專利名稱：油菜素內(nèi)酯失活基因bas1的根系重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是涉及油菜素內(nèi)酯基因根系重組表達(dá)載體的構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroid，BR)是甾醇類激素，在植物體內(nèi)的含量較少，但活性較高，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面具有顯著的生理效應(yīng)，而且其可增強(qiáng)植物的抗逆性。研究表明，鹽堿、干旱等逆境脅迫條件下外施油菜素內(nèi)酯可提高植物的耐逆性。但植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯水平的高低主要是通過(guò)原位油菜素內(nèi)酯代謝相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控來(lái)決定。BASl基因編碼一個(gè)細(xì)胞色素P450 (CYP72B1)，過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致油菜素內(nèi)酯C-26羥基羥化，但C-26 羥化后的油菜素內(nèi)酯生物活性遠(yuǎn)低于正常油菜素內(nèi)酯，因此BASl作為C-26-羥化酶，是一個(gè)重要的油菜素內(nèi)酯失活基因。并且在basl突變體中油菜素內(nèi)酯合成前體油菜素甾酮和6-脫氧油菜素甾酮的水平也受到抑制，因此認(rèn)為BASl基因在油菜素內(nèi)酯合成前體的代謝過(guò)程中也起作用。作物根系是植株的支柱，是作物吸收養(yǎng)分和水分的主要器官，還是鹽堿、干旱等逆境脅迫首先作用的器官，逆境通過(guò)影響根系活動(dòng)從而影響到植株地上部的生長(zhǎng)發(fā)育乃至產(chǎn)量形成。因此，維持根系的生理功能，增強(qiáng)根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收能力，是提高作物耐逆性的關(guān)鍵。但由于根系生長(zhǎng)在地下，根區(qū)環(huán)境的復(fù)雜性及根系研究方法和手段的局限性使根系性狀的研究與改良相對(duì)滯后。因此，本發(fā)明利用根系特異啟動(dòng)子構(gòu)建根系重組表達(dá)載體，為利用油菜素內(nèi)酯基因進(jìn)行根系改良提供途徑。煙草TobRB7基因?yàn)楦M織特異性表達(dá)基因，已知的啟動(dòng)子區(qū)段長(zhǎng)為1878bp，并且該啟動(dòng)子具有雙向啟動(dòng)子功能，在-823 +70bp區(qū)域該啟動(dòng)子正反方向插入均表現(xiàn)出較強(qiáng)的根組織特異性表達(dá)調(diào)控功能。因此，本發(fā)明以TobRB7基因啟動(dòng)子-823 +70bp區(qū)域?yàn)橹饕芯繀^(qū)域。本發(fā)明就是針對(duì)以上背景技術(shù)，通過(guò)從煙草基因組中克隆煙草根特異性表達(dá)啟動(dòng)子，構(gòu)建根系特異表達(dá)載體，從擬南芥中獲得油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1，并將其整合到根系表達(dá)載體上，獲得油菜素內(nèi)酯失活基因的根系重組表達(dá)載體，使油菜素內(nèi)酯基因在植物根系特異表達(dá)。該載體的構(gòu)建可為作物耐逆改良提供新途徑。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用煙草根特異啟動(dòng)子使油菜素內(nèi)酯基因在根系特異表達(dá)的方法。所解決的技術(shù)問(wèn)題是使目的基因在根系特異表達(dá)。本發(fā)明利用煙草根特異啟動(dòng)子使油菜素內(nèi)酯失活基因在根系定向表達(dá)的方法，包括根系特異啟動(dòng)子的克隆、根系表達(dá)載體的構(gòu)建，油菜素內(nèi)酯失活基因的克隆、油菜素內(nèi)酯基因根系重組表達(dá)載體的構(gòu)建，最終獲得油菜素內(nèi)酯基因根系特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種植物根系表達(dá)載體 pCAMBIA2301-TobRB7-rbc，以 pCAMBIA2301-35S_rbc 載體為骨架，在EcoR I和Sac I酶切位點(diǎn) 克隆入煙草TobRB7的啟動(dòng)子片段。上述的植物根系表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc的構(gòu)建方法，)以煙草DNA為模板，以 TobRB7-Fl :5’ -GGAATTCGGCATACTTTTAGAATGCGT-3’ (SEQ ID NO.1)和 TobRB7_Rl 5’ -CGAGCTCTTCTCACTAGAAAAATGCCC-3’ (SEQ ID NO. 2)為引物，通過(guò) PCR 擴(kuò)增 TobRB7 的啟動(dòng)子區(qū)域，用EcoR I和Sac I對(duì)PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-35S_rbc載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用 T41igase 連接成 pCAMBIA2301-TobRB7_rbc。一種植物根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl，是以所述pCAMBIA2301-TobRB7-rbc載體為骨架，在Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)克隆入擬南芥BASl基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)片段。上述植物根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的構(gòu)建方法，是將油菜素內(nèi)酯基因BASl整合到權(quán)利要求1的根系表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc上，獲得油菜素內(nèi)酯基因BASl的根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl。具體是以擬南芥RNA為模板，以 BASl-Fl :5’-TGCTCTAGAAAGAAACCAAACTCGC AAAG-3’ (SEQ ID NO. 3)；BAS1-R1 5’ -CGGGGTACCTTCCAAGTCCGGAACAAA-3’ (SEQ IDN0. 4)為引物，擴(kuò)增包括 BASl 編碼區(qū)的全長(zhǎng)片段，用Xba I和Kpn I對(duì)PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-TobRB7_rbc載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用T41igase 連接成 pCAMBIA2301-TobRB7_BASl。上述植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl用于煙草的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，獲得油菜素內(nèi)酯失活基因根系特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還公開(kāi)了種油菜素內(nèi)酯失活基因根系特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草，是用植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草而獲得。本發(fā)明克隆了煙草根系啟動(dòng)子TobRB7，構(gòu)建了根系特異表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc，再將油菜素內(nèi)酯失活基因BASl整合到上述根系特異表達(dá)載體上，獲得重組載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl，再將該重組載體轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草。該根系重組表達(dá)載體可以使油菜素內(nèi)酯基因在根系定向表達(dá)，同時(shí)為植物根系改良提供可能途徑。
圖1 是植物表達(dá)載體 pCAMBIA2301-TobRB7-rbc 的酶切結(jié)果 M DL2000DNAmarker, 1、2、3 均為構(gòu)建的 pCAMBIA2301-TobRB7_rbc 載體。圖2是油菜素內(nèi)酯失活基因BASl PCR擴(kuò)增結(jié)果M DL2000DNA marker。圖3是油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的構(gòu)建步驟。圖4是油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的物理圖譜。圖5 是載體 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl 的酶切結(jié)果 M 為 DL2000，1、2、3 均為構(gòu)建的 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl 載體。圖6是轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)M DL2000DNA marker ;1_10為轉(zhuǎn)基因植株?！?+ ”為pCAMBIA2301-TobRB7-BASl 質(zhì)粒，為陰性對(duì)照。圖7是轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀況I為過(guò)量表達(dá)BASl基因的轉(zhuǎn)基因煙草，2為根系表達(dá)BASl基因的轉(zhuǎn)基因煙草。圖8是轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR分析CK為非轉(zhuǎn)基因植株，I為過(guò)量表達(dá)BASl基因的轉(zhuǎn)基因煙草，2為根系表達(dá)BASl基因的轉(zhuǎn)基因煙草。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中，PTG19-T載體購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司；質(zhì)粒pCAMBIA2301-35s-rbc (鄭卿，抗I型糖尿病基因轉(zhuǎn)化煙草、番茄的研究[D]，揚(yáng)州大學(xué)碩士 研究生畢業(yè)論文，2010)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。1、煙草TobRB7啟動(dòng)子序列的獲得以煙草為實(shí)驗(yàn)材料，提取其基因組DNA并以其為模板，從公布的煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中TobRB7基因(GenBank登錄號(hào)S45406)啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增TobRB7啟動(dòng)子序列。在引物兩端分別引入EcoR I和Sac I酶切位點(diǎn)，引物序列如下TobRB7-Fl :5’ -GGAATTCGGCATACTTTTAGAATGCGT-3'，引入 EcoR I 酶切位點(diǎn)；TobRB7_Rl 5’ -CGAGCTCTTCTCACTAGAAAA ATGCCC-3’，引入 Sac I 酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min;94°C變性 40s，56°C復(fù)性 40s，72°C延伸 lmin，共 35 個(gè)循環(huán)；再 72°C延伸 IOmin0對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的條帶純化回收，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PTG19-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取在Amp抗性平板上長(zhǎng)出的單克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定并進(jìn)行測(cè)序，將TobRB7啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒命名為p-TobRB7。通過(guò)核苷酸測(cè)序后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的啟動(dòng)子片段全長(zhǎng)為892bp，用BLAST程序進(jìn)行核苷酸同源性檢索，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)獲得的啟動(dòng)子片段與已知的TobRB7 (S45406)啟動(dòng)子部分區(qū)域序列基本一致，可用于以后研究。2、攜帶TobRB7啟動(dòng)子的植物根系特異表達(dá)載體的構(gòu)建將質(zhì)粒p-TobRB7 和質(zhì)粒 pCAMBIA2301-35s_rbc 在 37 °C 條件下分別用 EcoR1、Sac I雙酶切3h，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收892bp的TobRB7的啟動(dòng)子序列和12kb的質(zhì)粒pCAMBIA2301-35s-rbc酶切后的大片段，用T4DNA連接酶4°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取在卡那霉素(Kan)抗性平板上長(zhǎng)出的單克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。將獲得的重組表達(dá)載體命名為pCAMBIA2301-TobRB7-rbc。圖1 為 pCAMBIA2301-TobRB7_rbc 酶切結(jié)果，說(shuō)明 TobRB7 已成功構(gòu)建到pCAMBIA2301-35s-rbc質(zhì)粒上。3、油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的克隆以野生型擬南芥植株為實(shí)驗(yàn)材料，提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板。根據(jù)已報(bào)道擬南芥BASl基因(GenBank No. NM_128228. 3)mRNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增BASl編碼區(qū)的全長(zhǎng)片段。在引物兩端分別引入Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)，引物序列如下BASl-Fl :5’ -TGCTCTAGAAAGAAACCAAACTCGCAAAG-3，，引入 Xba I 酶切位點(diǎn)；BAS1_R1 :5’ -CGGGGTACCTTCCAAGTCCGGAACAAA-3’，引入Kpn I酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s，52°C復(fù)性 40s，72°C延伸 2min，共 35 個(gè)循環(huán)；再 72°C延伸 IOmin0對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)，切下目的條帶純化回收，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PTG19-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取在Amp抗性平板上長(zhǎng)出的單克隆，提取質(zhì)粒、酶切鑒定并進(jìn)行測(cè)序，將BASl基因的質(zhì)粒命名為p-BASl。通過(guò)核苷酸測(cè)序后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的序列全長(zhǎng)為1770bp，用BLAST程序進(jìn)行核苷酸同源性檢索，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)獲得的基因片段與已知的BASl (NM_128228. 3)基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)核苷酸序列一致性為99. 94%，氨基酸序列一致性為99. 81%?？捎糜谝院笱芯?。4、油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達(dá)載體的構(gòu)建將質(zhì)粒p-BASl 和質(zhì)粒 pCAMBIA2301-TobRB7-rbc 在 37 °C 條件下分別用 Kpn1、Xba I雙酶切3h，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收1770bp的BASl基因序列和12kb的質(zhì)粒pCAMBIA2301-TobRB7-rbc酶切后的大片段，用T4DNA連接酶4°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取在Kan抗性平板上長(zhǎng)出的單克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。將獲得的油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達(dá)載體命名為 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl。 圖3為油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7_BASl的構(gòu)建步驟。圖4為油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的物理圖譜。圖5為載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的酶切結(jié)果，說(shuō)明油菜素內(nèi)酯失活基因BASl的根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl構(gòu)建成功。5、TobRB7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BASl基因在煙草根中特異表達(dá)(I)重組表達(dá)載體 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl 轉(zhuǎn)化煙草將4中構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取在Rif和Kan抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行PCR鑒定。將含有重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的農(nóng)桿菌采用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法(王關(guān)林和方宏筠.植物基因工程[M]. 1998)轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)當(dāng)代轉(zhuǎn)基因植株(T0代)進(jìn)行PCR檢測(cè)。收獲后對(duì)Tl代種子在含有Kan的MS培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性苗，并進(jìn)行RT-PCR分析。(2)轉(zhuǎn)基因煙草的檢測(cè)以TO代轉(zhuǎn)基因植株總DNA為模板，以質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)化植株的總DNA為陰性對(duì)照，用 BASl 基因引物(BAS1-F2 :5’ -AAGAAACCAAACTCGCAAAG-3’ (SEQ ID NO. 5)和BAS1-R2 :5’ -TTCCAAGTCCGGAACAAA-3’ (SEQIDN0. 6))進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出約1770bp的目的片段，而陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增帶(圖6)。證明油菜素內(nèi)酯基因BASl已整合到煙草基因組中。圖7為轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)狀況，可以看出組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株出現(xiàn)矮化，但是根系特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)正常。提取Tl代煙草葉片、根的總RNA，以轉(zhuǎn)基因煙草植株cDNA為模板，以未轉(zhuǎn)化煙草植株的cDNA為陰性對(duì)照，進(jìn)行BASl基因的半定量表達(dá)分析。根據(jù)BASl基因的cDNA序列設(shè)計(jì)RT-PCR引物，引物為BAS1-F3 :5’ -ACGGTGAAGTTGAGGTAGA-3’ (SEQ ID NO. 7)和 BAS1-R3 :5’-AACATAAGGACGGTAGGTG-3’ (SEQ IDNO. 8)，以 actin 基因(GenBank No EU938079)為內(nèi)部參照基因(469bp)，引物為 actin-F:5' -CCTCTTAACCCGAAGGCTAA-3' (SEQ IDNO. 9), actin-R:5/ -GAAGGTTGGAAAAGGACTTC-3'(SEQ ID NO. 10)。BASl基因的半定量表達(dá)結(jié)果(圖8)進(jìn)一步證實(shí)，根系特異表達(dá)載體使BASl基因僅在根系特異表達(dá)，在葉中基本不表達(dá)。
SEQUENCE LISTING
<11D>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
<120>油菜素內(nèi)_失活基因BASl的根系重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用<130>
<160>10 <l/0>Patentln version 3.3
<210>I
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>I
ggaattcggc atacttttag aatgcgt27
<210>2
<211>27
<212>DNA<213>人工序列
<400>2
cgagctcttc tcactagaaa aatgccc27
<210>3
<211>29
<212>DNA<213>人1:序列
<400>3
tgctctagaa agaaaccaaa ctcgcaaag29
<210>4
<211>27
<212>DNA<213>人工序列
權(quán)利要求
1.一種植物根系表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc，其特征在于， pCAMBIA2301-35S-rbc載體為骨架，在EcoR I和Sac I酶切位點(diǎn)克隆入煙草TobRB7的啟動(dòng)子片段。
2.權(quán)利要求1所述的植物根系表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc的構(gòu)建方法，其特征在于以煙草 DNA 為模板，以 TobRB7-Fl :5’ -GGAATTCGGCATACTTTTAGAATGCGT-3’ 和 TobRB7-Rl :5’-CGAGCTCTTCTCACTAGAAAAATGCCC-3’ 為引物，通過(guò) PCR 擴(kuò)增 TobRB7 的啟動(dòng)子區(qū)域，用EcoR I和Sac I對(duì)PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-35S_rbc載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用T4 Iigase 連接成 pCAMBIA2301-TobRB7_rbc。
3.一種植物根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl，其特征在于，以權(quán)利要求1 所述pCAMBIA2301-TobRB7-rbc載體為骨架，在Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)克隆入擬南芥BASl 基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)片段。
4.一種植物根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl的構(gòu)建方法，其特征在于， 將油菜素內(nèi)酯基因BASl整合到權(quán)利要求1的根系表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc上， 獲得油菜素內(nèi)酯基因BASl的根系重組表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于以擬南芥RNA為模板，以BASl-Fl 5，-TGCTCTAGAAAGAAACCAAACTCGCAA AG-3，；BAS1-R1 :5，-CGGGGTACCTTCCAAGTCC GGAACAAA-3’為引物，擴(kuò)增包括BASl編碼區(qū)的全長(zhǎng)片段，用Xba I和Kpn I對(duì) PCR產(chǎn)物和pCAMBIA2301-TobRB7-rbc載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，用T4 Iigase連接成 pCAMBIA2301-TobRB7-BASl。
6.一種油菜素內(nèi)酯失活基因根系特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草，其特征在于，是用植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-BASl通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草而獲得。
全文摘要
本發(fā)明提供了油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1的根系重組表達(dá)載體的構(gòu)建。本發(fā)明克隆了煙草根系啟動(dòng)子TobRB7，構(gòu)建了根系特異表達(dá)載體pCAMBIA2301-TobRB7-rbc，再將油菜素內(nèi)酯失活基因BAS1整合到上述根系特異表達(dá)載體上，獲得重組載體pCAMBIA2301-TobRB7-BAS1，再將該重組載體轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草。該根系重組表達(dá)載體可以使油菜素內(nèi)酯基因在根系定向表達(dá)，同時(shí)為植物根系改良提供可能途徑。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103014061SQ201310015909
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者束紅梅, 倪萬(wàn)潮, 郭書(shū)巧, 鞏元勇, 沈新蓮, 張香桂, 徐鵬 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院