專利名稱：基因phyb在控制水稻低溫脅迫耐性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及通過降低水稻PHYB基因的表達(dá)來(lái)提高水稻低溫脅迫耐性。
背景技術(shù)：
水稻是我國(guó)播種面積最大、總廣量最多、單廣最聞的糧食品種，是我國(guó)65%左右人口的主食，在糧食生產(chǎn)和消費(fèi)中處于主導(dǎo)地位。水稻是一種低溫敏感植物，在生長(zhǎng)發(fā)育的早期階段和開花期特別容易受低溫傷害(de Los Reyes et al., Methods MolBiol, 2013，956:227-241)，全世界每年有1500萬(wàn)hm2以上的稻作受到低溫威脅。我國(guó)稻谷生產(chǎn)地區(qū)都受到程度不同的低溫冷害危害:長(zhǎng)江中下游及華南地區(qū)的水稻容易受“倒春寒”的危害而造成早稻爛種、爛秧，并且“寒露風(fēng)”影響晚稻的抽穗與結(jié)實(shí)；東北地區(qū)的水稻平均3 4年中有I年遭受低溫冷害，我國(guó)每年因冷害損失稻谷30 50億kg,全國(guó)災(zāi)年每年要損失稻谷50 100億kg (劉永巍，北方水稻2011，41 (4): 75-77)。目前我國(guó)水稻南方種植面積已經(jīng)趨于飽和，傳統(tǒng)水稻主產(chǎn)區(qū)的南方區(qū)、長(zhǎng)江中下游區(qū)水稻播種面積減少較多，產(chǎn)量上升空間不大，而東北區(qū)水稻播種面積則出現(xiàn)較大幅度的增長(zhǎng)(鐘甫寧和劉順飛，中國(guó)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)，2007，9:39-44)，提高水稻耐冷性，可以進(jìn)一步往北擴(kuò)大水稻種植面積。另外提高水稻苗期耐冷性可以提前水稻種植時(shí)間，提前水稻收割時(shí)間，避免后期低溫對(duì)水稻影響。因此研究提高水稻的耐冷性是保持水稻持續(xù)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，擴(kuò)大水稻的種植面積的重要保障。溫帶植物可以通過冷鍛煉而耐受零度以下的寒害，熱帶亞熱帶植物只能耐受冷害(Pearce Plant Growth Regul, 1999，29 (1-2): 47-76)。當(dāng)植物遭遇寒冷環(huán)境時(shí)，通過活性氧(ROS)調(diào)節(jié)信號(hào)途徑、鈣離子信號(hào)途徑等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而激活許多寒冷脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，在植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的特異蛋白，協(xié)同調(diào)節(jié)植物生理生化以及代謝的變化，從而提高植物對(duì)寒冷的耐性(Cheng et al., BMC Genomics, 2007, 8:175; Yang et al., 2010, JBiol Chem, 285(10):7119-7126;Yun et al.,BMC Plant Biol, 2010，10:16;Knight andKnight, New Phytol, 20 12，195(4): 737-751.)冷脅迫誘導(dǎo)的1000多個(gè)應(yīng)答基因中170個(gè)是轉(zhuǎn)錄因子，其中CRT/DRE-binding factor (CBF，也稱為DREB)基因在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到重要的樞紐作用(Thomashow, Plant Physiol, 2010，154(2): 571-577)。研究顯示 DREB 受到多重調(diào)控=DREB基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有多拷貝的MYC蛋白識(shí)別序列，可被ICE1、ICE2(MYC類蛋白)正調(diào)控，ICEl是HOSl泛素化目標(biāo)蛋白，在正常生長(zhǎng)條件下ICEl被HOSl(—個(gè)E3連接酶)泛素化而降解，從而誘導(dǎo)CBF/DREB表達(dá)進(jìn)而避免引起下游耐冷基因的表達(dá)(Park etal., J Plant Biol, 2011，54:275-285)，而 SIZ1(SUM0_E3 連接酶)可以阻止 ICEl 的泛素化，導(dǎo)致低溫響應(yīng)的 CBFs表達(dá)量增加(Miura et al.，Plant Cell, 2007, 19 (4): 1403-1414);在擬南芥中 MYB15 負(fù)調(diào)控 DREBs (Agarwal et al., J Biol Chem, 2006，281:37636-37645)。近幾年來(lái)，多個(gè)報(bào)道表明晝夜節(jié)律調(diào)控因子MYB、LATE ELONGATED HYP0C0TYL (LHY)和CIRCADIAN CLOCK ASS0CIATED1 (CCAl)調(diào)節(jié)DREB的表達(dá)而參與植物的耐冷調(diào)節(jié)(Dong andThomashow, Proc Natl Acad Sci USA, 2011，108(17):7241-7246;Lee et al., Proc NatlAcad Sci USA,2012, 109(37):15054-15059)。光敏色素(phytochrome, phy)是植物體內(nèi)的一種重要光受體，主要感受紅光和遠(yuǎn)紅光，參與調(diào)節(jié)植物生命循環(huán)中多個(gè)重要發(fā)育過程(Bae and Choi, Annu Rev PlantBiol，2008，59:281-311)。高等植物的光敏色素由一個(gè)小基因家族編碼，在擬南芥中光敏色素基因家族由5個(gè)成員(PHYA-PHYE)組成(Sharrock and Quail, Genes Dev,1989, 3:1745-1757 ；Clack et al.,Plant Mol Biol, 1994，25:413 - 427.)。水稻光敏色素基因家族包括3個(gè)成員et al.,Nucleic Acids Res, 1989，17:2865 -2866 ；Dehesh et al.,Mol Gen Genet, 1991，225:305 - 313)。圖位克隆和全基因組序列檢索顯示，PHYA, PHYB和PHYC位于水稻的第3染色體，其中PHYB基因位于短臂，在基因組中以單拷貝形式存在。Takano等人的研究表明水稻PHYB感受紅光調(diào)節(jié)水稻幼苗去黃花、幼苗葉片與葉鞘之間的角度和花期等水稻的生長(zhǎng)發(fā)育(Takano et al.，PlantCell,2005, 17:3311 - 3325)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在水稻日本晴中，通過不同方法降低編碼水稻光敏色素B的PHYB基因的表達(dá)水平，顯著提高了水稻耐冷性。這為耐低溫水稻品種的培育提供新的途徑，具有一定的經(jīng)濟(jì)意義。 本發(fā)明提供了基因PHYB在控制水稻低溫脅迫耐性中的應(yīng)用，具體是在水稻中利用反義技術(shù)或RNAi技術(shù)降低PHYB基因的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)PHYB基因表達(dá)水平降低的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性水稻植株耐冷性提高。在低溫條件下，對(duì)照材料的存活率為百分之五至百分之十，而轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的存活率為百分之九十以上，均明顯高于對(duì)照。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明通過兩種方法降低PHYB基因的表達(dá)水平，一是利用水稻PHYB基因的cDNA片段作為應(yīng)用基因，將該基因反向轉(zhuǎn)入水稻日本晴中，抑制水稻PHYB基因的表達(dá)；二是利用水稻PHYB基因cDNA的特異片段，構(gòu)建相應(yīng)的RNAi (RNA interference)植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻日本晴中，抑制水稻PHYB基因的表達(dá)。通過這兩種方法獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的低溫脅迫耐性。水稻PHYB基因的mRNA序列可以在NCBI網(wǎng)站(www.ncb1.nlm.nih.gov)(序列號(hào)為AB109892)上獲得。本發(fā)明是通過PCR方法，擴(kuò)增出水稻PHYB基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，包含3516個(gè)堿基，反向連接在植物表達(dá)載體pIG121Hm-8上，構(gòu)建成反義植物表達(dá)載體；或者利用PHYB基因編碼區(qū)的部分特異性序列構(gòu)建RNAi植物表達(dá)載體。再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將反義植物表達(dá)載體或RNAi植物表達(dá)載體至分別轉(zhuǎn)化至水稻品種日本晴中，抑制水稻內(nèi)源PHYB基因的表達(dá)，得到水稻PHYB基因表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)基因的T3代植株中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性水稻植株的低溫脅迫耐性明顯高于對(duì)照植株。本發(fā)明用于構(gòu)建反義PHYB基因植物表達(dá)載體、能夠抑制內(nèi)源PHYB基因表達(dá)的DNA序列如SEQ ID N0:1所示。氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明進(jìn)一步利用熒光定量分析結(jié)果表明:PHYB基因表達(dá)水平降低導(dǎo)致OsDREBI家族基因表達(dá)水平的升高，從而使PHYB反義轉(zhuǎn)基因株系或者RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系具有較強(qiáng)低溫脅迫耐性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:(I)本發(fā)明在水稻品種日本晴中，利用反義技術(shù)或者RNAi技術(shù)抑制水稻PHYB基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的低溫脅迫耐性明顯提高。在同樣條件下低溫處理后，發(fā)現(xiàn)90%以上轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株能夠恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而對(duì)應(yīng)的野生型植株僅僅5%-10%恢復(fù)正常生長(zhǎng)。(2)本發(fā)明中所涉及的抑制PHYB基因的表達(dá)方法，除了反義技術(shù)或者RNAi技術(shù)夕卜，還可以通過下面一種或多種途徑實(shí)現(xiàn):物理誘變、化學(xué)誘變、T-DNA插入、轉(zhuǎn)座子插入等。因此通過降低PHYB基因的表達(dá)培育耐冷性水稻新品種具有較為廣泛的應(yīng)用空間。同時(shí)本發(fā)明也為利用水稻PHYB同源基因培育其它作物(如玉米)的耐冷性品種提供支持。(3)本發(fā)明中應(yīng)用的基因可以為水稻等禾谷類作物以及其它作物耐寒性研究提供支持。
圖1為本發(fā)明中反義PHYB基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。具體為:把pIG121Hm植物表達(dá)載體上的SacI位點(diǎn)替換成KpnI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成pIG121Hm-8植物表達(dá)載體。將克隆在pMD18_T載體上的PHYB基因利用KpnI和XbaI酶切，替換pIG121Hm-8植物表達(dá)載體上KpnI和XbaI之間的DNA片段，這樣PHYB基因反向插入35S啟動(dòng)子后，即pIG121Hm-ant1-PHYB植物表達(dá)載體。圖2為本發(fā)明中PHYB基因RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。A為RNAi植物表達(dá)載體構(gòu)建過程中的中間載體的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，RNAi代表用于構(gòu)建PHYB基因RNAi植物表達(dá)載體的特異性DNA序列；Pubq是玉米泛素基因的啟動(dòng)區(qū)。B為PHYB基因RNAi植物表達(dá)載體流程圖。圖3為用Western blot檢測(cè)T3代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中PHYB蛋白質(zhì)的表達(dá)水平結(jié)果圖。其中RNAi代表RNAi植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因水稻株系，Anti代表反義植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因水稻株系，WT代表野生型水稻植株。圖4為轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株和野生型植株的低溫脅迫耐性比較圖。A為野生型和反義轉(zhuǎn)基因株系在低溫下培養(yǎng)7天時(shí)的表型圖；B為野生型和反義轉(zhuǎn)基因株系在低溫下培養(yǎng)14天時(shí)的存活百分比。其中Anti表示轉(zhuǎn)反義PHYB基因的植株，WT代表野生型水稻植株。圖5為PHYB基因的RNAi轉(zhuǎn)基因水稻和野生型植株的低溫脅迫耐性比較圖。A為野生型和RNAi轉(zhuǎn)基因植株6天幼苗在2-4° C下生長(zhǎng)3天后的表型；B為三葉期野生型和RNAi轉(zhuǎn)基因株系在低溫(8±1° C)下生長(zhǎng)3天后的表型；C為五葉期野生型和RNAi轉(zhuǎn)基因株系在低溫(8±1° C)下生長(zhǎng)5天后，而后在正常溫度(28° C)下繼續(xù)培養(yǎng)5天后的表型。其中RNAi表示轉(zhuǎn)RNAi轉(zhuǎn)基因水稻植株，WT代表野生型水稻植株。圖6為水稻OsDREBI基因家族基因在低溫處理不同時(shí)間的野生型和PHYB RNAi轉(zhuǎn)基因水稻植株中的表達(dá)模式。 三葉期的野生型和PHYB基因的RNAi轉(zhuǎn)基因株系在4° C中處理O、1、4、12和24小時(shí)，取材，利用熒光定量PCR分析水稻OsDREBI家族基因的表達(dá)水平。其中RNAi表示PHYB基因的RNAi轉(zhuǎn)基因植株，WT代表野生型水稻植株。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆用于構(gòu)建反義PHYB基因植物表達(dá)載體和RNAi植物表達(dá)載體的DNA片段，以及驗(yàn)證功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其使用不同的用途和條件。實(shí)施例1:分離克隆用于構(gòu)建反義PHYB基因植物表達(dá)載體的DNA片段采用TRIZOL試劑(Invitrogen)從水稻品種日本晴(公開報(bào)道的一個(gè)品種)的葉片中提取總RNA。具體步驟如下:將20毫克葉片放至液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速磨成粉末，將粉末裝入1.5ml離心管中,迅速加入Iml Trizol (Invirogen)顛倒混勻,室溫靜置5分鐘。在4°C，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1.5ml離心管中。加入200 μ I氯仿，用手劇烈搖動(dòng)15秒鐘，室溫靜置2-3分鐘。4°C，12000rpm離心15分鐘。取無(wú)色水相至一新的離心管中，加入250 μ I異丙醇，250μ I高鹽溶液，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4°C，12000rpm離心10分鐘，吸除上清液。加入Iml冰冷的75%乙醇，上下倒置幾次，然后40C，7500rpm離心5分鐘，棄上清，在室溫干燥至沉淀變透明。加入適量的DEPC水(一般為60 μ I)溶解沉淀，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript II (Invitrogen)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,具體步驟如下:依次加入 I μ 1500 μ g/ml oligo (dT)12_18、2 μ g 總 RNA、I μ IlOmM dNTP 混合物和 DEPC 水至12 μ 1，在65°C水浴中5分鐘，迅速冰浴5分鐘，稍微離心，收集樣品于管底。然后依次加Λ4μ 15Χ 第一鏈緩沖液、2 μ 10.1M DTT 和 I μ I RNaseOUTC 40U/μ 1)，42°C，2 分鐘。然后加入I μ ISuperScript II，輕微混合均勻，42°C反應(yīng)50分鐘，70°C水浴15分鐘使酶失活，這樣就合成了第一鏈cDNA，以第一鏈c`DNA為模板擴(kuò)增目的基因。用帶有酶切位點(diǎn)的上游引物 PHYBFl (5，-ATG GTACCATGG CCT CGG GTAGCC-3’ (SEQ ID NO:3)，序列特異引物外加KpnI位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基)和下游引物PHYBRl (5，-ATT CTA GAT CAG CTT GTC CCC CTAC-3’(SEQ ID NO:4)，序列特異引物外加XbaI位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基)。利用PrimerSTAR HSDNA polymerase with GC buffer (TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增目的片段,PCR反應(yīng)條件是94°C預(yù)變性 Imin ；98°C IOmin, 68°C 4min, 30 個(gè)循環(huán)。利用 TArget Clone -Plus 試劑盒(Τ0Υ0Β0)在PCR產(chǎn)物末端加A。然后連接到pMD18-T載體(TaKaRa)。篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO:1所示)，將該克隆命名為pMD18_PHYB cDNA。實(shí)施例2:反義PHYB基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化為了能更好地分析PHYB的功能，申請(qǐng)人通過反義技術(shù)使PHYB基因在水稻中的表達(dá)水平降低。根據(jù)轉(zhuǎn)基因植株的表型和生理特征研究該基因的功能。反義PHYB基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下:首先將實(shí)施例1中得到的陽(yáng)性克隆PMD18-PHYB cDNA用KpnI和XbaI雙酶切，回收插入片段；同樣，用同樣的方法酶切pIG121Hm-8的植物表達(dá)載體，回收載體片段。用回收的插入片段和載體片段做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue。通過酶切篩選陽(yáng)性克隆，獲得植物表達(dá)載體，命名為pIG121Hm-ant1-PHYB (見圖1)。pIG121Hm_8是在國(guó)際常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pIG121Hm基礎(chǔ)上，用KpnI酶切位點(diǎn)取代⑶S基因編碼區(qū)和終止區(qū)之間的SacI位點(diǎn)所得到的(見圖I)。將 pIG121Hm-ant1-PHYB 轉(zhuǎn)化至 EHA105 宿主菌。實(shí)施例3:分離克隆用于構(gòu)建PHYB基因RNAi植物表達(dá)載體的DNA片段以及RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例1的方法，提取水稻葉片RNA，合成第一鏈cDNA。利用PrimerSTAR HSDNA polymerase with GC buffer (TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增PHYB基因cDNA的特異性片段,所用的特異性引物是:上游引物 PHYBF2 (5，-CAC CAT GAAAAG AAG TGT TAT GCAAG-3，(SEQ IDNO:5)、下游引物 PHYBR2 (5，-ATT TCA TCA GGG ATA TCT CGAATAAG-3’ (SEQ ID NO:6)。PCR 反應(yīng)條件是 98°C預(yù)變性 Imin ;98°C IOsec, 60°C 15sec，72°C lmin,30 個(gè)循環(huán)；后延伸72°C 5min,即得到了 PHYB基因特異性RNAi片段。利用ρΕΝΤ[1ΤΜ' -ΤΟΡΟ ! Cloning Kit 試劑盒(Invitrogen)將上述 PCR產(chǎn)物克隆在 pENTR 載體。具體步驟如下:依次加入 3μ1 RNAase-free water> I μ I Salt solution、1μ I pENTR vector和1μ I PCR產(chǎn)物(>10ng)，輕微混合均勻，23°C連接10分鐘，然后轉(zhuǎn)化試劑盒中提供的感受態(tài)T0P010細(xì)胞。將該克隆命名為pENTR-PHYB RNAi (圖2)。利用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (invitrogen)試劑盒將 PHYB 基因的RNAi片段重組在pANDA載體。具體步驟如下:依次加入150ng pENTR-PHYB RNAi質(zhì)粒、150ngPANDA vector>2 μ I LR Clonase enzyme mix,然后加TE Buffer (ΡΗ8.0),至終體積為 8 μ I,稍微渦旋離心(<2sec)，25°C溫浴l_16h，加入1μ I蛋白酶K (20 μ g/μ 1)，37°C溫浴IOmin終止反應(yīng)后，取1-5 μ I反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆，獲得PHYB基因的RNAi植物表達(dá)載體，命名為PANDA-PHYBRNAi (圖2)。然后將pANDA-PHYBRNAi轉(zhuǎn)化至EHA105宿主菌。實(shí)施例4:反義 PHYB基因植物表達(dá)載體和PHYB基因RNAi植物表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系(參見本發(fā)明后面的實(shí)施例)將其導(dǎo)入到水稻品種日本晴中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、移苗得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系在Hiei等人報(bào)道的方法基礎(chǔ)上改良進(jìn)行(Hiei et al.，1994，Plant J，6:271-282)。轉(zhuǎn)化分別獲得30株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因水稻植株。具體步驟如下:(I)愈傷誘導(dǎo):去殼的野生型日本晴水稻種子,用70%乙醇表面消毒I分鐘；5%(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無(wú)菌水沖洗4-5次；播種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織(成分見后)，于25-26°C暗培養(yǎng)4-7天后，將從成熟胚盾片處誘導(dǎo)出初生愈傷組織，同時(shí)用鑷子去掉胚上長(zhǎng)出的胚芽，繼代于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周，直至長(zhǎng)出色澤淡黃，質(zhì)地堅(jiān)硬呈顆粒狀的胚性愈傷組織。(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng):將愈傷組織轉(zhuǎn)至新鮮的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，于25_26°C暗培養(yǎng)4天。(3)農(nóng)桿菌培養(yǎng):挑取農(nóng)桿菌單克隆接種到5mL YEP液體培養(yǎng)基中(含有50mg/L的卡那霉素)，281:，220印111，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期(大約培養(yǎng)18-24小時(shí))。將獲得的菌液按1%接種量轉(zhuǎn)接到50mL新鮮的、含有50mg/L卡那霉素的AB液體培養(yǎng)基中(成分見后);28°C，220rpm,培養(yǎng)至0D600值為0.5左右(培養(yǎng)5-6小時(shí))。(4)農(nóng)桿菌侵染:把50mL菌液轉(zhuǎn)入離心管，4°C，4000g離心10分鐘，棄上清，加入等體積的AAM培養(yǎng)基重懸菌體。把(2)的日本晴胚性愈傷組織浸入上述AAM菌液，侵染2分鐘，緩慢搖動(dòng)。用無(wú)菌吸水紙將愈傷組織吸干，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基上鋪一層無(wú)菌濾紙)，26 ℃，黑暗共培養(yǎng)2-3天。(5)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng):共培養(yǎng)后的愈傷組織用無(wú)菌水洗4次，然后再用含500mg/L羧芐青霉素Cb的無(wú)菌水洗2次，再用無(wú)菌吸水紙吸干后置于工作臺(tái)吹30分鐘。將愈傷組織置于固體篩選培養(yǎng)基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧芐青霉素)上，26°C暗培養(yǎng)2周。然后轉(zhuǎn)移到固體篩選培養(yǎng)基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧芐青霉素)上，26°C暗培養(yǎng)，每2周繼代一次，篩選4周。(6)分化培養(yǎng):把抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，28°C光照培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)接一次后，培養(yǎng)至產(chǎn)生再生苗。(7)壯苗、移栽:將再生的小植株轉(zhuǎn)至新鮮的1/2MS培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)瓶中生根壯苗。待小苗長(zhǎng)至IOcm左右，打開封口膜，煉苗2-3天，將再生苗移至土中培養(yǎng)。試劑配方:(1)試劑和溶液縮寫:本發(fā)明中作用到的植物激素的縮寫表示如下:Cb(Cabenicillin,羧節(jié)青霉素);KT (Kinetin,激動(dòng)素);NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸);2,4_D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2, 4_ 二氯苯氧乙酸);AS (Acetosyringone,乙酸丁香酮)；DMS0 (Dimethyl sulfoxide, 二甲基亞諷)。(2)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方:1)YEP液體培養(yǎng)基:2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，1 NaCl，加水定容至200mL，用5N NaOH 調(diào) PH 至 7.0。2)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基:N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L 鹿糖，2mg/L2, 4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH5.8。3) AB 液體培養(yǎng)基:3g/L K2HPO4, lg/L NaH2PO4, lg/L NH4Cl, 300mg/L MgSO4.7H20,150mg/L KCl, lOmg/L CaCl2.2H20, 2.5mg/L FeSO4.7H20，5g/L 葡萄糖，ρΗ7.0。4)AAM培養(yǎng)基:AA大量，AA微量，0.9g/L L-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，MS維生素，
0.5g/L 酸水解酪蛋白，36g/L 葡萄糖,68.5g/L 鹿糖，20mg/LAS, pH5.2。5)共培養(yǎng)培養(yǎng)基:N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，
0.5g/L 酸水解酪蛋白，2mg/L2, 4_D，20mg/LAS，Gelrite (Sigma) 4g/L，ρΗ5.8。6)固體篩選培養(yǎng)基:Ν6大量、Ν6微量和Ν6維生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L鹿糖，2mg/L2, 4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH5.8,合適濃度的潮霉素和羧節(jié)青霉素。7)分化培養(yǎng)基:MS大量，MS微量，鐵鹽和MS維生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L 山梨醇，2mg/L KT, 0.2mg/L ΝΑΑ，ρΗ5.8，30mg/L 潮霉素 B，200mg/L 羧芐青霉素。8) 1/2MS 培養(yǎng)基:1/2MS 大量，1/2MS 微量，MS 維生素，30g/L 蔗糖，4g/L Gelrite,30mg/L潮霉素B，200mg/L羧芐青霉素，pH5.8.
(3)主要溶液配方:1 )N6 大量元素(IOX)KNO328.3 g
KH2PO44.0 g
MgS04.7H201.85 g
CaCl2OH2O1.66 g
(NH4)2SO44.63 g用水定容IL2) N6 微量(1000X):
MnS04-4H204.400 g
ZnSO4 TH2O1.500 g
HiBO3丨.600 g
KI0.800 g
NaMoO4JH2O0.250 g用水定容IL
3)N6 維生素(1000X)
甘氨酸200 mg 鹽酸硫胺素BIIOOmg
鹽酸吡哆素B650 mg煙酸50 mg肌醇10 g
用水定容IOOmL3) MS 大量元素(IOX)
ECNO519.0 g
NH4NO316.5 g
KH2PO41.7 g
MgS04-7H203.7 g
CaCl2CH2O4.4 g用水定容IL
4) MS 微量(1000X ):MnS04-4H2022.300g
ZnSO4-TH2O8.600 g
H3BO36.200 g
KI0.830 g
NaMoO4^H2O0.250 g
CuSO4-SH:00.025 g
CoC12 6H；;00.025 g用水定容IL5) MS 維生素(1000 X )
甘氨酸200 mg 鹽酸硫胺素BIIOmg 鹽酸吡哆素B650 mg 煙酸50 mg 肌醇10 g用水定容IOOmL6 )鐵鹽(200 X )FeSO4.7H205.56gNa2EDTA.2H207.46g7 ) AA 大量(200 X ) MgSO4-TH2O5 g
CaCI2-2H2O3 g
NaH2PO^3 g
KCl60 g8) AA 微量(1000X)
MnSO4-H2O10.0 g
Z nS04-7H202.0 g
H.,BO；,3.0 g
KI0.75 g
NaMoCVH2O0.250 g
CuSO4-SH2O0.025 g
CoCl2.6H200.025 g
用水定容IL9) 2，4-D 儲(chǔ)存液(2mg/ml)稱取2，4-D100mg，溶于Iml DMS0，加入蒸餾水定溶至49ml，然后加入0.5N NaOH,至完全溶解，于-20°C保存。10) Kinetin 儲(chǔ)存液(0.2mg/ml)稱取KinetinlOmg,溶于ImllNKOH,加蒸懼水定溶至50ml,于4°C保存。 11) NAA 儲(chǔ)存液(0.2mg/ml)·
稱取NAAlOmg，溶于0.5mllN K0H，加蒸餾水定溶至50ml，于4°C保存。12)乙酰丁香酮(100mg/ml)稱取乙酰丁香酮lOOmg，溶于Iml DMS0，于_20°C保存。13)卡那霉素(50mg/ml)稱取卡那霉素500mg，溶于8ml蒸餾水中，加蒸餾水定溶至10ml，然后用0.22 μ m濾器過濾除菌，于_20°C保存。實(shí)施例5:檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻的PHYB蛋白質(zhì)水平以水稻品種日本晴、3個(gè)獨(dú)立的RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系和3個(gè)反義轉(zhuǎn)基因株系。提取5葉期水稻葉片的可溶性蛋白質(zhì),利用western blot檢測(cè)水稻葉片中PHYB蛋白質(zhì)水平。具體方法如下:從上述材料收集I克水稻葉片，在液氮中充分研磨，加入2ml蛋白質(zhì)提取緩沖液(IOOmM Tris-HCl, pH8.3，5mM EDTA, 0.2%β -巰基乙醇和蛋白酶抑制劑混合物)，混勻，在冰上放置30min。然后12000Xg4°C離心15min。轉(zhuǎn)移上清液至另一管中，加入2/3體積的飽和硫酸銨，混勻，冰上靜止30min。12000乂841:離心301^11。棄上清，沉淀用200 μ I蛋白質(zhì)提取緩沖液懸浮。利用 Coomassie PLUS Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。利用10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，每個(gè)上樣孔50μ g蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，通過印跡法轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore, Billerica, MA)。然后按照Takano等人的方法進(jìn)行免疫化學(xué)分析，檢測(cè)PHYB蛋白質(zhì)水平(Takano et al,Plant Cell, 2005.17:3311-3325)。結(jié)果表明，在3個(gè)獨(dú)立的反義轉(zhuǎn)基因水稻植株和3個(gè)RNAi轉(zhuǎn)基因水稻植株中，PHYB蛋白質(zhì)的水平都顯著低于野生型(圖3)。實(shí)施例6:轉(zhuǎn)反義PHYB基因植株具有較強(qiáng)的低溫脅迫耐性將反義PHYB轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株種子用70%乙醇表面消毒I分鐘；5% (活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無(wú)菌水沖洗4-5次；播種于含有0.4%的瓊脂培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶。在光照培養(yǎng)箱(28° C，7900Lx)條件下生長(zhǎng)6天后，挑選生長(zhǎng)一致的幼苗轉(zhuǎn)移至土中，在正常情況下培養(yǎng)至二葉期，轉(zhuǎn)移至低溫生長(zhǎng)室中(暗期12h，8±l° C;暗期12h，4±l° C)培養(yǎng)，在低溫下培養(yǎng)7天時(shí)野生型葉片出現(xiàn)顯著萎蔫現(xiàn)象(圖4A)。在生長(zhǎng)室中培養(yǎng)14天時(shí)，90%以上的野生型枯死，而反義轉(zhuǎn)基因水稻基本全部正常，僅僅約5-10%枯萎(圖4B)，因此轉(zhuǎn)反義PHYB基因的水稻植株具有較強(qiáng)的低溫脅迫耐性。實(shí)施例7 =PHYB基因的RNAi轉(zhuǎn)基因水稻植株具有較強(qiáng)的低溫脅迫耐性將不同發(fā)育階段的T3代RNAi轉(zhuǎn)基因水稻和野生型進(jìn)行低溫處理，比較野生型和轉(zhuǎn)基因水稻植株的表型。具體步驟如下:去殼的RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系和野生型如實(shí)施例4所述經(jīng)過表面消毒后，播種于含有0.4%的瓊脂培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶。對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的水稻幼苗進(jìn)行不同低溫處理。第一種情況:在光照培養(yǎng)箱(28° C，7900Lx)條件下生長(zhǎng)6天后，轉(zhuǎn)移至低溫培養(yǎng)箱(2-4° C，7900LX)生長(zhǎng)3天，可見野生型葉鞘出現(xiàn)漂白、葉片萎蔫，而RNAi轉(zhuǎn)基因水稻基本正常(圖5A)。第二種情況:在光照培養(yǎng)箱(28° C，7900Lx)條件下生長(zhǎng)6天后，轉(zhuǎn)移至Yoshida溶液(Yoshida，1976)在光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至三葉期，而后轉(zhuǎn)移至低溫培養(yǎng)箱(8± I ° C，7900Lx)生長(zhǎng)3天，RNAi轉(zhuǎn)基因水稻植株能夠正常生長(zhǎng)，而野生型全部萎蔫(圖5B)。第三種情況:在光照培養(yǎng)箱(28° C，7900Lx)條件下生長(zhǎng)6天后，轉(zhuǎn)移至Yoshida溶液(Yoshida)在光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至五葉期,轉(zhuǎn)后轉(zhuǎn)移至低溫培養(yǎng)箱(8± 1° C，7900LX)生長(zhǎng)5天，大部分野生型水稻植株的葉片發(fā)生萎蔫，而僅僅少數(shù)RNAi轉(zhuǎn)基因水稻植株的葉片發(fā)生萎蔫；隨后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱(28° C,7900Lx)繼續(xù)培養(yǎng)5天，可以看出，在野生型中萎蔫的葉片全部死亡，而RNAi轉(zhuǎn)基因水稻植株中萎蔫的葉片能夠恢復(fù)(圖5C)。上述結(jié)果顯示，PHYB基因的RNAi轉(zhuǎn)基因基因水稻植株具有較強(qiáng)的低溫脅迫耐性。 實(shí)施例8 =PHYB基因表達(dá)水平降低增強(qiáng)水稻低溫脅迫耐性的機(jī)制分析已有報(bào)道表明，DREBl (CBF)家族基因在冷脅迫反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要的樞紐作用。因此我們檢測(cè)了 RNAi轉(zhuǎn)基因株系和野生型水稻在低溫處理不同時(shí)間后，水稻OsDREBI家族基因的表達(dá)水平。具體實(shí)施步驟如下:將RNAi轉(zhuǎn)基因植株(#1)和非轉(zhuǎn)基因野生型植株的種子用70%乙醇表面消毒I分鐘；5% (活性氯含量)NaC10溶液表面消毒20分鐘，然后無(wú)菌水沖洗4-5次，在30° C下誘導(dǎo)萌發(fā)3天后，在光照培養(yǎng)箱(28° C，7900Lx)培養(yǎng)至3葉期，然后轉(zhuǎn)移至低溫培養(yǎng)箱(4° C，7900Lx)處理，分別在處理后0、l、4、12、24h取材。按照實(shí)施例1方法提取RNA、合成cDNA第一鏈，并利用熒光定量RT-PCR分析水稻OsDREBI家族不同成員的的轉(zhuǎn)錄水平。熒光定量PCR所用引物序列及SEQ ID NO如表I。同時(shí)用水稻內(nèi)源翻譯延伸因子基因(OsEF-1a)作為熒光定量PCR分析的內(nèi)參基因，其特異引物見表I。利用SYBR Premix Ex Taq PCR試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。具體步驟如下:依次加入10 μ 12 X SYBR Premix Ex Taq ,2.0μ I cDNA模板、0.2 μ M基因特異性引物對(duì)，用RNase-free H2O補(bǔ)足反應(yīng)體系為20 μ I。PCR反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性30秒；95°C變性30秒，60°C退火延伸30秒，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，分析各個(gè)樣品的擴(kuò)增曲線和溶解曲線以確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。然后用Excel通過2_λ Δε 法處理熒光定量PCR獲得的Ct值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差，對(duì)最終處理結(jié)果作圖。如圖6所示，在低溫處理后，OsDREBI家族基因在RNAi轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平明顯高于野生型(OsDREBID和OsDREBIF在低溫處理12小時(shí)后的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因植株中降低)。另一方面，在正常生長(zhǎng)條件下，除OsDREBIA外，其余OsDREBI家族基因在RNAi轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平均高于野生型。這些結(jié)果表明PHYB基因表達(dá)水平降低導(dǎo)致OsDREBI家族基因表達(dá)水平的升高，OsDREBI基因的較高表達(dá)水平可能是PHYB反義轉(zhuǎn)基因株系或者RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系具有較強(qiáng)低溫脅迫耐性的原因。表1.實(shí)施例6中所用的熒光定量PCR引物及其在本發(fā)明中所對(duì)應(yīng)的序列號(hào)(SEQID N0.)
權(quán)利要求
1.因PHYB在控制水稻低溫脅迫耐性中的應(yīng)用。
2.按權(quán)利要求1所述的基因PHYB在控制水稻低溫脅迫耐性中的應(yīng)用，其特征是，通過降低水稻PHYB基因的表達(dá)來(lái)提高水稻低溫脅迫耐性。
3.按權(quán)利要求2所述的基因PHYB在控制水稻低溫脅迫耐性中的應(yīng)用，其特征是，基因PHYB表達(dá)水平降低導(dǎo)致OsDREBI家族基因表達(dá)水平的升高，從而提高了水稻的低溫脅迫耐性。
4.因PHYB在提高水稻低溫脅迫耐性中的應(yīng)用方法，其特征是，利用水稻PHYB基因的cDNA片段作為應(yīng)用基因，將該基因反向轉(zhuǎn)入水稻日本晴中，抑制水稻PHYB基因的表達(dá)；或者利用水稻PHYB基因cDNA的特異片段，構(gòu)建相應(yīng)的RNAi植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻日本晴中，抑制水稻PHYB基因的表達(dá)。
5.按權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征是，通過PCR方法，擴(kuò)增出水稻PHYB基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，反向連接在植物表達(dá)載體pIG121Hm-8上，構(gòu)建成反義植物表達(dá)載體；或者利用PHYB基因編碼區(qū)的部分特異性序列構(gòu)建RNAi植物表達(dá)載體；再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將反義植物表達(dá)載體或RNAi植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至水稻品種日本晴中，抑制水稻內(nèi)源PHYB基因的表達(dá)，得到水稻PHYB基因表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因植株。
6.按權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用方法，其特征是，擴(kuò)增PHYB基因編碼區(qū)的部分特異性序列的上游引物PHYBF2 為 5’-CAC CAT GAA AAG AAG TGT TAT GCA AG-3’，下游引物PHYBR2為 5， -ATT TCA TCA GGG ATA TCT CGA ATA AG-3，。
全文摘要
本發(fā)明公開了基因PHYB在控制水稻低溫脅迫耐性中的應(yīng)用。本發(fā)明將水稻PHYB基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)反向連接在pIG121Hm-8上，構(gòu)建成反義植物表達(dá)載體；或者利用PHYB基因編碼區(qū)的部分特異性序列構(gòu)建RNAi植物表達(dá)載體，再將反義植物表達(dá)載體或RNAi植物表達(dá)載體至分別轉(zhuǎn)化至水稻中，抑制水稻內(nèi)源PHYB基因的表達(dá)，得到水稻PHYB基因表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株的低溫脅迫耐性明顯高于對(duì)照植株。本發(fā)明進(jìn)一步利用熒光定量分析結(jié)果表明PHYB基因表達(dá)水平降低導(dǎo)致OsDREB1家族基因表達(dá)水平的升高，從而使PHYB反義轉(zhuǎn)基因株系或者RNAi轉(zhuǎn)基因水稻株系具有較強(qiáng)低溫脅迫耐性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103088056SQ20131004133
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者謝先芝, 周晉軍, 和亞男, 王盈盈, 吳修, 張士永, 李亞萍 申請(qǐng)人:山東省水稻研究所