專利名稱：一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法
技術領域：
本發明屬于固定化酶制備技術領域，特別涉及一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法。
背景技術：
氧化還原酶是一種在常溫常壓得條件下具有特殊催化功能的高效生物催化劑，催化效率比一般催化劑高出IO7 IO13倍，并具有專一性，很多化學反應可以采用氧化還原酶作為催化劑，而且可以避免副反應。它不僅催化生物體內化學反應，而且催化非體內的化學發應。但由于氧化還原酶的組成和結構，環境對其影響較大，各種因素都可能降低酶的催化活性。在催化過程中，隨著時間的推移，酶的催化活性會逐漸下降，導致催化效率降低，也不易回收重復利用，為了解決游離氧化還原酶的這種缺陷，人們發明了酶固定化技術。在本發明之前，現有的固定化氧化還原酶主要存在以下問題:1.固定化氧化還原酶的載體制備和固定化過程分開進行，造成固定化過程復雜，酶與載體的生物相容性較差；
2.采用共價結合法固定化的氧化還原酶，其固定化反應比較劇烈，容易造成酶的失活，導致固定化酶的活力降低。因此，亟需找到一種固定化過程簡單，操作條件溫和，生物相容性好，能耗低，固定化后酶活力高、穩定性好、使用壽命長的氧化還原酶固定化新方法。
發明內容
本發明的目的就在于克服上述缺陷，提供一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法。
本發明的技術方案是:一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法，其主要技術特征在于包括以下步驟:在固定化反應器中加入聚苯胺單體和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.01
0.2mol/L，用酸調節溶液pH為1.0 7.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，在_10°C 50°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在-10°C 50°C條件下恒溫的引發劑和助劑，引發劑與單體的摩爾濃度比為1: 0.3 1: 5，助劑和單體的摩爾濃度比為1:1 1: 10，同時加入游離氧化酶或還原酶，單體質量與酶質量比為1: 0.01 I: 0.1 ;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于-10°c 45°C恒溫條件下反應12 24h ；反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物真空干燥或冷凍干燥8 24h，得到固定化酶。上述的單體為苯胺及苯胺衍生物，包括苯胺、鄰苯二胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺、鄰甲氧基苯胺、鄰巰基苯胺。上述的引發劑為(NH4)2S208、K2Cr207、K103、FeCl3、FeCl4、H202、Ce(S04)2、AlCl3、Mn02、HAuCl4中的一種。上述的助劑為F127 (EO70PO100EO70)、十二烷基苯磺酸鈉、丁基萘磺酸鈉、二甲基二烯丙基氯化銨、十六烷基三甲基溴化銨中的一種。上述的真空干燥溫度為10°C 45°C，真空度為O -0.1MPa0用于固定化的酶為:過氧化氫酶，過氧化物酶，葡萄糖氧化酶，膽固醇氧化酶，乙醇脫氫酶，漆酶。本發明的優點和效果在于:制備載體的同時加入游離酶使得固定化過程簡單，條件溫和，時間較短，能耗低；固定化酶的蛋白吸附量高，酶活力好，對環境友好；固定化的酶穩定性好，使用壽命長，固定化過程簡單，操作條件溫和，生物相容性好，能耗低，固定化后酶活力高、穩定性好、使用壽命長的氧化還原酶固定化新方法。本發明方法制備固定化脂肪酶的工藝簡單，載體價廉易得，成本較低，有利于大規模的工業化生產。
具體實施例方式以下將通過具體的實施例進一步闡述本說明，但本發明技術方案不局限于以下所列的具體實施方式
。所述的單體為苯胺及苯胺衍生物，包括苯胺、鄰苯二胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺、鄰甲氧基苯胺、鄰巰基苯胺中的一種。所述的引發劑為(NH4)2S208、K2Cr207、K103、FeCl3、FeCl4、H202、Ce(S04)2、AlCl3、Mn02、HAuCl4中的一種。
所述的助劑為F127即EO7qPOiqqEO7q、十二烷基苯磺酸鈉、丁基萘磺酸鈉、二甲基二烯丙基氯化銨、十六烷基三甲基溴化銨中的一種。所述酶包括過氧化氫酶，過氧化物酶，葡萄糖氧化酶，膽固醇氧化酶，乙醇脫氫酶，漆酶。下面是具體實施例說明。實施例1:在固定化反應器中加入鄰氯苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.lmol/L，加入稀鹽酸溶液調節PH為6.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，10°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在10°C條件下恒溫的引發劑KIO3、助劑二甲基二烯丙基氯化銨，KIO3與鄰氯苯胺的摩爾濃度比為1: 0.6，二甲基二烯丙基氯化銨和鄰氯苯胺的摩爾濃度比為1: 3，同時加入游離過氧化氫酶，鄰氯苯胺質量與酶的質量比為1: 0.05;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于10°C恒溫條件下反應；反應時間為15h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥10h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 2.5倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例2:在固定化反應器中加入間氯苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.03mol/L，加入稀硝酸溶液調節pH為3.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，20°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在20°C條件下恒溫的引發劑MnO2，助劑十六烷基三甲基溴化銨，MnO2與間氯苯胺的摩爾濃度比為1: 2，十六烷基三甲基溴化銨和間氯苯胺的摩爾濃度比為1: 3，同時加入游離過氧化物酶，間氯苯胺質量與酶的質量比為1: 0.03;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于20°C恒溫條件下反應；反應時間為12h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥8h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 3.3倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例3:在固定化反應器中加入鄰甲氧基苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.06mol/L，加入稀磷酸溶液調節pH為7.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，30°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在30°C條件下恒溫的引發劑Ce(SO4)2，助劑丁基萘磺酸鈉，Ce(SO4)2與鄰甲氧基苯胺的摩爾濃度比為1: 4，丁基萘磺酸鈉和鄰甲氧基苯胺的摩爾濃度比為1: 6，同時加入游離葡萄糖氧化酶，鄰甲氧基苯胺質量與酶的質量比為I: 0.09，使整個體系混合均勻，放置于30°C恒溫條件下反應；反應時間為20h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液·無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在10°C、_0.06MPa條件下干燥20h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 2.1倍而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例4:在固定化反應器中加入苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.16mol/L，加入稀硫酸溶液調節pH為5.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，6°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在6°C條件下恒溫的引發劑H2O2，助劑十二烷基苯磺酸鈉，H2O2與苯胺的摩爾濃度比為1: 1，十二烷基苯磺酸鈉和苯胺的摩爾濃度比為1: 2，同時加入游離膽固醇氧化酶，苯胺質量與酶的質量比為1: 0.04;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于6°C恒溫條件下反應；反應時間為17h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥10h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 1.8倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例5:在固定化反應器中加入鄰苯二胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.12mol/L，加入稀醋酸溶液調節PH為4.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，25°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在25°C條件下恒溫的引發劑FeCl4，助劑F127即Ε07(ιΡ01(ι(ιΕ07(ι，FeCl4與鄰苯二胺的摩爾濃度比為I: 1.5，EO7ciPOiciciEO7ci和鄰苯二胺的摩爾濃度比為I: 3，同時加入游離乙醇脫氫酶，鄰苯二胺質量與酶的質量比為1: 0.03;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于25°C恒溫條件下反應；應時間為17h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在20°C、-0.04MPa條件下干燥12h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 2.9倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例6:在固定化反應器中加入鄰甲苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.18mol/L，加入濃硝酸溶液調節pH為1.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，15°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在15°C條件下恒溫的引發劑FeCl3、助劑十六烷基三甲基溴化銨，FeCl3與鄰甲苯胺的摩爾濃度比為1: 0.6，十六烷基三甲基溴化銨和鄰甲苯胺的摩爾濃度比為1: 4，同時加入游離漆酶，鄰甲苯胺質量與酶的質量比為1: 0.06;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于15°C恒溫條件下反應；反應時間為15h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥24h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 2.4倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例7:在固定化反應器中加入間甲苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.20mol/L，加入稀鹽酸溶液調節pH為7.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，40°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在40°C條件下恒溫的引發劑KIO3、助劑二甲基二烯丙基氯化銨，KIO3與間甲苯胺的摩爾濃度比為1: 0.3，二甲基二烯丙基氯化銨和間甲苯胺的摩爾濃度比為1: 1，同時加入游離乙醇脫氫酶，間甲苯胺質量與乙醇脫氫酶的質量比為1: 0.1;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于30°C恒溫條件下反應；反應時間為12h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在30°C、-0.05MPa條件下干燥20h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 3.2倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例8:在固定化反應器中加入對甲苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.lmol/L，加入稀磷酸溶液調節PH為3.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，-10°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在-10°C條件下恒溫的引發劑K2Cr2O7，助劑丁基萘磺酸鈉，K2Cr2O7與對甲苯胺的摩爾濃度比為1: 5，丁基萘磺酸鈉和對甲苯胺的摩爾濃度比為I: 10，同時加入游離過氧化物酶，對甲苯胺質量與過氧化物酶的質量比為1: 0.01;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于45°c恒溫條件下反應；反應時間為24h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥24h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 1.9倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工 業化生產。實施例9:在固定化反應器中加入鄰氯苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.18mol/L，加入濃硫酸溶液調節PH為1.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，5°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在5°C條件下恒溫的引發劑(NH4)2S2O8，助劑十二烷基苯磺酸鈉，(NH4)2S2O8與鄰氯苯胺的摩爾濃度比為1: 2.5，十二烷基苯磺酸鈉和鄰氯苯胺的摩爾濃度比為1: 3，同時加入游離過氧化氫酶，鄰氯苯胺質量與過氧化氫酶的質量比為I: 0.08;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于10°C恒溫條件下反應；反應時間為15h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥20h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 1.5倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例10:在固定化反應器中加入鄰苯二胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.01mol/L，加入稀硫酸溶液調節PH為7.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，50°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在50°C條件下恒溫的引發劑HAuCl4，助劑F127即Ε07(ιΡ01(ι(ιΕ07(ι，HAuCl4與鄰苯二胺的摩爾濃度比為1: 4.5，EO70PO100EO70和鄰苯二胺的摩爾濃度比為1: 5.5，同時加入游離漆酶，鄰苯二胺質量與漆酶的質量比為1: 0.02;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于30°C恒溫條件下反應；應時間為16h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在35°C、-0.03MPa條件下干燥21h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 2.6倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例11:在固定化反應器中加入鄰巰基苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.09mol/L,加入稀醋酸溶液調節pH為5.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，35°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在35°C條件下恒溫的引發劑MnO2、助劑二甲基二烯丙基氯化銨，MnO2與鄰巰基苯胺的摩爾濃度比為1: 0.6，二甲基二烯丙基氯化銨和鄰巰基苯胺的摩爾濃度比為1: 9，同時加入游離膽固醇氧化酶，鄰巰基苯胺質量與膽固醇氧化酶的質量比為1: 0.03;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于20°C恒溫條件下反應；反應時間為19h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物冷凍干燥15h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 2.3倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。實施例12:在固定化反應器中加入間甲苯胺和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.19mol/L,加入稀硝酸溶液pH為7.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，10°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在10°C條件下恒溫的引發劑AlCl3、助劑十二烷基苯磺酸鈉，AlCl3與間甲苯胺的摩爾濃度比為1: 3.5，十二烷基苯磺酸鈉和間甲苯胺的摩爾濃度比為I: 7，同時加入游離葡萄糖氧化酶，間甲苯胺質量與葡萄糖氧化酶的質量比為1: 0.06;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于-10°C恒溫條件下反應；反應時間為24h，反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物放置于真空干燥箱中在45°C、-0.02MPa條件下干燥20h，所得的固定化酶酶活比游離酶提高了 1.7倍，而且該固定化方法操作簡單，所使用載體價廉易得，所需成本較低，有利于大規模的工業化生產。
權利要求
1.一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟:在固定化反應器中加入聚苯胺單體和蒸餾水使得溶液的摩爾濃度為0.0l 0.2mol/L，用酸調節溶液pH為1.0 7.0 ;充分攪拌至待溶液充分混合均勻后，在-10°C 50°C條件下恒溫靜置；再向固定化反應器中加入事先在-10°C 50°C條件下恒溫的引發劑和助劑，引發劑與單體的摩爾濃度比為1: 0.3 1: 5，助劑和單體的摩爾濃度比為1:1 1: 10，同時加入游離氧化酶或還原酶，單體質量與酶質量比為1: 0.01 1: 0.1 ;然后攪拌使整個體系混合均勻，放置于-10°C 45°C恒溫條件下反應；反應結束后，分別用蒸餾水、無水乙醇過濾洗滌多次至濾液無色，然后將產物真空干燥或冷凍干燥，得到固定化酶。
2.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法，其特征在于所述的單體為苯胺及苯胺衍生物，包括苯胺、鄰苯二胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺、鄰甲氧基苯胺、鄰巰基苯胺。
3.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法，其特征在于所述的引發劑為(NH4)2S2O8' K2Cr2O7, K103、FeCl3' FeCl4' H2O2' Ce (SO4) 2、AlCl3' MnO2,HAuCl4中的一種。
4.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法，其特征在于所述的助劑為F127、十二烷基苯磺酸鈉、丁基萘磺酸鈉、二甲基二烯丙基氯化銨、十六烷基三甲基溴化銨中的一種。
5.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法，其特征在于真空干燥溫度為10°c 45°C，真空度為O -0.1MPa0
6.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法，其特征在于固定化的酶包括過氧化氫酶，過氧化物酶，葡萄糖氧化酶，膽固醇氧化酶，乙醇脫氫酶，漆酶。
7.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法，其特征在于單體質量與酶在-10°c 45°C恒溫條件下反應時間為12 24h。
8.根據權利要求1所述的一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法，其特征在于將產物真空干燥或冷凍干燥8 24h，得到固定化酶。
全文摘要
本發明涉及一種反應-吸附耦合固定化氧化還原酶的制備方法。本發明的技術方案涉及在制備聚苯胺載體同時加入氧化酶或還原酶進行吸附的反應-吸附耦合固定化氧化還原酶方法，以苯胺及苯胺衍生物為單體，加入引發劑和助劑，同時加入需固定化的游離氧化酶或還原酶，放置于恒溫條件下反應，過濾洗滌得到以聚苯胺為載體的固定化氧化酶或還原酶。本發明克服了現有的固定化氧化還原酶存在的過程復雜，酶與載體的生物相容性較差，共價結合法固定化的氧化還原酶的固定化反應比較劇烈，容易造成酶的失活，導致固定化酶的活力降低等缺陷。本發明具有固定化過程簡單，條件溫和，效率高；固定化酶的蛋白吸附量高，酶活力好；固定化的酶穩定性好，使用壽命長。
文檔編號C12N11/08GK103103177SQ20131005067
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月6日 優先權日2013年2月6日
發明者熊健, 張華 , 黃亞娟, 侯麗云 申請人:揚州大學