專利名稱：一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法
技術領域：
本發明利用大氣壓低溫等離子體發生裝置制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，屬于低溫等離子體技術應用領域。
背景技術：
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),又稱面包酵母或者出芽酵母。釀酒酵母是與人類關系最廣泛的一種酵母，在傳統上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，也是制作培養基中常用成分酵母提取物的主要原料，在現代分子和細胞生物學中用作真核模式生物，其作用相當于原核的模式生物大腸桿菌。酵母是單細胞微生物，卻有著真核細胞的基本結構和功能。酵母由細胞壁、細胞膜、細胞核和細胞質組成。其中蛋白質含量為40%-60%，其蛋白質水解產物包括人體必需的八種氨基酸。除蛋白質外，細胞中還含有豐富的酶系、礦物質、脂肪、糖類、多磷酸、多種B族維生素和維生素D，并且具有許多經濟價值很高的生理活性物質和生化試劑，如輔酶A、輔酶Q、細胞色素C、凝血質、麥角固醇、谷耽甘膚和核酸等。通過菌種選育，使酵母富含某種目的產物，大量培養細胞，再從酵母細胞出發，提取有重要經濟價值的生物產品，成為酵母利用的重要分支。活酵母細胞衍生物(Live Yeast Cell Derivative,即LYO))是酵母活細胞對有控制傷害反應的產物，這樣的傷害刺激細胞產生一些能夠增加細胞呼吸且促進修復作用的未知因子，LYCD。傳統的LYCD可以從經紫外照射培養后酵母細胞中提取。即將釀酒酵母置于286nm的紫外輻射之下，經可控制傷害培養，誘導酵母細胞產生。也可把亞致死劑量的過氧化氫加入到酵母細胞中，用同樣的提取過程制備LYCD。LYCD是一種十分復雜的低分子量物質，由氨基酸、單糖和雙糖以及酵母特有的痕量維生素和礦物質組成。而傳統方法難以實現LYCD的大量生產，并且其制備方法繁瑣、費時、費力、對人體有毒害作用。本發明采用了一種物理技術——大氣壓低溫等離子體具有易操作、加工速度快、處理效果好、環境污染小、節能等優點，可以很 好的解決傳統方法的弊端。大氣壓低溫等離子體是指在大氣壓(常壓)條件下產生的整體溫度較低的等離子體。大氣壓低溫等離子體成分復雜，它是氣體在強電場作用下電離而產生一種高度電離的氣體云，由電子、多種離子、原子、分子、活性自由基及臭氧03、紫外UV等組成。根據溫度和內部的熱力學平衡性，可以將等離子體分為高溫(熱力學平衡態)和低溫(熱力學非平衡態)等離子體。高溫等離子體是指離子與電子溫度相同，整體處于熱力學平衡狀態，體系溫度很高(5000——20000K)的等離子體。低溫等離子體是指離子溫度(300-500K)遠遠低于電子溫度(10000K)的等離子體，這時系統處于熱力學非平衡態，表觀溫度低，因此稱為低溫等離子體。目前，低壓低溫等離子體已經在工業領域有了很多成熟的應用，改變了一些行業的生產模式。近年來，大氣壓強條件下產生低溫等離子體技術的實現，使等離子體在殺菌、凝血、抑制腫瘤、治療皮膚病等生物醫學領域的研究取得不少成果。本發明利用大氣壓低溫等離子體發生裝置制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，屬于低溫等離子體技術應用領域。該法具有高效、方便增加酵母細胞內活性物質的優點。其制備產物可作為日用品添加劑，起抗紫外、抗氧化、抗老化、保鮮、殺菌、消炎等作用；并且本發明由于采取微生物發酵生產，不受環境和自然資源影響，易實現工業化、自動化；本發明工藝方法的生產成本低，工藝簡便、穩定、易調控、成功率高；本發明適合多種規模的企業投資。
發明內容
為了克服傳統利用紫外和過氧化氫誘導產生酵母活性提取物方法的不足，本發明提供了一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法。本發明利用低劑量的低溫等離子體處理酵母細胞懸液，再經破除細胞壁、破除細胞膜提取酵母的活性物質。所采用的低溫等離子體可高效誘導產生大量的高活性抗氧化、抗紫外物質，并且其操作工藝具有易操作、加工速度快、處理效果好、環境污染小、節能等優點。為實現上述目的本發明采用的技術方案如下:一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于，依次按以下步驟進行:1.1釀酒酵母菌株的選擇和培養所用的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為 Saccharomycescerevisiae4741MAT a野生型，及其超氧化物歧化酶I (SODl)和超氧化物歧化酶2 (S0D2)的過表達突變株p-Sodl，p-Sod2。具體培養方法如下:
1.1.1酵母培養基YAPD的配制YPAD (YEPD+adenine)的成分為:10g 酵母提取物(Yeast extract), 20g 蛋白腺(Peptone), 120mg腺嘌呤(Adenine)，20g瓊脂粉(固體培養基時使用)，加ddH20定容至1L。滅菌后加50ml已滅菌的40%葡萄糖。1.1.2斜面酵母細胞培養將保藏的酵母菌株接種于YPAD斜面培養基，于30°C恒溫、培養36-48小時，得到一級菌種；1.1.3酵母細胞懸液的制備將一級菌種接種至液體搖瓶培養基培養；液體搖瓶培養基:10g酵母提取物(Yeast extract), 20g 蛋白腺(Peptone), 120mg 腺嘌呤(Adenine), 50ml 已滅菌的 40%葡萄糖，蒸餾水定容至IL ;在大于IOOml三角瓶中加入30 50%三角瓶體積的液體培養基，每個三角瓶接種I 3支斜面菌種，接種后置于全溫振蕩培養箱，溫度30°C，轉速100 200rpm，過夜培養，即得到酵母細胞懸液；1.1.4酵母細胞懸液的活化將過夜培養的酵母細胞懸液以1: 100的比例接種于YPAD液體培養基中，在大于IOOml的三角瓶中培養1-2小時，溫度30。。，轉速200rpm，使其OD值在0.8-1.0，即得到活化的酵母細胞懸液。1.2低溫等離子體處理酵母細胞懸液將低溫等離子體的噴嘴沒入裝有5ml酵母細胞懸液的50ml的離心管的液面以下，通入工作氣體，然后打開放電裝置，放電處理1-5分鐘讓裝置產生的等離子體與水接觸，進而對溶液中的酵母細胞進行作用。1.3酵母細胞活性物質的提取將經過等離子體處理后的酵母細胞懸液離心收集，然后破除細胞壁，破除細胞膜，離心取上清即為酵母細胞的活性物質，置于-70°C保存。1.4酵母細胞提取物活性的檢測將經過等離子體處理過的酵母細胞的活性提取物，利用GSH和GSSG檢測試劑盒、過氧化氫酶檢測試劑盒、CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒(WST法)檢測酵母活性提取物中抗氧化物的活性。所述的一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于:步驟1.2中，所述的工作氣體選自氬氣、氦氣、空氣中的一種或氦氣/氬氣與氧氣兩種氣體以任意比例的混合氣體。所述的一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于:步驟1.2中，所述的等離子體為非平衡等離子體或低溫等離子體；所述放電形式選自輝光放電、電暈放電、介質阻擋放電、射頻放電、滑動電弧放電、射流放電中的一種。所述的一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于:步驟1.3中，所述的酵母細胞的破除細胞壁的方法選自堿破壁法、外加葡聚糖酶法、表面活性劑處理法、酸堿處理法、外加蛋白酶破壁法、鹽法破壁、高壓均漿法、超聲波法氣、微波加熱法擠壓式破壁法、凍融法、有機溶劑法中的一種。本發明采用低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，利用低劑量的低溫等離子體處理酵母細胞懸液，再經破除細胞壁、破除細胞膜提取酵母的活性物質。其中，物理變化包括:高能低溫等離子體中的紫外輻射誘導胞內產生大量的抗紫外活性物質；化學反應包括:等離子體的活性粒子在酵母細胞內形成了大量活性氧自由基，誘導其胞內產生大量的抗氧化活性物質。本發明由于采取微生物發酵生產，不受環境和自然資源影響，易實現工業化、自動化，工藝生產成本低、簡便、穩定、易調控、成功率高。并且本發明具有高效、方便以及不會引發活性物質變性的優點，可以達到提高抗氧化物酶活性的效果O
圖1為本發明經過低溫等離子體處理野生型釀酒酵母細胞后，其提取物中超氧化物歧化酶SOD與過氧化氫酶CAT的酶活。
具體實施例方式實現本發明方法的步驟如下:1.酵母細胞懸液的準備利用YPAD酵母培養基，培養獲得釀酒酵母4741野生型以及p-Sodl、p_Sod2胞內過表達重要抗氧化酶超氧化物歧化酶1、超氧化物歧化酶2的酵母細胞懸液。2.選擇低溫等離子體發生器的種類并設定工作參數
本發明使用的大氣壓低溫等離子體發生器為采用大氣壓輝光放電低溫等離子體發生器。根據需要大氣壓冷等離子體發生器也可以采用電暈放電、介質阻擋放電、射頻放電、滑動電弧放電、射流放電中的一種代替。需要產生大氣壓輝光放電低溫等離子體時，放電氣體可以采用氬氣、氦氣、空氣中的一種或氦氣/氬氣與氧氣兩種氣體以任何比例混合形成的混合氣的一種，氣流量為3-5slpm(標準升每分鐘)，外加電壓有效值為400-600V，電流為30mA。3.低溫等離子體處理酵母細胞懸液將低溫等離子體的噴嘴沒入裝有5ml酵母細胞懸液的50ml的離心管的液面以下，通入工作氣體，然后打開放電裝置，放電處理1-5分鐘讓裝置產生的等離子體與水接觸，進而對溶液中的酵母細胞進行作用。4.經過低溫等離子體處理后酵母細胞活性物質的提取將經過等離子體處理后的酵母細胞懸液離心收集，然后破除細胞壁，破除細胞膜，離心取上清即為酵母細胞的活性物質，置于-70°C保存。5.經過低溫等離子體處理后酵母細胞提取物的活性檢測根據活性物質的特性使用對應的方法測量經過等離子體處理后活性物質的濃度以及活性處理后待檢測酵母活性提取物需在4°C環境中保存。以下結合大氣壓輝光放電低溫等離子體發生器處理野生型釀酒酵母細胞4741的實驗過程詳細敘述本發明的具體實施方法。實施例1:
1.前一天晚上，挑取野生型釀酒酵母細胞4741MAT a的保存菌液0.分別于約10ml，YPAD培養基(glucose2%，含或不含G418100ug/ml)中過夜培養，使之后檢測的OD達到1.5左右。 2.按測得的OD值，用新鮮培養基稀釋菌液，稀釋比例為(菌液:新鮮培養基=
0.2: (0D-0.2))，再放入搖床中培養一個小時。此時菌液OD值將為1.0左右，為對數生長期。3.取50ml離心管，向每個離心管加入4ml水。I個小時后，OD為0.5左右時，每個菌株取3ml菌液，裝入5ml離心管中離心，lOOOrpm，5min。取出離心管，棄上清，用3ml水重懸菌體，混勻后分別加入3個50ml離心管中，形成Iml菌液-----5ml水的體系。4.取出菌液準備低溫等離子體作用。等離子體裝置工作參數:氣源為He+02 (2%volume)，氣體流速為2slm，工作電流和電壓分別為30mA和560V。將50ml離心管插到等離子體筆下方，筆頭沒入液面，開始計時。處理時間分別為Omin, lmin, 2min, 3min, 4min, 5min。5.lOOOrpm, 5min離心收集酵母細胞。利用坡壁酶Lyticase置于溫箱30°C孵育60min后,4000rpm, 5min收集破壁后的酵母細胞。6.將上述細胞用手指把細胞用力彈散。加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清即為經過低溫等離子體誘導的酵母活性提取物。7.對大氣壓低溫等離子體發生器處理后的酵母提取物的活性進行檢測，檢測方法如下:(I)酶量的測定(蛋白濃度的測定)BCA法，配制不同濃度梯度的標準蛋白溶液，然后繪制標準蛋白曲線。根據標準蛋白曲線求得酵母活性提取物的蛋白濃度。(2) GSH和GSSG含量的測定通過谷胱甘肽還原酶把GSSG還原成GSH，而GSH可以和生色底物DTNB反應產生黃色的TNB和GSSG。適當配制反應體系，前后兩個反應合并起來后，總谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相當于一個顏色產生的限速因素，總谷胱甘肽的量就決定了黃色的TNB形成量。從而通過測定A412就可以計算出總谷胱甘肽的量。用適當試劑先清除樣品中的GSH，然后利用上述反應原理就可以測定出GSSG的含量。用總谷胱甘肽(GSSG+GSH)的量扣除GSSG的含量，就可以計算出GSH的含量。利用標準物質求出標準曲線，然后求得酵母活性提取物中的GSH與GSSG的含量。(3)過氧化氫酶CAT活性檢測在過氧化氫相對比較充足的情況下，過氧化氫酶可以催化過氧化氫產生水和氧氣。殘余的過氧化氫在過氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物，產生紅色的產物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-pbenzoquinonemonoimine),最大吸收波長為520nm。用過氧化氫標準品，制作標準曲線，這樣就可以計算出樣品中的過氧化氫酶在單位時間單位體積內催化了多少量的過氧化氫轉變為水和氧氣，從而可以求得酵母活性提取物中過氧化氫酶的酶活力。(4) CuZn/Mn-SOD 活性 檢測W S T -1 2 - (4-1odophenyl) - 3 - (4-nitrophenyl) - 5 - (2，4-disulfophenyl)-2H_tetrazolium,monosodium salt。參考下圖，WST-1 可以和黃嘌呤氧化酶催化產生的超氧化物陰離子反應產生水溶性的甲臜染料(formazan dye)，該反應步驟可以被SOD所抑制。通過對WST-1產物的比色分析即可求得酵母活性提取物中SOD的酶活力。經等離子體處理后的酵母活性提取物中的抗氧化物成分超氧化物歧化酶SOD (圖1A)與過氧化氫酶CAT(圖1B)的酶活性隨著等離子體處理時間的增加顯著提高。說明本發明所采用的低溫等離子體技術可以高效誘導胞內抗氧化物質的產生。以上所述，僅是本發明實施例之一，并非對本發明作任何形式上的限制，凡是根據本發明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，均乃屬于本發明技術方案的范圍內。
權利要求
1.一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于，依次按以下步驟進行: 1.1釀酒酵母菌株的選擇和培養 所用的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為 Saccharomyces cerevisiae4741MATa野生型，及其超氧化物歧化酶I(SODl)和超氧化物歧化酶2(S0D2)的過表達突變株p-Sodl, p_Sod2。
具體培養方法如下: 1.1.1酵母培養基YAPD的配制 YPAD (YEPD+adenine)的成分為:10g 酵母提取物(Yeast extract), 20g 蛋白胨(Peptone)，120mg腺嘌呤(Adenine)，20g瓊脂粉(固體培養基時使用)，加ddH20定容至IL0滅菌后加50ml已滅菌的40%葡萄糖。
1.1.2斜面酵母 細胞培養 將保藏的酵母菌株接種于YPAD斜面培養基，于30°C恒溫、培養36-48小時，得到一級菌種； 1.1.3酵母細胞懸液的制備 將一級菌種接種至液體搖瓶培養基培養；液體搖瓶培養基:IOg酵母提取物(Yeastextract), 20g 蛋白胨(Peptone), 120mg 腺嘌呤(Adenine), 50ml 已滅菌的 40 %葡萄糖，蒸餾水定容至IL ;在大于IOOml三角瓶中加入30 50%三角瓶體積的液體培養基，每個三角瓶接種I 3支斜面菌種，接種后置于全溫振蕩培養箱，溫度30°C、轉速100 200rpm，過夜培養，即得到酵母細胞懸液； 1.1.4酵母細胞懸液的活化 將過夜培養的酵母細胞懸液以1: 100的比列接種于YPAD液體培養基中，在大于IOOml的三角瓶中培養1-2小時，溫度30。。、轉速200rpm，使其OD值在0.8-1.0,即得到活化的酵母細胞懸液。
1.2低溫等離子體處理酵母細胞懸液 將低溫等離子體的噴嘴沒入裝有5ml酵母細胞懸液的50ml的離心管的液面以下，通入工作氣體，然后打開放電裝置，放電處理1-5分鐘讓裝置產生的等離子體與水接觸，進而對溶液中的酵母細胞進行作用。
1.3酵母細胞活性物質的提取 將經過等離子體處理后的酵母細胞懸液離心收集，然后破除細胞壁，破除細胞膜，離心取上消即為酵母細胞的活性物質，置于_70°C保存。
1.4酵母細胞提取物活性的檢測 將經過等離子體處理過的酵母細胞的活性提取物，利用GSH和GSSG檢測試劑盒、過氧化氫酶檢測試劑盒、CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒(WST法)檢測酵母活性提取物中抗氧化物的活性。
2.根據權利要求1所述的一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于:步驟1.2中，所述的工作氣體選自氬氣、氦氣、空氣中的一種或氦氣/氬氣與氧氣兩種氣體以任意比例的混合氣體。
3.根據權利要求1所述的一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于:步驟1.2中，所述的等離子體為非平衡等離子體或低溫等離子體；所述放電形式選自輝光放電、電暈放電、介質阻擋放電、射頻放電、滑動電弧放電、射流放電中的一種。
4.根據權利要求1所述的一種基于低溫等離子體制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于:步驟1.3中，所述的酵母細胞的破除細胞壁的方法選自堿破壁法、外加葡聚糖酶法、表面活性劑處理法、酸堿處理法、外加蛋白酶破壁法、鹽法破壁、高壓均漿法、超聲波法氣、微波加熱法擠壓式破 壁法、凍融法、有機溶劑法中的一種。
全文摘要
本發明利用大氣壓低溫等離子體發生裝置制備抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，屬于低溫等離子體技術應用領域，其特征在于，依次含有以下步驟培養酵母細胞、選擇大氣壓低溫等離子體發生裝置的種類并設定工作參數，用大氣壓低溫等離子體處理所述酵母細胞懸液，提取經過等離子體處理的酵母細胞的活性物質。本發明具有高效、方便改變酵母細胞內酶活性的優點。可作為日用品添加劑，起抗紫外、抗氧化、抗老化、保鮮、殺菌、消炎等作用；本發明由于采取微生物發酵生產，不受環境和自然資源的影響，易實現工業化、自動化，工藝方法的生產成本低、簡便、穩定、易調控、成功率高；本發明適合多種規模的企業投資。
文檔編號C12N9/02GK103205401SQ201310021260
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月21日 優先權日2013年1月21日
發明者馬若男, 封紅青, 張玨, 方競 申請人:北京大學