專利名稱：用于鑒定小麥千粒重的引物對以及相關分子標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于鑒定小麥千粒重的引物對以及相關分子標記。
背景技術：
小麥是我國重要的糧食作物，小麥的高產、穩產是國家糧食安全的重要保障，其產量的高低直接影響到我國人們生活水平和國家糧食安全。隨著人口的增長、耕地減少和糧食生產成本的不斷提高，高產育種將是我國小麥育種的永恒主題。千粒重的高低與小麥產量直接相關，因此，通過現代分子生物學手段研究控制小麥籽粒大小基因的遺傳基礎、克隆粒重相關基因、發掘優異等位變異并開發其功能標記對我國高產育種具有重要意義。
產量構成要素比較復雜，尤其是穗數和穗粒數，而千粒重的增加則是相對獨立的， 并且小麥千粒重也較為穩定，遺傳力達59-80%。鄭天存認為河南及黃淮南片小麥單產提高的貢獻率依次是千粒重 > 穗粒數 > 穗數。所以，千粒重對小麥單產水平的提高起到了舉足輕重的作用。
目前對小麥千粒重已進行了大量的QTL定位研究。Giura等利用小麥單體研究發現，4A、4B、2B、3A和IB染色體與粒長有關，而IA和IB與小麥粒寬相關。Dholakia等將與小麥粒長相關的QTL定位于2BL、2DL、5BL、6BS及7BL上。在所定位的QTL中，2DL上的Xgwm261與小麥粒長、粒寬有關，其對粒長和粒寬的表型貢獻率分別為16. 6%和7. 7%。 Breseghello等通過關聯分析研究發現,小麥的2D、5A和5B與粒形和粒重相關。其中2D 染色體上的Xwmclll和Xgwm30與小麥的粒寬有關，而Xwm539與小麥的粒長相關。5A染色體上的Xwmcl50b, Xbarc 141與小麥的粒長、籽粒面積及粒重相關,而與小麥的粒寬相關不顯著。Breseghello等發現1A、IB、1D、2B、2D、4B、5B和6B與小麥籽粒大小及粒形有關，其中位于IB上的Xcdol 196與小麥的粒寬相關，4B上的Xggat27及上的Xcdo346a與小麥的粒長相關。Sun等在2A、 和6A染色體上定位了與小麥粒寬相關的QTL，位于6A染色體Xswesl23b-Xswes332a附近的標記受環境影響較小，對小麥粒寬貢獻率最高可達20%。 1A、1B、2B、4A、4B染色體上存在與小麥粒長相關的QTL，與其它位點相比4A染色體附近的 Xswes24a-Xswes24c遺傳相對穩定，對小麥粒長的貢獻率為11. 1-14. 6%。王瑞霞等利用QTL 作圖在不同環境條件下共檢測到17個與粒長的相關的QTL，其中位于2A和2D上的兩個位點在各環境條件下均可檢測到，分別解釋表型變異的10. 7%和14. 7%。檢測到16個影響籽粒寬度的QTL，分布于1Α、1Β、2Α、2Β、3Α、3Β、5Α、5Β、 和6D染色體上，但不同環境中未檢測到影響粒寬的共同QTL。
目前已定位的與小麥粒重及其構成要素相關的QTL已遍布小麥的21條染色體。由于受作圖群體、遺傳背景、QTL作圖方法、標記類型等因素的影響，使得不同研究者的結果可比性差。此外，由于大多數QTL對粒重及其構成要素的表型貢獻率較小，且在不同年際及環境間重復性差，所以仍不能滿足 分子標記輔助選擇的需要。發明內容
本發明的目的是提供一種用于鑒定小麥千粒重的引物對以及相關分子標記。
本發明提供的特異引物對，由序列表的序列3所不的單鏈DNA片段和序列表的序列4所示的單鏈DNA片段組成。
本發明還保護所述特異引物對的應用，為如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6) 或(7):
(I)鑒定待測小麥攜帶等位基因TaGS-Dla還是等位基因TaGS-Dlb ;所述等位基因 TaGS-Dla如序列表的序列I所不；所述等位基因TaGS-Dlb如序列表的序列2所不；
(2)輔助篩選攜帶所述等位基因TaGS-Dla的小麥品種；
(3)輔助篩選攜帶所述等位基因TaGS-Dlb的小麥品種；
(4)輔助鑒定待測小麥的千粒重；
(5)輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種；
(6)輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種；
(7)輔助比較不同小麥品種的千粒重。
應用所述特異引物對鑒定待測小麥攜帶等位基因TaGS-Dla還是等位基因 TaGS-Dlb的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板用所述特異引物對進行PCR擴增， 如果PCR擴增產物為562bp待測小麥攜帶所述等位基因TaGS-Dla，如果PCR擴增產物為 522bp待測小麥品種攜帶所述等位基因TaGS-Dlb。
應用所述特異引物對輔助篩選攜帶等位基因TaGS-Dla的小麥品種的方法如下 以待測小麥的基因組DNA為模板用所述特異引物對進行PCR擴增，如果PCR擴增產物為 562bp待測小麥為候選的攜帶所述等位基因TaGS-Dla的小麥品種，如果PCR擴增產物不為 562bp待測小麥為候選的不攜帶所述等位基因TaGS-Dla的小麥品種。
應用所述特異引物對輔助篩選攜帶等位基因TaGS-Dlb的小麥品種的方法如下 以待測小麥的基因組DNA為模板用所述特異引物對進行PCR擴增，如果PCR擴增產物為 522bp待測小麥為候選的攜帶所述等位基因TaGS-Dlb的小麥品種，如果PCR擴增產物不為 522bp待測小麥為候選的不攜帶所述等位基因TaGS-Dlb的小麥品種。
應用所述特異引物對輔助鑒定待測小麥的千粒重的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板用所述特異引物對進行PCR擴增，如果PCR擴增產物為562bp待測小麥的千粒重疑似為44g以上，如果PCR擴增產物為522bp待測小麥的千粒重疑似為43. 5g以下。
應用所述特異引物對輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板用所述特異引物對進行PCR擴增，如果PCR擴增產物為562bp待測小麥為候選的具有高千粒重性狀的小麥品種，如果PCR擴增產物不為562bp待測小麥為候選的不具有高千粒重性狀的小麥品種。
應用所述特異引物對輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種的方法如下以待測小麥的基因組DNA為模板用所述特異引物對進行PCR擴增，如果PCR擴增產物為522bp待測小麥為候選的具有低千粒重性狀的小麥品種，如果PCR擴增產物不為522bp待測小麥為候選的不具有低千粒重性狀的小麥品種。
應用所述特異引物對輔助比較不同小麥品種的千粒重的方法如下分別以不同小麥品種的基因組DNA為模板用所述特異引物對進行PCR擴增， PCR擴增產物為562bp的小麥品種的千粒重疑似大于PCR擴增產物為522bp的小麥品種的千粒重。
本發明還保護一種與小麥千粒重相關的分子標記，為以待測小麥的基因組DNA為模板用所述特異引物對擴增得到的DNA片段。所述分子標記具體可為分子標記甲或分子標記乙。所述分子標記甲如序列表的序列I自5’末端第870-1431位核苷酸所示。所述分子標記乙如序列表的序列2自5’末端第870-1391位核苷酸所示。
本發明還保護所述分子標記的應用，為如下(a)或(b)或(C)或(d)
(a)輔助鑒定待測小麥的千粒重；
(b)輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種；
(c)輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種；
(d)輔助比較不同待測小麥品種的千粒重。
應用所述分子標記輔助鑒定待測小麥的千粒重的方法如下如果所述待測小麥基因組中具有所述分子標記甲，待測小麥的千粒重疑似為44g以上，如果所述待測小麥基因組中具有所述分子標記乙，待測小麥的千粒重疑似為43. 5g以下。
應用所述分子標記輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種的方法如下如果所述待測小麥基因組中具有所述分子標記甲，待測小麥為候選的具有高千粒重性狀的小麥品種，如果所述待測小麥基因組中不具有所述分子標記甲，待測小麥為候選的不具有高千粒重性狀的小麥品種。
應用所述分子標記輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種的方法如下如果所述待測小麥基因組中具有所述分子標記乙，待測小麥為候選的具有低千粒重性狀的小麥品種，如果所述待測小麥基因組中不具有所述分子標記乙，待測小麥為候選的不具有低千粒重性狀的小麥品種。
應用所述分子標記輔助比較不同小麥品種的千粒重的方法如下如果所述待測小麥基因組中具有所述分子標記甲，將其命名為小麥品種甲；如果所述待測小麥基因組中具有所述分子標記乙，將其命名為小麥品種乙；小麥品種甲的千粒重疑似大于所述小麥品種乙的千粒重。
本發明還保護序列表的序列I所示的DNA分子(與小麥千粒重性狀相關的等位基因 TaGS-Dla)。
本發明還保護序列表的序列2所示的DNA分子(與小麥千粒重性狀相關的等位基因 TaGS-Dlb)ο
本發明還保護所述等位基因TaGS-Dla和/或所述等位基因TaGS-Dlb的應用，為如下(a)或(b)或(C)或(d): (a)輔助鑒定待測小麥的千粒重；(b)輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種；(C)輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種；(d)輔助比較不同待測小麥品種的千粒重。
本發明還保護一種檢 測待測小麥攜帶等位基因TaGS-Dla還是等位基因TaGS-Dlb 的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述特異引物對進行PCR擴增， 如果PCR擴增產物為562bp待測小麥攜帶所述等位基因TaGS-Dla，如果PCR擴增產物為 522bp待測小麥品種攜帶所述等位基因TaGS-Dlb。
本發明還保護所述方法的應用；為如下(a)或(b)或(C)或(d):
(a)輔助鑒定待測小麥的千粒重；
(b)輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種；
(c)輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種；(d)輔助比較不同待測小麥品種的千粒重。所述應用中，攜帶所述等位基因TaGS-Dla的待測小麥為候選的具有高千粒重性狀的小麥品種。所述應用中，攜帶所述等位基因TaGS-Dlb的待測小麥為候選的具有低千粒重性狀的小麥品種。所述應用中，攜帶所述等位基因TaGS-Dla的待測小麥品種的千粒重大于攜帶所述等位基因TaGS-Dlb的待測小麥品種。以上任一所述高千粒重性狀的含義為千粒重為44g以上。以上任一所述低千粒重性狀的含義為千粒重為43. 5g以下。本發明公開了普通小麥TaGS基因的等位變異序列TaGS-Dla和TaGS-Dlb，并提供了鑒定TaGS-Dla和TaGS-Dlb等位變異的功能標記及其與小麥千粒重的相關關系。將本發明中的功能標記運用于分子標記輔助選擇，能快速篩選出具有較高千粒重的小麥品種(材料)，從而加速高產小麥新品種的育成步伐。本發明對利用分子標記輔助選擇高產小麥品種具有重要的理論意義和經濟價值。
圖1為TaGS基因的兩種等位變異形式的比對譜圖。圖2為部分樣本 的電泳圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試劑，如無特殊說明，可以從常規生化試劑商店購買得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、等位基因的發現及引物對的開發在對大量小麥品種進行序列分析的基礎上，發現小麥TaGS基因，在小麥中TaGS基因存在的兩種等位變異形式，一種如序列表的序列I所示(命名為等位基因TaGS-Dla)，另一種如序列表的序列2所示(命名為TaGS-Dlb)。TaGS基因的兩種等位變異形式的比對譜圖見圖1，起始密碼子和終止密碼子以方框示出，加下滑線部分為外顯子，陰影部分為序列多態位點，序列缺失部分以短橫線代替。基于TaGS基因的兩種等位變異形式設計特異引物對如下上游引物(序列表的序列3) :5’ -AACTTAGGGAGCGAAAACAA-3’ ；下游引物(序列表的序列4) :5’ -CACCAAGACTGGAGATGAAA-3’。實施例2、等位基因和引物對的應用實驗材料為106份中國冬小麥主推品種，具體見表I。將各個實驗材料分別進行如下步驟1、提取基因組DNA。2、以步驟I提取的基因組DNA為模板，用實施例1設計的特異引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR 擴增的反應體系模板 DNA 約 lOOng，rTaq 酶(Takara，code DX100B)0. 2μ 1，GC buffer I 10 μ KTakara, code DRR20GC I), dNTP(Takara, code D4030RA,2. 5mM each)2μ l,上游引物和下游引物各6pmol，用無菌超純水補充反應體系至20 μ l。PCR擴增的反應程序94°C預變性5min ;94°C變性lmin、52°C復性lmin、72°C延伸lmin，共35個循環；最后72°C延伸7min ;10°C保溫。3、將PCR擴增產物進行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(80W恒功率電泳lh)，銀染顯色。部分樣本的電泳圖見圖2。各個小麥品種均擴增得到了 PCR擴增產物，PCR擴增產物按大小分為兩種，一種為562bp，另一種為522bp。結果見表1。4、將步驟3的PCR擴增產物進行測序。測序結果表明，562bp的擴增產物均如序列表的序列1自5’末端第870-1431位核苷酸所示，522bp的PCR擴增產物均如序列表的序列2自5’末端第870-1391位核苷酸所示。根據以上結果，可以得出如下結論以待測小麥的基因組DNA為模板，用實施例1設計的特異引物對進行PCR擴增，如果PCR擴增產物為562bp待測小麥攜帶等位基因TaGS-Dla，如果PCR擴增產物為522bp待測小麥品種攜帶等位基因TaGS-Dlb。5、在河南安陽種植各個小麥品種，收獲后檢測小麥籽粒的千粒重，進行三次重復實驗，結果取平均值。結果見表1。表1各個小麥品種的PCR檢測結果和千粒重檢測結果
權利要求
1.特異引物對，由序列表的序列3所示的單鏈DNA片段和序列表的序列4所示的單鏈 DNA片段組成。
2.權利要求1所述特異引物對的應用，為如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(7)Cl)鑒定待測小麥攜帶等位基因TaGS-Dla還是等位基因TaGS-Dlb ;所述等位基因 TaGS-Dla如序列表的序列I所不；所述等位基因TaGS-Dlb如序列表的序列2所不；(2)輔助篩選攜帶所述等位基因TaGS-Dla的小麥品種；(3)輔助篩選攜帶所述等位基因TaGS-Dlb的小麥品種；(4)輔助鑒定待測小麥的千粒重；(5)輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種；(6)輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種；(7)輔助比較不同待測小麥品種的千粒重。
3.以待測小麥的基因組DNA為模板，用權利要求1所述特異引物對擴增得到的DNA片段。
4.權利要求3所述DNA片段的應用，為如下(a)或(b)或(c)或(d)Ca)輔助鑒定待測小麥的千粒重；(b)輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種；(C)輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種；Cd)輔助比較不同待測小麥品種的千粒重。
5.序列表的序列I所示的DNA分子。
6.序列表的序列2所示的DNA分子。
7.等位基因TaGS-Dla和/或等位基因TaGS-Dlb的應用，為如下(a)或(b)或(C)或Cd)Ca)輔助鑒定待測小麥的千粒重；(b)輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種；(C)輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種；Cd)輔助比較不同待測小麥品種的千粒重；所述等位基因TaGS-Dla如序列表的序列I所不；所述等位基因TaGS-Dlb如序列表的序列2所示。
8.一種檢測待測小麥攜帶等位基因TaGS-Dla還是等位基因TaGS-Dlb的方法，包括如下步驟以待測小麥的基因組DNA為模板，用權利要求1所述特異引物對進行PCR擴增，如果PCR擴增產物為562bp待測小麥攜帶等位基因TaGS-Dla，如果PCR擴增產物為522bp待測小麥品種攜帶等位基因TaGS-Dlb ;所述等位基因TaGS-Dla如序列表的序列I所不；所述等位基因TaGS-Dlb如序列表的序列2所不。
9.權利要求8所述方法的應用，為如下(a)或(b)或(C)或(d)Ca)輔助鑒定待測小麥的千粒重；(b)輔助篩選具有高千粒重性狀的小麥品種；(C)輔助篩選具有低千粒重性狀的小麥品種；Cd)輔助比較不同待測小麥品種的千粒重。
全文摘要
本發明公開了一種用于鑒定小麥千粒重的引物對以及相關分子標記。本發明提供的特異引物對，由序列表的序列3所示的單鏈DNA片段和序列表的序列4所示的單鏈DNA片段組成。本發明公開了普通小麥TaGS基因的等位變異序列TaGS-D1a和TaGS-D1b，并提供了鑒定TaGS-D1a和TaGS-D1b等位變異的功能標記及其與小麥千粒重的相關關系。將本發明中的功能標記運用于分子標記輔助選擇，能快速篩選出具有較高千粒重的小麥品種(材料)，從而加速高產小麥新品種的育成步伐。本發明對利用分子標記輔助選擇高產小麥品種具有重要的理論意義和經濟價值。
文檔編號C12Q1/68GK103060319SQ20131001699
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月17日 優先權日2013年1月17日
發明者何中虎, 張穎君, 夏先春 申請人:中國農業科學院作物科學研究所