一種剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熒光定量pcr引物、探針及試劑盒的制作方法

專利名稱：一種剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熒光定量pcr引物、探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嗜皮菌分子診斷的熒光定量PCR檢測引物、探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
嗜皮菌病是一種以滲出性和增生性皮炎、淺表上有皮壞死并有痂塊形成為特征的皮膚病。此病主要感染牛、綿羊、馬；也可以影響山羊、貓、狗、許多野生動物以及爬行動物。最近，世界各地有很多人感染此病的報道。嗜皮菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴于觀察嗜皮菌培養(yǎng)后的特征性菌落和顯微鏡下出現(xiàn)的革蘭氏陽性的分枝菌絲或火車道型成行排列的孢子。然而，培養(yǎng)和其它傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法的特異性和靈敏度不夠，且耗時長。因此，建立嗜皮菌病診斷的新技術(shù)，尤其是早期、快速、高特異性和高靈敏度的檢測技術(shù)就顯得尤為重要和迫切。此外，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，龜型嗜皮菌僅存在于爬行動物，而剛果嗜皮菌存在于人和其他哺乳動物。我們成功地從患嗜皮菌病牛的皮膚分離出龜型嗜皮菌，本發(fā)明可以同時擴(kuò)增而且分辨剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的在于提供一種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適合臨床使用的定量PCR檢測嗜皮菌的引物、探針及試劑盒，同時方便的區(qū)分剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌。本發(fā)明的原理和核心是科學(xué)地設(shè)計擴(kuò)增和檢測嗜皮菌的特異、高效的引物和探針。在保證設(shè)計的引物高效擴(kuò)增嗜皮菌、設(shè)計的探針特異檢測嗜皮菌的同時，確保此引物和探針不擴(kuò)增和檢測其它類似的微生物。此`外，設(shè)計的探針和剛果嗜皮菌的基因序列完全吻合，而和龜型嗜皮菌有3個堿基的差異；因此，高分辨率熔點(diǎn)曲線技術(shù)會顯示剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的不同熔解溫度，這可以方便的用于基因分型。從GenBank (www. ncb1.nlm.nih.gov)獲取如下嗜皮菌和相關(guān)細(xì)菌的16SrDNA的序列后，用Clustal MultipleAlignment Algorithm的方法對所有序列進(jìn)行對齊剛果嗜皮菌(基因序列號AB550800,AJ243918, FJ708634, HM590697)，龜型嗜皮菌(AB550801)，放線菌(HQ891175，JF499686,JF820789),棒狀桿菌(FR874223), Kytococcus sedentarius (EU443746)和 Tosilophilusp. (AB096085)。引物和探針的選擇基于對齊序列的保守區(qū)和變異區(qū)。附圖1顯示設(shè)計的引物和探針NO. 5)。
上游引物擴(kuò)增嗜皮菌5’ -TTAACACATGCAAGTCGAACGATGAA-3’ (SEQ ID NO.1)；
下游引物-1 擴(kuò)增剛果嗜皮菌:5，-ATGCGAGGAAAGGTCATATT-3’ (SEQ ID NO. 2)；下游引物-2 擴(kuò)增龜型嗜皮菌 5’ -ATGCGGAGAAAGGTCATAGG-3’ (SEQ I D NO. 3)；探針-1 :5’ -TCCCAAAGTGARGGGYAGATTACTCAC-6FAM-3’ (SEQ ID NO. 4)；
探針-2:5 ‘-LCRed-640-TGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATC-pho s (磷酸)_3’ (SEQID
本發(fā)明還公開了剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括5倍定量PCR反應(yīng)液22 μ I,以及22 μ I的5倍的引物探針混合液含濃度為5 μ M的上游引物、5 μ M下游引物-1、5 μ M下游引物-2、I μ M的探針-1、I μ M的探針-2 )本發(fā)明進(jìn)一步公開了剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌分型鑒別方法，包括以下步驟(I)用上述引物和探針PCR擴(kuò)增待測菌，擴(kuò)增出145bp條帶，且熒光檢測在640nm波長增強(qiáng)的為陽性樣本；(2) PCR完成后，對步驟(I)陽性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)熔解溫度對埃里希氏菌進(jìn)行分型，剛果嗜皮菌的熔解溫度是一 63°C，比龜型嗜皮菌的熔解溫度一55 °C。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的引物、探針及試劑盒用于檢測嗜皮菌時，具有快速、更特異、更靈敏的優(yōu)點(diǎn)。i)經(jīng)典的培養(yǎng)和染色方法鑒定嗜皮菌需要3-7天，本發(fā)明僅需2-4個小時(包括DNA提取約90分鐘、PCR約60分鐘、高分辨率熔解曲線分析5分鐘、結(jié)果判定10分鐘);ii) PCR的分子診斷基于嗜皮菌的核酸序列，因而具有很高的特異性；iii)本發(fā)明可以有效地擴(kuò)增10個拷貝的嗜皮菌核酸，具有極高的靈敏度；iv)由于本發(fā)明的高靈敏度，本發(fā)明可用于嗜皮菌病的早期診斷和療效判定；v)傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，龜型嗜皮菌存在于爬行動物，而剛果嗜皮菌存在于人和其他哺乳動物。我們的研究成功的從牛的皮膚分類出龜型嗜皮菌。此發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)還包括，可以同時擴(kuò)增而且分辨剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌。本發(fā)明以經(jīng)過科學(xué)的優(yōu)化，和現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有很多優(yōu)點(diǎn)，可以方便的用于獸醫(yī)診所、人民醫(yī)院的嗜皮菌病的分子診斷。


圖1 :嗜皮菌熒光定量PCR的引物和探針剛果嗜皮菌、龜型嗜皮菌、放線菌、棒狀桿菌的16S rDNA的PCR擴(kuò)增子的序列對齊，方框內(nèi)顯示引物和探針 的序列?！北硎净蛐蛄泻蛣偣绕ぞ男蛄幸恢?，表示堿基的缺失。上游引物的序列如圖所示，而下游引物和二個探針的序列和顯示的序列成反義關(guān)系。圖2 :剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熔解溫度PCR完成后，對剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，觀察剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熔解溫度。由于設(shè)計的引物擴(kuò)增剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌，而設(shè)計的探針和剛果嗜皮菌的基因序列完全吻合、同龜型嗜皮菌有3個堿基的差異，這樣剛果嗜皮菌比龜型嗜皮菌有更高的熔解溫度，從而可以方便的用于基因分型。高分辨率熔解曲線分析結(jié)果顯示，剛果嗜皮菌的熔解溫度是飛3°C (上圖)，比龜型嗜皮菌的熔解溫度( 55°C)高約8°C (下圖)。圖3 :剛果嗜皮菌的培養(yǎng)菌落剛果嗜皮菌在37°C和5%培養(yǎng)CO2的條件下的血平皿培養(yǎng)3-5天后，呈現(xiàn)粗糙、干燥、金黃色、嵌入培養(yǎng)基的、直徑約5mm的特征型的菌落。圖4 :剛果嗜皮菌的革蘭氏染色剛果嗜皮菌的革蘭氏染色呈現(xiàn)具有診斷意義的分枝菌絲或成行排列火車道似的孢子的結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的技術(shù)方案通過以下步驟建立(I)嗜皮菌PCR的特異性的確定此PCR的特異性從三個方面得到保證。i)由Intergrated DNA Technology合成嗜皮菌及相關(guān)細(xì)菌的16S rDNA的序列，此序列涵蓋PCR的擴(kuò)增區(qū)域。設(shè)計的PCR系統(tǒng)(含一個上游引物、二個下游引物、二個探針的混合物)對合成的嗜皮菌及相關(guān)細(xì)菌的16S rDNA序列和對照剛果嗜皮菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；ii)觀察各個擴(kuò)增對象在PCR過程中熒光強(qiáng)度(640nm)的變化，和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳的條帶的大小。熒光在640nm波長出現(xiàn)或增強(qiáng)，顯示陽性；嗜皮菌的16S rDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳顯示預(yù)期的145bp的條帶；iii)對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行測序，測序的結(jié)果和GenBank的序列進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，設(shè)計的嗜皮菌PCR特異的擴(kuò)增剛果和龜型嗜皮菌，而不擴(kuò)增其他類似的細(xì)菌。(2)嗜皮菌PCR的靈敏度的確定由Intergrated DNA Technology合成嗜皮菌及相關(guān)細(xì)菌的16S rDNA的序列。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量以及PicoGreen的DNA定量技術(shù)，計算合成物所含的16S rDNA的基因拷貝的絕對數(shù)目。隨后，對合成物進(jìn)行稀釋，制備每10 μ I合成物的稀釋試劑含10000拷貝、1000拷貝、100拷貝、10拷貝的16S rDNA。用上述的PCR系統(tǒng)擴(kuò)增含不同濃度16S rDNA嗜皮菌和相關(guān)細(xì)菌的合成物，依此確定本發(fā)明檢測嗜皮菌的靈敏度。結(jié)果顯示，此發(fā)明可以擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)10拷貝的嗜皮菌16S rDNA。(3)分型鑒別PCR完成后，對剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，觀察剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熔解溫度。由于設(shè)計的引物擴(kuò)增剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌，而設(shè)計的探針和剛果嗜皮菌的基因序列完全吻合、同龜型嗜皮菌有3個堿基的差異，這樣剛果嗜皮菌比龜型嗜皮菌有更高的熔解溫度，而方便的用于基因分型。高分辨率熔解曲線分析顯示，剛果嗜皮菌的熔解溫度是63°C，比龜型嗜皮菌的熔解溫度
55。。，高約 80C (圖 2)。用發(fā)明引物、探針及試劑盒檢測的過程如下1.制備 PCR 用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑(standard)。由 Intergrated DNA Technology 合成嗜皮菌及相關(guān)細(xì)菌的16S rDNA的序列，此序列涵蓋PCR的擴(kuò)增區(qū)域。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量以及PicoGreen的DNA定量技術(shù)，計算合成物所含的16S rDNA的基因拷貝數(shù)目。隨后，對合成物進(jìn)行稀釋，制備每10 μ I合成物的稀釋試劑含1000拷貝、100拷貝、10拷貝、I拷貝的16S rDNA,作為PCR用的標(biāo)準(zhǔn)定量試劑。2.制備待檢樣品的DNA模板。皮膚或者皮膚結(jié)痂樣品(Ig)轉(zhuǎn)入Eppendorf管，加入Iml TE緩沖液并經(jīng)過組織勻漿充分破碎后，取400 μ I用于DNA提取。純化的DNA洗脫在 100 μ I T10Eai (含 IOmM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, ρΗ8· 5)用于 PCR 模板。3. PCR擴(kuò)增體系。20 μ I的擴(kuò)增體系包含10 μ I的樣品DNA模板或者定量標(biāo)準(zhǔn)試劑(s tandar d )、I xPCR緩沖液、I μ M上游引物、0. 7 μ M下游引物-1和下游引物_2、0. 2 μ M的探針-1和探針_2、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP。4. PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)。PCR擴(kuò)增包括18個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)(high-stringency step-down)和25個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐还猥@得循環(huán)(relaxed-stringency fluorescence acquisition)。18 個溫度遞減的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)6xl5sec@95。C, 60seci74° C;9xl5seci95° C，60sec@72。C;3xl5seci95° C, 10seci70。C，15sec@72。C. 25個欠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒晒猥@得循環(huán)25xl5sec@95。C，8sec@58。C，10sec@65。C,andl5seci72° C。5.高分辨率熔解曲線分析。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，立即實(shí)施高分辨率熔解曲線分析，溫度從38° C上升到80° C，以每秒O. 2° C遞增。數(shù)據(jù)分析是分析640nm:530nm(F2/Fl)的熒光強(qiáng)度的比例。F2/F1的第一衍生值(_d(F2/Fl)/dt)被讀為該DNA的熔解溫度。6. PCR結(jié)果的判定和定量分析。DNA模板的制備過程均設(shè)有DNA提取的陰性和陽性對照，隨后的PCR擴(kuò)增對象包括待測樣品的DNA模板、DNA提取的陰性和陽性對照、定量的標(biāo)準(zhǔn)試劑(每10 μ Istandard含IO4，IO3, IO2, IO1拷貝的嗜皮菌16S rDNA)。本發(fā)明的PCR擴(kuò)增效率高，有效地擴(kuò)增含IO1拷貝的嗜皮菌16SrDNA的standard。實(shí)施例1 :剛果嗜皮菌標(biāo)準(zhǔn)株的鑒定實(shí)驗(yàn)室從患嗜皮菌病的羊的皮膚分離出剛果嗜皮菌。本研究復(fù)蘇該細(xì)菌，進(jìn)行培養(yǎng)和染色，細(xì)菌表現(xiàn)特征性的菌落(圖3)和染色(圖4)特性。純化的細(xì)菌，提取DNA，用本發(fā)明技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及高分辨率熔解曲線分析(具體技術(shù)細(xì)節(jié)如上所述)。結(jié)果顯示，PCR能特異高效的擴(kuò)增剛果嗜皮菌的DNA，且出現(xiàn)63° C的熔解溫度。實(shí)施例2 臨床分離株的PCR擴(kuò)增和分型鑒定從12頭患嗜皮菌病的牛，采集34份皮膚結(jié)痂；每個皮膚結(jié)痂的樣品分成二份，一份用于細(xì)菌培養(yǎng)和染色鑒定，另一份直接用于DNA提取和PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，培養(yǎng)和染色確定14皮膚結(jié)痂樣品為陽性(14/34，42%)，而PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)的陽性率為100%。高分辨率熔解曲線顯示，其中34個嗜皮菌株中，有一株為龜型嗜皮菌,其余均為剛果嗜皮菌?；驕y序證實(shí)高分辨率熔解曲線的結(jié)論。`
權(quán)利要求
1.一種剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熒光定量PCR檢測引物及探針，其特征在于檢測引物為上游引物5 ’ -TTAACACATGCAAGTCGAACGATGAA-3，；下游引物-1 :5’ -ATGCGAGGAAAGGTCATATT-3’ ；下游引物-2 5’ -ATGCGGAGAAAGGTCATAGG-3’ ；探針-1 :5’ -TCCCAAAGTGARGGGYAGATTACTCAC-6FAM-3’ ；探針-2 5 ‘-LCRed-640-TGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATC-phos-3，。
2.一種剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括5倍定量PCR反應(yīng)液22 μ I,以及22 μ I的5倍引物探針混合液；所述的引物探針混合液含濃度為5 μ M的上游引物、5 口1下游引物-1、5 μ M下游引物-2、I μ M的探針-1、I μ M的探針-2。
3.一種剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌分型鑒別方法，包括以下步驟(1)用權(quán)利要求1所述述引物和探針PCR擴(kuò)增待測菌，擴(kuò)增出145bp條帶，且熒光檢測在640nm波長增強(qiáng)的為陽性樣本；(2)PCR完成后，對步驟(I)陽性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)熔解溫度對埃里希氏菌進(jìn)行分型，剛果嗜皮菌的熔解溫度是一 63°C，比龜型嗜皮菌的熔解溫度一55 0C ο
全文摘要
本發(fā)明涉及嗜皮菌分子診斷的熒光定量PCR檢測引物、探針及試劑盒。所述引物序列如SEQ ID NO.1、2、3所示，所述探針為SEQ ID NO.4和5。將上述引物和探針與PCR反應(yīng)液組成熒光定量PCR檢測試劑盒。用本發(fā)明的引物和探針能對剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌進(jìn)行分型。本發(fā)明用于檢測嗜皮菌時，具有快速、更特異、更靈敏的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK103060469SQ201310035350
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者王成明, 許傳靈, 張繼壘, 危藍(lán)菁 申請人:揚(yáng)州大學(xué)