改良型腈水合酶的制作方法

專利名稱：改良型腈水合酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有耐熱性提高或底物特異性改變的改良型腈水合酶活性的蛋白質；編碼該蛋白質的基因DNA ;具有該基因DNA的重組載體；具有該重組載體的轉化體或轉導體；提取自該轉化體或轉導體培養物的腈水合酶及其制備方法；以及使用了該培養物或該處理物的酰胺化合物的制備方法。
背景技術：
近年來，人們發現了具有腈水合活性的酶——腈水合酶，該酶可通過水合作用將腈基轉換為酰胺基，并且公開了利用該酶或具有該酶的微生物菌體以腈化合物制備對應的酰胺化合物的方法。與以往的化學合成方法相比，這種制備方法因具有高度的由腈化合物轉化成對應的酰胺化合物的轉化率和選擇率而為人所知。生產腈水合酶的微生物，可列舉例如屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假諾卡氏屬(Pseudonocardia)等的微生物。其中玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株已用于丙烯酰胺的工業生產,其有效性已被證實。另外，編碼生產該菌株的腈水合酶的基因也已查明(請參考專利文獻I)。從降低反應時酶的用量和降低成本的觀點出發，期待能獲取耐熱性進一步提高的酶。另一方面，不僅是利用從自然界存在的微生物離析得到的腈水合酶或其基因，出于改變腈水合酶的活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩定性、底物穩定性、產物穩定性等目的，人們嘗試對腈水合酶引入突變。(參考專利文獻2和3)專利文獻1:特許第3162091號公報專利文獻2:國際公開2004/056990號手冊(pamphlet)專利文獻3:特開2004-222538號公報
發明內容·腈水合酶是已用于丙烯酰胺工業生產的酶，但獲取耐熱性等性質較目前所使用的酶進一步提高的酶可降低酶反應時的成本。因此，本發明的目的在于進一步改良腈水合酶，提供耐熱性更為提高的具有腈水合酶活性的蛋白質，編碼該蛋白質的基因DNA，具有該基因DNA的重組載體，具有該重組載體的轉化體或轉導體，提取自該轉化體或轉導體培養物的腈水合酶及其制備方法以及使用了該培養物或處理物的酰胺化合物的制備方法。
另外,玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株的腈水合酶雖然已用于以丙烯腈為原料的丙烯酰胺的工業生產，但對于芳香腈反應活性低，在期待開發出對于芳香腈反應活性高的酶的同時，從降低催化劑成本的觀點出發，也期待開發出熱穩定、不易失活的酶。因此，本發明以改良腈水合酶獲得耐熱性提高的酶以及/或者獲得對芳香腈反應活性提高的酶為目的。本發明人為解決上述課題經過深入研究，發現在來源于玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株的腈水合酶的氨基酸序列中，通過將其中至少一個以上的氨基酸殘基用選自天然氨基酸組的殘基取代，該酶耐熱性得以提高以及/或者對芳香腈的反應活性得以提高，從而完成了本發明。即，本發明如下所述:
(I) 一種蛋白質，是野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列上第93位谷氨酸殘基被其他氨基酸殘基取代并且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質，所述其他氨基酸殘基是選自甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸中的任意一個氨基酸殘基，所述野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列如SEDIDNO:2所示。(2)上述(I)中所述的蛋白質，進一步地，β亞基的第103位谷氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代。(3)上述(I)中所述的蛋白質，進一步地，野生型腈水合酶的α亞基的氨基酸序列上，第132位天冬氨酸殘基被天冬酰胺殘基取代，所述野生型腈水合酶的α亞基的氨基酸序列如SED ID NO -A所示。(4) 一種DNA，編碼上述⑴-⑶中任意一項所述的蛋白質。(5) 一種重組載體，含有上述⑷所述的DNA。(6) 一種轉化體，含有上述(5)所述的重組載體。(7) 一種制備腈水合酶的方法，其特征在于，培養上述(6)所述的轉化體，從所得培養物提取腈水合酶。(8) 一種制備酰胺化合物的方法，培養上述(6)所述的轉化體，使所得的培養物或該處理物與腈基化合物接觸，提取通過該接觸生成的酰胺化合物。本發明提供與野生型腈水合酶相比耐熱性提高以及/或者對于芳香腈反應活性提高的突變型腈水合酶以及編碼該酶的基因。本發明進一步提供具有上述突變型腈水合酶基因的重組DNA，具有該重組DNA的轉化(轉導)體，使用該轉化(轉導)體制備酰胺化合物的方法。通過本發明，可以高效制備丙烯酰胺。


圖1為質粒pJH601的組成圖。圖2為質粒p3R的組成圖。圖3為質粒pMH301的組成圖。圖4為質粒p52的組成圖。圖5A為質粒pCF002的組成圖。圖5B為質粒pFY529的組成圖。
具體實施例方式以下詳細說明本發明。本說明書中所引用的文獻、公開公報、國際公開公報等其他專利公報作為參照并入本說明書。<腈水合酶>本發明通過使野生型腈水合酶的氨基酸序列部分突變，提供與野生型腈水合酶相比耐熱性和/或底物特異性提高的改良型腈水合酶。“腈水合酶”是催化腈化合物轉化為對應酰胺化合物的水合反應(RCN+H20 - RCONH2)的酶。另外，“腈水合酶”的結構是由α亞基與β亞基聚合形成的高級結構。“野生型腈水合酶”指具有來源于作為酶源的微生物的野生株(親株)的氨基酸序列的腈水合酶以及來源于野生株(親株)的基因序列編碼所得的腈水合酶。“野生型β亞基”或“野生型α亞基”指具有來源于野生株(親株)的氨基酸序列的β亞基或α亞基以及來源于野生株(親株)的基因序列編碼所得的β亞基或α亞基。“野生型腈水合酶”可列舉來源于各種微生物野生型的腈水合酶。微生物不僅限于具有編碼腈水合酶的基因的微生物。優選具有來源于紅球菌屬微生物的氨基酸序列的腈水合酶以及來源于紅球菌屬微生物的基因序列編碼所得的腈水合酶，所述紅球菌屬微生物例如可列舉玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1 (FERM BP-1478)、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) M8 (SU1731814)、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M3 3 (VKM Ac_1515D)或玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) ATCC39484 (特開平2001-292772)等。或者是來源于史密氏桿菌(Bacillus smithii)(特開平09-248188)的腈水合酶亦可。特別優選的是具有來源于玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1或玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8的氨基酸序列的腈水合酶以及來源于這兩株的基因序列編碼所得的腈水合酶。另外，玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33 (VKM Ac-1515D)菌是由M8 (SU1731814)菌通過自然突變產生的作為腈水合酶表達株而被篩選出的菌株。該菌株的腈水合酶本身的氨基酸序列和基因序列沒有突變(美國專利第5827699 號)。在此，耐熱性提高指來源于突變株的加熱處理后的酶的殘留活性比來源于親株的經相同處理的酶的殘留活性高10%以上。“殘留活性”指用經加熱處理后的菌體進行活性測定時酰胺化合物的生成量與用等量未經處理的菌體進行活性測定時酰胺化合物的生成量的比值。作為加熱處理方法可將培養液和收集、洗凈的培養菌體置于容器中，將此容器置于水浴或培養箱等加熱裝置中保溫一定時間即可。此時，為提高酶穩定性也可添加腈化合物或酰胺化合物后進行加熱處理。加熱處理的條件應適當研究處理溫度與處理時間，優選設定使親株活性降低至50%以下的條件。具體而言指在50°C至70°C的范圍內進行5分鐘至30分鐘的處理。未處理菌體使用4°C下冷藏的培養液和收集、洗凈的培養菌體。活性測定使用加熱處理或未處理的菌體，使底物腈化合物與該菌體接觸，轉化為對應的酰胺化合物后定量該酰胺化合物。底物可使用可與腈水合酶發生反應的任何腈化合物，優選丙烯腈。反應條件例如在底物濃度為2.5%、反應溫度為10 °C至30°C、反應時間為10分鐘至30分鐘的范圍內進行。添加磷酸使酶反應終止，利用HPLC和氣相色譜分析生成的丙烯酰胺。本發明的改良型腈水合酶,例如,可通過改變來源于玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous) J-1株的腈水合酶的氨基酸序列，篩選與親株腈水合酶活性相比耐熱性提高的改良型腈水合酶而得到。上述改變方法可以采用使羥胺或亞硝酸等作為變異源的藥物與Jl菌接觸或作用的方法、紫外線照射突變誘導法、在編碼來源于Jl菌的腈水合酶的基因(以下稱為:腈水合酶基因)中用PCR引入隨機突變的方法等。本發明中，發現了野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列(例如序列編號2)中第167位天冬酰胺被絲氨酸取代的改良型腈水合酶。本發明不僅篩選出上述這種改良型腈水合酶，還篩選出耐熱性進一步提高的改良型腈水合酶。該篩選方法是通過篩選符合上述“耐熱性”定義的突變體(突變基因)進行的。由此得到的酶，是具有下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列指腈水合酶的β亞基的氨基酸序列(例如序列編號2)上，第24位苯丙氨酸殘基、第88位異亮氨酸殘基、第92位谷氨酸殘基、第93位谷氨酸殘基、第96位組氨酸殘基、第103位谷氨酸殘基、第167位天冬酰胺殘基及第225位酪氨酸殘基中至少有一個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列。還包括具有下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列指腈水合酶的α亞基的氨基酸序列(例如序列編號4)上，第42位天冬酰胺殘基、第80位丙氨酸殘基、第118位丙氨酸殘基及第132位天冬氨酸殘基中至少有一個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列。本發明進一步包括具有下述氨基酸序列并且具有腈水合酶活性的蛋白質，所述氨基酸序列指野生型腈 水合酶的β亞基的氨基酸序列(序列編號2)上第167位天冬酰胺殘基被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列中，β亞基的氨基酸序列的第144位亮氨酸殘基、第219位纈氨酸殘基以及α亞基的氨基酸序列(序列編號4)上第129位纈氨酸殘基及第196位亮氨酸殘基中至少有一個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列。上述的復合突變體可通過任意方法制備，例如，可通過一條合成的核苷酸鏈進行特定位置的取代的方法或將多個含有不同單突變的DNA片斷利用限制性內切酶切割再重新連接的方法制備。只要不破壞耐熱性，允許在上述突變基礎上出現I個或多個(例如I個或者數個)氨基酸的取代、缺失以及/或者增加。例如，野生型腈水合酶β亞基的氨基酸序列(例如序列編號2)中或野生型腈水合酶α亞基的氨基酸序列(例如序列編號4)中的I 2個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代是允許的，或者，編碼野生型腈水合酶β亞基的基因(例如序列編號3)或編碼野生型腈水合酶α亞基的基因(例如序列編號3)所示的堿基序列編碼所得的氨基酸序列中I 2個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代也是允許的。以下，說明優選的氨基酸突變形態。本發明中，為敘述方便，可以使用氨基酸的單字母字符號及α或β亞基的氨基酸序列的氨基酸編號說明突變的形態。例如，F0 24L這一標記表示β亞基(例如序列編號2)的氨基酸序列中的第24位氨基酸由苯丙氨酸被取代為亮氨酸。又如，N0 167S這一標記表示β亞基(例如序列編號2)的氨基酸序列中的第167位氨基酸由天冬酰胺被取代為色氨酸。〈突變與取代的形態(1)>此形態為使腈水合酶的α或β亞基的至少一個的氨基酸殘基突變。單突變
1.24L2.1 β 88F3.Εβ 92Κ4.Εβ 93G5.Ηβ 96R6.Εβ 103D7.Νβ 167S8.Υβ 225Η9.Na 42D10.A a 80Τll.Aa 118V12.Da 132Ν

復合突變1.Εβ 93G, Εβ 103D2.Εβ 93G，Da 132Ν3.Ηβ 96R, Na 42D4.Εβ 92Κ, A a 80Τ產生上述的氨基酸取代時的堿基取代如下所述。應予說明，編碼β亞基、α亞基的基因DNA，分別以序列編號1、序列編號3所示的序列為例予以說明。單突變1:序列編號I中，第70 72位的堿基序列“TTC”被取代為CTT、CTC、CTA或CTG。特別優選第70位的T被取代為C (TTC — CTC)。單突變2:序列編號I所示的堿基序列中，第262 264位的堿基序列“ATC”被取代為TTT或TTC。特別優選第262位的A被取代為T (ATC — TTC)。單突變3:序列編號I所示的堿基序列中，第274 276位的堿基序列“GAA”被取代為AAA或AAG。特別優選第274位的G被取代為A (GAA — AAA)。單突變4:序列編號I所示的堿基序列中，第277 279位的堿基序列“GAG”被取代為GGG、GGC、GGA或GGT。特別優選第278位的A被取代為G (GAG — GGG)。單突變5:序列編號I所示的堿基序列中，第286 288位的堿基序列“CAC”被取代為CGC、CGG、CGA或CGT。特別優選第287位的A被取代為G (CAC — CGC)。單突變6:序列編號I所示的堿基序列中，第307 309位的堿基序列“GAG”被取代為GAC或GAT。特別優選第309位的G被取代為T (GAG — GAT)。單突變7:序列編號I所示的堿基序列中，第499 501位的堿基序列“AAC”被取代為AGC或AGT。特別優選第500位的被A取代為G (AAC — AGC)。單突變8:序列編號I所示的堿基序列中，第673 675位的堿基序列“TAC”被取代為CAC或CAT。特別優選第673位的T被取代為C (TAC — CAC)。單突變9:序列編號3所示的堿基序列中，第124 126位的堿基序列“AAC”被取代為GAC或GAT。特別優選第124位的A被取代為G (AAC — GAC)。單突變10:序列編號3所示的堿基序列中，第238 240位的堿基序列“GCC”被取代為ACC、ACG、ACA或ACT。特別優選第238位的G被取代為A (GCC — ACC)。
單突變11:序列編號3所示的堿基序列中，第352 354位的堿基序列“GCC”被取代為GTC、GTG、GTA或GTT。特別優選第353位的C被取代為T (GCC — GTC)。單突變12:序列編號3所示的堿基序列中，第394 396位的堿基序列“GAC”被取代為AAC或AAT。特別優選第394位的G被取代為A (GAC — AAC)。復合變異I 4的堿基序列的取代與單變異的取代相同。<突變與取代形態(2) > 此形態為使腈水合酶的β亞基的氨基酸序列至少2處發生突變或者β亞基的氨基酸序列至少I處并且α亞基的氨基酸序列至少I處發生突變。1.Νβ 167S, 144Η2.Νβ 167S, νβ 219Α3.Νβ 167S, Va 129Α4.Νβ 167S，144Η，νβ 219Α5.N β 167S, L β 144Η, V β 219Α, V a 129Α, L a 196Ρ產生上述的氨基酸取代時的堿基取代如下所述N β 167S:序列編號I所示的堿基序列中，第499 501位的堿基序列“AAC”被取代為AGC或AGT。特別優選第500位的A被取代為G (AAC — AGC)。L β 144Η:序列編號I所示的堿基序列中，第430 432位的堿基序列“CTC”被取代為CAC或CAT。特別優選第431位的T被取代為A (CTC — CAC)。νβ 219A:序列編號I所示的堿基序列中，第655 657位的堿基序列“GTC”被取代為GCT、GCC、GCA或GCG。特別優選第656位的T被取代為C (GTC — GCC)。Va 129Α:序列編號3所示的堿基序列中，第385 387位的堿基序列“GTG”被取代為GCT、GCC、GCA或GCG。特別優選第386位的T被取代為C (GTG — GCG)。L a 196P:序列編號3所示的堿基序列中，第586 588位的堿基序列“CTC”被取代為CCT、CCC、CCA或CCG。特別優選第587位的T被取代為C (CTC — CCC)。〈突變與取代的形態(3)>此變異形態是腈水合酶的β亞基的氨基酸序列中至少第26位或第48位氨基酸殘基被其他氨基酸取代。即，本發明提供對于芳香腈反應活性提高以及/或者耐熱性提高的腈水合酶。“腈水合酶”是催化腈化合物轉化為對應酰胺化合物的水合反應(RCN+2H20 — RCONH2)的酶。在此，“對于芳香腈反應活性提高的腈水合酶”是指對3-氰基吡啶的比活性提高1.5倍以上的酶。篩選方法為篩選符合上述“突變”定義的突變體(突變基因)。通過上述方法得到的對于芳香腈反應活性提高的酶是具有下述氨基酸序列的蛋白質，所述氨基酸序列為序列編號2 ( β亞基)的氨基酸序列上，第48位色氨酸殘基被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列。耐熱性提聞的酶是具有下述氣基酸序列的蛋白質，所述氣基酸序列為序列編號2 ( β亞基)的氨基酸序列上，第26位組氨酸殘基被其他氨基酸殘基取代的氨基酸序列。序列編號2所示的氨基酸序列(野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列)的第48位色氨酸被精氨酸取代時，不僅具有使腈水合酶耐熱性提高的效果，在對丙烯腈(短鏈脂肪族腈)具有底物特異性的基礎上，還使腈水合酶對3-氰基吡啶(芳香腈)的反應活性提聞。以下說明優選的氨基酸突變形態。例如，Wi3 48R這一標記表示β亞基(序列編號I)的第48位氨基酸殘基由色氨酸被取代為組氨酸。(I)對于芳香腈反應活性提高的突變W β 48R(2)耐熱性提高的突變Ηβ 26R(3)復合突變48R, Ηβ 26R產生上述的氨基酸取代時的堿基取代如下所述。ff^48R:序列編號I中，第142 144位的堿基序列“TGG”被取代為CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。特別優選第142位的T被取代為C (TGG — CGG)。Ηβ 26R:序列編號I中，第76 78位的堿基序列“CAC”被取代為CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。特別優選第77位的A被取代為G (CAC — CGC)。〈復合突變〉進一步，通過將上述〈突變與取代的形態 > 中(I) (3)中所記載的多個突變組合起來制備復合突變體的方法，可以制得同時具備兩種性質的突變酶。復合突變體可通過任意方法制備，例如，可通過一條合成的核苷酸鏈進行特定位置的取代的方法或將多個分別含有單個突變的DNA片斷利用限制性內切酶切割再重新連接的方法獲得。只要不破壞突變的性質，允許在上述突變基礎上出現氨基酸序列的缺失、被取代、增加等。例如，在上述已實施突變的氨基酸序列上，允許缺失I個或多個(例如I 10個，優選I 5個)氨基酸殘基，允許增加I個或多個(例如I 10個，優選I 5個)氨基酸殘基，或者，允許I個或多個(如I 10個，優選I 5個)氨基酸殘基被其他氨基酸殘基所取代。〈引入突變的方法〉上述的引入單個突變或復合突變的腈水合酶基因的制備方法，通過Kunkel法及Gapped duplex法等公知的方法實現,例如使用具有定點突變功能的試劑盒，如QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 公司生產)、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen 公司生產)、TaKaRa Site-DirectedMutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km 等:寶生物工程公司生產)來實現突變的引入[Nucleic.Acid.Res.10,6487 (1982) ；Molecular Cloning2nd Edt, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)]。在Jl以外菌株的腈水合酶中，通過上述的突變位點、突變的氨基酸種類、DNA序列也可引起耐熱性的提高。這 些菌株包括上述的玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8 (SU1731814)、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) M33 (VKM Ac_1515D)、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC39484(特開平 2001-292772)、史密氏桿菌(Bacillus smithii)(特開平 09-248188)等。
進一步，本發明的基因DNA還包括上述序列編號I或3所示的堿基序列中引入突變所得的堿基序列的互補堿基序列所得的DNA和嚴謹條件下可雜交的DNA。嚴格條件指:例如鹽(鈉)濃度150 900mM，溫度55 75°C，優選鹽(鈉)濃度250 450mM，溫度在68℃。〈酰胺化合物耐受性〉本發明的改良型腈水合酶還具有酰胺化合物耐受性的性質。在此，酰胺化合物耐受性指與其他來源于野生株的腈水合酶相比，可以在酰胺化合物存在下保持腈水合酶活性。本發明的突變型腈水合酶所耐受的酰胺化合物并無特別限制，可列舉例如用以下化學式所表示的化合物:R-CONH2(在此，R為取代或未被取代的烷基、取代或未被取代的烯基、取代或未被取代的環烷基、取代或未被取代的芳香基或者取代或未被取代飽和或不飽和雜環基)等。特別的，優選式中R為CH2 = CH的丙烯酰胺。酰胺化合物耐受性，例如，可通過以下方法來評價，即在丙烯酰胺等酰胺化合物(例如30 50%等高濃度)存在下，分析具有本發明改良型腈水合酶的轉化體的培養物或從轉化體中分離的腈水合酶對丙烯腈等腈化合物底物的消耗量或消耗速度。與來源于母體株的腈水合酶相比，例如，當消耗量或消耗速度超過1.1倍時，可評價為具有酰胺化合物耐受性。<重組載體及轉化(轉導)體的制備>以下說明具有上述腈水合酶基因的載體和轉化(轉導)體的制備方法。為使腈水合酶基因能夠在被轉化或轉導的宿主生物中表達，須將其重組入載體。例如，作為載體可列舉質粒DNA、噬菌體DNA、反轉座子DNA、人工染色體DNA等。作為宿主，可使用大腸桿菌、枯草桿菌等細菌、酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等。大腸桿菌作為宿主時，優選使用表達效率高的表達載體，例如具有trc啟動子的表達載體PKK233-2 (安瑪西亞生物科技公司生產)或pTrc99A (安瑪西亞生物科技公司生
廣)等。載體中除腈水合酶基因外還可連接啟動子、終止子、增強子、拼接信號、polyA插入信號、篩選標記、核糖體結合序列(SD序列)等。另外，作為篩選標記可列舉例如卡那霉素抗性基因、二氫葉酸還原酶基因、氨芐西林抗性基因、新霉素抗性基因等。以下，說明宿主的種類以及重組載體轉化宿主的方法。細菌作宿主時，大腸桿菌可列舉例如大腸桿菌(Escherichia coli)等，紅球菌(Rhodococcus)可列舉例如玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC12674、玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC17895、玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous) ATCC19140等。這些ATCC菌株從美國典型培養物保藏中心(American TypeCulture Collection)得到。重組載體轉化細菌的方法并無特別限制，只要是將DNA導入細菌的方法即可，可使用例如鈣離子法、電穿孔法等。酵母作宿主時,可使用例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等。重組載體轉化酵母的方法并無特別限制，只要是將DNA導入酵母的方法即可，可使用例如電穿孔法、原生質球轉染法、醋酸鋰法等。動物細胞作宿主時可使用綠猴C0S-7細胞、Vero, CHO細胞、小鼠L細胞、大鼠GH3細胞、人FL細胞等。重組載體轉化動物細胞的方法可使用例如電穿孔法、磷酸鈣法、脂質轉染法等。昆蟲細胞作宿主時可使用Sf9細胞、Sf21細胞等。重組載體轉化昆蟲細胞的方法可使用例如磷酸鈣法、脂質轉染法、電穿孔法等。植物細胞作宿主時可列舉煙草BY-2細胞等，但并不僅限于此。重組載體轉化植物細胞的方法可使用例如農桿菌介導法、粒子槍法、PEG法、電穿孔法等。〈腈水合酶的制備〉下面說明腈水合酶及其制備方法。本發明的腈水合酶可通過培養以上述方法制備的具有腈水合酶基因的轉化(轉導)體，從其培養物提取而得到。在此，培養物任指培養上清、培養細胞或培養菌體和細胞或菌體的破碎物。培養本發明的轉化(轉導)體的方法，可使用以下例舉的宿主依常法進行。培養以大腸桿菌、酵母菌等微生物為宿主的轉化體的培養基含有可以資化微生物的碳源、氮源、無機鹽類等，只要其可有效培養轉化體，可使用任意天然培養基、合成培養基。作為碳源，可列舉葡萄糖、果糖、蔗`糖、淀粉等碳水化合物，醋酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類。作為氮源，除可用氨水、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無機酸或有機酸銨鹽或其他含氮化合物外還可列舉蛋白胨、肉糜、玉米漿等。作為無機物，可列舉磷酸氫亞鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。培養通常在振蕩培養或通氣攪拌培養等需氧條件下、30-40°C下進行。pH的調整使用無機或有機酸、堿溶液等。培養中根據需要可在培養基中添加氨芐西林或四環素等抗生素。培養基中也可添加腈水合酶的補缺金屬即鈷離子或鐵離子，還可添加腈類或酰胺類作為酶誘導劑。以誘導性啟動子作啟動子，用表達載體培養轉化的微生物時，可根據需要在培養基中添加誘導物。例如，培養用具有可被異丙基_β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導的啟動子的表達載體轉化的微生物時，可在培養基中添加IPTG。又如，培養用具有可被吲哚乙酸(IAA)誘導的trp啟動子的表達載體轉化的微生物時，可在培養基中添加IAA。培養以動物細胞作宿主等到的轉化體所用的培養基，可列舉常用的RPMI1640培養基、DMEM培養基或在這些培養基中添加胎牛血清的培養基等。培養通常在5% CO2下，37°C培養I 30天。培養中可根據需要在培養基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。從培養基中提取腈水合酶的方法可通過反復超聲波處理、冷凍溶解后勻漿處理，將菌體或細胞破碎從而提取目標蛋白質。轉化體為植物細胞或植物組織時，培養可使用常用的植物培養用培養基，例如MS基礎培養基、LS基礎培養基進行。培養方法可采用任意常用的固體培養法或液體培養法。從培養物中提取腈水合酶的方法是，首先，通過以纖維素酶、蛋白酶等酶進行的細胞溶解處理、超聲破碎處理、磨碎處理等破壞細胞。然后，過濾或離心除去不溶物，得到粗蛋白質溶液。從上述粗溶液純化本發明的蛋白質，通過單獨或適當結合使用鹽析、各種色譜(例如凝膠過濾色譜、離子交換色譜、親和色譜)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法進行。另外，在菌體外或細胞外生產本發明的蛋白質時，使用培養液本身或通過離心除去菌體或細胞。然后，通過單獨或適當結合使用常用的蛋白質分離純化生物化學方法，例如硫酸銨沉淀、凝膠色譜、離子交換色譜、親和色譜等，可從上述培養物中分離純化本發明的蛋白質。另外，本發明中，也可以利用編碼本發明的腈水合酶的基因DNA或上述載體，通過完全不使用生物細胞的無細胞蛋白質合成體系合成并提取目標蛋白質。無細胞蛋白質合成體系是使用細胞提取液在試管等人工容器內合成蛋白質的體系，例如讀取mRNA的信息，在核糖體上合成蛋白質的體系。應予說明，本發明所使用無細胞蛋白質合成體系也包含以DNA為模版合成RNA的無細胞轉錄體系。上述細胞提取液，可使用來源于真核細胞或來源于原核細胞的提取液，例如，小麥胚芽、兔網狀紅血球、小鼠 L-細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母、大腸桿菌等的萃取液。應予說明，這些提取液可以經過濃縮或不經濃縮。在此,DNA上密碼化的遺傳信息通過轉錄轉化為mRNA,進而翻譯轉化為蛋白質。為在人工容器內再現這一過程合成蛋白質，需要核糖體、tRNA、各種蛋白質因子等，還需要構建可穩定翻譯酶系并根據目的生產mRNA的系統。細胞提取液，例如可通過超濾、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等得到。本發明的無細胞蛋白質合成也可使用市售試劑盒進行。所述試劑盒可列舉例如PROTEI OS (東洋紡織)，TNT System (Promega普洛麥格)、PG-Mate 合成裝置(東洋紡織)、RTS(Roche Diagnostics 羅氏診斷)等。通過無細胞蛋白質合成得到的突變型腈水合酶可以選擇適當的色譜純化。另外，突變型腈水合酶的純化可用SDS-PAGE等確認，活性測定可以通過測定腈化合物轉化為酰胺化合物的轉化率來進行。<酰胺化合物的制備>下面，說明利用轉化(轉導)體制備酰胺化合物的方法。上述培養法得到的培養物、酶等作為將腈化合物轉化為對應酰胺化合物時的生物催化劑所使用。作為轉換反應的底物使用的腈化合物，可根據生物催化劑的底物特異性適當選擇。例如，來源于玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株的腈水合酶適合的底物為丙烯腈。生物催化劑的使用形態、反應方式可根據生物催化劑的種類適當選擇。例如，作為生物催化劑的使用形態，既可以使用上述培養物、純化酶本身，也可以將它們固定于合適的載體上作為固定酶使用。實施例下面通過實施例對本發明進行更加詳細地說明，但本發明并不限于以下實施例。另外應予說明，玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株，以FERM BP-1478為編號保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東I丁目I番地-1中央第6)(原保藏日:1987年9月18日)。[實施例1]改良型腈水合酶基因的獲得(I)
(I)染色體DNA的制備玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous) J-1 株接種于 100ml MYK 培養基(0.5%多聚蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.3%麥芽提取物、I %葡萄糖、0.2% K2HPO4^0.2%KH2PO4, pH7.0)中，30°C振蕩培養72小時。培養后，收集菌體，將收集的菌體懸浮于4ml Saline-EDTA溶液(0.1M EDTA、
0.15MNaCl(pH8.0))中。混懸液中加入8mg溶菌酶，在37°C下振蕩I 2小時后，在_20°C下冷凍。接著，邊平穩振蕩邊加入IOml的Tris-SDS溶液(I % SDS、0.1M NaCU0.1MTris-HCl (pH9.0))，之后再加入蛋白酶K (Merck公司)(最終濃度0.lmg)，37°C振蕩I小時。接著，加入等量的用TE飽和的苯酚溶液并攪拌(TE:10mM Tris-HClUmMEDTA (pH8.0))，離心，取上層溶液，加入2倍量的乙醇后，用玻璃棒卷取DNA。以90 %、80 %、70%的乙醇依次脫除苯酚。接著，將DNA溶解于3ml的TE緩沖液中，加入核糖核酸酶A溶液(已經100°C 15分鐘加熱處理)至最終濃度 ο μ g/ml，并在37°C下振蕩30分鐘。然后，加入蛋白酶K，在37°C下振蕩30分鐘后，加入等量的用TE飽和的苯酚溶液，離心使上層溶液與下層溶液分離。同樣的操作對上層溶液重復兩次之后，加入等量的氯仿(含4%異戊醇)，重復同樣的提取操作(以下該操作稱為苯酚處理)。之后取上層溶液加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取回收DNA，得到染色體DNA樣品。(2)質粒的構建首先，為了用作耐熱性評價的對照，利用通常的PCR方法對野生型的腈水合酶基因進行擴增。PCR反應以下面記載的反應液組成、反應條件進行。應予說明，引物JH1_02(序列編號5)及引物NH-17 (序列編號6)各自的序列上已預先引入了限制性內切酶NcoI和限制性內切酶Hindi 11的識別位點，擴增的DNA產物在兩種限制性內切酶的切割下，可輕松地插入后述表達載體pTrc99A的NcoI部位-HindIII部位之間。<反應液組成>
權利要求
1.一種蛋白質，是野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列上第93位谷氨酸殘基被其他氨基酸殘基取代并且具有耐熱性腈水合酶活性的蛋白質， 所述其他氨基酸殘基是選自甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸中的任意一個氨基酸殘基， 所述野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列如SED ID Ν0:2所示。
2.如權利要求1所述的蛋白質，進一步地，β亞基的第103位谷氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代。
3.如權利要求1所述的蛋白質，進一步地，野生型腈水合酶的α亞基的氨基酸序列上，第132位天冬氨酸殘基被天冬酰胺殘基取代，所述野生型腈水合酶的α亞基的氨基酸序列如 SED ID NO:4 所示。
4.一種DNA，編碼權利要求1 3中的任意一項所述的蛋白質。
5.一種重組載體，含有權利要求4所述的DNA。
6.一種轉化體，含有權利要求5所述的重組載體。
7.一種制備腈水合酶的方法，其特征在于，培養權利要求6所述的轉化體，從所得培養物提取腈水合酶。
8.一種制備酰胺化合物的方法，培養權利要求6所述的轉化體，使所得的培養物或該處理物與腈基化合物 接觸，提取通過該接觸生成的酰胺化合物。
全文摘要
本發明提供具有改良型腈水合酶活性的蛋白質，該蛋白質通過改變腈水合酶的氨基酸序列得到，與野生型腈水合酶活性相比耐熱性提高；本發明還提供編碼該蛋白質的基因DNA，具有該基因DNA的重組載體，具有該重組載體的轉化體或轉導體，提取自該轉化體或轉導體培養物的腈水合酶及其制備方法，以及酰胺化合物的制備方法。
文檔編號C12N1/15GK103146670SQ201310054539
公開日2013年6月12日 申請日期2005年5月26日 優先權日2004年5月26日
發明者渡邊文昭, 氏原大, 酒井美紀, 湯不二夫, 中村哲二 申請人:Dia-Nitrix株式會社