一種耐熱α-葡萄糖苷酶的制備與固定化的方法
【專利摘要】本發明公開了一種耐熱α-葡萄糖苷酶的制備與固定化的方法，以嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)為菌種，對產α-葡萄糖苷酶的培養條件進行優化，確定實驗最佳條件，在此基礎之上，進行多批次的5L小型發酵實驗和20L放大發酵實驗，對收集的產物，采用離心、高壓破壁法，得到α-葡萄糖苷酶粗酶。最后，以磁性殼聚糖微球為載體，采用吸附-交聯法固定α-葡萄糖苷酶。本發明所得的α-葡萄糖苷酶是工業上生產低聚異麥芽糖的關鍵酶，作為主要酶制劑用于淀粉加工工業中的糖苷的轉移提供了一種方法。
【專利說明】一種耐熱Cl-葡萄糖苷酶的制備與固定化的方法【技術領域】
[0001]本發明涉及一種耐熱α -葡萄糖苷酶的制備與固定化的方法。
[0002]
【背景技術】
[0003]α-葡萄糖苷酶(α-gluCOSidaSe，EC.3.2.l.20)，系統命名為a-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，又名α-葡萄糖基轉移酶或麥芽糖酶，簡稱α-糖苷酶。它在糖的催化反應方面具有水解和轉糖苷雙重作用，可從α -葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非還原性末端切開α -1, 4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或將游離出的葡萄糖殘基以α -1, 6糖苷鍵轉移到另一個糖類底物上，從而得到非發酵性的異麥芽低聚糖(簡稱頂O)、糖脂或糖肽等。
[0004]不同來源的α-葡萄糖苷酶相對分子質量差異很大，一般在40000-150000之間。Pl在3.0-5.0之間，多數具有較高的熱穩定性和最適溫度，屬于鍵專一性酶，可專一性地切開糖類底物分子中的α-1，4糖苷鍵，個別種類的也可以作用于蔗糖的α-1，2糖苷鍵。目前，α-葡萄糖苷酶已廣泛應用于基礎和開發研究領域，主要包括生產低聚異麥芽糖、淀粉水解、酒精發酵、催化化學合成、代謝機理研究、食品成分分析、臨床檢測和醫學診斷等方面。
[0005]自20世紀80年代日本從黑曲霉中篩選出α-葡萄糖苷酶生產菌種，并得以工業化生產酶制劑以來，α-葡萄糖苷酶在基礎研究和工業生產上發揮著越來越重要的作用。目前，國外生產的α-葡 萄糖苷酶大部分為純酶，酶活較高；而國內主要以粗酶液為主，酶活較低。而且，國內尚未有商品化α-葡萄糖苷酶酶制劑出售，用于生產的酶均來自國外少數幾個酶制劑廠，進口價格昂貴。微生物發酵是α-葡萄糖苷酶產業化的基礎，研究其生化性質、轉糖苷反應條件、優化發酵工藝和固定化等方面，不僅可彌補工業生產中該酶依賴進口所帶來的不便，還可填補國內研究領域空白，具有重要的理論和應用價值。
[0006]在實際生產中，由于游離酶價格昂貴，難以回收利用，穩定性和可控性欠佳，難以在工業中得到廣泛的應用。而酶固定化技術是實現酶重復連續使用和改善穩定性的有效手段。與游離酶相比，固定化酶具有儲存穩定性高、易于分離回收、可多次重復使用、操作連續可控、工藝簡便等優點，不僅在化學生物學、生物工程醫學及生命科學等領域異常活躍，而且具有節省能源與資源、減少污染的生成。在固定化酶領域中，關鍵技術是交聯試劑與載體的選擇。殼聚糖是一種生物相容性好、易生物降解、無毒無副作用的天然高分子材料，其分子表面存在著豐富的羥基和氨基等官能團。具有磁性的殼聚糖微球固定化酶技術，不但能保持酶催化高效性和專一性，而且易于分離，有利于酶的重復性使用及產品的純化。
【發明內容】
[0007]鑒于上述，本發明的目的在于提供一種耐熱α-葡萄糖苷酶的制備與固定化的方法。該方法以嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus s tear ο thermophi I us)為菌種,對產α -葡萄糖苷酶的培養條件進行優化，確定實驗最佳條件，在此基礎之上，進行多批次的5L小型發酵實驗和20L放大發酵實驗，對收集的產物，采用離心、高壓破壁法，得到α -葡萄糖苷酶粗酶。最后，以磁性殼聚糖微球為載體，采用吸附-交聯法固定α-葡萄糖苷酶。
[0008]本發明的目的是通過以下技術方案來實現:
一種耐熱α-葡萄糖苷酶的制備與固定化的方法，其步驟是:
1.產α -葡萄糖苷酶菌株的發酵
①營養肉汁培養基:分別稱取蛋白胨(0XIDE)，牛肉提取物(BBI)，氯化鈉，加入蒸餾水，混合均勻，使氫氧化鈉調整至ρΗ7.0, 1.05Kg/cm2滅菌20min。
[0009]②產酶培養基:分別稱取蛋白胨(OXIDE)，牛肉提取物(BBI)，氯化鈉，加入蒸餾水，混合均勻，自然pH, 1.05Kg/cm2滅菌20min。
[0010]③種子液的制備:將嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophiIus)為菌種接種營養肉汁培養基中，在40-50°C下振蕩培養15-25h，初始pH5.0-7.0，裝瓶量20_40ml，接種量 5-20%，轉速 100-300 r/min。
[0011]2.粗酶液的制備
將③得到的種子液以10%的接種量，接種于產酶培養基，在45°C下振蕩培養24h，于10000r/min離心20min，去除上清液，收集沉淀，將菌體沉淀使用高壓破壁，即為α -葡萄糖苷酶。
[0012]3.α-葡萄糖苷酶的固定化
①磁性殼聚糖微球的制備:稱取納米Fe3O4微球與0.01 g/mL的殼聚糖乙酸溶液混合后，進行超聲分散10_30min，邊攪拌邊緩慢加入液體石蠟和司盤_80，室溫下充分攪拌10-30min，加入濃度為4%戊二醛溶液，在60-80°C下充分攪拌1_3 h，之后在70-90°C水浴中，熟化1-3 h，用磁鐵收集得到的產物，最后依次用石油醚、丙酮、蒸餾水充分洗滌，在50-70°C下真空干燥，得到磁性殼聚糖微球；
②酶的固定化:將磁性殼聚糖微球加入三角瓶中，加入pH為7.0的磷酸-磷酸鉀緩沖液，充分混合l_3h，將磁性殼聚糖微球取出，同時，將α -葡萄糖苷酶溶于PH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，得到濃度為0.8 mg/mL的酶液，然后將磁性殼聚糖微球加入到配制好的酶液中，再加入濃度為1%的戊二醛溶液，恒溫振蕩1.5 h，用磁鐵收集磁性固定化酶，用緩沖液充分洗滌，在4°C下保存固定化的α-葡萄糖苷酶。
[0013]本發明的優點和產生的有益效果:
1.本發明所得的α-葡萄糖苷酶是工業上生產低聚異麥芽糖的關鍵酶，作為主要酶制劑用于淀粉加工工業中的糖苷的轉移。
[0014]2.本發明以納米Fe3O4微球為基質，磁性殼聚糖微球為載體，采用吸附_交聯法固定α-葡萄糖苷酶，將固定化的酶與游離的酶相比，均有較大提高，特別是在固定化過程中較高溫度時，使酶活性損失減少，酶的復活回收率較高。
[0015]3.磁性殼聚糖微球是一種新型功能高分子材料，兼有磁性無機物與殼聚糖聚合物的優點，有利于固定化酶從反應體系中分離和回收，提高了酶的催化效率和回收率，操作簡便、成本較低，可實現生產工藝的連續化和工業化。
【具體實施方式】
[0016]實施例1本發明采用的菌株為:嗜熱脂肪芽孢桿菌{Bacillus stearothermophiIus )
本發明所使用的試劑:蛋白胨(OXIDE)，牛肉提取物(BBI)，醫藥用納米Fe3O4微球(99.6%，( 20nm球形，市售)，其他試劑均為分析純。
[0017]本發明所采用的儀器:Mettler Toledo AL204分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；LDZM型立式智能壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)；SHA-B水浴恒溫振蕩器(江蘇常州)；BS-1E恒溫振蕩培養箱(江蘇金壇市億通電子有限公司)；UV-1800PC紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；MD2300全自動5L液體發酵罐(B.E.Marubsishi日本)。GL-21M高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)。AH100B高壓細胞破碎機(ATS工業系統有限公司)；DL-SB-5Z20低溫冷卻液循環泵(鄭州長城科工貿有限公司)
一種嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus s tearo thermophilus)產α -葡萄糖苷酶的方法，其步驟如下:
1.培養基的制備
①營養肉汁培養基:分別稱取蛋白胨(OXIDE)10.0g，牛肉提取物(BBI) 3.0g，氯化鈉
5.0g,加入蒸懼水1.0L,混合均勻，使用5mol/L氫氧化鈉(約0.2ml)調整至ρΗ7.0, 1.05Kg/cm2滅菌20min ;該培養基可用于5 tearo thermophiIus菌株生長；
②產酶培養基:分別稱取蛋白胨(OXIDE)10.0g，牛肉提取物(BBI) 3.0g，氯化鈉
5.0g,加入蒸懼水1.0L,混合均勻,自然pH, 1.05Kg/cm2滅菌20min。
[0018]③種子液的制備:將菌種嗜熱脂肪芽孢桿菌iBaciIlusstearothermophiIus)接種營養肉汁培養基中，在45°C下振蕩培養24h ;初始pH5.0-7.0，裝瓶量20_40ml，接種量5-20%，轉速 100-300 r/min。
[0019]2.粗酶液的制備
將種子液以10%的接種量，接種于產酶培養基，在45°C下振蕩培養24h，于10000r/min離心20min，去除上清液，收集沉淀，將菌體沉淀使用高壓破壁，即為α -葡萄糖苷酶。
[0020]實施例2
α-葡萄糖苷酶的固定方法為:
1.磁性殼聚糖微球的制備:取0.40g Fe3O4粒子與100 mL 0.01 g/mL殼聚糖乙酸溶液混合后，進行30 min超聲分散，邊攪拌邊緩慢加入到70 mL液體石蠟和3 mL司盤-80中，常溫下攪拌30min，加入25mL 4%戊二醛，在80°C下攪拌2 h，然后在90°C水浴中熟化1.5h，得到的產物用磁鐵收集。再依次用石油醚、丙酮、蒸餾水充分洗滌，于60°C真空干燥，得磁性殼聚糖微球；
2.固定化酶的制備:將90mg磁性殼聚糖微球加入錐形瓶中，用10 mLpH7.0的磷酸-磷酸鉀緩沖液充分溶脹2.5h取出，同時將α -葡萄糖苷酶溶于ρΗ4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，配制成0.8 mg/mL的酶液。然后將微球加入α -葡萄糖苷酶緩沖溶液中，并加20mL 1%的戊二醛，恒溫搖床振蕩1.5 h，用磁鐵收集磁性固定化酶，用緩沖液充分洗滌，最后在4°C下保存固定化的α-葡萄糖苷酶。
[0021]試驗例I 酶的性質
將酶分別在40-60°C溫度下，緩沖液用pH6.8的磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L),以pNPG作為底物進行酶活測定，最高酶活為100%。
[0022]用不同ρΗ5.0-9.0 的 40mmol/L Brittion-Robinson 通用緩沖液(40 mmol/L 憐酸-40 mmol/L硼酸-40 mmol/L乙酸，用NaOH調pH)取代酶活測定方法中的緩沖液進行酶活測定。
[0023]取適量酶液(終濃度為5mM)分別在不同溫度45_60°C下保溫4h，每隔Ih取出一組樣品，置于4°C冰箱內，待保溫結束后統一在標準條件下測定殘余酶活，以未處理的酶液的酶活設為100%。
酶在不同ρΗ4.0-9.0的0.2mol/L Brittion-Robinson通用緩沖液中常溫下24h處理后，加入0.2mol/L、pH6.8緩沖液恢復pH，然后在標準條件下測定殘余酶活，以未處理的酶液的酶活設為100%。
[0024]經金屬離子(Fe3+、Al3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、K+)和化學試劑(EDTA)與酶液混合，使其最終濃度分別達到1.0 mM,5.0 mM，然后在45°C下測定酶活。以未經金屬離子和化學試劑處理的酶液的酶活設為100%。
[0025]試驗例2 酶活測定
α -葡萄糖苷酶活測定方法:采用對硝基酚-a -D-葡萄糖苷(pNPG)為底物。精確吸取 0.1ml PNPG 溶液(濃度為 5mmol/L)、0.2ml0.lmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.8)和 0.2ml 蒸懼水于60°C水浴中保溫5min,加入0.1ml適度稀釋的酶液,反應10min后,立即加入3.0ml
0.2mol/L硼酸鈉終止反應，在400nm測定吸光度值。
[0026]酶活力定義:每分鐘水解產生I μ mo I對硝基酚所需的酶量為一個酶活力單位。在如下公式中計算酶活力:
酶活力單位^!!!(^/!!!!^二丫“樣)/…※^^)
使用空白管作為參比溶液，將測得的吸光度值在對硝基酚標準曲線中查找生成對硝基酚的量Y(A樣)，M代表反應時間(IOmin)，V代表加入酶量(0.1ml)。
[0027]試驗例3
α -葡萄糖苷酶5L小型發酵實驗和20L放大發酵實驗
(I)產α -葡萄糖苷酶5L小型發酵實驗
在試管和搖瓶培養的基礎上采用5L發酵罐完成小型發酵實驗。培養基選用經優化的小型發酵用液體培養基，發酵條件:接種量為5-20%，ρΗ5.0-7.0,培養溫度40_50°C，培養時間15-25h。將試管培養的菌株接入到三角瓶中，放置在搖床上，攪拌速度100-300r/min，溫度40-50°C培養15-25h后測定酶活力。把培養15_25h后的三角瓶中的菌株，接入到發酵罐中，攪拌速度100-300r/min，通氣量1.0-2.0，溫度40_50°C培養15_25h后測定酶活力，酶活力為2.80 U/mL，通過十批次的穩定性發酵試驗，酶活力趨于恒定基本在2.5-3.0 U/mL之間。
[0028] ( 2 )產α -葡萄糖苷酶20L放大發酵實驗
在試管和搖瓶培養的基礎上采用20L發酵罐完成放大發酵實驗。培養基選用經優化的小型發酵用液體培養基，發酵條件:接種量為5-20%，ρΗ5.0-7.0,培養溫度40_50°C，培養時間15-25h。將試管培養的菌株接入到三角瓶中，放置在搖床上，攪拌速度100-300r/min，溫度40-50°C培養15-25h后測定酶活力。把培養15_25h后的三角瓶中的菌株，接入到發酵罐中，攪拌速度100-300r/min，通氣量2-4，溫度40-50°C培養15-25h后測定酶活力。酶活力為13.5U/mL,通過十二批次的穩定性發酵試驗,酶活力趨于恒定基本在10-15U/mL之間 。
【權利要求】
1.一種耐熱α-葡萄糖苷酶的制備與固定化的方法，其步驟是: (1)產α-葡萄糖苷酶菌株的發酵 ①營養肉汁培養基:分別稱取蛋白胨，牛肉提取物，氯化鈉，加入蒸餾水，混合均勻，使氫氧化鈉調整至ρΗ7.0, 1.05Kg/cm2滅菌20min ； ②產酶培養基:分別稱取蛋白胨，牛肉提取物，氯化鈉，加入蒸餾水，混合均勻，自然pH, 1.05Kg/cm2 滅菌 20min ； ③種子液的制備:將嗜熱脂肪芽孢桿菌為菌種接種營養肉汁培養基中，在40-50°C下振蕩培養 15-25h，初始 ρΗ5.0-7.0，裝瓶量 20_40ml，接種量 5_20%，轉速 100-300 r/min ； (2)粗酶液的制備 將種子液以10%的接種量，接種于產酶培養基，在45°C下振蕩培養24h，于10000r/min離心20min，去除上清液，收集沉淀，將菌體沉淀使用高壓破壁，即為α -葡萄糖苷酶； (3)α-葡萄糖苷酶的固定化 ①磁性殼聚糖微球的制備:稱取納米Fe3O4微球與0.01g/mL的殼聚糖乙酸溶液混合后，進行超聲分散10-30min，邊攪拌邊緩慢加入液體石蠟和司盤-80，室溫下攪拌10-30min，加入濃度為4%戊二醛溶液，在60-80°C下充分攪拌1_3 h，之后在70-90°C水浴中，熟化1-3 h，用磁鐵收集得到的產物，最后依次用石油醚、丙酮、蒸餾水充分洗滌，在50-70°C下真空干燥，得到磁性殼聚糖微球； ②酶的固定化:將磁性殼聚糖微球加入三角瓶中，加入pH為7.0的磷酸-磷酸鉀緩沖液，充分混合l_3h，將磁性殼聚糖微球取出，同時，將α -葡萄糖苷酶溶于ρΗ4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，得到濃度為0.8 mg/mL的酶液，然后將磁性殼聚糖微球加入到配制好的酶液中，再加入濃度為1%的戊二醛溶液，恒溫振蕩1.5 h，用磁鐵收集磁性固定化酶，用緩沖液充分洗滌，在4°C下保存固定化的α-葡萄糖苷酶。
【文檔編號】C12N9/26GK103937765SQ201310019805
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月21日 優先權日:2013年1月21日
【發明者】陳朋, 嚴曉娟, 胡先望, 梁寧 申請人:甘肅省商業科技研究所