專利名稱：一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法
技術領域：
本發明屬于固定化酶制備技術領域，特別涉及一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法。
背景技術：
蛋白酶是一種具有特殊催化功能的高效生物催化劑，因其具有高選擇性、催化反應條件溫和、無污染等特點，該酶催化過程已經在工業中獲得了較多的應用。但由于游離酶對工業催化過程存在一定的障礙，限制了其在工業上更廣泛的應用，主要存在以下問題:
(I)酶在脫離細胞內的環境后，往往很難保持長期的穩定性，容易失去活性，尤其在油相或油-水界面，更容易失去活性；(2)由于酶為水溶性，在水相中反應時難以回收利用，造成使用成本偏高；為了解決游離蛋白酶的缺陷，人們發明了酶固定化技術，即酶的固定化是用固體材料將酶束縛或限制于一定區域內，使之仍能進行其特有的催化反應，并可回收及重復使用的一類技術。在本發明之前，依據酶的性質及用途主要分為吸附法、共價結合法、包埋法和交聯法幾種。傳統酶固定化方法還存在著一定的缺陷性:(I)固定化蛋白酶的載體制備和固定化過程分開進行，造成固定化過程復雜，酶與載體的生物相容性較差；(2)采用吸附交聯法固定化的蛋白酶，其與載體之間的結合作用相對較弱，容易造成酶脫落，從而使得固定化酶的穩定性差，使用壽命低；(3)采用共價結合法固定化的蛋白酶，其固定化反應通常較劇烈，容易造成酶的失活，從而導致固定化酶的活力降低。
發明內容
本發明的目的就在于克服上述缺陷，提供一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法。 本發明的技術方案是:一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其主要技術特征在于包括以下步驟:在固定化反應器中加入聚苯胺單體和蒸餾水使得溶液濃度為0.01 0.2mol/L，用酸調節溶液pH為1.0 7.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，在-10°C 45°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在-10°C 45°C條件下恒溫的引發劑和助劑，引發劑與單體的摩爾濃度比為1: 0.3 1: 5，助劑和單體的摩爾濃度比為1:1 1: 10，同時加入游離蛋白酶，單體質量與蛋白酶質量比為1: 0.01 1: 0.1 ;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于-10°C 45°C恒溫條件下反應12 24h ;反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物真空干燥或冷凍干燥8 24h，得到固定化酶。用于固定化的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、鏈霉菌蛋白酶、氨基肽酶、膠原酶。上述的單體為苯胺及苯胺衍生物，即苯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰苯二胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺、鄰甲氧基苯胺、鄰巰基苯胺中的一種。上述用于調節單體溶液pH值的酸為無機酸，即鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸中的一種。上述的引發劑為K2Cr2O7, (NH4)2S2O8' Ce(SO4)2' FeCl3' FeCl4' AlCl3' HAuCl4, KIO3'H2O2、MnO2 中的一種。上述的助劑為F127 (EO70PO100EO70)、丁基萘磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、二甲基二烯丙基氯化銨中的一種。上述的真空干燥溫度為10°C 45°C，真空度為O -0.1MPa0本發明的優點和效果在于:制備載體的同時加入游離酶使得固定化過程簡單，條件溫和，時間縮短，生物相容性好，能耗降低；固定化酶的蛋白吸附量高，酶活力高；固定化的酶穩定性好，使用壽命長。本發明方法制備固定化蛋白酶的工藝簡單，載體價廉易得，成本較低，有利于大規模的工業化生產。
具體實施例方式以下將通過具體的實施例進一步闡述本說明，但本發明技術方案不局限于以下所列的具體實施方式
。所述的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、鏈霉菌蛋白酶、氨基肽酶、膠原酶。所述的單體為苯胺及苯胺衍生物，即苯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰苯二胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺、鄰甲氧基苯胺、鄰巰基苯胺中的一種。所述調節單體溶液pH值的酸為無機酸，包括鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸中的一種。所述的引發劑為K2Cr2O7, (NH4)2S2O8' Ce(SO4)2' FeCl3' FeCl4' AlCl3' HAuCl4, KIO3'H2O2、MnO2 中的一種。所述的助劑為F127即EO7ciPOiciciEO7c1、丁基萘磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、二甲基二烯丙基氯化銨中的一種。下面是具體實施例說明。實施例1:在固定化反應器中加入苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.0lmol/L，加入硫酸調節溶液pH為3.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，在0°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在0°C條件下恒溫的引發劑K2Cr2O7、助劑EO70PO100EO70, K2Cr2O7與苯胺的摩爾濃度比為1: 0.5，EO7ciPOiciciEO7ci與苯胺的摩爾濃度比為1: 2，同時加入游離的木瓜蛋白酶，苯胺質量與木瓜蛋白酶質量比為1: 0.05;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于(TC恒溫條件下反應；反應時間為18h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥15h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 3.9倍。該過程載體制備與酶的固定化同時進行，操作簡單，耗時較短，生物相容性好，能耗較少，成本較低，有利于大規模的工業化生產。同 時，將該固定化酶重復使用多次后酶活沒有明顯降低。實施例2:
在固定化反應器中加入鄰甲苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.05mol/L，加入鹽酸調節溶液PH為5.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，10°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在10°C條件下恒溫的引發劑(NH4)2S2O8，助劑丁基萘磺酸鈉，(NH4)2S2O8與鄰甲苯胺的摩爾濃度比為1: 1，丁基萘磺酸鈉和鄰甲苯胺的摩爾濃度比為1: 5，同時加入游離的菠蘿蛋白酶，鄰甲苯胺質量與菠蘿蛋白酶質量比為1: 0.08 ;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于10°C恒溫條件下反應；反應時間為15h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在15°C、-0.05MPa條件下干燥18h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 4.2倍。該效果同實施例1。實施例3:在固定化反應器中加入間甲苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.lmol/L，溶液pH為7.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，20°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在20°C條件下恒溫的引發劑Ce (SO4)2,助劑十二烷基苯磺酸鈉，Ce (SO4) 2與間甲苯胺的摩爾濃度比為1: 3，十二烷基苯磺酸鈉和間甲苯胺的摩爾濃度比為1: 8，同時加入游離的胃蛋白酶，間甲苯胺質量與胃蛋白酶質量比為1: 0.1;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于20°C恒溫條件下反應；反應時間為12h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在30°C、_0.05MPa條件下干燥18h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 3.6倍。效果同實施例1。實施例4:在固定化反應器中加入對甲苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.08mol/L，加入醋酸調節溶液PH為6.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，_5°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在_5°C條件下恒溫的引發劑FeCl3，助劑十六烷基三甲基溴化銨，FeCl3與對甲苯胺的摩爾濃度比為1: 0.8，十六烷基三甲基溴化銨和對甲苯胺的摩爾濃度比為I: 3，同時加入游離的胰凝乳蛋白酶，對甲苯胺質量與胰凝乳蛋白酶質量比為1: 0.04;然后攪拌使整個體系 混合均勻，放置于_5°C恒溫條件下反應；反應時間為20h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥8h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 3.8倍。效果同實施例1。實施例5:在固定化反應器中加入鄰苯二胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.12mol/L，加入磷酸調節溶液PH為1.0;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，15°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在15°C條件下恒溫的引發劑FeCl4，助劑二甲基二烯丙基氯化銨，FeCl4與鄰苯二胺的摩爾濃度比為1: 1.5，二甲基二烯丙基氯化銨和鄰苯二胺的摩爾濃度比為1: 6，同時加入游離的胰蛋白酶，鄰苯二胺質量與胰蛋白酶質量比為1: 0.01;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于15°C恒溫條件下反應；反應時間為16h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在20°C、_0.08MPa條件下干燥10h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 4.0倍。效果同實施例I。實施例6:在固定化反應器中加入鄰氯苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.2mol/L，加入硝酸調節溶液PH為2.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，30°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在30°C條件下恒溫的引發劑AlCl3、助劑十二烷基苯磺酸鈉，AlCl3與鄰氯苯胺的摩爾濃度比為1: 4，十二烷基苯磺酸鈉和鄰氯苯胺的摩爾濃度比為1: 10，同時加入游離的糜蛋白酶，鄰氯苯胺質量與糜蛋白酶質量比為1: 0.06 ;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于30°C恒溫條件下反應；反應時間為24h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在10°C、-0.1MPa條件下干燥12h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 4.0倍。效果同實施例1。實施例7:在固定化反應器中加入間氯苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.18mol/L，溶液pH為7.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，45°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在45°C條件下恒溫的引發劑HAuCl4、助劑丁基萘磺酸鈉，HAuCl4與間氯苯胺的摩爾濃度比為1: 5，丁基萘磺酸鈉和間氯苯胺的摩爾濃度比為1: 9，同時加入游離的羧肽酶，間氯苯胺質量與羧肽酶質量比為1: 0.02;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于45°C恒溫條件下反應；反應時間為17h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在35°C、_0.04MPa條件下干燥14h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 4.3倍。效果同實施例1。實施例8:在固定化反應器中加入鄰甲氧基苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.06mol/L，加入鹽酸調節溶液pH為4.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，-10°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在-10°C條件下恒溫的引發劑KIO3，助劑十二烷基苯磺酸鈉，KIO3與鄰甲氧基苯胺的摩爾濃度比為1: 1，十二烷基苯磺酸鈉和鄰甲氧基苯胺的摩爾濃度比為I: 7，同時加入游離的組織蛋白酶，鄰甲氧基苯胺質量與組織蛋白酶質量比為1: 0.08;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于-10°C恒溫條件下反應；反應時間為20h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥16h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 3.5倍。效果同實施例1。實施例9:在固定化反應器中加入鄰巰基苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.16mol/L，加入硫酸調節溶液PH為3.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，35°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在35°C條件下恒溫的引發劑H2O2，助劑十六烷基三甲基溴化銨，H2O2與鄰巰基苯胺的摩爾濃度比為1: 0.3，十六烷基三甲基溴化銨和鄰巰基苯胺的摩爾濃度比為1: 4，同時加入游離的枯草桿菌蛋白酶，鄰巰基苯胺質量與枯草桿菌蛋白酶質量比為I: 0.05;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于35°C恒溫條件下反應；反應時間為15h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥15h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 4.5倍。效果同實施例1。實施例10:在固定化反應器中加入苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.08mol/L，加入鹽酸調節溶液pH為2.0 ;充分攪拌至溶液充分 混合均勻后，40°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在40°C條件下恒溫的引發劑MnO2，助劑二甲基二烯丙基氯化銨，MnO2與苯胺的摩爾濃度比為1: 4.5，二甲基二烯丙基氯化銨和苯胺的摩爾濃度比為1: 1，同時加入游離的鏈霉菌蛋白酶，苯胺質量與鏈霉菌蛋白酶質量比為1: 0.01 ;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于40°C恒溫條件下反應；應時間為12h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在40°C、-0.02MPa條件下干燥20h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 3.9倍。效果同實施例1。
實施例11:在固定化反應器中加入鄰甲苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.03mol/L,溶液pH為
7.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，45°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在45°C條件下恒溫的引發劑FeCl3、助劑E07(lP01(l(lE07(l，FeCl3與鄰甲苯胺的摩爾濃度比為I: 0.5，E07(iP01(i(iE07(i和鄰甲苯胺的摩爾濃度比為1: 6，同時加入游離的氨基肽酶，鄰甲苯胺質量與氨基肽酶質量比為1: 0.03;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于45°C恒溫條件下反應；反應時間為14h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在45°C、_0.0lMPa條件下干燥17h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 4.2倍。效果同實施例1。實施例12:在固定化反應器中加入鄰氯苯胺和蒸餾水使得溶液濃度為0.15mol/L，加入硝酸調節溶液PH為1.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，20°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在20°C條件下恒溫的引發劑HAuCl4、助劑十二烷基苯磺酸鈉，HAuCl4與鄰氯苯胺的摩爾濃度比為1: 3.5，十二烷基苯磺酸鈉和鄰氯苯胺的摩爾濃度比為1: 7，同時加入游離的膠原酶，鄰氯苯胺質量與膠原酶質量比為1: 0.06;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于20°C恒溫條件下反應；反應時間為17h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥24h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 4.6倍。效果同實施例1。
權利要求
1.一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟:在固定化反應器中加入聚苯胺單體和蒸餾水使得溶液濃度為0.0l 0.2mol/L，用酸調節溶液pH為1.0 7.0 ;充分攪拌至溶液充分混合均勻后，在-10°C 45°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在-10°C 45°C條件下恒溫的引發劑和助劑，引發劑與單體的摩爾濃度比為1: 0.3 1: 5，助劑和單體的摩爾濃度比為1:1 1: 10，同時加入游離蛋白酶，單體質量與蛋白酶質量比為1: 0.01 1: 0.1;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于-10°C 45°C恒溫條件下反應；反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物真空干燥或冷凍干燥，得到固定化酶。
2.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于所述的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、組織蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、鏈霉菌蛋白酶、氨基肽酶、膠原酶。
3.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于所述的單體為苯胺及苯胺衍生物，即苯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰苯二胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺、鄰甲氧基苯胺、鄰巰基苯胺中的一種。
4.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于調節單體溶液pH值的酸為無機酸，即鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸中的一種。
5.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于所述的引發劑為 K2Cr2O7, (NH4)2S2O8' Ce (SO4) 2、FeCl3' FeCl4' AlCl3' HAuCl4, K103、H2O2' MnO2中的一種。
6.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于所述的助劑為F127、丁基萘磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、二甲基二烯丙基氯化銨中的一種。
7.根據權 利要求1所述的一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于真空干燥溫度為10°c 45°C，真空度為O -0.1MPa0
8.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于單體質量與蛋白酶在-10°C 45°C恒溫條件下反應的時間為12 24h。
9.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法，其特征在于將產物真空干燥或冷凍干燥8 24h，得到固定化酶。
全文摘要
本發明涉及一種反應-吸附耦聯固定化蛋白酶的制備方法。本發明的技術方案是在制備聚苯胺載體同時加入蛋白酶進行吸附的反應-吸附耦聯固定化蛋白酶方法，本發明為以苯胺及苯胺衍生物為單體，加入引發劑和助劑，同時加入需固定化的游離蛋白酶，放置于恒溫條件下反應，過濾洗滌得到以聚苯胺為載體的固定化蛋白酶。本發明克服了現有傳統酶固定化方法存在的固定化過程復雜，酶與載體的生物相容性較差，其與載體之間的結合作用相對較弱，固定化酶的穩定性差，使用壽命低，其固定化反應通常較劇烈，容易造成酶的失活，活力降低等缺陷。本發明具有固定化過程簡單，條件溫和，效率高，固定化酶的蛋白吸附量高，酶活力好，使用壽命長。
文檔編號C12N11/08GK103103178SQ20131005067
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月6日 優先權日2013年2月6日
發明者熊健, 黃亞娟, 侯麗云, 張華 申請人:揚州大學