專利名稱：檢測含有nos終止子的轉基因水稻的引物、試劑盒和方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地，本發明涉及檢測轉基因水稻的引物、試劑盒和方法。
背景技術：
轉基因生物是指利用生物技術，將外源基因轉移到物種中以改造其遺傳特性，從而獲得人類所需的性狀、營養品質而產生的生物新品種。以轉基因生物或以其為原料加工而來的食品就是轉基因食品。從1994年第一例轉基因食品(轉基因番茄)在美國誕生至今，轉基因生物已廣泛用于食品領域。轉基因水稻的發展狀況國內外轉基因生物的研發、生產蓬勃發展，通過基因工程方式培育農作物新品種是目前作物育種的發展方向，在提高作物產量、改善品質、提高抗性等方面具有巨大潛力。水稻(Oryza sativa L.)是我國最重要的主糧,常年播種面積約為3100萬公頃，總收獲量在2億噸左右，約占我國糧食總產量的40%。1991年，Christou等用基因槍轉化技術獲得了轉基因水稻植株。隨后幾年，各國將各類目的基因導入水稻獲得大量轉基因水稻品系。1994年，Hiei等建立了農桿菌介導的高效粳稻遺傳轉化技術，隨后爪哇稻和秈稻的農桿菌介導轉化體系也先后建立，并逐步成為水稻的主流轉化技術。其它物種的抗除草齊[J、抗蟲、抗病、抗病毒、耐鹽、改善稻米品質等有益基因被引入商業水稻品種中。中國在轉基因水稻培育方面取得了重大進展，已將豇豆胰蛋白酶抑制劑基因，CryIAb、CrylAc, Crylc, CryIAh、Cry2a等毒蛋白基因，雪花蓮凝集素基因，抗菌肽基因和來自野生稻的Xa21基因等導入多種雜交 水稻恢復系中。經農業部批準，十多種轉基因水稻品系正在進行環境釋放、中間試驗，其中有2個抗蟲轉基因水稻已獲轉基因生物安全證書。目前中國正在進行環境釋放、中間試驗的轉基因水稻的轉基因構建中都含有NOS終止子，故采用NOS終止子特異性方法可篩選檢測轉基因水稻及其制品。轉基因食品的管理要求轉基因食品已經得到廣泛使用，但是轉基因作為一種新的生物技術，其對人類健康、生態平衡的影響以及轉基因食品潛在的安全性越來越成為消費者關注的焦點。2000年聯合國通過了“生物安全議定書”，該議定書對除了藥物以外的所有進出境活性轉基因生物有關過境、審批、檢測、風險評估和管理、賠償責任等做出了詳細的規定。世界上主要國家立法對轉基因產品進行管理，美加、歐盟、日本、韓國、澳新的法律明確規定，轉基因生物需經政府批準，并經嚴格的生物安全、環境安全測試才可以田間種植、環境釋放及作為食品、飼料。歐盟、日本、韓國、澳洲等要求轉基因食品進行標識，并規定了相應閾值水平。我國于2001年5月23日頒布了《農業轉基因生物安全管理條例》，規定對農業轉基因生物實行檢驗檢疫。2002年3月20日開始實行的《農業轉基因生物標識管理辦法》也規定了轉基因食品的標識制度。對于執行上述聯合國及各國的法規措施，轉基因產品的檢測是關鍵措施之一，需要通過定性檢測確定轉基因的種類，鑒別其是否為已批準的或已獲準用于食品飼料，以防止具有風險的未知轉基因產品的任意擴散，對社會產生危害。由于每個國家轉基因標識的閾值水平都不相同，還需要通過定量檢測確定轉基因產品的含量，明確是否已達到所在國規定的閾值水平。轉基因食品的環介導等溫擴增檢測方法(LAMP)轉基因食品檢測大致可分為兩類。一類是核酸檢測，當外源基因插入到受體細胞染色體時，一般要構建啟動子、終止子、選擇標記基因和報告基因，如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35s啟動子，胭脂堿合酶終止子(NOS終止子)等。轉基因食品核酸檢測的靶標是插入的外源基因，包括外源基因的整合位點、啟動子、終止子、選擇標記基因和報告基因的核酸序列。目前的轉基因成分檢測數據庫中有超過400對PCR檢測引物和40多種內源參照基因。另一類是蛋白檢測，即通過插入外源基因表達的蛋白質產物或其功能進行檢測，已有大約20種轉基因蛋白檢測方法在轉基因檢測領域中投入使用。核酸檢測主要利用PCR方法和環介導等溫擴增方法。核酸檢測方法具有很高的靈敏度，在轉基因領域使用最為廣泛。與蛋白質具有的組織特異性相比，核酸檢測技術不受材料的限制。另外，核酸比蛋白質穩定，變性之后容易復性，因此在加工食品中仍可檢出。核酸檢測方法的關鍵是引物設計，檢測的特異性和靈敏度取都決于引物序列的設計。
2000年日本的Notomi發明一種基因診斷技術-環介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)，并在中國獲得發明專利權(專利號 00818262. 0)。LAMP法近年已成功地應用于多種疾病病原檢測中。LAMP方法具有如下優點靈敏度高；反應時間短(15 60min完成反應)；不需要貴重儀器(只需60-70°C左右恒溫)；操作步驟簡單(將反應液、酶和模板混合于PCR管中，置于60-65°C保溫);結果檢測簡單，可肉眼觀察結果。因此，LAMP方法適合現場快速檢測診斷，是可替代PCR的基因擴增技術。通常，LAMP方法針對靶基因的6個序列區域設計4_6條引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫(60-650C )持續15分鐘到I小時左右，將靶基因擴增IO9 101°倍。可通過3種方法肉眼判斷檢測結果1)濁度法，由于LAMP反應可產生大量白色焦磷酸鎂沉淀，故可憑肉眼觀察反應管內是否出現白色渾濁，進行結果判斷；2)熒光顯色劑法，由于LAMP反應能將靶基因擴增IO9倍以上，在反應完成后加入SYBR Green1、Evagreen等核酸染色劑，在紫外光下可對結果進行熒光顯色判定；3)金屬離子滴定指示劑法，由于LAMP反應生成大量的焦磷酸根，與反應體系中的錳離子、鎂離子生成絡合物或沉淀，導致反應體系中的錳離子、鎂離子濃度降低，故當LAMP反應體系中加入羥基萘芬藍(英文名hydroxynaphthol blue 或 2-Hydroxy-l- (2-hydroxy-4-sulfo-l-naphthylazo) -3, 6-naphthalenedisulfonic acid)，反應結束后，溶液由淺藍色變為深藍色；或者當LAMP反應體系中加入錳離子與鈣黃綠素(英文名Calcein，又名3，3’-雙(甲胺二乙酸)熒光素，Bis [N, N-bis (carboxymethyl) aminomethyl3’ fluorescein)時，反應結束后，溶液由淺掠色變為綠色，可通過觀察反應管的顏色變化直接判定反應結果。當然，也可以通過電泳對LAMP反應的擴增產物進行檢測，當電泳結果顯示特異性條帶時，則表明所測樣品中包含靶標DNA序列。目前，國內外少見報道利用LAMP技術簡單、快速、特異且靈敏地測定含有NOS終止子的轉基因水稻。
因此，本領域需要一種簡單、快速、特異性好且靈敏度高的檢測含有NOS終止子的轉基因水稻的方法。
發明內容
本發明的目的旨在提供一種操作簡單、快速、特異而靈敏地檢測含NOS終止子的轉基因水稻或其制品用引物、試劑盒及其應用以及相應的檢測方法。第一方面，本發明提供了用于通過環介導等溫擴增法檢測含有NOS終止子的轉基因水稻或其制品的引物，其中，所述引物的序列為SEQ ID NOs. 1-4或SEQ ID NOs. 1_6。第二方面，本發明提供了用于通過環介導等溫擴增法檢測含有NOS終止子的轉基因水稻或其制品的試劑盒，其中所述試劑盒包括本發明第一發明所述的引物，并進一步包括甜菜堿。在一個具體的實施方式中，所述的試劑盒還包括用于提取轉基因水稻DNA的試劑、用于環介導等溫擴增的試劑、陽性對照、陰性對照、空白對照以及使用說明書。在一個具體的實施方式中，所述的試劑盒進一步包括可用于環介導等溫擴增法的核酸用染色熒光劑和/或金屬離子滴定指示劑。在一個具體的實施方式中，所述核酸染色劑為SYBR Green I或Evagreen,所述金屬離子滴定指示劑為羥基萘芬藍或錳離子與鈣黃綠素。在一個具體的實施方式中，所述錳離子為硫酸錳。第三方面，本發明提供了通過環介導等溫擴增法檢測含有NOS終止子的轉基因水稻或其制品的方法，所述方法包括使用本發明第一發明的引物或者本發明第二方面的試劑
盒。`在一個具體的實施方式中，所述方法包括如下步驟(a)從待測樣品中提取DNA ;和(b)使用本發明第一方面所述的引物或本發明第二方面所述的試劑盒，通過環介導等溫擴增的反應進行核酸擴增反應和擴增產物的檢測。在一個具體的實施方式中，所述核酸擴增反應在實時濁度儀上進行。在一個具體的實施方式中，所述核酸擴增反應在恒溫裝置中進行。第四方面，本發明提供了本發明第一方面所述的引物或者本發明第二方面所述的試劑盒在檢測含有NOS終止子的轉基因水稻或其制品中的應用。利用本發明的引物、試劑盒或方法能夠對轉基因水稻或其制品進行簡單、快速、特異而靈敏地檢測，從而檢出含NOS終止子的轉基因水稻或其制品。
圖1 :不加環引物的LAMP方法在實時濁度儀上檢測轉基因水稻是否包含NOS終止子。樣品DNA包括科豐6號、克螟稻(KMDl)、Bt汕優63、T2a_l、Tlc_19、陰性對照水稻和空白對照。本發明所述的轉基因水稻是農業部公布的水稻品系標準名稱。圖2 :以鈣黃綠素為顯色劑檢測轉基因水稻是否包含NOS終止子。I為科豐6號，2為克螟稻(KMD1)，3為Bt汕優63，4為T2a_l，5為Tlc_19，6為陰性對照水稻，7為空白對照。
圖3 :以SYBR Green I為顯色劑檢測轉基因水稻是否包含NOS終止子。I為科豐6號，2為克螟稻(KMD1 )，3為Bt汕優63，4為T2a_l，5為Tlc_19，6為陰性水稻，7為空白對照。圖4 :添加鎖核酸修飾環引物的LAMP方法在實時濁度儀上檢測轉基因水稻是否包含NOS終止子。樣品DNA包括科豐6號、克螟稻(KMDl)、Bt汕優63、T2a_l、TlC_19、陰性水稻和空白對照。
具體實施例方式以下通過具體實施方式
對本發明作進一步描述，但是，本發明并不限于以下具體實施例。實施例1 :不加環引物在實時濁度儀上檢測轉基因水稻在本實施例中利用反向外引物N0S-B3 (SEQ ID No.1)、反向內引物NOS-BIP (SEQID No. 2)、正向外引物 N0S-F3 (SEQ ID No. 3)和正向內引物 NOS-FIP (SEQ ID No. 4)，通過LAMP法實現了在實時濁度儀上檢測含有NOS終止子的轉基因水稻。在本實施例中檢測的DNA樣品分別來自科豐6號、克螟稻(KMDl)、T2a-l、Tlc_19，同時還包括已知包含NOS終止子的Bt汕優63作為陽性對照，不含NOS終止子的非轉基因水稻的DNA樣品作為陰性對照和不含DNA的樣品作為空白對照。1.主要檢測儀器實時濁度儀(LA-320C，日本);1000uL、100uL、10uL、2.5uL微量移液器(Eppendorf，德國)。2.主要檢測試劑所有引物均由上海英駿生物技術有限公司合成(具體序列見表l);BstDNA聚合酶、IOXThermoPol Buffer、MgSO4購自NEB公司；dNTPs購自大連寶生物公司；甜菜堿購自北京東方嘉城生物公司。表1:引物序列
權利要求
1.用于通過環介導等溫擴增法檢測含有NOS終止子的轉基因水稻或其制品的引物，其中，所述引物的序列為SEQ ID NOs. 1-4或SEQ ID NOs. 1-6。
2.用于通過環介導等溫擴增法檢測含有NOS終止子的轉基因水稻或其制品的試劑盒，其中所述試劑盒包括權利要求1所述的引物序列，并進一步包括甜菜堿。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其還包括用于提取轉基因水稻DNA的試劑、用于環介導等溫擴增的試劑、陽性對照、陰性對照、空白對照以及使用說明書。
4.如權利要求2或3所述的試劑盒，其進一步包括可用于環介導等溫擴增法的核酸用染色熒光劑和/或金屬離子滴定指示劑。
5.如權利要求4所述的試劑盒,其中所述核酸染色劑為SYBRGreen I或Evagreen,所述金屬離子滴定指示劑為羥基萘芬藍或錳離子與鈣黃綠素。
6.通過環介導等溫擴增法檢測含有NOS終止子的轉基因水稻或其制品的方法，所述方法包括使用權利要求1所述的引物或者權利要求2-5中任一項所述的試劑盒。
7.如權利要求6所述的方法，所述方法包括如下步驟 (a)從待測樣品中提取DNA;和 (b)使用權利要求1所述的引物或權利要求2-5中任一項所述的試劑盒，通過環介導等溫擴增的反應進行核酸擴增反應和擴增產物的檢測。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述核酸擴增反應在實時濁度儀上進行。
9.如權利要求7所述的方法，其中所述核酸擴增反應在恒溫裝置中進行。
10.權利要求1所述的引物或者權利要求2-5中任一項所述的試劑盒在檢測含有NOS終止子的轉基因水稻或其制品中的應用。
全文摘要
本發明涉及用于通過環介導等溫擴增法檢測含有NOS終止子的轉基因水稻的引物SEQ ID NOs.1-4或SEQ ID NOs.1-6，包含所述引物的試劑盒，以及利用所述引物或試劑盒通過環介導等溫擴增法檢測含有NOS終止子的轉基因水稻的方法。使用本發明的引物或試劑盒能夠簡單、快速、高特異性且高靈敏度地測定含有NOS終止子的轉基因水稻。
文檔編號C12N15/11GK103060460SQ20131001869
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月17日 優先權日2013年1月17日
發明者黃文勝, 陳穎, 鄧婷婷, 付凱 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院