專利名稱：一種菲利普孢囊線蟲lamp快速檢測方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種菲利普孢囊線蟲LAMP快速檢測方法及應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
小麥孢囊線蟲(cereal cyst nematode, CCN)是全世界范圍內分布的禾谷類作物重要病原線蟲。該線蟲自1874年在德國被發現以來，目前在全世界40多個國家均有發生和危害，其中中國、澳大利亞、歐洲、印度、中東等地區的禾谷孢囊線蟲病危害嚴重并遭受了巨大的經濟損失。目前小麥孢囊線蟲組(Heterodera avenae group)共包括12種孢囊線蟲,其中以禾谷孢囊線蟲(H.avenae)、菲利普孢囊線蟲(H.filipjevi)和大麥孢囊線蟲(H.1atipons)危害最為嚴重。在我國，禾谷孢囊線蟲自1989年在湖北天門縣矮黃麥株上首次發現以來[陳品三，王明祖，彭得良.我國小麥禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae wollenweber)鑒定研究[J].植物病理學報，1992，22 (4): 339— 343]，目前在我國小麥主產區的河北、河南、北京、山西、內蒙古、青海、湖北、安徽等16省、市和自治區均有發生和分布，危害面積達400萬hm2以上，且有逐漸蔓延之勢，目前已成為危害我國麥類作物的重要病原線蟲(彭德良等，我國小麥孢囊線蟲的新發生分布地區.中國線蟲學研究第二卷，2008，2:344-345;黃文坤，葉文興，王高峰，龍海波，歐師琪，彭德良，寧夏地區禾谷孢囊線蟲的發生與分布.華中農業大學學報，2011, 30(1): 74-77)。據調查，一般病田可減產20%_40%，嚴重地塊減產達70%以上[彭德良，張東升，齊淑華，陳品三等，我國小麥孢囊線蟲(Heterodera avenae)發生分布區域和防治初步研究.植物保護研究進展，1995，p53-56.中國科學技術出版社]。1981年菲利普孢囊線蟲最先在塔吉克斯坦被報道(Madzhidov，A.R.1981.Bidera filipjevi n.sp.(Heteroderina:Tylenchida)inTadzhikistan.1zv.Akad.NaukTadzh.SSR Otd.Biol.Nauk2:40-44)，目前已經在歐洲、亞洲、北美均有發生和分布(Smiley, R.ff., Yan, G.P., and Handoo, Z.A.2008.First Record ofthe CystNematode Heterode ra filipjevi on Wheat in Oregon.Plant Disease92(7):1136 ；Ho I gado, R., Andersson, S., Rowe, J.A., and Magnusson, C.2004First recordofHeterodera filipjevi in Norway.Nematologia Mediterranea32(2):205-211 ； X 彭德良等最先在我國河南湯陰發現菲利普孢囊線蟲危害(Peng，D.L.，Ye, ff.X.，Peng, H.，andGu,X.C.2010.First Report ofthe Cyst Nematode(Heterodera filipjevi)on Wheatin Henan Province, China.Plant Disease94 (10):1262-1262.)。目前該線蟲被認為是國際小麥等禾谷類作物生產中面臨的潛在威脅性線蟲。菲利普孢囊線蟲危害也非常嚴重，在土耳其該線蟲造成冬小麥減產35% (Nicol, J.M.，Bolat, N.，Sahin,
E., Tiilek, A., Ylldlrlm, A.F., Yorgancllar, A., Kaplan, A., and Braun, H.J.2006.The cereal cyst nematode is causing economic damage on rain-fed wheatproduction systemsofTurkey.Phytopathology96:S196 ；Yan,G.P.,and Smiley,R.ff.2008.First detection ofthe cereal cyst nematode Heterodera filipjeviin North America.Phytopathology98:176),在伊朗最大造成了 48% 的產量損失(Hajihasani, A., Tanha Maafi, Z., Nicol, J.M., and Rezaee, S.2010.Effect ofthecereal cyst nematode, Heterodera filipjevi, on wheat in microplot trials.Nematologyl2 (3): 357-363.)。目前菲利普孢囊線蟲病主要發生在河南省，且造成了嚴重的產量損失，目前已經成為我國的麥類作物生產中的又一嚴重威脅，嚴重制約著麥類作物生產的發展，同時該線蟲的發生分布還不十分的明確，對該線蟲做出快速準確的鑒定是當前麥類作物生產急需解決的問題。菲利普孢囊線蟲和禾谷孢囊線蟲的形態學差異非常小，主要在于菲利普孢囊線蟲陰門錐有下橋結構，而禾谷孢囊線蟲沒有該結構，同時孢囊顏色、囊泡，雙膜孔的形狀也有細微的差異(Subbotin, S.A., ffaeyenberge, L., Molokanova, 1.A., and Moens, Μ.1999.1dentification of species from the Heterodera avenae group by morphomometricsand ribosomal DNA RFLPs.Nematology (I): 195-207),但是這些差異需要豐富的專業知識才能夠區分，在生產實際中很難應用，同時傳統的形態學鑒定耗時較多，工作量大很難滿足目前的高通量快速檢測的要 求。今年來，隨著分子生物學的快速發展，PCR等快速檢測技術已經廣泛的運用到植物線蟲的快速檢測和鑒定中。目前運用到孢囊線蟲的檢測技術主要包括ITS-RFLP，PCR，realtime PCR 等。zheng等采用ITS-RFLP技術，通過HinfI內切酶酶切ITS區域，發現中國的禾谷孢囊線蟲和歐洲H.avenae (A型)和印度群體(B型)均不相同，稱其為“C型”(Zheng, J., Subbotin S.A.,ffaeyenberge L., Moens Μ., Molecular characterizationof Chinese Heterodera glycines and H.avenae populations based on RFLPs andsequences of rDNA-1TS regions.Russian Journal of Nematology2000, 8:109-113.X彭德良等擴增了中國小麥禾谷孢囊線蟲群體的核糖體基因的內轉錄間隔區，用AluI和RsaI酶切ITS擴增產物證明中國禾谷孢囊線蟲ITS屬于“B型”，Hinf I酶切揭示出中國與摩洛哥禾谷孢囊線蟲ITS之間存在明顯差異(彭德良，Subbotin S.A., M.Moens.小麥禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)的核糖體基因(rDNA)限制性片段長度多態性研究.植物病理學報，2003, 33(4):323-329)。Subbotin等同樣采用ITS-RFLP技術通過Cfo I內切酶能夠有效的區分菲利普孢囊線蟲(Subbotin, S.A., Sturhan, D., Rumpenhopst, H.J., andMoens, Μ.2003.Molecular and morphological characterisation of the Heteroderaavenae complex species(Tylenchida:Heteroderidae).Nematology5(5):515-538.X Yan等運用rDNA-1TS區域RFLP結合形態學鑒定的方法對美國部分地區的禾谷孢囊線蟲進行了檢測，該方法通過6種限制性內切酶能夠有效的區分禾谷孢囊線蟲和菲利普孢囊線蟲(Yan, G.P., and Smiley,R.ff.2010.Distinguishing Heterodera filipjevi and H.avenaeusing polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism andcyst morphology.PhytopathologylOO (3): 216-224.)。Fu 等對我國黃淮海麥區的禾谷抱囊線蟲進行了 ITS 和 RFLP 分析(Fu Bo, Ian T.Riley, Li Honglian, et al.Molecularcharacterisation of cereal cyst nematodes in winter wheat on the Huang-Huaifloodplainof China using RFLP and rDNA-1TS sequence analyses.Australasian PlantPathol2011, 40:277285)。
在孢囊線蟲模式線蟲甜菜孢囊線蟲的檢測中，Amiri等通過對H.betae、H.cicer1、H.glycines 和 H.medicaginis、H.schachti1、H.trifolii 的 ITS 序列進行分析，篩選出特異性引物SHF6，將此引物與AB28 (或rDNA2)引物結合，構建了甜菜孢囊線蟲一步雙重 PCR 的檢測方法(Amiri S., Subbotin S.A., Moens Μ., An efficient method foridentification ofthe Heterodera schachtii sensu stricto group using PCR withspecific primers.Nemato1.medit.2001, 29:241-246)。Subbotin S A, Peng D L, Moens M.運用雙重PCR檢測大豆孢囊線蟲的方法,在一個PCR反應體系中同時運用通用引物D3A和D3B以及特異性引物GlyFl和rDNA2，從52個大豆孢囊線蟲群體中均擴增出兩個DNA片斷(18Ibp and345bp),檢測的敏感度高達單個抱囊、單頭二齡幼蟲的微量 DNA (Subboton S.A., Peng D L, Moens M., A rapid methodfor the identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines usingduplex PCR.Nematology2001，vol.3(4): 365-371)。0u, S.Q.和 Peng D.L 采用 RAPD 技術，獲得了基于大豆孢囊線蟲基因組DNA的特異性SCAR標記，同時和D2A和D3B相結合，發明了一步雙重PCR方法檢測大豆孢囊線蟲。在PCR擴增條件下，大豆孢囊線蟲群體都獲得了 500bp 的特異性 SCAR 標記片段和 800bp 片段(0u S.Q., Peng D.L.,Li Y.，MoensM.,Identification ofHeterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplified region(SCAR)primers.Nematology2008, 10(3):397-403)。亓曉莉等采用RAPD的方法，研究出禾谷孢囊線蟲特異性SCAR分子標記，該方法能夠特異的將禾谷孢囊線蟲與菲利普孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲和豌豆孢囊線蟲區分開，檢測靈敏度高達1/80條2齡幼蟲(亓曉莉，彭德良，彭煥，龍海波，黃文坤，賀文婦.基于SCAR標記的小麥禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)快速分子檢測技術.中國農業科學，2012,45(21):4388-4395)。同時，Ophel-Keller等開發出蟲土壤中直接檢測禾谷孢囊線蟲的real time PCR檢測技術,靈敏度達I個卵/lg(0phel_Keller Kathy,McKayAlan, Hartley Di, Herdina and Curran, John.Development of a routine DNA-basedtesting service for soilborne diseases in Australia.Australian Plant Pathology,2008，37:243-253)。以PCR為基礎的分子鑒定方法一定程度上彌補了傳統形態鑒定上的缺陷。但PCR檢測需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(紫外儀)等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，以上檢測只能在實驗室條件下才可以檢測，需要較長的時間，限制了 PCR檢測方法在生產中的推廣應用，在禾谷孢囊線蟲發生分布調查和田間快速診斷過程中，迫切需要一種簡便快捷的檢測手段。循環恒溫擴增技術(loop-mediatedisothermal amplification of DNA, LAMP)是2000年日本榮研株式會社Notomi等人開發的一種新型循環恒溫核酸擴增技術。(NotomiT,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T, Watanabe K, Amino N and Hase T.Loop-mediatedisothermal amplification ofDNA [J].Nucleic Acids Res, 2000, 28 (12): e63.),該技術通過識別靶序列上6個特異區域的特異性引物和利用具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下能特異、高敏、快速地擴增靶序列。該技術有如下特點:1)特異性強、靈敏度高。LAMP反應正針對靶基 因序列的6-8個特異性位點設計出4-6條引物，相比普通其他分子檢測方法具有更強的特異性。2)擴增反應時間短、設備要求簡單。LAMP反應具有極高的擴增效率，30-90分鐘內可將靶基因擴增IO9-1Oltl,同時擴增過程無需專業的PCR儀等設備，簡單的水浴即可完成反應。3)檢測結果可以肉眼直接觀察，簡便快捷。由于該檢測方法具有特異性強，靈敏度高，快速簡便等特點，目前已廣泛引用于人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測中。但在植物病原線蟲檢測中的運用剛剛起步，2008年日本科學家首次利用LAMP技術建立了從病木中直接檢測松材線蟲LAMP檢測的方法(Kikuchi T, AikawaT, OedaY, Karim N, Kanzaki N.A Rapid and Precise Diagnostic Method for Detectingthe Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus by Loop-Mediated IsothermalAmplification.Nematology, 2009，12:1365-1369)。2011 年 Niu et al 等建立了南方根結線蟲LAMP檢測技術，能夠從土壤和根結中檢測出南方根結線蟲(Niu J H, Guo Q X，JianH,Chen C L, Yang D, Liu Q, Guo Y D.Rapid detection of Meloidogyne spp.by LAMPassay in soil and roots.Crop Protection, 2011，8:1063-1069)和象耳豆根結線蟲(NiuJ H, Jian H, Guo Q X, Chen C L, Wang X Y,Liu Q, Guo Y D.Evaluation of loop-mediatedisothermal amplification(LAMP)assays based on5S rDNA_IGS2regions for detectingMeloidogyne enterolobi1.Plant Pathology, 2011，02562.x)。2012 年彭德良首次以象耳豆根結線蟲ITS為靶標，建立了象耳豆根結線蟲LAMP快速檢測技術，檢測靈敏度達到1/200000 條幼蟲(專利號:201110034960)。2012 年彭煥等(Peng H, Peng D L, Hu X Q, He XF，Wang Q, Huang W K, He ff T.Loop-mediated isothermal amplification for rapid andprecise detection of the burrowing nematode, Radopholus similis, directly fromdiseased plant tissues.Nematology, 2012, 14 (8):977-986.)研究出從摧病植物組織中用LAMP快速和特異性檢測香蕉穿孔線蟲的方法，檢測極限達1/20000條幼蟲，靈敏度比常規PCR檢測高100倍。除此之外，LAMP檢測技術在菲利普孢囊線蟲上尚無相關報道，本發明首次建立了菲利普孢囊線蟲LAMP快速檢測方法。
發明內容
本發明的目的是建立循環恒溫擴增技術(LAMP)檢測菲利普孢囊線蟲的LAMP快速檢測方法，該方法具有靈敏度高、特異性強等特點，適用于各種實驗條件下檢測工作的使用，也適合在實驗條件不足的室外檢測。一種菲利普孢囊線蟲LAMP快速檢測方法，其特征在于:其中LAMP反應體系所使用的引物是:①HF11-F3:5'-GGCAGCGATCAAAAGACT-3' ；②HFl 1-B3:5' -AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3' ;③HFl1-BIP:5' -GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTTGGAGCCATGTTATTT TGTTGA-3' ;④HFl1-FIP:5'-TCTTGGTGCCCAAACTTCCCGCATCTAACATTCTCAATA ATTGTC-3';⑤HFl 1-LF:5' -GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3' ;⑥HFl1-LB:5' -TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3' ;其中的LAMP反應體系包括:I)引物混合液: 外引物HF11-F3和HF11-B3各0.2ymol/L，內引物HF11-FIP和HFll-BIP 各 1.4 μ mol/L,環引物 HFll-LB 和 HFll-LF 為 0.4 μ mol/L ；2)反應混合液:2.0mmol/L dNTP, 20mmol/LTris-HCl(pH8.8), 10mmol/LKCl, 5mmol/LMgS04, I Ommol/L (NH4)2S04, 0.l%Triton x-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段;
3) I μ IDNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補全到25 μ I。其中LAMP反應條件如下:將引物混合液和反應混合液混合均勻后加入I μ IDNA模板，61 65°C保溫 30 90min，85°C保溫 lOmin。LAMP反應的最終產物中加入顯色劑，輕甩離心管后觀察。所述顯色劑為SYBRgreen I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1:9。所述DNA模板的提取方法為:挑取單個菲利普孢囊放入裝有10 μ IddH2O的0.2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在_80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min, 95°C反應IOmin處理后12000rpm離心Imin后，上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應，所述LB溶液為500mmol/L KCl,10mmol/LTris-HCl, 15mmol/LMgCl2,1.0mmol/L DTT, 4.5%Tween20,等體積混勻，過濾滅菌。上述任一檢測方法在診斷植物、土壤的菲利普孢囊線蟲感染情況或鑒別菲利普孢囊線蟲中的應用。本發明利用循環恒溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamp Ii feat ion, LAMP)建立針對菲利普孢囊線蟲的檢測方法。本方法具有多條引物的擴增，并在兩端形成了帶有引物功能 的環狀結構，這種多引物結合和可自產生引物的原理使其具有了靈敏度高、特異性強等特點，由于LAMP反應操作步驟簡單及反應產物經熒光顯色后，結果可以通過肉眼直接判定，適用于各種實驗條件下檢測工作的使用，特別適合在實驗條件不足的室外檢測。本發明的方案具體實施步驟如下:1.線蟲DNA提取試劑配制I) LB (Lysis Buffer)溶液:500mmol/L KCI, 10mmoI /I, Tris-HCl, 15mmol/LMgCl2, 1.0mmol/L DTT, 4.5%Tween20,121。。滅菌 15min。2)蛋白酶K:600 μ g/ml蛋白酶K，過濾滅菌。2.DNA 的提取挑取單個菲利普孢囊放入裝有10 μ I ddH20的0.2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用無菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2μ I的eooyg/ml蛋白酶K溶液，然后在-80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應。3.菲利普孢囊線蟲PCR擴增及序列分析采用本實驗室開發的菲利普孢囊線蟲SCAR特異性分子標記引物0PK16-HfF2(5'-CAGGACGAAACTCATTCAACCAA-3')和 0PK16_HfR2(5' -AGGGCGAACAGGAGAAGATTAGA-3' )對菲利普孢囊線蟲進行 PCR 檢測。PCR 擴增反應體系為50 μ 1，PCR反應體系為10XBuffer (含Mg2+) 5 μ 1，IOmM dNTP4y 1，引物0PK16_HfF2 和 0PK16_HfR2 (10 μ mol/L)各 I μ 1，Taq 酶(5U/μ I, Takara)0.5 μ 1，模板DNA5y 1，滅菌ddH20補足至50 μ I。PCR擴增條件為:95°C預變性5min，58°C退火30sec，72°C延伸1.5min ;35個循環；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴增后，取5μ I擴增產物加I μ I加樣緩沖液在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測并照相回收、克隆和測序，序列測定由北京六合華大基因科技有限公司完成。4.菲利普孢囊線蟲LAMP引物設計根據菲利普孢囊線蟲SCAR片段的測序結果為模板，采用在線軟件設計、實驗篩選出以下6條特意性強，穩定性高的引物，序列如下:①HF 11-F3:5' -GGCAGCGATCAAAAGACT-3' ；②HFl 1-B3:5' -AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3' ;③HFll-BIP:5'-GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTT-GGAGCCATGTTATT TTGTTGA-3';④HFll-FIP:5'-TCTTGGTGCCCAAACTTCCC-GCATCTAACATTCTCAATAA TTGTC-3';⑤HF 11-LF: 5' -GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3' ;⑥HFl 1-LB:5' -TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3' ;5.LAMP反應體系配置:外引物HF11-F3和HF11-B3各0.2 μ mol/L,內引物HFl 1-FIP和 HFl 1-BIP 各 1.4 μ mol/L，環引物 HFl 1-LB 和 HFl 1-LF 為 0.4 μ mol/L，2.0mmol/LdNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，I Ommol/L KCl, 5mmol/L MgSO4, lOmmol/L (NH4) 2S04, 0.1%Triton x-100和8U Bst DNA聚合酶大片段，I μ IDNA模板，用滅菌雙蒸餾水補足25 μ I。6.LAMP反應擴增條件:將以上混合液置于65°C恒溫水浴中等溫擴增75min，再85°C保溫lOmin，反應結束 后加入I μ I配制好的顯色劑混勻后觀察結果。7.LAMP結果檢測:結果可以采用以下兩種檢測方法:I)將上述反應完的體系中加入I μ I的顯色劑。輕晃混勻，即可觀察；2)取2 μ I擴增產物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；本發明所提供的菲利普孢囊線蟲LAMP快速檢測方法具有以下優點:一、靈敏度高。對菲利普孢囊線蟲的檢測極限可達到1/20000個孢囊水平，比常規PCR檢測菲利普孢囊線蟲的檢測靈敏度高100倍。二、特異性強。所用的特異引物根據菲利普孢囊線蟲的特異性的SCAR片段的八個不同位置設計出6條引物，特異性比常規PCR要強。三、檢測時間短。1.5小時左右可獲得檢測結果，比常規PCR檢測縮短2 4h。四、對儀器設備要求簡單，不需要任何PCR儀、凝膠電泳和成像系統等專業儀器設備，簡單的水浴鍋或者保溫設施就可以完成檢測。五、操作簡單、結果直接。整個檢測過程不涉及復雜儀器和和實驗操作，一般技術人員即可完成檢測，結果通過肉眼即可判定。六、對人和環境友好。檢測過程不需要使用EB等有毒試劑，對人和環境非常安全。綜上所述，本發明比現有的檢測菲利普孢囊線蟲方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性。可以在實際生產中進行現場應用檢測。該技術可應用于對菲利普孢囊線蟲田間土壤樣品及菲利普孢囊線蟲病的發生早期快速分子檢測，具有實際的應用價值。
圖1為菲利普孢囊線蟲RAPD序列的LAMP引物設計示意圖，圖2為菲利普孢囊線蟲LAMP方法檢測，
A為加熒光染料檢測結果，1:陽性結果，具有綠色熒光，2:陰性對照，為紅褐色。B檢測結果為電泳圖，M:D2000DNA標準分子量(Takara)1:陽性結果，為LAMP擴增梯形條帶，2:陰性對照，無擴增產物。圖3為菲利普孢囊線蟲LAMP檢測方法特異性檢測結果圖A為LAMP加熒光染料檢測結果圖，1-10分別為:禾谷孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲、豌豆孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、香蕉穿孔線蟲和象耳豆根結線蟲。B為LAMP檢測結果電泳圖，M:D2000DNA標準分子量(Takara)，1-10分別為:禾谷孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲、豌豆孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、香蕉穿孔線蟲和象耳豆根結線蟲。圖4為菲利普孢囊線蟲靈敏度檢測結果A為LAMP加熒光染料檢測結果圖，I 7分別為:單頭線蟲，10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6和陰性對照。B為LAMP檢測結果電泳圖，M:D2000DNA標準分子量(Takara)，I 7分別為:單頭線蟲，10-1、10_2、10_3、I O-4、1 O-5、10_6 和陰性對照。C為普通PCR法檢測結果電泳圖，M:D2000DNA標準分子量(Takara)，I 7分別為:單頭線蟲，10-1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、陰性對照。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明。所述試劑均為市售，所用菲利普孢囊線蟲本申請人實驗室均有保存，可以免費向公眾發放。主要試劑:Taq DNA聚合酶購自天根公司；DNA marker購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成；pGEM_T EasyVector購于美國promega Pro K(蛋白酶K)購自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段購自New England Biolabs公司；SYBR green I購自 Invitrogen 公司。實施例1菲利普孢囊線蟲DNA的提取、RAPD擴增及序列分析1.1菲利普孢囊線蟲DNA的提取挑取單個菲利普孢囊放入裝有10 μ I ddH20的0.2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用無菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2μ I的eooyg/ml蛋白酶K溶液，然后在-80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應。1.2菲利普孢囊線蟲SCAR片段擴增及序列分析應用SCAR 標記弓丨物 0PK16-HfF2(5'-CAGGACGAAACTCATTCAACCAA-3')和0PK16-HfR2 (5' -AGGGCGAACAGGAGAAGATTAGA-3' )擴增菲利普孢囊線蟲特異性 SCAR 片段。PCR擴增反應體系為50 μ 1，PCR反應體系為10XBuffer (含Mg2+) 5 μ I, IOmM dNTP4 μ 1，引物 0PK16-HfF2 和 0PK16-HfR2 (10 μ mol/L) # I μ I, Taq 酶(5υ/μ I, Takara) 0.5 μ 1，模板DNA5y 1，滅菌ddH20補足至50 μ I。PCR擴增條件為:95°C預變性5min，58°C退火30sec，72°C延伸1.5min ;35個循環；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴增后，取5 μ I擴增產物加I μ I加樣緩沖液在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測并照相回收、克隆和測序，序列測定由北京六合華大基因科技有限公司完成。實施例2LAMP技術檢測菲利普孢囊線蟲方法的建立2.1LAMP 引物設計根據菲利普孢囊線蟲SACR特異性片段的測序結果，設計并篩選下述LAMP引物(見圖1)，引物交上海生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下:①HFl 1-F3:5' -GGCAGCGATCAAAAGACT-3' ；②HFl 1-B3:5' -AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3' ;③HFll-BIP:5' -GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTTGGAGCCATGTTATTT TGTTGA-3' ;④HFll-FIP:5'-TCTTGGTGCCCAAACTTCCCGCATCTAACATTCTCAATA ATTGTC-3';
⑤HF 11-LF: 5' -GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3' ;⑥HF 11-LB: 5' -TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3' ;2.2LAMP反應體系配置:弓I物混合液:外引物HFl 1-F3和HFl 1-B3各0.2 μ mol/L,內引物HFl 1-FIP和HFl IBIP 各 1.4 μ mol/L,環引物 HF11-LB 和 HFll-LF 為 0.4 μ mol/L ；反應混合液:2.0mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl(pH8.8), lOmmol/LKCl, 5mmol/L MgSO4, lOmmol/L(NH4)2S04, 0.l%Triton x-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段，I μ IDNA模板，加滅菌雙蒸餾水補全到25 μ I。2.3LAMP反應擴增條件:將以上混合液置于65°C恒溫水浴中等溫擴增75min，85°C保溫lOmin，反應結束后加入I μ I配制好的顯色劑混勻后觀察結果(圖2中Α)。取2 μ I產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測并照相，可看到有LAMP的特征性梯形帶(圖2中B)。實施例3菲利普孢囊線蟲LAMP特異性檢測收集禾谷孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲、豌豆孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、香蕉穿孔線蟲、象耳豆根結線蟲(見表1)，分別提取其DNA作為模板與菲利普孢囊線蟲DNA模板一起進行LAMP檢測，以檢測菲利普孢囊線蟲LAMP檢測方法的特異性。表I供試的其它植物線蟲群體樣品代碼及來源
權利要求
1.一種菲利普孢囊線蟲LAMP快速檢測方法，其特征在于:其中LAMP反應體系所使用的引物是:①HF11-F3:5'-GGCAGCGATCAAAAGACT-3' ；②HF11-B3:5'-AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3' ; HFll-BIP:5'-GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTT-GGAGCCATGTTATTTTGTTGA-3';④HFll-FIP:5'-TCTTGGTGCCCAAACTTCCC-GCATCTAACATTCTCAATAATTGTC-3';⑤HFll-LF:5'-GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3' ;⑥HFll-LB:5'-TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3'。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其中的LAMP反應體系包括: 1)引物混合液:外引物HFl1-F3和HFl 1-B3各0.2 μ mol/L,內引物HFl1-FIP和HFll-BIP 各 1.4 μ mol/L,環引物 HFll-LF 和 HFll-LB 各為 0.4 μ mol/L ； 2)反應混合液:3.2mmol/LdNTP, 20mmol/L 且 ρΗ8.8 的 Tris-HCl, 10mmol/LKCl, 3mmol/L MgS04, lOmmol/L (NH4) 2S04, 0.l%Triton x-100, 8U Bst DNA 大片段聚合酶；3)I μ I DNA 模板； 加滅菌雙蒸餾水補全到25 μ I。`
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其中LAMP反應條件如下:將引物混合液和反應混合液混合均勻后加入Iul DNA模板,61 65°C溫育30 90min,85°C保溫lOmin。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其中LAMP反應的最終產物中加入有顯色劑，輕甩離心管即可肉眼觀察。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，所述顯色劑為SYBRgreen I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1:9。
6.根據權利要求2所述的檢測方法，所述DNA模板的提取方法為:挑取單個菲利普孢囊放入裝有10 μ I ddH20的0.2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8 μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在-80°C冷凍30min ;將離心管取出，在65°C溫育90min，95°C反應IOmin處理后以上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP反應，所述LB溶液為500mmol/L KCl，10mmol /T, Tris-HCl, 15mmol/L MgC12,1.0mmol/L DTT, 4.5%Tween20,等體積混勻，過濾滅菌。
7.權利要求1-6所述任一檢測方法在診斷罹病植物、土壤的菲利普孢囊線蟲感染情況或鑒別菲利普孢囊線蟲中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種菲利普孢囊線蟲LAMP快速檢測方法及應用。根據菲利普孢囊線蟲RAPD特異性片段序列，設計篩選出6條LAMP引物HF11-F3、HF11-B3、HF11-FIP、HF11-BIP、HF11-LB和HF11-LF，通過提取菲利普孢囊線蟲基因組DNA，環介導等溫擴增體系建立及其優化、擴增產物顯色和觀察，從而快速檢測和鑒定出菲利普孢囊線蟲。本發明的檢測方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、高效快捷，結果肉眼即可觀察，在菲利普孢囊線蟲快速檢測和菲利普孢囊線蟲病的早期和田間診斷方面具有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK103103285SQ20131005305
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月18日 優先權日2013年2月18日
發明者彭德良, 徐小琴, 彭煥, 黃文坤, 亓曉莉, 姜道宏 申請人:中國農業科學院植物保護研究所