一種產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因與應用。該脂肪酸合酶由RgrFAS1亞基和RgrFAS2亞基組成，所述RgrFAS1亞基是如下(a)或(b)的蛋白質：(a)由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將SEQ?ID?NO：1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基1功能的由SEQ?ID?NO：1所衍生的蛋白質；所述RgrFAS2亞基是如下(c)或(d)的蛋白質：(c)由SEQID?NO：2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)將SEQ?ID?NO：2的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基2功能的由SEQ?ID?NO：2所衍生的蛋白質。
【專利說明】一種產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種產油酵母脂肪酸合酶及其基因與應用。具體地，所述產油酵母脂肪酸合酶以及編碼其的核苷酸來源于禾本紅酵母(Rhodotorulagraminis)。本發明還提供一種構建油脂生產重組細胞的方法。
【背景技術】
[0002]油脂是一種氧含量低、能量密度高、碳鏈長度適中的可再生資源，可以代替化石資源作為化學工業和可再生能源產業的基本加工原料，是人類從碳氫經濟向碳氫氧經濟過渡的重要鏈接，其市場潛力巨大。自然界中一部分微生物在特定條件下(如氮源缺乏)能在胞內貯存超過其細胞干重20%的油脂，其中以甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)為主，具有這種表型的微生物稱為產油微生物，包括細菌、酵母、霉菌、藻類等，其中產油酵母包括Rhodotorula, Candida, Cryptococcus, Rhizopus, Trichosporon 和 Yarrowia 屬中的某些菌株[Ratledge C, Wynn J P.Adv Appl Microb1l2002, 51,1-51]。利用微生物轉化生物質資源生產油脂，可發展成基本不依賴耕地、可連續生產、降低農業污染、資源綜合利用的新技術，形成化學品的石化資源替代品生產新途徑[趙宗保.中國生物工程雜志2005，25 (2)，8-11]。
[0003]半個世紀以來，國內外微生物油脂研究的重點集中在菌株篩選、馴化和發酵工藝優化等領域，取得了重大進展。隨著生物技術的快速發展，單純的菌種篩選和培養工藝的優化已不能滿足產油微生物性狀改良的需要。做為某一化學品的天然生產菌株，其特定的生產性能往往并非 最優。如何優化或改變工業菌株的代謝網絡和表達調控網絡，以提高生物基產品的積累速度或定向控制靶產品的質量，是當今生物【技術領域】研究的熱點和難點。油脂發酵研究需要油脂代謝途徑的重構和強化，賦予重組菌株生產新型脂肪酸衍生物的性能。由于優良土著生產菌株的遺傳背景目前仍不清楚，油脂積累代謝調控相關基因克隆有限，尋找更多的油脂積累代謝調控相關基因，是目前微生物油脂研究的重要方向之一。
[0004]研究人員發現，來源于產油微生物(圓紅冬孢酵母和斯氏油脂酵母)的異檸檬酸脫氫酶(IDH)和蘋果酸酶(ME)的編碼基因在土著菌油脂積累過程中有表達差異，釀酒酵母功能互補分析也證明這些基因可增加重組菌株的油脂含量，但并沒能將一個非產油菌株成功改造成一個產油菌株[Yang F, Zhang SF, Zhou YJ, Zhu Zff, Lin XP, Zhao ZK.Appl.Microb1l.B1technol.2012,94(4)，1095-1105]。實驗結果暗示，微生物油脂積累代謝調控可能涉及更多的基因及其間的相互調節和相互作用。
[0005]從乙酰CoA和丙二酸單酰CoA從頭合成短鏈和中長鏈飽和脂肪酸，需要一系列的克萊森縮合反應并脫羧，是由幾種酶活介導催化的復雜過程。在大多數細菌和植物中，這些酶活性是由離散的單功能多肽組成的酶系來完成(脂肪酸合酶類型II);而在哺乳動物和真菌中，這些酶活性則由一個或兩個多功能多肽組成的寡聚酶來行使(脂肪酸合酶類型I)。在脂肪酸合成過程中，底物和中間產物分子在各個功能結構域(可以位于同一酶分子，也可以位于不同酶分子)中傳遞直到完成脂肪酸的整個合成過程[stoops JK,Arslanian MJ, Oh YH, Aune KC, Vanaman TC, Wakil SJ.Proc Natl Acad SciUSA.1975,72(5)，1940-1944]。
[0006]哺乳動物中的脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase, FAS)是一個同源二聚體,含有兩個相同的多功能亞基(亞基分子量為272kDa)，每一個亞基的N端區域含有三個催化結構域:酮酯-酸基 ACP 合酶(ketoacyl synthase, KS)、單酸 / 乙酸轉移酶(acyltransferase,AT)和脫水酶(dehydratase, DH), C端區域則含有四個結構域:烯酰ACP還原酶(enoylreductase, ER)、酮脂酸還原酶(ketoacyl reductase, KR)、酸基載體蛋白(acyl carrierprotein, ACP)和硫酯酶(th1esterase, TE);這兩個區域被中間600個氨基酸殘基組成的核心區域所分隔。在子囊菌門酵母中，ACP和其它6個酶活性結構域分別定位于兩個不同亞基上，其一具有ACP、KR、KS和磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(phosphopantetheinyltransferase, PPT)結構域，另一亞基則含有AT、ER、DH和丙二酰/棕櫚酰轉移酶(malonyl/palmitoyl transferase, MPT)結構域。
[0007]最近,我們在禾本紅酵母(Rhodotorula graminis)中發現一種新穎的脂肪酸合酶，該酶與別的真菌中存在的脂肪酸合酶的不同在于，其beta亞基(FASl)只含有AT(單酰/乙酰轉移酶)結構域和ER(烯酰ACP還原酶)結構域，而其余的結構域均在alpha亞基(FAS2)上；同時，該脂肪酸合酶上存在兩個前后串聯的ACP結構域。截止專利提交日，NCBI上未檢索到關于禾本紅酵母(R.graminis)脂肪酸合酶的任何序列信息。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種產油酵母脂肪酸合酶及其編碼基因與應用。
[0009]本發明提供的產油酵母脂肪酸合酶，名稱縮寫為RgrFAS (R.graminisFattyAcid Synthase),來源于禾本紅酵母(R.graminis) JCM8242,所述產油酵母脂肪酸合酶由RgrFASl亞基和RgrFAS2亞基組成，其中所述RgrFASl亞基是如下(a)或(b)的蛋白質:
[0010](a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0011 ] (b)將SEQ ID NO:1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白質；
[0012]所述RgrFAS2亞基是如下(C)或(d)的蛋白質:
[0013](c)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0014](d)將SEQ ID NO:2的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白質。
[0015]其中所述“脂肪酸合酶亞基I功能”具體是指單酰/乙酰轉移酶(AT)活性和烯酰ACP還原酶(ER)活性的加合；其中所述“脂肪酸合酶亞基2功能”具體是指脫水酶(DH)活性、丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)活性、第一酰基載體蛋白(ACP)活性、第二酰基載體蛋白(ACP)活性、酮脂酰還原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)活性的加合。
[0016]本 發明還涉及產油酵母脂肪酸合酶(RgrFAS)的生物活性多肽片段(在本文中，也稱為結構域)，其氨基酸序列為選自如下片段中的任何一個或者任意兩個或更多個片段的組合:
[0017]SEQ ID NO:1的位置191-600 (其具有單酰/乙酰轉移酶(AT)活性)，[0018]SEQ ID NO:1的位置612-1143 (其具有烯酰ACP還原酶(ER)活性)，
[0019]SEQ ID NO:2的位置58-488 (其具有脫水酶(DH)活性)，
[0020]SEQ ID NO:2的位置491-883 (其具有丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)活性)，
[0021]SEQ ID NO:2的位置1022-1187 (其具有第一酰基載體蛋白(ACP)活性)，
[0022]SEQ ID NO:2的位置1214-1380 (其具有第二酰基載體蛋白(ACP)活性)，
[0023]SEQ ID NO:2的位置1727-1985 (其具有酮脂酰還原酶(KR)活性)，
[0024]SEQ ID NO: 2的位置2068-2714 (其具有酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性)，和
[0025]SEQ ID NO: 2的位置2815-2926 (其具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)活性)。
[0026]所述的RgrFAS的生物活性多肽片段(結構域)，其生物活性選自單酰/乙酰轉移酶(AT)活性、烯酰ACP還原酶(ER)活性、脫水酶(DH)活性、丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)活性、第一酰基載體蛋白(ACP)活性、第二酰基載體蛋白(ACP)活性、酮脂酰還原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)活性中的任一種或者任兩種或更多種的組合。
[0027]在基因工程生產該脂肪酸合酶用于體外合成脂肪酸及其衍生物方面，為了使所述的RgrFASl亞基和(/或)RgrFAS2亞基分泌到細胞周質或培養基中或使其功能穩定，可在所述RgrFASl亞基和(/或)RgrFAS2亞基的氨基端連接上信號肽序列；為了使RgrFAS蛋白或其亞基或其生物活 性多肽片段(結構域)便于純化，可在RgrFASl亞基或RgrFAS2亞基或其生物活性多肽片段(結構域)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽或GST標簽(谷胱甘肽S-轉移酶標簽)。
[0028]表1標簽及其序列
[0029]
【權利要求】
1.一種產油酵母脂肪酸合酶，其由RgrFASl亞基和RgrFAS2亞基組成，其中所述RgrFASl亞基是如下(a)或(b)的蛋白質: (a)由SEQID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將SEQID NO:1的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基I功能的由SEQ ID NO:1所衍生的蛋白質； 所述RgrFAS2亞基是如下(c)或(d)的蛋白質: (c)由SEQID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (d)將SEQID NO:2的氨基酸經過一個或幾個氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與具有脂肪酸合酶亞基2功能的由SEQ ID NO:2所衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的產油酵母脂肪酸合酶，其中所述RgrFASl亞基的氨基酸序列為SEQ ID NO:1，所述RgrFAS2亞基的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
3.一種來源于權利要求1所述的產油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或結構域，所述多肽片段或結構域的氨基酸序列為選自如下片段中的任意一個或者任意兩個或更多個片段的組合:
SEQ ID NO:1 的位置 191-600，
SEQ ID NO:1 的位置 612-1143，
SEQ ID NO:2 的位置 58-488，
SEQ ID NO:2 的位置 491-883，
SEQ ID NO:2 的位置 1022-1187，
SEQ ID NO:2 的位置 1214-1380，
SEQ ID NO:2 的位置 1727-1985， SEQ ID NO:2 的位置 2068-2714，和 SEQ ID NO:2 的位置 2815-2926。
4.權利要求3所述的產油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或結構域，其生物活性選自單酰/乙酰轉移酶(AT)活性、烯酰ACP還原酶(ER)活性、脫水酶(DH)活性、丙二酰/棕櫚酰轉移酶(MPT)活性、第一酰基載體蛋白(ACP)活性、第二酰基載體蛋白(ACP)活性、酮脂酰還原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(PPT)活性中的任一種或者任兩種或更多種的組合。
5.編碼權利要求1所述的產油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
6.根據權利要求5所述的核苷酸序列，其中編碼所述產油酵母脂肪酸合酶的RgrFASl亞基的核苷酸序列為SEQ ID NO:3 ;編碼所述產油酵母脂肪酸合酶的RgrFAS2亞基的核苷酸序列為SEQ ID NO:4o
7.編碼權利要求3所述的產油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或結構域的核苷酸序列，其選自如下核苷酸序列中的任意一個或者任意兩個或更多個序列的組合: (a)如SEQID NO:5所示的核苷酸序列，其編碼RgrFASl亞基的AT結構域； (b)如SEQID NO:6所示的核苷酸序列，其編碼RgrFASl亞基的ER結構域； (c)如SEQID NO:7所示的核苷酸序列，其編碼RgrFAS2亞基的DH結構域； (d)如SEQID NO:8所示的核苷酸序列，其編碼RgrFAS2亞基的MPT結構域； (e)如SEQID NO:9所示的核苷酸序列，其編碼RgrFAS2亞基的第一 ACP結構域；(f)如SEQID NO:10所示的核苷酸序列，其編碼RgrFAS2亞基的第二 ACP結構域； (g)如SEQID NO: 11所示的核苷酸序列，其編碼RgrFAS2亞基的KR結構域； (h)如SEQID NO:12所示的核苷酸序列，其編碼RgrFAS2亞基的KS結構域； (i)如SEQID NO:13所示的核苷酸序列，其編碼RgrFAS2亞基的PPT結構域。
8.含有權利要求5-7中任何一項所述的核苷酸序列的表達盒或重組表達載體。
9.含有權利要求5-7中任何一項所述的核苷酸序列的細胞。
10.一種構建油脂生產重組細胞的方法，所述方法包括將權利要求3-7中任何一項所述的核苷酸序列或者權利要求8的表達盒或重組表達載體導入宿主細胞中，得到油脂生產重組 細胞。
【文檔編號】C12N15/54GK104031895SQ201310067767
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月4日 優先權日:2013年3月4日
【發明者】趙宗保, 朱志偉, 張素芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所