ 14 X SDS-PAGE 樣品緩沖液(12% SDS (W/V)，6 % 巰基乙醇(V/V)，30 % 甘油(^)，0.05%考馬斯藍6-250(561^3)，1501111 Tris/HCl (ρΗ7.0))，50 °C 溫育 15min。取8 μ I 樣品進行 Trcine-SDS-PAGE,凝膠濃度為 16% [ Schagger H.Nat Protoc.2006，I (I)，16-22.]。結果顯示，純化的GST-PPT可以催化GST-ACP發生4’ -磷酸泛酰巰基乙胺修飾，由于ACP被修飾后分子量增加340Dalton，通過Tricine-SDS-PAGE可以在16%聚丙烯酰胺凝膠上分離Apo-ACP和Holo-ACP (圖6)
[0155]實施例6:圓紅冬孢酵母脂肪酸合酶的真核表達和重組菌株構建
[0156]步驟一、圓紅冬孢酵母脂肪酸合酶表達載體pYX212_RtFASl+2構建
[0157]利用釀酒酵母體內高效同源重組優勢，基于模塊組裝策略[Zhou YJ, Gao W，RongQX, Jin GJ, Chu HY, Liu WJ, Yang ff, Zhu Zff, Li GH, Zhu GF, Huang LQ, Zhao ZK.J.Am.Chem.Soc.2012，134，3234-3241]，進行RtFAS重組釀酒酵母菌株的構建和RtFAS的功能互補分析。
[0158]根據RtFASl和RtFAS2編碼基因序列以及釀酒酵母組成型表達載體pYX212 [購自B1vector中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心]的DNA序列,設計以下用于模塊組裝的引物。模塊組裝過程如圖7所示，引物序列信息如表2所示。 [0159]表2.pYX212-RtFASl+2載體構建所需引物
[0160]
引物名稱 I別稱I序列
【權利要求】
1.一種產油酵母脂肪酸合酶，其由RtFASl亞基和RtFAS2亞基組成，其中所述RtFASl亞基是如下(a)或(b)的蛋白質: (a)由SEQID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將SEQID NO:1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白質； 所述RtFAS2亞基是如下(c)或(d)的蛋白質: (c)由SEQID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (d)將SEQID NO:2的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的產油酵母脂肪酸合酶，其中所述RtFASl亞基的氨基酸序列為SEQ ID N0:1，所述RtFAS2亞基的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
3.一種來源于權利要求1所述的產油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或結構域，所述多肽片段或結構域的氨基酸序列為選自如下片段中的任意一個或者任意兩個或更多個片段的組合:
SEQ ID NO:1 的位置 190-599，
SEQ ID NO:1 的位置 611-1142，
SEQ ID NO:2 的位置 60-490，
SEQ ID NO:2 的位置 493-885，
SEQ ID NO:2 的位置 1021-1186，
SEQ ID NO:2 的位置 1212-1378，
SEQ ID NO:2 的位置 1725-1983， SEQ ID NO:2 的位置 2066-2716，和 SEQ ID NO:2 的位置 2815-2926。
4.權利要求3所述的產油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或結構域，其生物活性選自單酰/乙酰轉移酶(AT)活性、烯酰ACP還原酶(ER)活性、脫水酶(DH)活性、丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)活性、第一酰基載體蛋白(ACP)活性、第二酰基載體蛋白(ACP)活性、酮脂酰還原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)活性中的任一種或者任兩種或更多種的組合。
5.編碼權利要求1所述的產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
6.根據權利要求5所述的核苷酸序列，其中編碼所述產油酵母脂肪酸合酶的RtFASl亞基的核苷酸序列為SEQ ID NO:3 ;編碼所述產油酵母脂肪酸合酶的RtFAS2亞基的核苷酸序列為 SEQ ID NO:4o
7.編碼權利要求3所述的產油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或結構域的核苷酸序列，其選自如下核苷酸序列中的任意一個或者任意兩個或更多個序列的組合: (a)如SEQID NO:5所示的核苷酸序列，其編碼RtFASl亞基的AT結構域； (b)如SEQID NO:6所示的核苷酸序列，其編碼RtFASl亞基的ER結構域； (c)如SEQID NO:7所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的DH結構域； (d)如SEQID NO:8所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的MPT結構域； (e)如SEQID NO:9所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的第一 ACP結構域；(f)如SEQID NO:10所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的第二 ACP結構域； (g)如SEQID NO: 11所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的KR結構域； (h)如SEQID NO:12所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的KS結構域； (i)如SEQID NO:13所示的核苷酸序列，其編碼RtFAS2亞基的PPT結構域。
8.含有權利要求5-7中任何一項所述的核苷酸序列的表達盒或重組表達載體。
9.含有權利要求5-7中任何一項所述的核苷酸序列的細胞。
10.一種構建油脂生產重組細胞的方法，所述方法包括將權利要求3-7中任何一項所述的核苷酸序列或者權利要求8的表達盒或重組表達載體導入宿主細胞中，得到油脂生產重組細胞。
【文檔編號】C12N15/63GK104031896SQ201310067825
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月4日 優先權日:2013年3月4日
【發明者】趙宗保, 朱志偉, 張素芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所