一種用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體及其應(yīng)用的制作方法

一種用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藍(lán)細(xì)菌基因工程領(lǐng)域。具體而言，本公開涉及用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌突變株的載體，包括所述載體的啟動子和基因元件，以及構(gòu)建無篩選標(biāo)簽的藍(lán)細(xì)菌突變株的方法。
【專利說明】一種用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藍(lán)細(xì)菌基因工程領(lǐng)域，具體而言是一種用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]藍(lán)細(xì)菌廣泛分布于地球各種環(huán)境中，是一類能夠進(jìn)行植物型光合作用的原核生物。1996年，日本Kazusa研究所完成了藍(lán)細(xì)菌集胞藻PCC6803全基因組測序工作，這是第一個完成全基因組測序的光合生物；到目前為止，已經(jīng)有約40多種藍(lán)細(xì)菌基因組被測序完成。另外，由于藍(lán)細(xì)菌具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單、易于培養(yǎng)、生長相對迅速、遺傳操作簡單方便等優(yōu)勢，包括集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942和魚腥藻PCC7120在內(nèi)的一些藍(lán)細(xì)菌菌株，成為光合作用、晝夜節(jié)律和固氮機(jī)理等研究的重要模式生物。
[0003]近年來，在能源和環(huán)境危機(jī)的背景下，基于生物質(zhì)資源的通過生物或化學(xué)轉(zhuǎn)化制備生物燃料的研究再次成為研究熱點(diǎn)。而藍(lán)細(xì)菌由于具有高效的光合作用能力、清晰的遺傳背景、簡單方便的遺傳操作體系等優(yōu)勢，又被改造成為新一代光合能源微生物系統(tǒng)(Angermayr, S.A.，et al.(2009).“Energy biotechnology withcyanobacteria”，Curr 0pinBiotechnol20 (3): 257-263.)，用于合成各種生物燃料分子，如乙醇(Dexter, J.and Fu, P.(2009).“Metabolic engineering of cyanobacteria forethanol production”，Energy & EnvironmentalScience2(8):857-864.；Gao, Z., H.Zhao,et al.(2012)." Photosynthetic production of ethanol from carbondioxide ingenetically engineered cyanobacteria." Energy & EnvironmentalScience5 (12):9857-9865.)、正丁 醇(Lan，E.1.and J.C.Liao (2012)." ATP drivesdirect photosynthetic production of 1-butanol incyanobacteria." Proc NatlAcad Sci U S A109 (16): 6018-6023.)、異丁 醇(Atsumi, S.，et al.(2009).“Directphotosyntheticrecycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde，，，Nat.Biotechnol.27:1177-1180.)、脂肪醇(Tan, X.，L.Yao, et al.(2011)." Photosynthesisdriven conversion of carbon dioxide to fattyalcohols and hydrocarbonsin cyanobacteria.^Metab Engl3(2):169-176.)> 脂肪酸(Liu,Χ.，J.Sheng, etal.(2011)." Fatty acidproduction in genetically modified cyanobacteria." ProcNatl AcadSci U S A108(17):6899-6904.)和脂肪烴(Schirmer, A.，M.A.Rude, etal.(2010)." Microbial biosynthesis of alkanes." Science329 (5991): 559-562.)等。自2009年以來，相關(guān)研究證明了基因工程藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料的可能性和巨大應(yīng)用潛力，也引起了國際上學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的高度關(guān)注。不過，產(chǎn)品產(chǎn)率不高以及由此引起的生產(chǎn)成本過高，又成為限制了基因工程藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料路線產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的主要瓶頸問題。
[0004] 為了不斷提高藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料的產(chǎn)量，對藍(lán)細(xì)菌基因組系統(tǒng)地遺傳改造工作就顯得十分重要。傳統(tǒng)的藍(lán)細(xì)菌遺傳操作手段多通過同源重組的方式將篩選標(biāo)簽(多為抗性篩選標(biāo)簽)插入待改造基因位點(diǎn)中或置換其部分編碼序列。這種遺傳改造方式依賴于可用的抗性篩選標(biāo)簽數(shù)目，已經(jīng)不能滿足多基因位點(diǎn)(3個以上)乃至基因組范圍的遺傳改造工作。因此，開發(fā)一種能夠在藍(lán)細(xì)菌中切除篩選標(biāo)簽，構(gòu)建無篩選標(biāo)簽突變株的方法，對于藍(lán)細(xì)菌系統(tǒng)地遺傳改造工作，和基因工程藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)生物燃料研究具有重要的意義。 [0005]位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，如Flp/FRT或Cre/LoxP等，就是一種能夠?qū)崿F(xiàn)篩選標(biāo)簽基因組內(nèi)切除的有效工具，目前已經(jīng)在包括E.coli (Datsenko, K.A.andB.L.Wanner(2000)." One-step inactivationof chromosomal genes in Escherichiacoli K-12 using PCR products." Proceedings of the National Academy ofSciences 97(12):6640-6645.和植物(Li, B.，N.Li, et al.(2010)." Generation ofmarker-freetransgenic maize with improved salt tolerance using the FLP/FRTrecombination system." J Biotechnol 145 (2): 206-213.)等許多模式生物體系中成功應(yīng)用。以Flp/FRT重組系統(tǒng)在E.coli的應(yīng)用為例，它的基本原理是，首先，在第一輪轉(zhuǎn)化中通過抗生素篩選得到基因組的特定位置被帶有FRT側(cè)翼的抗性基因片段插入的突變株；然后，通過第二輪轉(zhuǎn)化將flp基因?qū)氲缴鲜鐾蛔冎?，并誘導(dǎo)其表達(dá)，而FLP則特異地切除并連接抗性基因片段兩側(cè)的FRT位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)抗性標(biāo)簽的切除；最終，通過熱激等條件誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)flp表達(dá)質(zhì)粒的丟失。而重復(fù)這一過程就能實(shí)現(xiàn)在多個基因位點(diǎn)的遺傳改造。其中Flp/FRT系統(tǒng)中的Flp酶，最適反應(yīng)溫度為30° C，這與大多數(shù)藍(lán)細(xì)菌最適生長溫度一致，適合用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽的基因工程藍(lán)細(xì)菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體及其應(yīng)用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為:
[0008]一種用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體，包含抗性基因片段和FLP基因元件；所述FLP基因元件包含F(xiàn)LP基因和用于驅(qū)動FLP基因的啟動子；所述FLP基因由誘導(dǎo)型啟動子控制。
[0009]所述驅(qū)動FLP基因啟動子為Ppew啟動子、Ptac啟動子、PpetE>Prbpl > PisiA或PnrsB。
[0010]所述FLP基因?yàn)獒劸平湍傅腇LP基因。所述用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體如序列表SEQ ID N0:5的堿基序列所示。所述抗性基因片段為Omega片段、氯霉素抗性基因片段或紅霉素抗性基因片段。
[0011]所述藍(lán)細(xì)菌為集胞藻(Synechocystissp.) PCC6803、聚球藻(Synechococcuselongatus sp.) PCC7942、聚球藻(Synechococcus sp.) PCC7002、魚渥藻(Anabaena sp.)PCC7120 或嗜熱聚球藻(Thermosynechococcus elongatus) BP-1。
[0012]用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體的應(yīng)用，利用所述載體誘導(dǎo)FLP基因表達(dá)獲得無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌突變株。
[0013]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
[0014]本發(fā)明利用來源于釀酒酵母的FLP/FRT重組系統(tǒng)構(gòu)建無篩選標(biāo)簽的藍(lán)細(xì)菌突變株。
[0015]本發(fā)明利用在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動子驅(qū)動FLP酶在帶有FRT側(cè)翼的抗性基因敲除的藍(lán)細(xì)菌突變株中表達(dá)，利用FLP特異性切除并連接FRT位點(diǎn)的特點(diǎn)，構(gòu)建無篩選標(biāo)簽的藍(lán)細(xì)菌突變株。獲得的切除抗性片段后的突變株，可以多次被遺傳改造，最終得到的還是無篩選標(biāo)簽的藍(lán)細(xì)菌突變株。本發(fā)明由FLP/FRT重組系統(tǒng)能夠很好的切除藍(lán)細(xì)菌突變株基因組中的抗性基因片段，可以實(shí)現(xiàn)對藍(lán)細(xì)菌多個基因位點(diǎn)乃至基因組規(guī)模的系統(tǒng)改造。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的質(zhì)粒pXT218a的基本結(jié)構(gòu)圖。其中元件包括Ptae啟動子、Ppetj啟動子、flp基因、Trafi終止子和Omega片段。
[0017]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的質(zhì)粒pXT218b的基本結(jié)構(gòu)圖。其中元件包括Ptae啟動子、Omega片段、Ppetj啟動子、flp基因和Trafi終止子。
[0018]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測FLP基因在藍(lán)細(xì)菌突變株轉(zhuǎn)錄效果圖。其中M，200bp DNA標(biāo)準(zhǔn)品；B，以無菌水作為模板；W，以野生型集胞藻PCC6803或野生型聚球藻PCC7942cDNA作為模板；+Cu，以普通BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)的6803-XT206 (pXT218b)細(xì)胞cDNA作為模板；_Cu，以缺銅BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)的6803-XT206 (pXT218b)細(xì)胞cDNA作為模板；_IPTG，以普通8611培養(yǎng)基培養(yǎng)的79424了212(?乂了218&)細(xì)胞cDNA為模板；+IPTG，以補(bǔ)加IPTG (終濃度ImM) BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)的7942-XT212 (pXT218a)細(xì)胞cDNA為模板。
[0019]圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的FLP表達(dá)后藍(lán)細(xì)菌突變株基因型檢測結(jié)果圖。其中A圖為集胞藻PCC6803野生型、phaAB基因突變株以及后續(xù)FLP表達(dá)后phaAB突變株基因型檢測結(jié)果；B圖為聚球藻PCC7942野生型、NSl基因突變株以及后續(xù)FLP表達(dá)后NSl突變株基因型檢測結(jié)果。A、B圖中，M為200bp DNA標(biāo)準(zhǔn)品；WT為以野生型集胞藻PCC6803或野生型聚球藻PCC7942基因組DNA作為模板；MT為以phaAB突變株或NSl突變株DNA作為模板；S為以誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)的6803-XT206 (pXT218b)或7942-XT212 (pXT218a)細(xì)胞DNA作為模板。
[0020]圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的FLP表達(dá)質(zhì)粒丟失后突變株基因型檢測結(jié)果圖。其中A，B圖為，以fIp-F和flp-R引物對PCR檢測各菌株中pXT218b和pXT218a質(zhì)粒的丟失情況；C圖為以pha-cl和pha_c2引物檢測各突變株phaAB位點(diǎn)基因型；D圖為，以7942-NSl-seq-l和7942-NSl_seq-2弓丨物對PCR檢測檢測各突變株NSl位點(diǎn)基因型。圖A、B、C和D圖中M為200bp DNA標(biāo)準(zhǔn)品；BC為以無菌水作為模板；W為以pXT218b或pXT218a質(zhì)粒作為模板；C為以未誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失的突變株(在補(bǔ)加壯觀霉素或鏈霉素的BGll培養(yǎng)基培養(yǎng))DNA為模板；1-4，以隨機(jī)選取的4個對壯觀霉素(或鏈霉素)和卡那霉素敏感的單克隆DNA作為模板。
[0021]其中，
[0022]SEQ ID NO:1:質(zhì)粒 pXT218a 序列。
[0023]SEQ ID NO:2:質(zhì)粒 pXT218b 序列。
[0024]SEQ ID NO: 3:切除抗性標(biāo)簽后的phaAB突變株phaAB位點(diǎn)附近的DNA序列。
[0025]SEQ ID NO: 4:切除抗性標(biāo)簽后的NS I突變株NS I位點(diǎn)附近的DNA序列。
[0026]SEQ ID NO:5:來源于釀酒酵母的Flipase酶基因序列。
【具體實(shí)施方式】
[0027]相關(guān)術(shù)語
[0028] 藍(lán)細(xì)菌(也稱為藍(lán)藻)是一類光合自養(yǎng)的原核微生物，其能夠利用太陽能，固定二氧化碳。
[0029]FLP酶(Flipase，F(xiàn)LP)是能夠特異性的剪切和連接FRT位點(diǎn)的酶。
[0030]FRT 位點(diǎn)(Flipase Recognition Target, FRT)是一段長度為 34bp 的特定 DNA 序列(GAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC)。
[0031]細(xì)胞色素c553(cytochrome c553,PetJ)是光合作用中將電子由細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體傳遞到光系統(tǒng)I的電子載體，在集胞藻PCC6803基因組其編碼基因?yàn)閜etj，slll796。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將它的啟動子(本發(fā)明的實(shí)施方案中表不為PprtJ)克隆用于驅(qū)動FLP基因在集胞藻PCC6803中的表達(dá)，(其具體序列如SEQ ID NO:5的堿基序列所示)
[0032]ta c啟動子(Pta。)是大腸桿菌色氨酸啟動子(Pfep)和乳糖啟動子(Pla。)的雜合啟動子。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，該啟動子被用于驅(qū)動FLP基因在聚球藻PCC7942中的表達(dá)，其具體序列為 TGACAATTAATC ATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAAITTC。
[0033]phaAB基因簇是集胞藻PCC6803基因組中編碼酮硫解酶(beta-ketothiolase)和乙酰乙酰輔酶還原酶(acetoacetyl-CoAreductase)的基因。本發(fā)明的實(shí)施方案就是通過同源重組將帶有FRT側(cè)翼序列的抗性基因片段置換該基因簇的編碼序列，從而構(gòu)建得到集胞藻PCC6803phaAB突變株。
[0034]NSl位點(diǎn)是聚球藻PCC7942基因組中的一個中性位點(diǎn)(neturalsite)。本發(fā)明的實(shí)施方案就是通過同源重組在該位點(diǎn)整合帶有FRT側(cè)翼序列的抗性基因片段，從而構(gòu)建得到聚球藻PCC7942NS1突變株。
[0035]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，載體(vector)是指能夠?qū)NA片段(目的基因)轉(zhuǎn)移到受者細(xì)胞中的一種自我復(fù)制的DNA分子。
[0036]“雜交”表示這樣一個過程:在該過程中，于合適的條件下，兩條核酸序列以穩(wěn)定且特異的氫鍵相互結(jié)合以致形成雙鏈。這些氫鍵在互補(bǔ)堿基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之間(則這稱為A-T鍵)或在互補(bǔ)堿基鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之間(則這稱為G-C鍵)形成。兩條核酸序列的雜交可以是全部的(則稱為互補(bǔ)序列)，即在該雜交過程中獲得的雙鏈僅包含A-T鍵和C-G鍵。這種雜交可以是部分的(則稱為足夠互補(bǔ)的序列)，即獲得的雙鏈包含允許形成雙鏈的A-T鍵和C-G鍵，但還包含未與互補(bǔ)堿基結(jié)合的堿基。兩條互補(bǔ)序列或足夠互補(bǔ)的序列之間的雜交取決于所使用的操作條件，并且特別是嚴(yán)緊性。嚴(yán)緊性特別是根據(jù)兩條核酸序列的堿基組成來定義，以及通過這兩條核酸序列之間的錯配程度來定義。嚴(yán)緊性還可以取決于反應(yīng)參數(shù)，例如存在于雜交溶液中的離子種類的濃度和類型，變性劑的性質(zhì)和濃度，和/或雜交溫度。所有這些數(shù)據(jù)是所熟知的，并且合適的條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。
[0037]如本領(lǐng)域已知的，核酸序列彼此雜交的條件可以被描述為從低到高嚴(yán)緊性的范圍。在此處提及低嚴(yán)緊雜交條件時，包括至少大約0%到至少大約15%v/v甲酰胺，以及用于雜交的至少大約IM到至少大約2M的鹽，和用于洗滌條件的至少大約IM到至少大約2M的鹽。一般地，低嚴(yán)緊雜交條件的溫度為大約25-30°C到大約42°C。在此處提及中等嚴(yán)緊雜交條件時，包括至少大約16%v/v到至少大約30%v/v的甲酰胺，以及用于雜交的至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽，和用于洗滌條件的至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽。在此處提及高嚴(yán)緊雜交條件時，包括至少大約31%v/v到至少大約50%v/v的甲酰胺，以及用于雜交的至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽，和用于洗滌條件的至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽。一般地，洗滌在下列條件下進(jìn)行:1?=69.3+0.41 (G+C)% (Marmur和Doty, J.Mol.Biol.5:109，1962)。但是，每增加1%的錯配堿基對數(shù)目，雙鏈體DNA的Tm 下降 I °C (Bonner 和 Laskey, Eur.J.Biochem.46.:83，1974)。在這些雜交條件中甲酰胺是可選的。因此，特別優(yōu)選的嚴(yán)緊雜交條件如下確定:低嚴(yán)緊雜交條件是6x SSC緩沖液，1.0%w/v SDS，在25-42°C下；中等嚴(yán)緊雜交條件是2x SSC緩沖液，1.0%w/v SDS，在20°C至65°C的溫度下；高嚴(yán)緊雜交條件是0.1x SSC緩沖液，0.l%w/v SDS，在至少65°C的溫度下。關(guān)于核酸的雜交的詳盡指導(dǎo)可見于Ti jssen, (1993)LaboratoryTechniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes,第 I部分，第 2 章(Elsevier, New York);和 Ausubel 等人，編輯(1995) Current Protocolsin MolecularBiology,第 2章(Greene Publishing and Wiley-1nterscience, NewYorkX還可參見 Sambrook 等人,(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual (第 2 版,ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
[0038]“同一性”或“同一性百分比”是指兩個氨基酸序列之間或兩個核酸序列之間的序列同一性。為確定兩個氨基酸序列或兩個核酸的同一性百分?jǐn)?shù)，以最佳比較目的對序列進(jìn)行比對。兩個序列之間的同一性百分比是由這些序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，同一性百分?jǐn)?shù)=相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)(例如，重疊位置)X100)。例如，“同一性百分比”通過下列方式來計算:在比較窗中比較兩個經(jīng)最佳比對的序列，測定在兩個序列中出現(xiàn)相同核苷酸堿基或相同氨基酸殘基的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)目(即，窗的大小)，并且將結(jié)果乘以100從而產(chǎn)生序列同一性百分比。用于比較的序列的最佳比對可以通過下述來進(jìn)行:例如，Smith和Waterman (Adv.App1.Math.2:482, 1970)的局部同源性算法；Needleman 和 Wunsch (J.Mol.Biol.48:443, 1970)的同源性比對算法；Pearson 和 Lipman (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444，1988)的相似性搜索方法；這些算法的計算機(jī)化實(shí)施(例如，WisconsinGeneticsSoftware Package, Genetics Computer Group, 575ScienceDr., Madison, ffis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P,BLAST N和TFASTA);或手工比對和目測檢查(參見，例如Ausubel等人，CurrentProtocoIs in Molecular Biology (1995 增刊))。
[0039]本發(fā)明的實(shí)施方案所涉及的同一性百分比包括至少大約60%，或至少大約65%，或至少大約70%，或至少大約75%，或至少大約80%，或至少大約85%，或至少大約90%，或更高，例如大約95%，或大約96%，或大約97%，或大約98%，或大約99%，例如至少大約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、
100% O
[0040]本發(fā)明用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌突變株的載體為質(zhì)粒pXT218a和質(zhì)粒pXT218b。所述載體可以包含在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動子，以及處于該啟動子控制之下的FLP酶基因。
[0041]所述載體還可以包含RSF1010復(fù)制子，用于使所述載體能夠在藍(lán)細(xì)菌中自主復(fù)制。所述在藍(lán)細(xì)菌中具 有活性的啟動子可以選自Pprtl啟動子和Pta。啟動子。另外，在本發(fā)明的實(shí)施方案中還可以使用 PpetE、Prbpl、PisiA 和 PnrsB0
[0042]所述FLP酶基因可以為選自下列的基因:來源于釀酒酵母的flp基因，另外，在本發(fā)明的實(shí)施方案中還可以使用與上述基因具有至少80%同一性，優(yōu)選地至少85%同一性，更優(yōu)選地至少90%同一性，更加優(yōu)選地至少95%同一性，最優(yōu)選地至少99%同一性，并且編碼具有FLP酶活性的蛋白質(zhì)的基因；或者與上面所列基因在嚴(yán)緊雜交條件，優(yōu)選高嚴(yán)緊雜交條件下雜交，并且編碼具有FLP酶活性的蛋白質(zhì)的基因。
[0043]所述藍(lán)細(xì)菌為集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7942。另外，在本發(fā)明的實(shí)施方案中還可以使用聚球藻(Synechococcus sp.)PCC7002、魚渥藻(Anabaena sp.)PCC7120 和嗜熱聚球藻(Thermosynechococcuselongatus) BP-1。
[0044]實(shí)施例1:
[0045]構(gòu)建用于在藍(lán)細(xì)菌表達(dá)FLP基因從而得到無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌突變株的載體pXT218a 或 pXT218b:
[0046]為了驗(yàn)證FLP/FRT系統(tǒng)用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌突變株的可行性，基于穿梭載體pRL59Hl構(gòu)建了載體pXT218b和pXT218a。在這兩個載體中，Ppew啟動子和Ptae啟動子分別被用于驅(qū)動FLP基因在兩種藍(lán)細(xì)菌(集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7942)的突變株中表達(dá)。
[0047]I)質(zhì)粒pXT218a的構(gòu)建
[0048]以 PpetJ-F (CATCGGGGGCTGTGTTGGC)和 PpetJ-R (GTGTTTTACATAATATACCAAATTGTGGCATATGTTCTCCTTTCAAGGATAAAGT)為引物對，以集胞藻PCC6803基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系如表1所示；反應(yīng)程序如表2所示);再以Flp-F(ACTTTATCCTTGAAAGGAGAACATATGCCACAATTTGGTATATTATGTAAAACAC)和 Flp-R (TTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGG)為引物對，以質(zhì)粒 pCP20 (Datsenko, K.A.and B.L.Wanner (2000)." One-step inactivationofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products." Proceedingsof the National Academy of Sciences97 (12): 6640-6645.)為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(反應(yīng)體系如表1所示；反應(yīng)程序如表2所示)；將上述兩步分別得到的PCR產(chǎn)物分別用回收試劑盒(Omega, Catalog N0.:D2500_01)收后,等摩爾比混合,不加任何引物,通過融合PCR串聯(lián)(融合PCR反應(yīng)體系中除了不添加任何引物和模板，其他如表1所示；反應(yīng)程序除了退火溫度由55°C改為50°C，循環(huán)次所由30次改為10次，其他如表2所示)；取融合PCR產(chǎn)物為模板，以 PpetJ-F (CATCGGGGGCTGTGTTGGC)和 Flp-R (TTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGG)為引物對，再次PCR (反應(yīng)體系如表1所示；反應(yīng)程序除了 72°C延伸時間改為2分鐘，其他如表2所示)，將得到的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體(Takara，Catalog N0.:D101A)中，從而得到質(zhì)粒PXT208。
[0049]表1.PCR反應(yīng)體系a
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體，其特征在于:包含抗性基因片段和FLP基因元件；所述FLP基因元件包含F(xiàn)LP基因和用于驅(qū)動FLP基因的啟動子；所述FLP基因由誘導(dǎo)型啟動子控制。
2.按權(quán)利要求1所述的用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體，其特征在于:所述驅(qū)動FLP基因啟動子為Ppetl啟動子、Pta。啟動子、PpetE> Prbpl、PisiA或PmsB。
3.按權(quán)利要求1所述的用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體，其特征在于:所述FLP基因?yàn)獒劸平湍傅腇LP基因。
4.按權(quán)利要求1所述的用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體，其特征在于:所述用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體如序列表SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2中堿基序列所示。
5.按權(quán)利要求1所述的用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體，其特征在于:所述抗性基因片段為Omega片段、氯霉素抗性基因片段或紅霉素抗性基因片段。
6.按權(quán)利要求1所述的用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體，其特征在于:所述藍(lán)細(xì)菌為集胞藻(Synechocystis sp.) PCC6803、聚球藻(Synechococcus elongatus sp.)PCC7942、聚球藻(Synechococcus sp.)PCC7002、魚腥藻(Anabaena sp.)PCC7120 或嗜熱聚球藻(Thermosynechococcus elongatus) BP-1。
7.—種權(quán)利要求1所述的用于構(gòu)建無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體的應(yīng)用，其特征在于:利用所述載體誘導(dǎo)FLP基因表達(dá)獲得無篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌突變株。
【文檔編號】C12R1/01GK103966249SQ201310028228
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月24日
【發(fā)明者】呂雪峰, 談曉明, 梁飛燕 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所