專利名稱：一種無物種限制無生物安全性問題的真核生物基因打靶方法及螺旋結構dna序列的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，更具體地說，涉及一種無物種限制無生物安全性問題的真核生物基因打靶方法及螺旋結構DNA序列。
背景技術：
基因打祀(gene targeting)技術是一種定向改變生物體遺傳信息的實驗方法。近年來隨著生物技術的發展，鋅指核酸酶(ZFN)技術和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)技術被應用于基因打靶中，這兩項技術大大提高了定向修飾的特異性。ZFN是由一個DNA識別域和一個非特異性核酸內切酶構成。DNA識別域是由一系列Cys2-His2鋅指蛋白(zinc-fingers)串聯組成(一般3 4個),每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的三聯體堿基。多個鋅指蛋白可以串聯起來形成一個鋅指蛋白組識別一段特異的堿基序列，與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內切酶是來自FokI的C端的96個氨基酸殘基組成的DNA剪切域。FokI是來自海床黃桿菌的一種限制性內切酶，只在二聚體狀態時才有酶切活性，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構成一個ZFN,識別特定的位點，當兩個識別位點相距恰當的距離時(6 8bp)，兩個單體ZFN相互作用產生酶切功能。從而達到DNA定點剪切的目的。剪切后產生DNA雙鏈斷裂，通過誘導細胞自身天然的DNA修復過程“同源定向修復”或“非同源末端連接”來引入外源DNA，從而修改細胞內源基因。鋅指核酸酶技術突破了基因打靶限制性的因素-打靶效率，將基因打靶的效率由原來的10-6 10-7提高至10-1 10-2。但是鋅指核酸酶在進行基因修飾過程中會產生脫革El現象(off-target),引起細胞劑量依賴性毒性。Gupta等通過不同的鋅指核酸酶對斑馬魚kdrl基因座進行祀向修飾研究,利用Illumina測序評估了斑馬魚中141處潛在的脫靶位點，發現只有少數的脫靶位點導致細胞累積損傷。為此尚需對鋅指核酸酶-基因打靶技術進行深入研究。
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TALEN技術是利用植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白一_即激活因子樣效應物(TAL effectors, TALEs)能夠識別特異性DNA堿基對的功能，設計一串合適的TALEs來識別和結合到任何特定序列，再在TALEs后附加一個非特異性核酸內切酶FokI，構建出TALEN，從而實現了在特定位點切斷DNA雙鏈，通過誘導細胞自身天然的DNA修復過程，在細胞基因組中引入新的遺傳物質。相對鋅指核酸酶技術而言，TALEN能夠靶向更長的基因序列，而且也更容易構建。但是到目前為止，無論是ZFN還是TALEN，對其識別序列都有很多要求，無法實現靶向每一種可能的DNA序列，而且不容易進行兩個或更多位點的同期打祀，并且組裝ZFN或TALEN蛋白也是一個耗時、耗力且花費很高的過程，人們一直都沒有一種低成本的而且公開能夠獲得的方法來快速地產生大量的ZFNs或TALENs
發明內容
1.發明要解決的技術問題針對現有技術中通過ZFNs或TALENs實現特異性基因組改造存在的局限性大、耗時耗力且成本高的問題，本發明提供了一種無物種限制無生物安全性問題的真核生物基因打靶方法及螺旋結構DNA序列，該方法步驟簡單、識別位點靈活且消耗低。2.技術方案發明原理:利用原核生物的規律成簇間隔短回文重復(CRISPR/Cas)系統的定向識別和剪切功能，本發明的方法通過增加這一系統在真核生物中的核定位，實現對真核生物中靶向DNA的特定位點的剪切，在剪切后的修復過程中會引入靶向DNA序列的突變，從而實現基因打靶的目的。本發明通過以下技術方案實現上述目的:一種無物種限制無生物安全性問題的真核生物基因打靶方法，其步驟為:
(I) CRISPR/Cas9和嵌合RNA的設計與構建I)優化編碼Cas9的密碼子2) Cas9核酸酶載體構建和Cas9核酸酶mRNA合成根據步驟I)優化后的序列，定制合成編碼Cas9核酸酶的DNA序列，并將其分別插入到如下表達載體中形成:pST1374-Cas9、pST1374-NLS-Flag-Cas9 ；利用Cas9C_NLS Cla For和Cas9C_NLS Apa Rev兩個引物，通過鏈式聚合酶反應(PCR)擴增一個DNA片段，使用ClaI和ApaI兩個限制性內切酶消化擴增的DNA片段和 pST1374-NLS-Flag-Cas9，將擴增的 DNA 片段插入到 pST1374-NLS_Flag-Cas9，構建pST1374-NLS-Flag-Cas9-NLS 載體；編碼三個細胞核定位信號NLS的序列是利用Cas9-N-3NLS For和Cas9_N_3NLSRev引物以寡核苷酸為模板PCR擴增出來的，PCR產物經NheI和NotI兩個限制性內切酶消化后，再由同樣的酶切位點插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9載體中，構建pST1374-3XNLS-Flag-Cas9 ；螺旋結構(Helix)DNA序列經定制合成后插入到編碼標簽蛋白Flag的序列和編碼Cas9核酸酶序列中間，形成pST1374-NLS-Flag-Helix_Cas9載體；Cas9系統來源于原核細胞，在真核細胞中難于向細胞核轉移，因而無法保證這一系統在真核細胞中實現其剪切功能。本發明通過在細胞核核定位信號序列和Cas9編碼序列間添加螺旋結構DNA序列增加Cas9在真核生物細胞核內的表達，解決了這一問題，見圖
2。在這個過程中使用了人類293T。Cas9核酸酶系列載體經AgeI線性化后，利用T7Ultra Kit體外轉錄后得到Cas9核酸酶mRNA，直接用于基因打靶；由于mRNA的不穩定性，不會長期存在生物體內，不會對環境產生進一步影響，因而沒有生物安全性問題。3)嵌合RNA的合成嵌合RNA模板上的T7啟動子序列,是以合成的寡核苷酸為模板通過PCR產生,利用T7Shortscript Kit體外轉錄出嵌合RNA,它包含crRNA以及tracrRNA結構，可以定向結合靶向DNA上的位點；(2) Cas9mRNA體內翻譯后形成Cas9核酸酶與嵌合RNA結合，實現定點剪切，剪切后產生DNA雙鏈斷裂，通過誘導細胞自身天然的DNA修復過程“非同源末端連接”來引入外源DNA，從而修改細胞內源基因。一種螺旋結構DNA序列，該螺旋結構DNA序列在核定位信號指導下增強蛋白的核轉移能力以及與核酸結合的能力，其基因序列為:ctggaacccggcgagaagccatacaaatgcccagagtgtggtaaatctttctctcagtctggtgctctgaccagacaccagcggacccacactaga。3.有益效果相比于現有技術，本發明的優點在于:(I)準確性更高。采用本發明的方法，只要RNA靶向序列和基因組序列之間存在任何堿基對的差異，Cas9都不會結合，因而無法實現對DNA的剪切；(2)基因組多位點打靶。采用本發明的方法，可以同時對靶基因上的多個位點實行剪切，實現基因組改造的目的；(3)使用更方便，費用更低。無論是ZFN還是TALEN都需要針對不同靶點改變核酸酶前面的識別序列，這些識別序列的合成或組裝耗時耗力且費用很高。本發明的方法中，CRISPR/Cas系統只需改變很短的RNA序列就可以實現不同位點的特異性識別。在動物基因工程模型的建立中，如果使用ZFN或TALEN技術，還要將ZFN或TALEN質粒轉錄為mRNA，這又增加了費用和實驗的難度，采用CRISPR/Cas系統只需轉錄一次Cas核酸酶就可完成多次實驗，極大地降低了成本；(4)無生物安全性問題。本發明采取mRNA和RNA做為基因打靶原材料，沒有任何篩選用抗性基因，因而不存在生物安全性問題；( 5)采用本發明的方法，無物種限制。
圖1為Cas9與嵌合RNA結合實現定點剪切導致DNA雙鏈斷裂過程示意圖；圖2為Cas9核酸酶各載體的共聚焦顯微鏡拍攝熒光照片。
具體實施例方式下面結合附圖和具體的實施例對本發明的技術方案做進一步介紹。實施例1本實施例的一種無物種限制無生物安全性問題的真核生物基因打靶方法，其步驟為:(I) CRISPR/Cas9和嵌合RNA的設計與構建I)優化編碼Cas9的密碼子Cas9屬于第二類CRISPR/Cas系統，來源于原核細胞，為了使其能更好地在真核細胞內表達，首先對Cas9編碼序列經過優化，在不改變氨基酸的前提下，使用真核細胞內編碼氨基酸的密碼子；2) Cas9核酸酶載體構建和Cas9核酸酶mRNA合成根據步驟I)優化后的序列，定制合成編碼Cas9核酸酶的DNA序列，并將其分別插入到如下表達載體中形成:pST1374-Cas9、pST1374-NLS_Flag-Cas9 (這個載體上除含有載體pST1374-Cas9所有序列外，還有一個編碼細胞核定位信號的序列NLS和一個編碼標簽蛋白Flag的序列)；利用Cas9C_NLS Cla For和Cas9C_NLS Apa Rev兩個引物(引物序列見表I )，通過鏈式聚合酶反應(PCR)擴增一個DNA片段，使用ClaI和ApaI兩個限制性內切酶消化擴增的DNA 片段和 pST1374-NLS-Flag-Cas9，將擴增的 DNA 片段插入到 pST1374-NLS-Flag-Cas9，構建pST1374-NLS-Flag-Cas9-NLS載體，該載體上除含有載體pST1374_Cas9所有序列外，還有前后兩個編碼細胞核定位信號的序列NLS和一個編碼標簽蛋白Flag的序列；編碼三個細胞核定位信號NLS的序列是利用Cas9-N_3NLS For和Cas9_N_3NLSRev引物(引物序列見表I)以寡核苷酸為模板(模板序列見表1)PCR擴增出來的，PCR產物經NheI和NotI兩個限制性內切酶消化后，再由同樣的酶切位點插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9 載體中，構建 pST1374-3XNLS_Flag-Cas9，該載體上除含有載體pST1374-Cas9所有序列外，還有三個編碼細胞核定位信號的序列NLS和一個編碼標簽蛋白Flag的序列；螺旋結構(Helix)DNA序列(見表2)經定制合成后插入到編碼標簽蛋白Flag的序列和編碼Cas9核酸酶序列中間，形成pST1374-NLS-Flag-Helix-Cas9載體，該載體上除含有載體pST1374-Cas9所有序列外,還有一個編碼細胞核定位信號的序列NLS, —個編碼標簽蛋白Flag的序列和一個螺旋結構DNA序列；Cas9系統來源于原核細胞，在真核細胞中難于向細胞核轉移，因而無法保證這一系統在真核細胞中實現其剪切功能。本發明通過在細胞核核定位信號序列和Cas9編碼序列間添加螺旋結構DNA序列增加Cas9在真核生物細胞核內的表達，解決了這一問題，見圖
2。在這個過程中使用了人類293T。本實施例還 構建了一系列含有Cas9的表達載體，將這些載體轉染到細胞內后通過免疫染色反應就可以展示Cas9在細胞內的定位情況。細胞轉染前，要將細胞培育在多聚賴氨酸包被的蓋片上，利用Lipofectamine2000轉染試劑將Cas9系列質粒DNA轉染入293T細胞中。在免疫染色實驗中，用4%的多聚甲醛在室溫下將細胞固定15分鐘，用緩沖液PBS洗兩次，再用PBS加0.2%的Triton X-100浸泡5分鐘，再用PBS洗兩次。之后用正常的山羊血清室溫下封閉I小時，再將抗標簽蛋白FLAG的抗體加入封閉液中，室溫孵育2小時。用PBS清洗后，再用溶解于PBS中的cy3結合的山羊抗小鼠的二抗和Hoechst室溫孵育細胞I小時，用PBS清洗后，將細胞用Vectashield培育液封閉，然后用Olympus FlueviewlOOO共聚焦顯微鏡拍攝熒光照片(見圖2)。只有在細胞核核定位信號序列和Cas9編碼序列間添加螺旋結構DNA序列才能使Cas9在真核生物細胞核內得以表達，進一步保障了其在基因打靶中行使剪切功能。Cas9核酸酶系列載體經AgeI線性化后，利用T7Ultra Kit體外轉錄后得到Cas9核酸酶mRNA，可直接用于基因打靶；由于mRNA的不穩定性，不會長期存在生物體內，不會對環境產生進一步影響，因而沒有生物安全性問題。3)嵌合RNA的合成嵌合RNA模板上有段T7啟動子序列，這是以合成的寡核苷酸為模板通過PCR產生的(模板序列見表1)，利用T7Shortscript Kit體外轉錄出嵌合RNA，它包含crRNA以及tracrRNA結構,可以定向結合祀向DNA上的位點；(2) Cas9mRNA體內翻譯后形成Cas9核酸酶與嵌合RNA結合，實現定點剪切，剪切后產生DNA雙鏈斷裂，通過誘導細胞自身天然的DNA修復過程“非同源末端連接”來引入外源DNA，從而修改細胞內源基因；見圖1。表I
權利要求
1.一種無物種限制無生物安全性問題的真核生物基因打靶方法，其步驟為: (1)CRISPR/Cas9和嵌合RNA的設計與構建 1)優化編碼Cas9的密碼子 2)Cas9核酸酶載體構建和Cas9核酸酶mRNA合成 根據步驟I)優化后的序列，定制合成編碼Cas9核酸酶的DNA序列，并將其分別插入到如下表達載體中形成:pST1374-Cas9、pST1374-NLS-Flag-Cas9 ； 利用Cas9 C-NLS Cla For和Cas9 C-NLS Apa Rev兩個引物，通過鏈式聚合酶反應擴增一個DNA片段，使用CI a I和Apa I兩個限制性內切酶消化擴增的DNA片段和 pST1374-NLS-Flag-Cas9，將擴增的 DNA 片段插入到 pST1374-NLS_Flag-Cas9，構建pST1374-NLS-Flag-Cas9-NLS 載體； 編碼三個細胞核定位信號NLS的序列是利用Cas9-N-3NLS For和Cas9_N_3NLSRev引物以寡核苷酸為模板PCR擴增出來的，PCR產物經NheI和NotI兩個限制性內切酶消化后，再由 同樣的酶切位點插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9載體中，構建pST1374-3XNLS-Flag-Cas9 ； 螺旋結構DNA序列經定制合成后插入到編碼標簽蛋白Flag的序列和編碼Cas9核酸酶序列中間，形成 pST1374-NLS-Flag-Helix_Cas9 載體； Cas9核酸酶系列載體經AgeI線性化后，利用T7 Ultra Kit體外轉錄后得到Cas9核酸酶mRNA，直接用于基因打靶； 3)嵌合RNA的合成 嵌合RNA模板上的T7啟動子序列，是以合成的寡核苷酸為模板通過鏈式聚合酶反應產生，利用T7 Shortscript Kit體外轉錄出嵌合RNA; (2)Cas9mRNA體內翻譯后形成Cas9核酸酶與嵌合RNA結合，實現定點剪切，剪切后產生DNA雙鏈斷裂，通過誘導細胞自身天然的DNA修復過程“非同源末端連接”來引入外源DNA，從而修改細胞內源基因。
2.一種螺旋結構DNA序列，其特征在于，該螺旋結構DNA序列在核定位信號指導下增強蛋白的核轉移能力以及與核酸結合的能力，其基因序列為:ctggaacccggcgagaagccatacaaatgcccagagtgtggtaaatctttctctcagtctggtgctctgaccagacaccagcggacccacactaga。
全文摘要
本發明公開了一種無物種限制無生物安全性問題的真核生物基因打靶方法及螺旋結構DNA序列，屬于基因工程領域。該方法的步驟為(1)CRISPR/Cas9和嵌合RNA的設計與構建；(2)Cas9mRNA體內翻譯后形成Cas9核酸酶與嵌合RNA結合，實現定點剪切，剪切后產生DNA雙鏈斷裂，通過誘導細胞自身天然的DNA修復過程“非同源末端連接”來引入外源DNA，從而修改細胞內源基因。該方法步驟簡單，識別位點靈活且消耗低。
文檔編號C12N15/11GK103233028SQ201310028668
公開日2013年8月7日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者沈彬, 黃行許 申請人:南京徇齊生物技術有限公司