新城疫病毒rNDV-H₅2AH₉及其構建方法和應用的制作方法

專利名稱：新城疫病毒rNDV-H₅2AH₉及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及應用反向遺傳技術，拯救一株以新城疫病毒為載體共表達H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株rNDV-H52AH9，用于研制疫苗。
背景技術：
反向遺傳操作技術(Reversegenetics manipulation technique)是指通過在體外構建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒的一項研究技術[Rdmer-Oberddrfer A, Mundt E, Mebatsion T, Buchholz UJ, MettenleiterTC.Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.J GenVirol 1999.80(11):2987— 95.]，也叫“病毒拯救”。由于最終“拯救”出的RNA病毒來源于cDNA克隆，因此，可通過中間過程中人為加入的DNA環節，在DNA水平上對RNA病毒基因組進行各種體外人工改造，解決了 RNA病毒基因組難以操作這一難題，同時為新型疫苗的研制和開發提供了新的思路[Nakaya T, et a1.Recombinant Newcastle disease virus as avaccine vector.Journal of Virology, 2001.75 (23):p.11868-73.] 新城疫(ND)是危害養禽業的重要疫病之一，新城疫病毒(NDV)基因組全長約15kb，其結構為3 ' -NP-P-M-F-HN-L-5丨，依次編碼6種結構蛋白:核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein, NP)、憐蛋白(Phosphoprotein, P)、基質蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein, F)、血凝素-神經氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidase protein, HN)和大分子蛋白(Large protein, L)。從近十年來的ND流行特點來看，臨床上所分離到的NDV毒株大多數屬于基因VII型強毒株[LiuXF, Wan HQ, Ni XX, et al.Pathotypical and genotypical characterization of strainof Newcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in someregions of China duringl985-2001.Archives of Virology, 2003, 148(7):1387-1403.],而常規的ND疫苗株的基因型主要為I和II型(如V4、LaSota等)，在遺傳距離上與當前分離株相差較遠。禽流感病毒(AvianInfluenza Virus,AIV)屬于正粘病毒科(Orthomyxovoridae)中的A型流感病毒屬，病毒基因組由8個負鏈的單股RNA片段組成。該病毒感染禽類的癥狀從輕度上呼吸道感染、產蛋量降低，直至急性全身致死性疾病。基因組分為8個片段，是負義的單股RNA，片段I 8由大到小依次命名為PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M和NS基因。根據表面抗原血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的不同劃分亞型，迄今已發現了 16種HA和9種NA亞型，HA蛋白是禽流感病毒的主要保護性抗原，它不僅誘導機體產生特異性抗體，而且誘導CTL反應。目前H5N1亞型禽流感 病毒在世界范圍內對養禽業造成了巨大的損失，呈現高發病率和高死亡率，嚴重威脅著養禽業的健康發展，同時也威脅著人類的健康，是重要的人畜共患病病原。H9亞型禽流感病毒長期以來困擾養禽業發展，H9N2是目前亞洲的流行主型之一，廣泛存在于家禽中，雖然表現低致病性，但由于傳播廣泛、能造成免疫抑制使宿主易發生繼發感染、產蛋雞的產蛋下降、發病率高，對養禽業造成了嚴重的危害，并具有重要的公共衛生意義。疫苗接種是防制這兩種疾病的主要有效手段。常規疫苗具有耗時費力、成本高等缺點。重組活載體疫苗能達到一針防多病的效果，且節約成本，省時省力，適合于大規模免疫。載體病毒最重要的一個特點是能被用來迅速研制出針對新發高致病性傳染病的基因工程疫苗。NDV除具備這一特點外，還具有遺傳穩定性好、不存在與細胞基因組整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性強等諸多優點，可作為疫苗載體[Bukreyev A, Skiadopoulos MH, Murphy B R, et al.Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors[J].Journal of Virology, 2006, 80 (21): 10293-10306.] 在 NDV 基因組內插入禽流感病毒HA基因后的重組病毒，可在動物體內復制并穩定持續地表達HA蛋白，用此重組病毒作為疫苗，可以誘導機體產生針對Al和ND的雙重免疫保護力[Veits J, Wiesner D, FuchsWj et al.Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protectschickens against Newcastle disease and avian influenza[J].Proc Natl Acad SciU S A, 2006, 103(21):8197-8202.Schroer Dj Veits Jj Grund C，et al.Vaccination withNewcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highlypathogenic H7 avian influenza virus[J].Avian Dis，2009，53 (2):190-197.]2007年，葛金英等報道了以NDV LaSota株為載體，將一株H5N1 HPAIV的HA基因插入NDV基因組的P、M基因之間，重組病毒接種雞能夠同時抵抗速發型新城疫病毒以及同源和異源高致病性禽流感病毒的攻擊，接種BALB/c小鼠也能夠激發抗流感保護性免疫[Ge J, Deng G, Wen Z, et al.Newcastle disease virus-based live attenuatedvaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge ofhomologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses [J].Journal ofVirology, 2007，81 (I): 150-158.]。該重組疫苗已于2005年12月23日在中國正式批準生產，對中國乃至世界禽流感和新城疫防控起到積極推動作用，對人用新型禽流感疫苗的研制也具有重要的借鑒意義。但目前尚無同時插入兩個HA基因的相關報道。HA基因在NDV基因組的插入位置一般選擇在P、M之間或者F、HN基因之間[Nakaya Tj Cros Jj Park M S，et al.RecombinantNewcastle disease virus as a vaccine vector[J].Journal of Virology, 2001, 75(23):11868-11873.Ramp K，Skiba M，Karger A，et al.1nfluence of insertion site of theavian influenza virus haemagglutinin(HA) gene within the Newcastle disease virusgenome on HA expression [J].J Gen Virol，2011，92 (Pt2): 355-360.]。Ramp K 等的實驗數據表明NDV基因組可以同時容納總長度超過3500bp的兩個外源基因，對復制無明顯不利影口向[Ramp K, Veits J，Deckers Dj et al.Coexpression of Avian Influenza Virus H5and NI by Recombinant Newcastle Disease Virus and the Impact on Immune Responsein Chickens[J].Avian Diseases，2011，55 (3):413-421.]。連接肽可以同時連接多個基因并且保證多基因的協同表達。口蹄疫病毒(Footand mouth disease virus ，FMDV) 2A是自剪切多肽的典型代表。在兩個HA基因之間引入口蹄疫病毒具有自剪切功能的多肽2A序列(Self-cleaving 2A peptide)，使兩個HA蛋白同步表達，且蛋白性質基本不發生改變，避免了融合基因中兩基因由于空間的障礙而影響某個基因活性的可能，是構建單載體表達多蛋白的理想工具之一 [de Felipe P,Luke G A，Hughes L E, et al.Co-translational, intraribosomal cleavage of polypeptides bythe foot-and-mouth disease virus 2A peptide [J].J.Biol.Chem., 2003, 278:11441 —11448.]。2011年胡增壘等經反向遺傳技術獲得了基因vn型新城疫病毒致弱毒株NDV/AI4，效價高達 IOlog2 [Hu Z, Hu S，Meng C，et al.Generation of a genotype VII Newcastledisease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis 2011，55 (3): 391-397.]。含有H5亞型禽流感病毒流行株1117株HA基因的真核表達質粒PHW_HA[張妍等.clade2.3.2 H5N1亞型禽流感疫苗候選株的構建[J].畜牧獸醫學報.2012, 43 (6):915-921.]及H9N2亞型禽流感病毒流行株SD12E均由揚州大學農業部畜禽傳染病重點開放實驗室保存。因此，本專利以新城疫病毒致弱株AI4為載體，構建可同時表達H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株，以預防當前禽流感和新城疫流行株的感染。

發明內容
新城疫和禽流感是當前困擾我國養禽業的兩大重要疫病。H5N1亞型禽流感是一種嚴重危害養禽業的高度致死性疾病；H9亞型禽流感雖然表現為低致病性，但發病率高，常呈混合感染，引起免疫抑制，減少產蛋雞產蛋，給養禽業造成巨大的經濟損失。因此，本發明的第一個目的在于提供一種以新城疫病毒為載體共表達H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株，從而解決當前基因Vn型新城疫病毒、H5和Η9亞型禽流感病毒流行情況復雜、所用疫苗多而雜等問題，起到一針防多病的效果。一株新城疫病毒(Newcastle Disease Virus) rNDV_H52AH9,它的保藏號 CGMCC No:6654。所述新城疫病毒rNDV-H52AH9用于同時等量表達H5和H9亞型禽流感病毒的HA蛋白。新城疫病毒致弱株AI4為基因VII型，與我國當前NDV流行株的基因型一致；所插入的兩個HA基因在遺傳進化上均來源于H5和H9亞型AIV的流行毒株。因此，重組疫苗株rNDV-H52AH9在控制當前禽流感和新城疫的發病、流行方面顯示出了廣闊的應用前景。本發明的第二個目的在于提供一種以新城疫病毒為載體共表達H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株rNDV-H52AH9的構建方法:是利用已建立的致弱的鵝源新城疫病毒AI4株的反向遺傳操作平臺，將H5N1亞型禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/1117/2011 株的 HA 基因與 H9N2 亞型禽流感病毒 A/Chicken/Shandong/12E/2010株的HA基因通過FMDV的2A序列串聯在一起后插入轉錄載體pNDV/AI4的P、M的基因間隔區，構建出重組質粒pNDV/AI4-H52AH9，轉染后，獲得了具有較高繁殖性能的共表達H5和H9亞型禽流感病毒HA蛋白的重組疫苗株rNDV-H52AH9。具體包括以下步驟:1)H9亞型AIV流行株SD12E株HA基因與NDV AI4株M基因融合克隆的構建分別以SD12E株基因組cDNA和pNDV/AI4為模板PCR擴增H9 HA基因ORF和AI4株基因組3148 3804nt及3727 4735nt，通過Overlap PCR和分子克隆得到陽性質粒pH9M。
2)H5N1亞型AIV流行株1117株HA基因與NDV AI4株P基因融合克隆的構建分別以含有1117株HA基因的質粒PHW-HA和AI4株基因組cDNA為模板擴增HA基因(不含終止子)以及AI4株基因組部分P基因2714-3141nt。通過分子生物學方法將兩者融合在一起并克隆入pGEMT-easy載體,得到質粒pPH5。3)全長克隆 pNDV/AI4_H52AH9 的獲得質粒pPH5與pH9M同時用Aar I和Spe I進行雙酶切，回收目的片段并連接，構建質粒PPH5H9M ;然后用Age I和Bstzl7 I對pPH5H9M進行雙酶切后替換pNDV/AI4的對應序列，構建出重組NDV基因組全長克隆pNDV/AI4-H52AH9。4)重組病毒rNDV_H52AH9株的拯救將pC1-NP、pC1-P和pCI_L三個輔助質粒與轉錄載體pNDV/AI4_H52AH9共轉染BSR-T7/5細胞，轉染18h后加入終濃度為10%的SPF雞胚尿囊液，60h后將轉染細胞輕輕刮下，與細胞上清充分混合后接種9 11日齡SPF雞胚，即獲得重組病毒rNDV-H52AH9。


圖1重組質粒pNDV/AI4_H52AH9構建模式圖。圖2重組質粒pNDV/AI4_H52AH9的EcoR I酶切鑒定圖；M:500bp DNA ladder marker ；1:pNDV/AI4_H52AH9。圖3 重組病毒 rNDV_H52AH9 的 RT-PCR 鑒定；1、2:H5S、H5R 引物擴增產物；M:200bp DNA ladder marker ;3、4:H9mS、H9mR 引物
擴增產物。圖4重組病毒感染CHO細胞外源基因表達的檢測；A-D為AI4感染組，E-H為rNDV_H52AH9感染組。A、E組以抗NDV HN的單克隆抗體為一抗，B、F組以H5N1亞型AIV高免血清為一抗，C、G組以H9N2亞型AIV高免血清為一抗，D、H組以SPF雞陰性血清為一抗進行間接免疫熒光檢測。。
具體實施例方式本發明以新城疫病毒為載體構建的共表達H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株rNDV-H52AH9于2012年10月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；其保藏號CGMCC No:6654，分類命名為:新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)其長度為:18648bp。構建步驟一:以致弱的新城疫病毒AI4為載體共表達H5和H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的全長表達克隆的構建生物材料準備:新城疫病毒JS/5/05/Go株的致弱全長表達克隆pNDV/AI4 [Hu Z, Hu S，Meng C，etal.Generation of a genotype VII Newcastle disease virus vaccine candidatewith high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis 2011，55 (3):391-397.]，含有H5N1亞型禽流感病毒流行株A/Chicken/Yangzhou/1117/2011株HA基因的真核表達質粒PHW-HA[張妍等.clade2.3.2 H5N1亞型禽流感疫苗候選株的構建[J].畜牧獸醫學報.2012,43(6):915-921.]，由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室構建、保存；H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/12E/2010株由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室分離、保存。pGEMT-easy 載體:購自 Promega 公司。1、融合克隆pH9M的構建1)H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列分析與基因突變提取H9N2亞型禽流感病毒SD12E株的總RNA，并用12nt隨機引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3’，SEQ ID N0.1)進行RT-PCR反應，得到cDNA。序列分析發現需要對其ORF的31和1063位兩個Spe I酶切位點進行沉默突變。設計2對突變引物，分別用于擴增 HA 基因 ORF 的 I 1076nt、1050 1683nt。兩對突變引物分別是:TBlS:5' ATGGAAGTAGTATCACTAATAACTATACT G CT GTAGT 3’ (SEQ ID N0.2)TBlR:5’ CAACCAGCAAC (I AG O CCTGACCAACCTCCCTCTAT 3’ (SEQ ID N0.3)TB2S:5' AGGTTGGTCAGG Q CT O GTTGCTGGTTGGTATGGATT 3’ (SEQ ID N0.4)TB2R:5’TTATATACAAATGTTGCATC 3' (SEQ ID N0.5)突變堿基以斜體標注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。用引物TBlS和TBlR擴增HA基因ORF的I 1076nt區域，得到片段TBl ;用引物TB2S和TB2R擴增其1050 1683nt區域，得到片段TB2。PCR反應:以反轉錄的cDNA為模板配制如下PCR反應體系:
權利要求
1.一株新城疫病毒(Newcastle Disease Virus) rNDV_H52AH9,它的保藏號 CGMCC No:6654。
2.權利要求1所述新城疫病毒rNDV-H52AH9用于同時等量表達H5和H9亞型禽流感病毒的HA蛋白。
3.權利要求1所述新城疫病毒rNDV-H52AH9的構建方法，其特征在于:以VIId亞型新城疫致弱株AI4的基因組全長轉錄載體pNDV/AI4為骨架，同時表達兩株流行AIV毒株H5亞型 AIV A/Chicken/Yangzhou/1117/2011 和 H9 亞型 AIV A/Chicken/Shandong/12E/2010的HA基因；即將H5和H9亞型AIV的HA基因通過口蹄疫病毒2A基因串聯在一起后，插入轉錄載體PNDV/AI4的P、M基因之間，獲得重組新城疫病毒基因組全長cDNA克隆pNDV/AI4-H52AH9 ;該質 粒與輔助質粒共轉染BSR-T7/5細胞后獲得重組病毒rNDV_H52AH9。
全文摘要
本發明涉及新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus)rNDV-H52AH9，保藏號CGMCC No6654。本發明以新城疫病毒致弱株AI4為載體，將H5和H9亞型禽流感病毒的HA基因通過口蹄疫病毒2A基因串聯在一起后插入到含有AI4基因組全長的轉錄載體pNDV/AI4中，獲得重組NDV基因組全長克隆pNDV/AI4-H52AH9。經反向遺傳操作獲得了重組病毒rNDV-H52AH9，該重組病毒在雞胚上具有較高的繁殖滴度，且能同時穩定表達H5和H9亞型禽流感病毒的HA蛋白，為AI和ND的多聯重組基因工程活載體疫苗的研制與應用奠定了基礎。
文檔編號C12N7/01GK103074306SQ20131004427
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月4日 優先權日2013年2月4日
發明者劉秀梵, 丁平云, 宋慶慶, 王曉泉, 劉曉文, 胡順林 申請人:揚州大學