專利名稱：一種具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制備工藝方法。
背景技術(shù)：
近年來，糖尿病已經(jīng)成為一種嚴重影響人類健康的常見病、多發(fā)病。在我國，隨著人口的老齡化趨勢，糖尿病發(fā)病率近10年逐年上升，平均每年增加100多萬，其中II型糖尿病占到90%以上。在II型糖尿病的防治過程中，糖耐量異常(Impaired GlucoseTolerance, IGT)是糖尿病發(fā)生的一個重要階段，是人體處于糖代謝紊亂的代償性階段，同時IGT階段屬于可逆階段，如果在這一階段實施有效的干預(yù)治療，可使糖耐量異常者發(fā)展為糖尿病機率極大的降低，有效的預(yù)防糖尿病的發(fā)生。目前，臨床對IGT階段的干預(yù)藥物應(yīng)用尚處于實驗階段，國內(nèi)外臨床報道用于此階段的藥物主要有雙胍類(如二甲雙胍)和α -葡萄糖苷酶抑制劑類(如阿卡波糖)等藥物，但是這些藥物在毒副作用以及治療成本等方面還存在一定的不足，所以研發(fā)適用于IGT階段人群的安全、高效的干預(yù)治療藥物是防治糖尿病研究的一個重要研究方向。茶作為最早起源于中華民族的傳統(tǒng)保健飲料已經(jīng)有四五千年的歷史，其主成分是以兒茶素為主的多酚類化合物，其中含量最高的為(-)-epigaIlocatechin-3-O-gallate (EGCg)。多項調(diào)查研究結(jié)果表明，茶葉中所含有的多酚類化合物的攝入量與高血糖的發(fā)生與發(fā)展呈負相關(guān)。特別是經(jīng)過發(fā)酵處理的紅茶、烏龍茶所含有的兒茶素氧化物類化合物，對與IGT階段干預(yù)治療密切相關(guān)的α -葡萄糖苷酶抑制方面有著很好的生物活性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以含98%茶多酚為原料，安全高效的制備α -葡萄糖苷酶抑制劑的制備工藝。為了達到上述目的，本發(fā)明有如下技術(shù)方案:本發(fā)明為一種具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制備工藝，使用綠茶葉片提取物98%茶多酚，在食品級漆酶的氧化催化作用下對其進行氧化，得到茶多酚氧化聚合物。茶多酚氧化聚合物具體包括以下步驟:①茶多酚溶液制備:將98%茶多酚與蒸餾水按lmg/0.5ml混合，加熱到60°C，攪拌均勻，使其呈現(xiàn)透明澄清液體狀態(tài)；②漆酶溶液制備:將5000U/g食 品級漆酶與蒸餾水按lmg/0.5ml比例混合，加熱到500C 一 60°C之間，攪拌均勻，濾去沉淀物；③茶多酚氧化物制備:將步驟①制得的茶多酚溶液與步驟②制得的漆酶溶液按體積比1:5比例混勻，調(diào)節(jié)pH5.5，保持加熱500C 一 60°C之間，同時通入空氣或氧氣，保持反應(yīng)進行3個小時；④茶多酚氧化聚合聚合物精制:將步驟③所得的液體逐漸加入醫(yī)藥級DlOl大孔吸附樹脂層析柱中，以蒸餾水洗脫3倍體積，再用99%乙醇洗脫至氧化聚合物完全流出，減壓濃縮蒸餾，冷凍干燥，即得茶多酚氧化聚合物干燥粉末。由于采取了以上技術(shù)方案，本發(fā)明的優(yōu)點在于:1、本發(fā)明使用的98%茶多酚主要化學(xué)成分是兒茶素類化合物，是日常飲用茶葉的主要化學(xué)成分，這類化合物具有高度的生物安全性，未見任何毒性及副作用報道，同時具有抗氧化等多種生物學(xué)功能。發(fā)明人將其作為原料應(yīng)用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的研發(fā)原料具有高度的安全性和可靠性。2、本發(fā)明涉及的漆酶是一類含銅的氧化還原酶，它們廣泛地存在于自然界中，如植物以及真菌中都有存在。它是一種來源廣泛的多酚氧化酶，適合催化氧化具有酚羥基的多酚類化合物，J L茶素正是一類這樣的化合物。3、利用漆酶進行催化的反應(yīng)是利用分子氧，產(chǎn)生的副產(chǎn)物只有水，不產(chǎn)生其他任何具有毒副作用的化學(xué)產(chǎn)物。本發(fā)明所使用的漆酶來源于真菌，經(jīng)過制備達到食品應(yīng)用級另IJ。同時在處理得到的兒茶素氧化聚合物時使用的分離大孔樹脂為醫(yī)藥級，洗脫溶劑為蒸餾水和99%乙醇，符合食品及醫(yī)藥原料制備標準。4、本發(fā)明將高純度的98%茶多酚與食品級漆酶在溫和條件下進行催化反應(yīng)，生成的兒茶素氧化聚合物經(jīng)過實驗驗證具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1: 該工藝使用的原料如下:含98%茶多酚茶葉提取物；食品級漆酶(5000U/g)，食品級漆酶即漆酶達到食用級的安全級別；蒸餾水。反應(yīng)體系包括:茶多酚lg、漆酶5g、蒸餾水1000mL。I)將相應(yīng)重量份的98%茶多酚加入帶有攪拌子燒杯中，在恒溫磁力攪拌器上均勻攪拌，并控制溫度在60°C，攪拌至其呈現(xiàn)澄清透明液體狀態(tài)；2)在燒杯中加入相應(yīng)重量份的漆酶，同時在燒杯中通入氧氣,在恒溫磁力攪拌器上均勻攪拌，使漆酶均勻分布于燒杯液體中，攪拌約10分鐘至其呈現(xiàn)半透明液體狀態(tài)，調(diào)節(jié) ρΗ5.5 ；3)維持反應(yīng)溫度50°C，反應(yīng)3小時，通過TLC或HPLC確認兒茶素完全被氧化，及茶多酚氧化聚合物產(chǎn)生；4)將反應(yīng)所得的液體冷卻并過濾后，逐漸加入裝有DlOl大孔吸附樹脂的層析柱中，用蒸餾水進行洗脫，至無渾濁液體流出，然后加入99%乙醇進行洗脫，收集洗脫液進行減壓濃縮蒸餾；5)將濃縮液進行冷凍干燥處理，得到干燥的茶多酚氧化聚合物粉末備用。實施例2:該工藝使用的原料如下:
含98%茶多酚茶葉提取物；食品級漆酶(5000U/g)，食品級漆酶即漆酶達到食用級的安全級別；蒸餾水。反應(yīng)體系包括:茶多酹lg、漆酶5g、蒸懼水1000mL。1)將相應(yīng)重量份的98%茶多酚加入帶有攪拌子燒杯中，在恒溫磁力攪拌器上均勻攪拌，并控制溫度在60°C，攪拌至其呈現(xiàn)澄清透明液體狀態(tài)；2)在燒杯中加入相應(yīng)重量份的漆酶，同時在燒杯中通入氧氣，在恒溫磁力攪拌器上均勻攪拌，使漆酶均勻分布于燒杯液體中，攪拌約10分鐘至其呈現(xiàn)半透明液體狀態(tài)；3)維持反應(yīng)溫度55°C，反應(yīng)3小時，通過TLC或HPLC確認兒茶素完全被氧化，及茶多酚氧化聚合物產(chǎn)生；4)將反應(yīng)所得的液體冷卻并過濾后，逐漸加入裝有DlOl大孔吸附樹脂的層析柱中，用蒸餾水進行洗脫，至無渾濁液體流出，然后加入99%乙醇進行洗脫，收集洗脫液進行減壓濃縮蒸餾；5)將濃縮液進行冷凍干燥處理，得到干燥的茶多酚氧化聚合物粉末備用。實施例3:該工藝使用的原料如下:含98%茶多酚茶葉提取物；食品級漆酶(5000U/g)，食品級漆酶即漆酶達到食用級的安全級別；蒸餾水。反應(yīng)體系包括:茶多酚lg、漆酶5g、蒸餾水1000mL。1)將相應(yīng)重量份的98%茶多酚加入帶有攪拌子燒杯中，在恒溫磁力攪拌器上均勻攪拌，并控制溫度在60°C，攪拌至其呈現(xiàn)澄清透明液體狀態(tài)；2)在燒杯中加入相應(yīng)重量份的漆酶，同時在燒杯中通入氧氣，在恒溫磁力攪拌器上均勻攪拌，使漆酶均勻分布于燒杯液體中，攪拌約10分鐘至其呈現(xiàn)半透明液體狀態(tài)；3)維持反應(yīng)溫度60°C，反應(yīng)3小時，通過TLC或HPLC確認兒茶素完全被氧化，及茶多酚氧化聚合物產(chǎn)生；4)將反應(yīng)所得的液體冷卻并過濾后，逐漸加入裝有DlOl大孔吸附樹脂的層析柱中，用蒸餾水進行洗脫，至無渾濁液體流出，然后加入99%乙醇進行洗脫，收集洗脫液進行減壓濃縮蒸餾；5)將濃縮液進行冷凍干燥處理，得到干燥的茶多酚氧化聚合物粉末備用。實驗例:將以上獲得的茶多酚氧化聚合物組分精密稱量8mg/ml，并分別稀釋至4mg/ml>2mg/ml>lmg/ml>0.5mg/ml,以拜耳公司生產(chǎn)的α _葡萄糖苷酶抑制劑藥物阿卡波糖作為對照品，分別配置同等濃度溶液，使用糖尿病模型db/db小鼠腸道獲得的α -葡萄糖苷酶進行體外酶活性抑制研究，實驗步驟如下:①將NaOH配制成濃度為67mmol/L的溶液，然后加入磷酸二氫鉀調(diào)pH值至6.8的緩沖液；②加入抑制劑200 μ I，陰性對照組和空白對照組補加相同體積的緩沖液；③加入80 μ I濃度為0.25U/ml的酶液，及100 μ I濃度為lmg/ml的還原型谷胱苷肽?？瞻讓φ战M不加酶液，補加80 μ I緩沖液。④混勻后將反應(yīng)體系在37°C水浴恒溫振蕩器中保溫反應(yīng)15min。⑤向反應(yīng)后的體系中加入2ml，I μ mo I/ml的底物PNPG。
⑥將其混勻后在37°C下保溫反應(yīng)30min。⑦向反應(yīng)后體系加入3ml，0.5mol/L終止液終止反應(yīng)。⑧利用紫外可見分光光度計在400nm處測其光吸收值。計算各組分對α -葡萄糖苷酶抑制率，進行比較。其抑制活性結(jié)果如下:1、反應(yīng)溫度為50 C結(jié)果:
權(quán)利要求
1.一種具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制備工藝，其特征在于:使用綠茶葉片提取物98%茶多酚，在食品級漆酶的氧化催化作用下對其進行氧化，得到茶多酚氧化聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制備工藝，其特征在于包括以下步驟: ①茶多酚溶液制備:將98%茶多酚與蒸餾水按lmg/0.5ml混合，加熱到60°C，攪拌均勻，使其呈現(xiàn)透明澄清液體狀態(tài)； ②漆酶溶液制備:將5000U/g食品級漆酶與蒸餾水lmg/0.5ml比例混合，加熱到500C 一 60°C之間，攪拌均勻，濾去沉淀物； ③茶多酚氧化聚合物制備:將步驟①制得的茶多酚溶液與步驟②制得的漆酶溶液按體積比1:5混勻，調(diào)節(jié)pH5.5，保持加熱50°C — 60°C之間，同時通入空氣或氧氣，保持反應(yīng)進行3個小時； ④茶多酚氧化聚合物精制:將步驟③所得的液體逐漸加入醫(yī)藥級DlOl大孔吸附樹脂層析柱中，以蒸餾水洗脫3倍體積，再用99%乙醇洗脫至氧化聚合物完全流出，減壓濃縮蒸餾，冷凍干燥 ，即得茶多酚氧化聚合物干燥粉末。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制備工藝，將98%茶多酚與食品級漆酶按一定比例分別溶于蒸餾水中，待其充分溶解后調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為5.5，加熱至60℃進行攪拌，同時通入空氣或氧氣，經(jīng)過3小時催化氧化反應(yīng)得到茶多酚的氧化聚合物，將獲得的反應(yīng)溶液進行減壓濃縮，濃縮液使用大孔樹脂進行柱層析分離，收集乙醇洗脫部分，獲得具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物。采用本方法得到的茶多酚氧化聚合物具有明顯的α-葡萄糖苷酶抑制作用，反應(yīng)及制備過程中未使用任何有毒試劑、溶劑。原料及制備工藝具有高度的安全性，使用設(shè)備要求簡單，為控制餐后高血糖提供了很好的化合物來源。
文檔編號C12P17/06GK103103227SQ20131002061
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者李巖, 么煥開, 李勇, 張騰, 崔文 申請人:徐州醫(yī)學(xué)院