專利名稱：抗紋枯病基因關聯抗病同源序列及其分子標記獲取方法
技術領域：
本發明涉及植物抗病基因的植物基因工程以及分子標記輔助育種領域，具體涉及抗紋枯病基因的抗病基因同源序列及其分子標記，及其專用引物在水稻抗紋枯病中的應用。
背景技術：
水稻紋枯病是由枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)侵染而引發的一種真菌病害，世界各個稻區都有不同程度的發生。該病害可在水稻整個生育期都可發病，一般造成水稻減產10 30%，嚴重時可達50%。近年來，由于高產品種的推廣，種植密度的提高，氮肥施用量的增加，水稻紋枯病的危害日益嚴重，已成為我國南方稻區的第一大病害。由于使用抗病品種防治紋枯病被認為最經濟、最有效和對環境最友好的方式，因而對水稻紋枯病抗性基因研究成為熱點，目前已定位的紋枯病抗性數量位點(Quantitative TraitLoci, QTL)約有90多個。不過，由于紋枯病抗性屬于數量性狀,而且紋枯病抗性QTLs的定位多是利用非基因功能的分子標記，例如微衛星標記(SSR)，因此這些分子標記在抗紋枯病育種上利用價值不高。
發明內容
本發明的目的是提供一種水稻抗紋枯病基因位點分子標記，通過檢測這些與抗紋枯病關聯的分子標記，可以預測水稻植株的紋枯病抗性，加快抗紋枯病水稻新品種的選育速度，簡化選育手段。本發明實施例是這樣實 現的，抗紋枯病基因關聯抗病同源序列及其分子標記獲取方法，該獲取方法包括:引物及其序列、水稻抗紋枯病關聯RGA引物及其產生的抗病同源序列片段以及相對應的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project上的注釋號、編
碼的蛋白質，具體為:
權利要求
1.抗紋枯病基因關聯抗病同源序列及其分子標記獲取方法，其特征在于，該獲取方法包括:引物及其序列、水稻抗紋枯病關聯RGA引物及其產生的抗病同源序列片段以及相對應的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project上的注釋號、編碼的蛋白質。
2.如權利要求1所述的抗紋枯病基因關聯抗病同源序列及其分子標記獲取方法，其特征在于，引物及其序列、水稻抗紋枯病關聯RGA引物及其產生的抗病同源序列片段以及相對應的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project上的注釋號、編碼的蛋白質具體為:
3.如權利要求2所述的抗紋枯病基因關聯抗病同源序列及其分子標記獲取方法，其特征在于，抗紋枯病基因關聯抗病同源序列及其分子標記獲取方法如下: RGA引物設計，根據檢索到的全基因組抗病同源序列，利用引物設計軟件PrimerPremier6設計了水稻全基因組RGA引物； 178份全球核心種質RGA基因型鑒定，用CTAB法提取137份全球核心種質的DNA，用1.中設計的備選RGA標記178份全球核心種質進行RGA基因型分析，PCR反應在NBIVeriti9600擴增儀上進行，擴增產物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析，并記錄帶型；178份全球核心種質抗紋枯病表型，利用紋枯病病菌微管快速鑒定技術，對178份核心種質接種鑒定；抗性對照品種為Jasmine85,感病對照品種為Lemont ;每個品種選3株,設三次重復；當感病品種Lemont的發病指數達90%時，記錄每個品種的發病情況； 分子性狀關聯分析，利用單分子標記分析方法進行分子性狀關聯分析，取P < 0.001,獲得 RGA4、RGA218、RGA320、RGA378、RGA470、RGA50 和 RGA468 與紋枯病抗性相關聯； 關聯RGA標記相對應抗病同源序列測序及比對，利用關聯RGA標記對紋枯病抗感種質進行克隆測序。
4.如權利要求3所述的抗紋枯病基因關聯抗病同源序列及其分子標記獲取方法，其特征在于，關聯RGA標記相對應抗病同源序列測序及比對，利用關聯RGA標記對紋枯病抗感種質進行克隆測序具體過程如下: 抗病同源序列克隆PCR擴增體系50 μ 1:1 μ I DNA, 10Xbuffer5 μ 1，IOmMdNTP2 μ 1，10 μ M引物各3 μ 1，高保真Taq酶0.5，超純水35.5 μ I ； PCR 反應程序:94°C 5min;95°C 20s, 57°C 45s, 72°C lmin,共 35 個循環；然后 72°C延長7min ;最后4 C保存； PCR產物在1%瓊脂糖電泳分離，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。再將用將目的片段構建到寶生物工程有限公司生產的PMD19T質粒載體，然后將構建好的載體轉化到感受態大腸桿菌DH5ci中，最后送樣測序。
5.如權利要求2所述的抗紋枯病基因關聯抗病同源序列及其分子標記獲取方法，其特征在于，序列比對分 析 序列RGA742共588bp，通過在線軟件對抗感種質的PCR片段比對發現兩者存在9個堿基缺失；編碼一個144個氨基酸的P-1oopNTPase超級家族；通過比對，RGA74-2與L0C_0s01g52550 在 30253614bp 之間 95% 的同源； 序列RGA2183共807bp，編碼一個119個氨基酸，通過DNAMAN6.0對抗感種質的PCR片段比對發現兩者在蛋白質序列中存在I個氨基酸突變；通過比對，RGA2183與L0C_0s09gll020有三處共37個堿基缺失，在2871062bp之間89%的同源； 序列RGA3202共978bp，編碼一個259個氨基酸；通過比對，RGA3202與L0C_0s07g09900在30173916bp之間99%的同源； 序列RGA3783共873bp，編碼一個202個氨基酸。通過DNAMAN6.0對抗感種質的PCR片段比對發現兩者在蛋白質序列中存在3個氨基酸突變；通過比對，RGA3783與L0C_0sl2g30070在20802758bp之間99%的同源； 序列RGA4703共1383bp，編碼一個290個氨基酸。通過DNAMAN6.0對抗感種質的PCR片段比對發現兩者在蛋白質序列中存在兩個氨基酸突變；通過比對，RGA4703與L0C_0sl2g03750 在 26503630bp 之間 99% 的同源； 序列RGA50-2共1654bp，編碼一個415個氨基酸的NBS蛋白家族。通過DNAMAN6.0對抗感種質的PCR片段比對發現兩者在蛋白質序列中存在7個氨基酸插入/缺失突變；通過比對，RGA502 與 L0C_0sl2gl7490 在 16733326bp 之間 99% 的同源； 序列RGA4682共1189bp，通過DNAMAN6.0對抗感種質的PCR片段比對發現兩者在堿基序列上存在插入/缺失突變；通過比對，RGA4682與L0C_0sl2g32680在16322535bp之間98%的同源。
全文摘要
本發明公開了水稻抗紋枯病基因關聯抗病同源序列及其分子標記獲取方法，對全基因組抗病同源序列設計RGA引物,獲得水稻種質的RGA基因型，通過紋枯病病菌微管鑒定技術178份核心種質的抗紋枯病表型，結合RGA基因型和抗紋枯病表型進行分子性狀關聯分析以及對PCR產物克隆測序，獲得與抗紋枯病關聯的抗病基因同源序列及其分子標記。本發明通過遺傳轉化和雜交，將其導入普通栽培水稻品種，能夠提高水稻對紋枯病的抗性；本發明獲得的抗紋枯病基因的相關聯的分子標記，可檢測抗紋枯病基因的有無，實現對抗病植株的間接選擇，避免了接種紋枯病病菌鑒定受氣候、地理位置等不確定因素的影響，可以用于早代選擇，縮短抗紋枯病育種年限，提高育種效率。
文檔編號C12N15/11GK103146690SQ201310046578
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月5日 優先權日2013年2月5日
發明者任鄄勝, 曾禮華, 任光俊, 高方遠, 陸賢軍, 吳賢婷 申請人:四川省農業科學院作物研究所