專利名稱：小鼠裸卵體外成熟方法及小鼠裸卵體外成熟培養(yǎng)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小鼠裸卵體外成熟方法及小鼠裸卵體外成熟培養(yǎng)液。
背景技術(shù)：
卵母細(xì)胞又稱為卵子，是一個(gè)新的生命個(gè)體發(fā)生發(fā)育的前提和基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展，卵母細(xì)胞是新品種培育、轉(zhuǎn)基因育種和品種改良等方面的重要的材料。對于人類生殖健康而言，卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)是試管嬰兒誕生的基礎(chǔ)。因此，卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代生殖發(fā)育的核心技術(shù)。卵母細(xì)胞在體內(nèi)存在于卵巢上，出生后的動物卵巢上存在的卵母細(xì)胞停滯于生發(fā)泡(germinal vesicle, GV)期，不再增殖且數(shù)量有限，伴隨著年齡的增長，數(shù)量不斷減少，并最終枯竭。因此，卵母細(xì)胞不像雄性生殖細(xì)胞精子具有數(shù)量龐大和源源不斷發(fā)生的特點(diǎn)，卵母細(xì)胞的體內(nèi)發(fā)生發(fā)育特點(diǎn)也就決定了卵子的稀有珍貴。在正常生長發(fā)育的情況下，卵母細(xì)胞外周包裹有大量的卵丘細(xì)胞，自然排卵時(shí)，卵母細(xì)胞連同外圍的卵丘細(xì)胞一起排入輸卵管內(nèi)等待同精子結(jié)合。在進(jìn)行胚胎工程操作或輔助生殖技術(shù)應(yīng)用時(shí)，由于從卵巢上直接抽取的卵母細(xì)胞還未達(dá)到完全成熟狀態(tài)，其中一半以上的卵母細(xì)胞周圍未完全由卵丘細(xì)胞包裹，臨床應(yīng)用中把未完全被卵丘細(xì)胞包裹的卵母細(xì)胞稱為裸卵。目前，由于包裹卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞在體外進(jìn)行成熟培養(yǎng)時(shí)能夠獲得較高的發(fā)育質(zhì)量和成熟率，則裸卵不能被發(fā)育成熟，常被廢棄，因此造成了卵母細(xì)胞資源的浪費(fèi)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種小鼠裸卵體外成熟方法。本發(fā)明要解決的 另外一個(gè)技術(shù)問題是提供一種用于小鼠的裸卵體外成熟培養(yǎng)液。
對于小鼠裸卵體外成熟方法，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:包括以下步驟:
(1)小鼠裸卵的分離培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)動物為性成熟后小鼠，采用頸部脫臼處死小鼠，取出卵巢組織，清洗血跡，分離除去多余的脂肪組織，將卵巢放置在裸卵洗滌培養(yǎng)液中，體視顯微鏡下，用分離針輕輕劃破卵巢表面有腔卵泡，處于不同發(fā)育狀態(tài)的裸卵進(jìn)入到裸卵洗滌培養(yǎng)液中，收集裸卵洗滌后隨機(jī)分組，用裸卵體外成熟培養(yǎng)液進(jìn)行37°c培養(yǎng)；
(2)小鼠裸卵的成熟檢測
小鼠裸卵體外成熟培養(yǎng)24小時(shí)后，在顯微鏡下觀察記錄培養(yǎng)成熟裸卵排出第一極體情況，并且要求裸卵形態(tài)正常，裸卵胞質(zhì)顏色光澤均一；
成熟培養(yǎng)后小鼠裸卵用多聚甲醛固定液固定，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌，TrionX-1OO細(xì)胞膜通透，含牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液封閉，通過免疫細(xì)胞組織化學(xué)方法，用抗微管蛋白的單克隆抗體監(jiān)測成熟裸卵紡錘體的微管蛋白發(fā)育狀態(tài)，裸卵內(nèi)細(xì)胞核遺傳物質(zhì)DNA分裂分離形成第一極體的狀況，用細(xì)胞核遺傳物質(zhì)DNA特異性染料DAPI染色顯示；
(3)小鼠裸卵成熟后發(fā)育能力檢測
將成熟后的裸卵用裸卵體外成熟培養(yǎng)液洗滌后，用在含乙醇的裸卵體外成熟培養(yǎng)液中孵育，經(jīng)胚胎培養(yǎng)液KSOM洗滌后，轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)液KSOM微滴中進(jìn)行培養(yǎng)。作為優(yōu)選，裸卵洗滌培養(yǎng)液為a-MEM + 10% FBS。作為優(yōu)選，裸卵體外成熟培養(yǎng)液為α-ΜΕΜ + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/mlhCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml 丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin。對于小鼠裸卵體外成熟培養(yǎng)液，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:由以下組分組成:a -MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml 丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin。Forskolin又稱毛喉素，作為一種天然化合物和常用的腺苷酸環(huán)化酶激活劑，其具有使神經(jīng)細(xì)胞分化的功能，用于許多細(xì)胞分化過程，能刺激腺苷酸環(huán)化酶的活性并增加cAMP, cAMP是一個(gè)信號分子，是細(xì)胞發(fā)生過程中關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)因子。本發(fā)明的有益效果是:
為了充分挖掘卵母細(xì)胞資源，本發(fā)明通過在小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加同卵母細(xì)胞體外成熟相關(guān)的化學(xué)試劑，建立了小鼠裸卵體外高效成熟發(fā)育體系，該體系不僅能夠有效人工調(diào)控小鼠裸卵的體外成熟，而且成熟后的裸卵能夠具有正常卵母細(xì)胞形成胚胎的發(fā)育能力，從而為小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物模型在新品種培育、轉(zhuǎn)基因育種和品種改良等方面的重要的材料，也為人類輔助生殖技術(shù)的縱深發(fā)展提供基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式一、實(shí)驗(yàn)方法1、小鼠裸卵的分離培養(yǎng) 裸卵洗滌培養(yǎng)液:a -MEM + 10% FBS
裸卵體外成熟培養(yǎng)液:a -MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/mlGlu + 0.23 mM/ml 丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin
實(shí)驗(yàn)動物為性成熟后小鼠，為了能夠取得較多可用卵母細(xì)胞數(shù)量，對每只小鼠腹腔注射5IU孕馬血清促性腺激素以促進(jìn)卵巢上更多卵母細(xì)胞發(fā)育，激素注射48小時(shí)后，采用頸部脫臼處死小鼠，取出卵巢組織，清洗血跡，分離除去多余的脂肪組織，將卵巢放置在裸卵洗滌培養(yǎng)液中，體視顯微鏡下，用分離針輕輕劃破卵巢表面有腔卵泡，處于不同發(fā)育狀態(tài)的裸卵進(jìn)入到裸卵洗滌培養(yǎng)液中，收集裸卵洗滌后，隨機(jī)分組，裸卵于37°C在裸卵體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2、小鼠裸卵的成熟檢測
排出第一極體是卵母細(xì)胞成熟的最顯著的形態(tài)學(xué)特征，小鼠裸卵經(jīng)過體外成熟培養(yǎng)24小時(shí)后，在顯微鏡下觀察記錄培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞排出第一極體情況，且以卵母細(xì)胞形態(tài)正常，卵母細(xì)胞胞質(zhì)顏色光澤均一為基本標(biāo)準(zhǔn)。成熟培養(yǎng)后小鼠卵母細(xì)胞用多 聚甲醛固定液固定，經(jīng)磷酸緩沖鹽液洗滌，TrionX-1OO通透，含牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽液封閉，用抗微觀蛋白的單克隆抗體a-tubulin監(jiān)測成熟卵母細(xì)胞紡錘體的微管蛋白發(fā)育狀態(tài)，用紅色熒光羅丹明標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗Ct -tubulin抗體，同時(shí)，卵母細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核遺傳物質(zhì)DNA分裂分離形成第一極體的狀況，用細(xì)胞核遺傳物質(zhì)DNA特異性染料DAPI染色顯示。3、小鼠裸卵成熟后發(fā)育能力檢測
卵母細(xì)胞成熟后經(jīng)過孤雌激活能夠發(fā)育形成胚胎，因此，卵母細(xì)胞的孤雌激活是檢測卵母細(xì)胞成熟后發(fā)育能力的重要指標(biāo)。將成熟后的裸卵用培養(yǎng)液洗滌后，用在含7%的乙醇的卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育6分鐘，經(jīng)胚胎培養(yǎng)液KSOM洗滌后，轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)液KSOM微滴中于37 °C進(jìn)行培養(yǎng)。二、結(jié)果
裸卵在該體外成熟培養(yǎng)液中能夠克服外圍沒有卵丘細(xì)胞的成熟協(xié)助，在培養(yǎng)液其它組成成分不變的情況下，不含10 uM Forskolin的成熟培養(yǎng)液中裸卵體外培養(yǎng)成熟率為15.5%，采用添加10 uM Forskolin的成熟培養(yǎng)液能夠使裸卵的成熟率達(dá)到27.5%，具有顯著進(jìn)一步提高裸卵的體外成熟發(fā)育效率(P < 0.05)，在成熟培養(yǎng)液中發(fā)育成熟的裸卵，排出第一極體，細(xì)胞直徑達(dá)到成熟卵母細(xì)胞的大小，卵母細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)顏色光澤均一。通過免疫熒光檢測分析證實(shí)，裸卵在體外成熟過程中隨著細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟，裸卵逐漸發(fā)生生發(fā)泡破裂，減數(shù)分裂啟動和發(fā)生，裸卵細(xì)胞核中紡錘體微絲、微管組裝形成，染色體排列在紡錘體中央，并由兩端的微絲牽引移動。隨著微絲的牽引，染色體被分裂到兩端，裸卵發(fā)生非對稱分裂，并將一半染色體遺傳物質(zhì)以第一極體的形式排出。裸卵體外成熟培養(yǎng)過程中染色體遺傳物質(zhì)的遷移排列，紡錘體的微絲、微管形成過程與體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟的發(fā)生過程一致。通過使用含7%乙醇的卵母細(xì)胞激活液，來源于裸卵體外成熟發(fā)育的卵母細(xì)胞能夠正常激活、分裂和發(fā)育。孤雌激活的卵母細(xì)胞分裂后形成胚胎，胚胎組成中的卵裂球分裂均等，胞質(zhì)均勻，形態(tài)、色澤均一正常。以上所述 的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.小鼠裸卵體外成熟方法，包括以下步驟: (1)小鼠裸卵的分離培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動物為性成熟后小鼠，采用頸部脫臼處死小鼠，取出卵巢組織，清洗血跡，分離除去多余的脂肪組織，將卵巢放置在裸卵洗滌培養(yǎng)液中，體視顯微鏡下，用分離針輕輕劃破卵巢表面有腔卵泡，處于不同發(fā)育狀態(tài)的裸卵進(jìn)入到裸卵洗滌培養(yǎng)液中，收集裸卵洗滌后隨機(jī)分組，用裸卵體外成熟培養(yǎng)液進(jìn)行37°c培養(yǎng)； (2)小鼠裸卵的成熟檢測 小鼠裸卵體外成熟培養(yǎng)24小時(shí)后，在顯微鏡下觀察記錄培養(yǎng)成熟裸卵排出第一極體情況，并且要求裸卵形態(tài)正常，裸卵胞質(zhì)顏色光澤均一； 成熟培養(yǎng)后小鼠裸卵用多聚甲醛固定液固定，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌，TrionX-1OO細(xì)胞膜通透，含牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液封閉，通過免疫細(xì)胞組織化學(xué)方法，用抗微管蛋白的單克隆抗體監(jiān)測成 熟裸卵紡錘體的微管蛋白發(fā)育狀態(tài)，裸卵內(nèi)細(xì)胞核遺傳物質(zhì)DNA分裂分離形成第一極體的狀況，用細(xì)胞核遺傳物質(zhì)DNA特異性染料DAPI染色顯示； (3)小鼠裸卵成熟后發(fā)育能力檢測 將成熟后的裸卵用裸卵體外成熟培養(yǎng)液洗滌后，用在含乙醇的裸卵體外成熟培養(yǎng)液中孵育，經(jīng)胚胎培養(yǎng)液KSOM洗滌后，轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)液KSOM微滴中進(jìn)行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠裸卵體外成熟方法，其特征在于，所述裸卵洗滌培養(yǎng)液為 a -MEM + 10% FBS。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠裸卵體外成熟方法，其特征在于，所述裸卵體外成熟培養(yǎng)液為 a -MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin。
4.一種小鼠裸卵體外成熟培養(yǎng)液，其特征在于，由以下組分組成:a-MEM + 10% FBS +10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml 丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin。
全文摘要
本發(fā)明公開了小鼠裸卵體外成熟方法及小鼠裸卵體外成熟培養(yǎng)液。其中，小鼠裸卵體外成熟方法的步驟包括(1)小鼠裸卵的分離培養(yǎng)；(2)小鼠裸卵的成熟檢測；(3)小鼠裸卵成熟后發(fā)育能力檢測。小鼠裸卵體外成熟培養(yǎng)液由α-MEM+10%FBS+10ng/mlEGF+1.5U/mlhCG+1mM/mlGlu+0.23mM/ml丙酮酸鈉+10uMForskolin組成。本發(fā)明通過在小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加同卵母細(xì)胞體外成熟相關(guān)的化學(xué)試劑，建立了小鼠裸卵體外高效成熟發(fā)育體系，該體系不僅能夠有效人工調(diào)控小鼠裸卵的體外成熟，而且成熟后的裸卵能夠具有正常卵母細(xì)胞形成胚胎的發(fā)育能力，從而為小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物模型在新品種培育、轉(zhuǎn)基因育種和品種改良等方面的重要的材料，也為人類輔助生殖技術(shù)的縱深發(fā)展提供基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/075GK103074296SQ20131002066
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月21日
發(fā)明者楊盼, 曹鴻國, 章孝榮, 張飛, 張運(yùn)海, 劉亞, 李運(yùn)生, 陶勇, 方富貴 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)