專利名稱：一種分離葉綠體dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離葉綠體DNA的方法。
背景技術：
茶樹(Camellia sinensis (L.))隸屬于山茶科山茶屬，為多年生常綠木本植物，是我國重要的經濟作物之一。因其含有兒茶素類、茶多酚和咖啡堿等多種藥用和保健成份，廣泛地受到人們的關注。葉綠體是植物光合作用的器官，同時也是細胞內具有自主遺傳信息的細胞器。伴隨著生物技術的深入發展，人們發現葉綠體因基因組小，編碼區及非編碼區進化速率的差異而越來越多地被用于各類分類階元的系統發育研究，葉綠體基因組結構和序列的信息在揭示物種起源、進化演變及其不同物種之間的親緣關系等方面具有重要價值。而且，利用葉綠體基因工程來改良作物的產量及重要化合物的含量具有重要意義。提取較高純度的葉綠體DNA(cpDNA)是進行對葉綠體基因組測序及序列和結構分析的基礎。目前最常用的葉綠體基因組提取純化方法主要是在以下兩種方法的基礎上發展建立起來的:高鹽緩沖方法和蔗糖或Percoll密度梯度法。在早期，趙衍(趙衍等，1986 ；1991)將調節低的pH來改變細胞器表面帶電狀況與蔗糖梯度離心相結合提取水稻cpDNA，龔小松(龔小松等，1991)又將低pH法和高鹽緩沖結合起來，用于高粱的cpDNA的純化，均得到很好的效果，而且操作也快速簡便、省去密度梯度離心昂貴、耗時的步驟，對儀器的要求不高，成本較低。然而，茶樹葉片具有很多豐富而特有的次生代謝物，在分離純化葉綠體DNA過程中這些物質很容易被氧化，導致茶樹葉綠體基因組DNA的提取因為其葉片的特殊結構和成分而困難重重，且僅采用高鹽低PH方法仍有核基因組的污染，因此需要根據茶樹葉片的特殊性質 ，建立一套適用于山茶屬乃至所有高等植物的葉綠體DNA提取方法。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的缺陷，提供一種分離葉綠體DNA的新方法。本發明的方法可以獲得純度很高且完整的葉綠體DNA。本發明提供的分離葉綠體DNA的方法，包括葉綠體的提取、葉綠體外核DNA的去除和葉綠體DNA的提取三個步驟。具體的，包括下列步驟:(I)以新鮮的葉片為材料，勻漿后，經過濾、濾液離心獲得葉綠體；(2)采用DNasel、RnaseA和蛋白酶K酶解去除葉綠體外吸附的核DNA ；(3)裂解葉綠體，純化葉綠體DNA，最終得到了純度非常高的完整的葉綠體DNA。更為具體的，步驟(I)中:所述新鮮葉片可為綠葉植物的葉片。優選茶樹(Camellia sinensis (L.))的新鮮葉片。所述茶樹可選任一品種的茶樹。新鮮葉片可直接用于分離葉綠體；或者也可將新鮮葉片于-80°C冰箱保存備用。
分離葉綠體前無需將葉片置于4°C冰箱中暗處理。
勻漿可采用普通家用榨汁機將葉片充分勻漿。
較佳的，勻漿前，榨汁機經預冷處理。
勻漿時，將葉片與預冷的緩沖液A混合勻漿。
所述緩沖液A的pH為3.6-3.8，每IOOOml包括下列組分:
EDTA-Na26-9gTris4-8gNaCl60-100g抗壞血酸30-50g水余量
所述緩沖液A的制備方法如下:按比例稱取EDTA-Na2, Tris, NaCl，抗壞血酸，力口水混勻，調pH至3.6-3.8，再定容。
較佳的，緩沖液A預冷為2-8°C，勻漿時間為0.5-lmin。
較佳的，新鮮葉片與緩沖液A的重量體積比為:30_50g:400ml。
較佳的，勻漿液經兩層紗布過濾，過濾完畢后擠出殘留的液體；再用四層紗布過濾，過濾完畢不要擠壓，得到濾液。
濾液離心可采用常規速度。
較佳的，濾液離心包括下列步驟:
I)濾液分裝后，100_300g離心3-lOmin，收集上清；
2)將步驟I)獲得的上清液，1 500_2500g離心10_15min，棄上清；用預冷的緩沖液B重懸沉淀并再次離心棄上清，多次重復此步驟；獲得的沉淀即為葉綠體。
所述離心的溫度優選4°C。
所述緩沖液B的pH為1.0-9.0,每IOOOml包括下列組分:
EDTA-Na26-9gTris4-8 gNaCl60—IOOgBSA0.5-3gβ-巰基乙醇1.5-3ml水余量
所述緩沖液B (分離緩沖液)的配制方法如下:按比例將EDTA-Na2, Tris, NaCl加水混勻，調pH至8.0，再加入BSA和β -巰基乙醇，加水定容。
較佳的，新鮮葉片與緩沖液B的重量體積比為:30-50g:200-300ml。
本發明所述分離葉綠體DNA的方法中，所述步驟(2)具體包括下列步驟:
a.向步驟(I)獲得的葉綠體中加入預冷的緩沖液C，2_8°C下1500_2500g離心10-15min,棄上清。b.用緩沖液C重懸步驟a的沉淀，加入DNaseI和RNaseA，37°C反應5_10分鐘，然后加入蛋白酶K37°C反應5-10分鐘，再加入EDTA-Na2水溶液終止酶解；c.將步驟b的酶解液用預冷的緩沖液D沖洗，2-8°C、3000-4000g離心15_20min棄上清，獲得純化的葉綠體。所述緩沖液C的pH為7.0-9.0,每500ml包括下列組分:
蔗糖6-9g
Tris2-4g
BSA0.2-1, Sg
水余量所述緩沖液C(清洗緩沖液)的配制方法如下:按配比稱取蔗糖，Tris，加雙蒸水后，調pH，再加入BSA，并定容。較佳的，新鮮葉片與步驟a所用緩沖液C的重量體積比為:30-50g:1O-1OOml較佳的，新鮮葉片與DNase1、RnaseA和蛋白酶K的比例為:30_50g新鮮葉片:5_15UDNase1:1OO-3OOugRNaseA:1OO-3OOug 蛋白酶 K。較佳的，加入EDTA-Na2水溶液使EDTA-Na2終濃度達到0.1-1.0moI/L終止酶解。所述緩沖液D的pH為7.0-9.0,每IOOOml包括下列組分:
EDTA-Na215-30 g
Tris4-8g
NaClh0-l00g
NaFl_3g
水余_￥:所述緩沖液D (DNaseI清洗緩沖液)的配制方法如下:按配比稱取EDTA-Na2, NaCl，Tris, NaF,加雙蒸水，調pH至8.0,再加水定容。較佳的，新鮮葉片與緩沖液D的重量體積比例為:30_50g:50_100ml。獲得純化的葉綠體需馬上鏡檢觀察，立即用于后續DNA純化步驟或置沉淀于-20°C長期保存。純化獲得葉綠體后，可采用常規方法抽提DNA。進一步改進的,從純化的葉綠體中抽提DNA的具體包括下列步驟:A.向純化的葉綠體沉淀中加入裂解液，65 V裂解30_45min，加入RNaseA，室溫_37°C靜置5-10分鐘獲得消化液。B.向步驟A得到的消化液中加入酚/氯仿/異戊醇混合液，抽提I次；取上清，加入氯仿/異戊醇混合液抽提I次；C.取上清液加入預冷的異丙醇和1/10體積的5-10mol/L乙酸鹽，-20 °C放置10-30min, 10000-14000rpm離心10_20min，收集沉淀，用70_95v%乙醇沖洗并晾干；
D.加入TE緩沖液溶解。
較佳的，步驟A所用裂解液為Plant DNAzol植物基因組DNA快速提取試劑(杭州萊楓生物科技有限公司)。在裂解葉綠體時，采用該裂解液僅需約30min。
裂解時，如采用室溫以上溫度，可采用水浴。
步驟B中，所述酚/氯仿/異戊醇混合液中酚:氯仿:異戊醇的體積比為25: 24:1 ;氯仿/異戊醇混合液中氯仿:異戊醇的體積比為24: I。
步驟C中，所述乙酸鹽為乙酸鉀、乙酸胺和乙酸鈉中的至少一種。
步驟D 所用 TE 緩沖液為 pH8.0 含 lOmmol/LTris-HCl 及 lmmol/L EDTA-Na2 的水溶液。
TE溶液為如下方法制備得到的溶液:將濃度為lmol/LpH8.0的Tris.Cl水溶液和濃度為0.5mol/LpH8.0的EDTA-Na2水溶液按比例混合，再加入已滅菌的雙蒸水定容。
較佳的，新鮮葉片與所用裂解液、酚/氯仿/異戊醇混合液、氯仿/異戊醇混合液和預冷的異丙醇的重量體積比均為:30-50g:l-5ml。新鮮葉片與5_10mol/L乙酸鹽的重量體積比均為:30-50g:100-500uL.
上述優選條件均可任意組合。
與現有技術相比，本發明提取葉綠體DNA的時間節省了近一半，且制備分離的葉綠體DNA純度較高。紫外分光光度計檢測表明，本發明制備的DNA樣品的D260nm/D280nm在1.8-2.0之間；產率高達10 μ gcpDNA/g葉片樣品。經過驗證，以分離的cpDNA為模板完全能夠滿足PCR和目標基因序列的克隆等常規分子生物學操作的需要，并且分離的cpDNA能夠達到高通量測序中對實驗樣品的要求。
圖1為實施例1提取的葉綠體DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖2為實施例1中DNA用葉綠體特異性引物和核基因特異性引物PCR結果；
圖3為實施例2提取的葉綠體DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖4為實施例3提取的葉綠體DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑公司購買得到。
實例所采用的分離葉綠體DNA的基本步驟如下:
1.葉綠體的提取，包括如下步驟(I)至步驟(3):
(I)取新鮮茶樹葉片用于分離葉綠體或將該葉片轉入到-80°C冰箱保存備用，無需將葉片置于4°C冰箱中暗處理，取10-50g葉片置于預冷的榨汁機中，加入300-500ml4°C預冷的緩沖液A，勻漿0 .5-lmin。勻漿液經兩層紗布過濾，過濾完畢后擠出殘留的液體；再用四層紗布過濾，過濾完畢不要擠壓，得到濾液。
(2)將步驟(I)的濾液分裝到50ml離心管中，于4°C下100_300g離心3-lOmin，取上清，重復此步驟。
(3)將步驟(2)的上清液在4°C下2000g離心lOmin，棄上清，向沉淀中加入25ml預冷的緩沖液B，用移液槍吸打使沉淀懸浮，在4°C下2000g離心lOmin，棄上清；重復此步驟，沉淀即為茶樹葉綠。I1.葉綠體外核DNA的去除,包括如下步驟(4)至步驟(6):(4)向步驟(3)沉淀中加入15ml預冷的緩沖液C，4°C下2000g離心IOmin,棄上清。(5)向步驟(4)沉淀中加4mL緩沖液C重懸浮，使終體積約為5mL，溶液中加入IOulDNaseI (濃度 lU/ul)和 IOulRNaseA (20mg/ml),同時加入 2ul25mmol/LMgCl2 混合均勻，37°C溫浴5min ;然后加入IOul蛋白酶K(10mg/ml)，混合均勻，37°C溫浴5min ;向反應溶液中加入2mL0.5mol/LEDTA-Na2，使終濃度達到0.2mol/L，終止酶解。(6)加入50mL預冷的緩沖液D沖洗，4°C、3500g離心20min，棄上清。沉淀即為純化的葉綠體。馬上鏡檢觀察，溶解或置沉淀于_20°C長期保存。II1.葉綠體DNA的提取，包括如下步驟(7)至步驟(10):(7)向步驟(6)得到的純凈的葉綠體沉淀中加入3-5ml裂解液，65°C水浴30min,加入IOulRNaseA (20mg/ml)，室溫——37°C靜置5min。所述裂解液為Plant DNAzol植物基因組DNA快速提取試劑。(8)向步驟(7)得到的消化液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25: 24: I),抽提I次；取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24: I)抽提I次。(9)取上清液加入等體積預冷的異丙醇和1/10體積的5-10mol/L乙酸鹽，_20°C放置10-30min, 12000rpm離心15min,收集沉淀，用75%乙醇沖洗兩遍，室溫晾干。(10)加入100 μ ITE (ρΗ8.0)溶解。用分光光度計測定DNA濃度和純度，得到純凈的葉綠體DNA。所述方法中，所述茶樹樣品、所述緩沖液Α、所述緩沖液B、所述緩沖液C、所述DNase1、所述RNase、所述蛋白酶K、步驟(5)的所述EDTA-Na2水溶液、所述緩沖液D、所述裂解液、步驟(9)的所述乙酸鹽水溶液和所述TE溶液的配比為:30-50g茶樹樣品:400ml緩沖液 A:200-300ml 緩沖液 B:1O-1OOml 緩沖液 C: 5-lOUDNase1: 100_300ugRNaseA: 100-300ug 蛋白酶 K:2ml0.5mol/LpH8.0 的 EDTA*Na2 溶液:50_100ml 緩沖液 D:l_5ml 裂解液:100-500ul 的 5-10mol/L 乙酸鹽水溶液:50_200ulTE 溶液。步驟⑵中，所述的離心參數具體可為:200g3-10分鐘；步驟(3)、⑷中，所述的離心參數具體為:2000gl0-15分鐘；步驟(6)中，所述離心的參數為:3500gl5-20分鐘。步驟(5)具體可為，向步驟(4)沉淀中加入所述緩沖液C、DNaseI和RNaseA后，37 V反應5-10分鐘，然后加入蛋白酶K37°C反應5_10分鐘，再加入所述EDTA-Na2水溶液。步驟(7)具體可為，所步驟(6)所述葉綠體加入所述裂解液，所述裂解液為PCB裂解液，65°C 裂解 30-45min。步驟(7)中，在步驟(6)的溶液中加入所述RNaseA, 37°C水浴5-10分鐘。步驟(9)中，所述乙酸鹽為乙酸鉀、乙酸胺和乙酸鈉中的至少一種。 試劑配方:
緩沖液A,每1000ml包括下列組分:
EDTA-Na26-9g Tris4-8gNaCl60-100g抗壞血酸30-50g水余量 pH3.6-3.8
緩沖液B,每IOOOml包括下列組分:
EDTA-Na26_9g Tris4-8 gKaCl60-100g BSA0.5-3gP-巰基乙醇1.5-3ml水余量pH7.0-9.0
緩沖液C，每500ml 包括下列組分:
蔗糖6-9g Tris2_4gBSA0.2-1.5g水余量pH7.0-9.0
所述緩沖液D，每IOOOml包括下列組分:
EDTA-Na215-30 g Tris4-8 gNaCl60-1OOg NaF1-3g水余量pH7.0-9.0
實施例1
茶樹葉綠體DNA的提取
緩沖液的配制:
緩沖液A (提取緩沖液)的配制方法如下:稱取7.45gEDTA-Na2,6.05gTris,73gNaCl, 44g抗壞血酸,加雙蒸水至800ml,調pH至3.6,再加水定容至1000ml。
緩沖液B (分離緩沖液)的配制方法如下:稱取7.45gEDTA-Na2,6.05gTris,73gNaCl,加雙蒸水至800ml,調pH至8.0,再加入lgBSA, 2ml β -巰基乙醇，加水定容至IOOOml0
緩沖液C (清洗緩沖液)的配制方法如下:稱取6.48g蔗糖，3.03g Tris，加雙蒸水至400ml，調pH至8.0，再加入0.5gBSA，并定容至500ml。
緩沖液D (DNaseI清洗緩沖液)的配制方法如下:稱取18.6IgEDTA-Na2, 73g NaCl,6.05g Tris，2.05g NaF，加雙蒸水至800ml，調pH至8.0，再加水定容至1000ml。
TE溶液的制備方法如下:取1ml，濃度為lmol/LpH8.0的Tris.Cl水溶液和200ul,濃度為0.5mol/LpH8.0的EDTA-Na2水溶液,再加入已滅菌的雙蒸水定容至100ml。
(I)取新鮮茶樹葉片50g,加入AOOmlfC預冷的緩沖液A,勻衆lmin。勻衆液經兩層紗布過濾，過濾完畢后擠出殘留的液體；再用四層紗布過濾，過濾完畢不要擠壓，得到濾液。
(2)將步驟(I)的濾液分裝到50ml離心管中，于4°C下200g離心3_5min，取上清，重復此步驟。
(3)將步驟(2)的上清液在4°C下2000g離心IOmin,棄上清，加入25ml預冷的緩沖液B，用移液槍吸打使沉淀懸浮，在4°C下2000g離心lOmin，棄上清；重復此步驟，沉淀即為茶樹葉綠體。
所述葉綠體外核DNA的去除包括如下步驟(4)至步驟(6):
(4)向步驟(3)沉淀中加入15ml預冷的緩沖液C，4°C下2000g離心IOmin,棄上清。
(5)向步驟(4)沉淀中加4mL緩沖液C重懸浮，使終體積約為5mL,溶液中加入IOul DNase I (濃度 lU/ul)和 IOulRNaseA (20mg/ml)，同時加入 2ul25mmol/L MgCl2 混合均勻，37 溫浴5min ;然后加入IOul蛋白酶K(10mg/ml)，混合均勻，37 溫浴5min ;向反應溶液中加入2mL0.5mol/LEDTA-Na2，使終濃度達到0.2mol/L，終止酶解。
(6)加入50mL預冷的緩沖液D沖洗，4°C、3500g離心20min，棄上清。沉淀即為純化的葉綠體。
所述葉綠體DNA的提取包括如下步驟(7)至步驟(10):
(7)向步驟(6)得到的純凈的葉綠體沉淀中加入3ml裂解液PCB，65°C水浴30min，加入 IOulRNaseA (20mg/ml),室溫靜置 5min。
(8)向步驟(7)得到的消化液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25: 24: I),抽提I次；取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24: I)抽提I次。
(9)取上清液加入等體積預冷的異丙醇和1/10體積的5mol/L乙酸鈉，_20°C放置30min, 12000rpm離心15min,收集沉淀， 用75%乙醇沖洗兩遍,室溫晾干。
(10)加入 100 μ ITE (ρΗ8.0)溶解。
用分光光度計測定DNA濃度為30ng/ul，0D260/0D280比值為1.83，顯示純度較好。
將葉綠體DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖1。
(11)以步驟(10)中的DNA為模板，進行PCR擴增。
核基因組特異性弓丨物序列:Primer_F:TAGCAATGGTGGAAGAGTGCPrimer_R:GTGGGCGATGAAACTGATG
葉綠體基因組特異性引物序列:Primer_F:TCATTGCTGCTCCTCCAGTAPrimer_R:GAAAAACTTCCTTGACCGATTG
PCR 體系:
IOXBuffer5ul Mg2'4ul dNTP(IOum)Iul PrimerF (SOura) 0.5ul PrimerR(50um) 0.5Sul TagE0.5Sul ddH=038.5ul
PCR 循環條件:94°C，5min;
94°C,30s;
55°C, 30s;
72°C,30s;30cycles;
72°C, IOmin;4°C, hold
將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖2。
實施例2
山茶葉綠體DNA的提取
緩沖液的配制:
緩沖液A (提取緩沖液)的配制方法如下:稱取6gEDTA_Na2，4gTris，60gNaCl，50g抗壞血酸，加雙蒸水至800ml,調pH至3.7,再加水定容至IOOOml。
緩沖液B(分離緩沖液)的配制方法如下:稱取6gEDTA_Na2，4gTris，73g60gNaCl，力口雙蒸水至800ml,調pH至7.0,再加入0.3gBSA, 1.5ml β -巰基乙醇,加水定容至1000ml。
緩沖液C(清洗緩沖液)的配制方法如下:稱取6g蔗糖，2gTris，加雙蒸水至400ml，調pH至7.0，再加入1.5gBSA，并定容至500ml。
緩沖液D (DNaseI清洗緩沖液)的配制方法如下:稱取15gEDTA_Na2，60gNaCl，4gTris, IgNaF,加雙蒸水至800ml,調pH至7.0，再加水定容至1000ml。
TE溶液的制備方法如下:取lml，濃度為lmol/LpH8.0的Tris.Cl水溶液和200ul,濃度為0.5mol/LpH8.0的EDTA.Na2水溶液,再加入已滅菌的雙蒸水定容至100ml。
(I)取新鮮山茶葉片50g，加入400ml4°C預冷的緩沖液A，勻漿lmin。勻漿液經兩層紗布過濾，過濾完畢后擠出殘留 的液體；再用四層紗布過濾，過濾完畢不要擠壓，得到濾液。
(2)將步驟(I)的濾液分裝到50ml離心管中，于4°C下200g離心3_5min，取上清，重復此步驟。
(3)將步驟(2)的上清液在4°C下2000g離心lOmin，棄上清，加入25ml預冷的緩沖液B，用移液槍吸打使沉淀懸浮，在4°C下2000g離心lOmin，棄上清；重復此步驟，沉淀即為茶樹葉綠體。
所述葉綠體外核DNA的去除包括如下步驟⑷至步驟(6):
(4)向步驟(3)沉淀中加入15ml預冷的緩沖液C，4°C下2000g離心IOmin,棄上清。
(5)向步驟(4)沉淀中加4mL緩沖液C重懸浮，使終體積約為5mL,溶液中加入IOulDNaseI (濃度 lU/ul)和 IOulRNaseA (20mg/ml),同時加入 2ul25mmol/LMgCl2 混合均勻，37°C溫浴5min ;然后加入IOulProteinaseK (10mg/ml)，混合均勻，37°C溫浴5min ;向反應溶液中加入2mL0.5mol/LEDTA-Na2，使終濃度達到0.2mol/L，終止酶解。
(6)加入50mL預冷的緩沖液D沖洗，4°C、3500g離心20min，棄上清。沉淀即為純化的葉綠體。
所述葉綠體DN A的提取包括如下步驟(7)至步驟(10):
(7)向步驟(6)得到的純凈的葉綠體沉淀中加入3ml裂解液PCB，65°C水浴30min，加入 IOulRNaseA (20mg/ml),室溫靜置 5min。
(8)向步驟(7)得到的消化液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25: 24: I),抽提I次；取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24: I)抽提I次。
(9)取上清液加入等體積預冷的異丙醇和1/10體積的5mol/L乙酸鈉，_20°C放置30min, 12000rpm離心15min,收集沉淀，用75%乙醇沖洗兩遍，室溫晾干。
(10)加入 100 μ ITE (ρΗ8.0)溶解。
用分光光度計測定DNA濃度和純度為25ng/ul，0D260/0D280比值為1.85，顯示純度較好。
將葉綠體DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖3。
實施例3
菝葜葉綠體DNA的提取
緩沖液的配制:
緩沖液A(提取緩沖液)的配制方法如下:稱取9g EDTA-Na2,8gTris, IOOgNaCl，30g抗壞血酸，加雙蒸水至800ml,調pH至3.8,再加水定容至1000ml。
緩沖液B (分離緩沖液)的配制方法如下:稱取9g EDTA-Na2,8g Tris, IOOgNaCl,加雙蒸水至800ml,調pH至9.0,再加入3gBSA,3ml β -巰基乙醇，加水定容至1000ml。
緩沖液C (清洗緩沖液)的配制方法如下:稱取9g蔗糖，4g Tris，加雙蒸水至400ml，調pH至9.0，再加入0.2gBSA,并定容至500ml。
緩沖液D (DNase I清洗緩沖液)的配制方法如下:稱取30g EDTA_Na2，IOOgNaCl，8g Tris, 3g NaF,加雙蒸水至800ml,調pH至9.0,再加水定容至1000ml。
TE溶液的制備方法如下:取1ml，濃度為lmol/L pH8.0的Tris.Cl水溶液和200ul,濃度為0.5mol/L pH8.0的EDTA.Na2水溶液,再加入已滅菌的雙蒸水定容至100ml。
(I)取新鮮菝葜葉片50g,加入400ml4°C預冷的緩沖液A,勻楽；lmin。勻楽;液經兩層紗布過濾，過濾完畢后擠出殘留的液體；再用四層紗布過濾，過濾完畢不要擠壓，得到濾液。(2)將步驟(I)的濾液分裝到50ml離心管中，于4°C下200g離心3_5min，取上
清，重復此步驟。(3)將步驟(2)的上清液在4°C下2000g離心IOmin,棄上清，加入25ml預冷的緩沖液B，用移液槍吸打使沉淀懸浮，在4°C下2000g離心lOmin，棄上清；重復此步驟，沉淀即為茶樹葉綠體。所述葉綠體外核DNA的去除包括如下步驟⑷至步驟(6):(4)向步驟(3)沉淀中加入15ml預冷的緩沖液C，4°C下2000g離心IOmin,棄上清。(5)向步驟(4)沉淀中加4mL緩沖液C重懸浮，使終體積約為5mL,溶液中加入IOul DNase I (濃度 lU/ul)和 IOulRNaseA (20mg/ml)，同時加入 2ul25mmol/LMgCl2 混合均勻，37°C溫浴5min ;然后加入IOul蛋白酶K(10mg/ml)，混合均勻，37°C溫浴5min ;向反應溶液中加入2mL0.5mol/LEDTA-Na2，使終濃度達到0.2mol/L，終止酶解。(6)加入50mL預冷的緩沖液D沖洗，4°C、3500g離心20min，棄上清。沉淀即為純化的葉綠體。所述葉綠體DNA的提取包括如下步驟(7)至步驟(10):(7)向步驟(6)得到的純凈的葉綠體沉淀中加入3ml裂解液PCB，65°C水浴30min，加入 IOulRNaseA (20 mg/ml),室溫靜置 5min。(8)向步驟(7)得到的消化液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25: 24: I),抽提I次；取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24: I)抽提I次。(9)取上清液加入等體積預冷的異丙醇和1/10體積的5mol/L乙酸鈉，_20°C放置30min, 12000rpm離心15min,收集沉淀，用75%乙醇沖洗兩遍，室溫晾干。(10)加入 100 μ I TE (ρΗ8.0)溶解。將葉綠體DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖4。
權利要求
1.一種分離葉綠體DNA的方法，包括下列步驟: (1)以新鮮的葉片為材料，勻漿后，經過濾、濾液離心獲得葉綠體； (2)采用DNase1、RnaseA和蛋白酶K酶解去除葉綠體外吸附的核DNA獲得純化的葉綠體； (3)裂解葉綠體，純化葉綠體DNA。
2.如權利要求1分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，所述更為具體的，步驟(I)中，勻漿時，將葉片與預冷的緩沖液A混合勻漿，所述緩沖液A的pH為3.6-3.8，每IOOOml包括下列組分:EDTA-Na2Tris4_8gNaCI60-1OOg抗壞血酸30-50g水余量。
3.如權利要求2分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，所述新鮮葉片與所述緩沖液A的重量體積比為:30-50g:400ml。
4.如權利要求1分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，步驟(I)中，濾液離心包括下列步驟: O濾液分裝后，100-300g離心3-10min,收集上清； 2)將步驟I)獲得的上清液，1500-2500g離心10_15min，棄上清；用預冷的緩沖液B重懸沉淀并再次離心棄上清，多次重復此步驟；獲得的沉淀即為葉綠體； 所述緩沖液B的pH為7.0-9.0,每IOOOml包括下列組分:EDTA-Na26_9gTris4-8 gNaCl60-1OOg BSA0.5-3gβ-巰基乙醇1.5-3ml水余量。
5.如權利要求4所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，所述新鮮葉片與所述緩沖液B的重量體積比為:30-50g:200-300ml。
6.如權利要求1所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體包括下列步驟: a.向步驟(I)獲得的葉綠體中加入預冷的緩沖液C，2-8V下1500-2500g離心10-15min,棄上清； b.用緩沖液C重懸步驟a的沉淀，加入DNaseI和RNaseA, 37°C反應5-10分鐘，然后加入蛋白酶K37°C反應5-10分鐘，再加入EDTA-Na2水溶液終止酶解； c.將步驟b的酶解液用預冷的緩沖液D沖洗，2-8°C、3000-4000g離心15_20min棄上清，獲得純化的葉綠體； 所述緩沖液C的pH為7.0-9.0,每500ml包括下列組分:萠糖6-9g Tris2_4g BSAO, 2-1.Sg水余量 ； 所述緩沖液D的pH為7.0-9.0,每IOOOml包括下列組分:EDTA-Na215-30 g Tris4-8gNaCl60-1OU NaFl~3g 水余景 O
7.如權利要求6所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，新鮮葉片與步驟a所用緩沖液C的重量體積比為:30-50g:1O-1OOml ;新鮮葉片與緩沖液D的重量體積比例為:30_50g:50_100mlο
8.如權利要求6所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，新鮮葉片與DNase1、RnaseA 和蛋白酶 K 的比例為:30_50g 新鮮葉片:5_10U DNase 1:100_300ugRNaseA: 100_300ug 蛋白酶 K。
9.如權利要求6所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，所述步驟b中，加入EDTA-Na2水溶液使EDTA-Na2終濃度達到0.1-1.0moI/L終止酶解。
10.如權利要求1-9任一所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，所述步驟(3)具體包括下列步驟: A.向純化的葉綠體中加入裂解液，65°C裂解30-45min，加入RNaseA，室溫_37°C靜置5-10分鐘獲得消化液。
B.向步驟A得到的消化液中加入酚/氯仿/異戊醇混合液，抽提I次；取上清，加入氯仿/異戊醇混合液抽提I次； C.取上清液加入預冷的異丙醇和1/10體積的5-lOmol/L乙酸鹽，_20°C放置10-30min, 10000-14000rpm離心10_20min，收集沉淀，用70_95v%乙醇沖洗并晾干； D.加入TE緩沖液溶解。
11.如權利要求10所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，I步驟A所用裂解液為Plant DNAzol植物基因組DNA快速提取試劑。
12.如權利要求10所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，步驟B中，所述酚/氯仿/異戊醇混合液中酚:氯仿:異戊醇的體積比為25: 24: I;氯仿/異戊醇混合液中氯仿:異戊醇的體積比為24: I。
13.如權利要求10所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，步驟B中，所述乙酸鹽為乙酸鉀、乙酸胺和乙酸鈉中的至少一種。
14.如權利要求10所述分離葉綠體DNA的方法，其特征在于，新鮮葉片與所用裂解液、酚/氯仿/異戊醇混合液、氯仿/異戊醇混合液和預冷的異丙醇的重量體積比均為:30-50g:l-5ml ;新 鮮葉片與5-lOmol/L乙酸鹽的重量體積比為:30_50g:10_50ul。
全文摘要
本發明提供了一種分離葉綠體DNA的方法,包括下列步驟以新鮮的葉片為材料,勻漿后,經過濾、濾液離心獲得葉綠體；采用DNaseI、RNaseA和蛋白酶K酶解去除葉綠體外吸附的核DNA獲得純化的葉綠體；裂解葉綠體，純化葉綠體DNA。與現有技術相比，提取時間節省了近一半，且制備分離的葉綠體DNA純度較高,以分離的cpDNA為模板完全能夠滿足PCR和目標基因序列的克隆等常規分子生物學操作的需要，并且分離的cpDNA能夠達到高通量測序中對實驗樣品的要求。
文檔編號C12N15/10GK103215251SQ20131006633
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月1日 優先權日2013年3月1日
發明者施菲, 李威 申請人:生工生物工程(上海)股份有限公司