含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA其制備方法及用途

含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA其制備方法及用途
【專利摘要】本發明公開了含自由三磷酸基團的谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS）特異性siRNA（ppp-GLS）、制備方法及其應用。ppp-GLS的反義鏈和正義鏈序列5’端均為鳥嘌呤核苷，該鳥嘌呤核苷的戊糖5’位點上修飾有一個自由三磷酸基團。本發明ppp-GLS可在制備治療腫瘤特別是神經膠質瘤、胰腺癌、肺癌、肝癌的藥物中應用。
【專利說明】含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA其制備方法及用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于RNA干擾技術治療領域，涉及siRNA及其制備方法和應用，具體涉及含自由三磷酸基團的特異性siRNA靶向腫瘤代謝關鍵酶GLS，及其制備方法和在腫瘤治療中的應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤細胞不受限制的生長增殖依賴于其快速的能量供應和胞內氧化還原平衡系統，有氧糖酵解(Glycolysis,也稱Warburg effect)和谷氨酰胺酵解(Glutaminolysis)是腫瘤細胞滿足上述要求的兩個關鍵步驟。通過有氧糖酵解途徑，腫瘤細胞將大部分的葡萄糖(Glucose)催化水解產生乳酸，快速產生ATP等高能分子；同時由于進入三羧酸循環(TCAcycle)的丙酮酸減少(Matthew G et al.Science.2009),腫瘤細胞通過高表達谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)來催化谷氨酰胺產生谷氨酸,谷氨酸進一步水解產生a_酮戍二酸進入三羧酸循環，以補充因有氧糖酵解而減少的TCA循環生物總量，并且通過這個替代途徑為腫瘤細胞快速的分裂增殖補充能量、碳骨架、核酸和脂質合成的中間產物等。此外，谷氨酰胺酵解還提供細胞抗氧化系統中最為關鍵的分子一谷胱甘肽(Glutathione，GSH),能夠有效清除腫瘤細胞旺盛代謝所產生的氧自由基等活性氧(R0S)，維持細胞內的氧化還原平衡(Erickson Jff and Cerione RA.0ncotarget.2010)。綜上，谷氨酰胺酵解途徑對于腫瘤細胞的生長增殖至關重要，因而使GLS成為一個抗腫瘤的潛在靶點。
[0003]科學家已經發現一些GLS的化學抑制劑，但治療效果均不甚理想，可能與腫瘤細胞產生的耐藥性、藥物靶向特異性不足及毒副作用有關。小干擾RNA技術直接沉默目的基因是目前最有效而且最特異的手段。這種含21-23個堿基對的特異雙鏈RNA序列，其反義鏈能靶向識別這些分子相應的信使RNA (mRNA),并在相關酶的協同作用下，剪切mRNA從而干預目的蛋白的合成。但在抗腫瘤領域，小干擾RNA的靶向的特異性決定了其作用機制的單一性，從而使其抗腫瘤治療效果并不理`想。

【發明內容】

[0004]發明人通過大量實驗設計并篩選出多條具有良好基因沉默功能的人GLS特異性siRNA，通過設計5’ 一 3’端依次含有GLS特異性siRNA的cDNA序列、胞嘧啶核苷及T7RNA聚合酶啟動子序列的DNA模板，在體外利用T7RNA聚合酶轉錄合成得到含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA (以下簡稱ppp-GLS)，其特征為5’端為一鳥嘌呤核苷，在該鳥嘌呤核苷的戊糖5’位點上修飾有一個自由三磷酸基團。
[0005]該ppp-GLS的顯著性效果表現為:
(I)本發明ppp-GLS能有效地特異性沉默腫瘤代謝關鍵酶一谷氨酰胺酶(GLS)蛋白的表達，抑制腫瘤細胞的代謝過程，顯著降低腫瘤細胞內ATP水平，從而有效地抑制腫瘤細胞生長增殖。
[0006](2)本發明ppp-GLS，一方面由于含自由三磷酸基團的siRNA能夠上調胞內ROS的產生；另一方面，通過沉默GLS顯著性地抑制胞內關鍵的抗氧化分子谷胱甘肽，破壞腫瘤細胞對ROS的清除作用，從而能夠協同作用，使腫瘤細胞內的ROS大量累積，誘發腫瘤細胞死亡。
[0007](3)本發明ppp-GLS為5’端含自由三磷酸基團的siRNA，是胞漿內視磺酸誘導基因-1 (RIG-1)的特異性配體，能激活固有免疫信號通路，并分泌多種細胞因子，活化機體免疫系統對腫瘤細胞的殺傷作用；同時能夠大幅度上調腫瘤細胞表面I類抗原遞呈分子的表達，阻斷腫瘤免疫逃逸。
[0008](4)本發明ppp-GLS能激活腫瘤細胞內源性凋亡通路，大幅度上調Noxa、Caspase，PARP等前凋亡蛋白和凋亡蛋白的表達，誘導腫瘤細胞的程序性死亡。
[0009]本發明的特色是將上述4種獨特的抗腫瘤功能融合于一個分子。對比于傳統的小干擾RNA (OH-RNA, 一種直接體外化學合成的siRNA，其5’端核苷C-5上僅含有一個自由羥基，而不含有磷酸分子)、非特異性的含自由三磷酸基團的siRNA (簡稱ppp-RNA)和其它靶向GLS的化學藥物有著更加顯著的優勢:更有效地促進了腫瘤細胞的死亡和抑制腫瘤生長；該藥物并不存在腫瘤細胞產生耐藥性的問題(如對化療藥物的耐藥)；更重要的是，該藥物對正常細胞并無毒性作用。
[0010]所述的GLS特異性SiRNA序列分別為ppp-GLSl，其正義鏈序列如SEQ ID N0.1所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.2所示；或ppp-GLS2,其正義鏈序列如SEQ ID N0.3所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.4所示；或ppp-GLS3,其正義鏈序列如SEQ ID N0.5所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.6所示；或ppp-GLS4，其正義鏈序列如SEQ ID N0.7所示，反義鏈序列如SEQID N0.8所不。序列詳細喊基對見序列表。
[0011]本發明的另一目的是提供該siRNA的用途:
本發明所述的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
[0012]本發明所述的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA在制備治療神經膠質瘤的藥物中的用途。
[0013]本發明所述的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA在制備治療胰腺癌的藥物中的用途。
[0014]本發明所述的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA在制備治療肺癌的藥物中的用途。
[0015]本發明所述的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA在制備治療肝癌的藥物中的用途。
[0016]本發明還提供了治療腫瘤的藥物組合物，其包含本發明所述的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA。
[0017]本發明還提供了含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA的設計篩選、模板合成、體外轉錄和提純檢測的方案，其包括如下步驟:
步驟一、siRNA的設計與篩選:根據PUBMED基因庫中，人GLS mRNA完整編碼序列，使用siRNA設計軟件設計篩選出數條相應匹配的反義短序列，各含19對核糖核苷。在體外合成相應的siRNA (Invitrogen, China),并于每條單鏈3’端鏈接2個游離尿喃唳核苷,用作體外篩選及抑瘤實驗的OH-GLS組。[0018]將合成的siRNA序列(0H-GLS)，在體外用脂質體(Lipofectamine 2000)按0.5微克/微升在OptiMEM培養基中混合包被，體外轉染腫瘤細胞24h之后提取細胞總RNA，用定量RT-PCR方法檢測GLS的mRNA量，依據GLS的抑制效果而選擇抑制效果最佳的siRNA，從而得到四條 GLS 特異性 siRNA，分別為 OH-GLS1、0H-GLS2、0H-GLS3、0H-GLS4。
[0019]步驟二、模板合成:依據步驟一中篩選出siRNA的cDNA序列，在其3’端依次鏈接一個胞嘧啶核苷和一段T7RNA聚合酶啟動子序列，作為DNA模板，交公司合成，并且在體外合成識別T7RNA聚合酶啟動子序列的引物。具體方法:PCR無酶反應微管中，加入10微升雜交緩沖液、2微升引物、2微升相應的DNA模板，于70°C孵育5分鐘，再于25°C孵育約25分鐘。在上述PCR反應管中，加入5微升不含RNA酶的純水、2微升Klenow緩沖液、2微升dNTP混合液(2.5mM)和I微升Exo-Minus Klenow DNA多聚酶(20單位/微升,Fermentas),置于370C孵育30分鐘，以合成雙鏈DNA。PCR反應管再于70°C孵育5分鐘，以滅活剩余Exo-MinusKlenow DNA 多聚酶。
[0020]步驟三、體外轉錄:利用T7RNA聚合酶啟動體外轉錄并在新合成的RNA5’端加上三磷酸基團。在滅菌PCR反應管中，加入6微升不含RNA酶的無菌純水、2微升10xT7Running buffer,8微升NTP混合物、2微升雙鏈DNA模板和2微升T7RNA聚合酶(Megashortskript?T7 kit, Ambion),在 37°C過夜,合成 5’端含三憐酸基團 GLS siRNA 的正義鏈或反義鏈。再將合成的正義鏈和反義鏈混合，置于37°C過夜，雜交形成穩定雙鏈，即為ppp-GLS。在步驟一中篩選出的四條不同序列對應的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA 分別為 ppp-GLS 1、ppp-GLS2、ppp_GLS3、ppp_GLS4。
[0021]步驟四、提純檢測:利用氯仿、異戊醇、苯酚等萃取，最后過柱、離心提純，檢測RNA純度和濃度。在步驟三合成產物中，加入2微升Turbo-DNA酶并孵育30分鐘去除殘存的DNA鏈，再加入30微升乙酸銨滅活DNA酶，將合成產物轉移到1.5毫升反應管，加入115微升不含RNA酶的純水，再加入30`0微升異戊醇:酚:氯仿混合物混合均勻，于12000g室溫下離心5分鐘，將上層苯酚(相)吸出，轉移到新的1.5毫升EP管中，再加入300微升氯仿，混合均勻后，于12000g室溫下離心5分鐘，吸出上層苯酚(相)，轉移至新的EP管。向苯酚/RNA混合液中加入600微升100無水乙醇，吹打均勻，將混合物置于_20°C過夜，使RNA沉淀析出，再于14000g 4°C離心30分鐘，取出EP管立即置于冰上，棄去上清液，將所得的RNA沉淀溶于50微升不含RNA酶的純水中。進一步可以將RNA加入到Mini Quick Spin Columns(Roche)過柱，離心進行提純，最后進行RNA定量及純度測定。
[0022]本發明綜合了抗腫瘤代謝，激活抗腫瘤免疫，誘導腫瘤細胞氧化損傷，活化腫瘤細胞程序性死亡通路等多種機制，有效地解決了傳統siRNA僅有單一基因沉默功能，而治療腫瘤療效不佳的問題，并且繞過了化療藥物容易使腫瘤細胞產生耐藥性的問題，同時具有良好的安全性。本發明ppp-GLS siRNA及其應用有著預料不到的技術效果，具有突出的實質性特點，而且PPP-GLS siRNA用于腫瘤治療相比于傳統方法有著顯著性的進步，證實本發明在腫瘤的生物治療領域具有極大的進步意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為實施例2實時定量PCR技術檢測ppp-GLS的基因沉默功能:ppp-GLS轉染多種腫瘤細胞株24h，檢測不同序列的基因沉默功能。圖1A、B、C、D分別代表U251 (人膠質細胞瘤)、A549 (人非小細胞肺癌)、patu-8988t (人胰腺癌)、H印G2 (人肝癌)細胞株。GLSl、GLS2、GLS3、GLS4分別代表篩選出的四對不同的GLS siRNA序列，下圖同。
[0024]圖2為實施例3實時定量PCR技術檢測ppp-GLS的免疫誘導功能:ppp-GLS轉染多種腫瘤細胞株24h，檢測不同序列合成的ppp-GLS顯著上調I型干擾素(IFN-β )的功能。圖2A、B、C、D分別代表U251 (人膠質細胞瘤)、A549 (人非小細胞肺癌)、patu_8988t (人胰腺癌)、HepG2 (人肝癌)細胞株。
[0025]圖3為實施例3實時定量PCR技術檢測ppp-GLS的免疫誘導功能:ppp-GLS轉染多種腫瘤細胞株24 h，檢測不同序列合成的ppp-GLS的可以顯著上調趨化因子CXCLlO(IP-10)的功能。圖3A、B、C、D分別代表U251 (人膠質細胞瘤)、A549 (人非小細胞肺癌)、patu_8988t (人膜腺癌)、HepG2 (人肝癌)細胞株。 [0026]圖4為實施例4流式細胞術(FACS)檢測ppp-GLS活化抗腫瘤免疫的功能:ppp-GLS轉染多種腫瘤細胞株24 h，檢測不同序列合成的ppp-GLS的誘導I型抗原呈遞分子HLA-ABC高表達的功能，其中Isotype為同型對照抗體。
[0027]圖5為實施例5檢測ppp-GLS促進腫瘤細胞死亡的功能:ppp-GLS轉染多種腫瘤細胞株48小時，檢測不同序列合成的ppp-GLS大量促進細胞死亡。
[0028]圖6為實施例6檢測ppp-GLS誘導細胞凋亡的功能:ppp-GLS轉染腫瘤細胞株U251、patu-8988t 48 h, Annexin V/PI檢測ppp-GLS誘導的細胞凋亡率。圖6A、B分別為
三次試驗統計結果。
[0029]圖7為實施例7檢測ppp-GLS抑制腫瘤細胞能量代謝的功能:ppp-GLS轉染多種腫瘤細胞株48 h，檢測不同序列合成的ppp-GLS顯著性抑制腫瘤細胞能量代謝的功能。圖7A、B、C、D 分別為 U251、patu-8988t、A549、！fepG2 細胞。
[0030]圖8為實施例8檢測ppp-GLS對腫瘤細胞內ROS水平的影響:分別用OH-control，ppp-control, OH-GLS和ppp-GLS轉染多種腫瘤細胞株48 h,檢測ppp-RNA上調細胞ROS的作用，檢測不同序列合成的ppp-GLS顯著性增加腫瘤細胞內ROS的水平。圖8A、B、C、D分別為U251、patu-8988t、A549、H印G2細胞。同時驗證了 ppp-GLS對關鍵抗氧化分子GSH的抑制作用。圖8E、8F分別為U251、patu-8988t細胞。
[0031]圖9為實施例9在蛋白水平上，用免疫印跡檢測ppp-GLS的基因沉默，激活抗腫瘤免疫，誘導細胞死亡，抑制腫瘤代謝的功能ΦΡΡ-GLS轉染腫瘤細胞株U251、patu-8988t48 h。圖9A是基因沉默功能檢測，圖9B是誘導細胞凋亡功能檢測，圖9C是活化免疫分子檢測，圖9D是抑制腫瘤代謝檢測。
[0032]圖10為實施例10檢測ppp-GLS對于正常細胞的安全性:ppp-GLS轉染正常細胞人臍靜脈內皮細胞HUVEC，檢測細胞活率，判斷ppp-GLS對正常細胞安全性。
【具體實施方式】
[0033]實施例1本發明ppp-GLS siRNA的合成 1.1 GLS特異小干擾RNA的設計和篩選:
根據PUBMED基因庫中，人GLS mRNA完整編碼序列，使用siRNA設計軟件設計篩選出數條相應匹配的反義短序列，各含19對核糖核苷。在體外合成相應的siRNA (Invitrogen,China),并于每條單鏈3’端鏈接2個游離尿嘧啶核苷，用作體外篩選和抑瘤實驗的OH-GLS組。
[0034]將合成的siRNA序列(0H-GLS)，在體外用脂質體(Lipofectamine 2000)按0.5微克/微升在OptiMEM培養基中混合包被，體外轉染神經膠質瘤細胞24h之后提取細胞RNA,用定量RT-PCR方法檢測GLS的mRNA表達量，最后選擇抑制效果最佳的siRNA，從而得到四條GLS特異性siRNA，其序列分別表示為GLS1、GLS2、GLS3、GLS4，普通siRNA分別為 0H-GLS1、0H-GLS2、0H-GLS3、0H-GLS4，其含自由三磷酸基團的 siRNA 分別為 ppp-GLSl、ppp_GLS2、ppp_GLS3、ppp_GLS4。
[0035]同時，設計并合成一對無意義siRNA,含自由三磷酸基團的siRNA為ppp-control,其正義鏈序列為SEQ ID N0.9,反義鏈序列為SEQ ID N0.10,該序列通過與PUBMED基因庫中相關mRNA進行匹配分析，證實無任何干擾作用。合成時為增強其穩定性，于每條單鏈3’端鏈接2個游離尿嘧啶核苷。該3’端鏈接2個UU的無意義siRNA，在考察抑瘤效果時作為OH-RNA對照。
[0036]合成ppp-GLS的DNA模板設計:
根據1.1篩選得到的序列，在相應的正義鏈或反義鏈的cDNA序列的3’端依次鏈接一個胞嘧啶核苷和一段T7RNA聚合酶啟動子序列，作為編碼相應的ppp-GLS正義鏈或反義鏈的DNA模板,送交基因公司(Invitrogen, China)合成,序列見表1。其中胞嘧唳的加入是為了增強轉錄效率，T7RNA聚合酶啟動子序列的加入是使T7RNA聚合酶能特異識別并啟動從5’端向3’端的轉錄，從而得到在5’端核糖核苷的戊糖5’位點上修飾有一自由三磷酸基團轉錄的產物，即ppp-GLS。
[0037]表1.合成ppp-GLS的DNA模板
類別I序列.含自由三磷酸基團的人GLS特異性SiRNA正義鏈DNA模板ISEQIDN0.11
含自由三磷酸基團的人GLS特異性`siRNA反義鏈DNA模板ISEQIDN0.12
含自由三磷酸基團的人GLS特異性siRNA正義鏈DNA模板2SEQIDN0.13
含自由三磷酸基團的人GLS特異性siRNA反義鏈DNA模板2SEQIDN0.14
含自由三磷酸基團的人GLS特異性siRNA正義鏈DNA模板3SEQIDN0.15
含自由三磷酸基團的人GLS特異性siRNA反義鏈DNA模板3SEQIDN0.16
含自由三磷酸基團的人GLS特異性siRNA正義鏈DNA模板4SEQIDN0.17
含自由三磷酸基團的人GLS特異性siRNA反義鏈DNA模板4SEQIDN0.18
無意義siRNA正義鏈DNA模板SEQIDN0.19
無意義siRNA反義鏈DNA模板Iseqidn0.20
1.3DNA模板雙鏈的合成:
A.弓丨物與模板鏈雜交:體外合成識別T7RNA聚合酶啟動子序列的引物。于PCR反應微管中，加入10微升雜交緩沖液、2微升引物、2微升相應的DNA模板，于70°C孵育5分鐘，再于25 °C孵育約25分鐘。
[0038]B.在上述PCR反應管中，加入5微升不含RNA酶的純水、2微升Klenow緩沖液、2微升dNTP混合液(2.5mM)和I微升Exo-Minus Klenow DNA多聚酶(20單位/微升，Fermentas)，置于37°C孵育30分鐘，以合成雙鏈DNA。PCR反應管再于70°C孵育5分鐘，以滅活剩余Exo-Minus Klenow DNA多聚酶。
[0039]體外轉錄:
含自由三磷酸基團siRNA合成的原理:T7RNA聚合酶能特異識別DNA模板鏈上的T7RNA聚合酶啟動子序列，并啟動從5’端向3’端(即從T7RNA聚合酶啟動子端向另一端)的轉錄，并在RNA的轉錄過程中，于新合成的RNA序列5’端的首個核糖核苷戍糖5’位點上,修飾一個不被其它分子包被的自由三磷酸基團。
[0040]合成過程與反應體系:在滅菌PCR反應管中，加入6微升不含RNA酶的無菌純水、2微升10xT7 Running緩沖液、8微升NTP混合物、2微升雙鏈DNA模板和2微升T7RNA聚合酶(Megashortskript?T7 kit, Ambion),在 37°C過夜,合成 5’端含三憐酸基團 GLS siRNA的正義鏈或反義鏈。再將合成的正義鏈和反義鏈混合，置于37°C過夜，雜交形成穩定雙鏈，即為ppp-GLS。四條不同的序列對應的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA分別為ppp-GLS 1、ppp-GLS2、ppp-GLS3、ppp-GLS4。利用上述方法,轉錄合成5’端含自由三磷酸基團的無意義siRNA,即為ppp-control。
[0041]的提純:
在1.4合成產物中，加入2微升Turbo-DNA酶并孵育30分鐘去除殘存的DNA鏈，再加入30微升乙酸銨滅活DNA酶，將合成產物轉移到1.5毫升反應管，加入115微升不含RNA酶的純水，再加入300微升異戊醇:酚:氯仿混合物混合均勻，于12000g室溫下離心5分鐘，將上層苯酚(相)吸出，轉移到新的1.5毫升EP管中，再加入300微升氯仿，混合均勻后，于12000g室溫下離心5分鐘，吸出上層苯酚(相)，轉移至新的EP管。向苯酚/RNA混合液中加入600微升無水乙醇，吹打均勻，將混合物置于_20°C過夜，使RNA沉淀析出，再于14000g4°C離心30分鐘，取出EP管立即置于冰上，棄去上清液，將所得的RNA沉淀溶于50微升不含RNA酶純水中。進一步可以將RNA加入到Mini Quick Spin Columns (Roche)過柱,離心進行提純，最后進行RNA定量及純度測定。
[0042]實施例2實時定量PCR技術檢測ppp-GLS的基因沉默功能
人胰腺癌細胞株Patu-8988t，來自于德國微生物菌種保藏中心、人神經膠質細胞瘤U251，人非小細胞肺癌A549 ，人肝癌細胞H印G2，來自于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。以上腫瘤細胞株均用含有5% FBS (胎牛血清)和1%青霉素鏈霉素的DMEM培養基培養在37°C，5% CO2的細胞培養箱中。
[0043]轉染方案:腫瘤細胞按每孔2 X IO5個細胞均勻鋪種在6孔板中，過夜。用轉染試劑lipofectamine2000 (Invitrogen)按照操作手冊轉染。每孔用 lipofectamine2000 3 μ I包裹2 μ g siRNA,使siRNA的終濃度為I μ g/ml。轉染24 h之后用于RNA提取實驗。
[0044]RNA提取及qRT-PCR檢測:按照操作手冊使用Trizol (Invitrogen)提取細胞內總RNA，然后用TaKaRa RT-PCR Master Mix (DRR0036A)按照說明書方法逆轉錄成cDNA，最后實時定量PCR使用ABI7300 Real-time system和SYBR Green (Roche)檢測各個指標的相對表達量。引物由Invitrogen合成。qRT-PCR結果分析采用相對定量的方法分析。
[0045]結果顯示:ppp-GLS特異性siRNA體外轉染人類腫瘤細胞株patu_8988t，U251,A549, HepG2 24 h后，腫瘤細胞內GLS mRNA水平顯著降低(見圖1Α?))，并且所設計的4個GLS序列都有非常良好地基因沉默功能。
[0046]實施例3實時定量PCR技術檢測ppp-GLS的免疫誘導功能 細胞株，轉染方案，RNA提取和qRT-PCR方法均同實施例1。
[0047]結果顯示:ppp-GLS特異性siRNA體外轉染人類腫瘤細胞株patu_8988t，U251,A549, HepG2 24 h后，腫瘤細胞內I型干擾素(IFN-β )水平有非常顯著上升(見圖2A~D)，趨化因子CXCL10 (ΙΡ-10)也有非常顯著的上升(見圖3Α?))。并且所設計的4個不同GLS特異性序列合成的ppp-GLS siRNA都有非常良好地免疫誘導的功能。
[0048]實施例4流式細胞術(FACS)檢測ppp-GLS激活抗腫瘤免疫的功能
ppp-GLS處理24 h后的腫瘤細胞，轉染方案同實施例1，流式細胞術檢測腫瘤細胞表面的1-型抗原遞呈分子HLA-ABC的表達。流式細胞儀(BD FACSCalibur)使用FL-1通道檢測 HLA-ABC 的表達，抗體為 HLA-ABC-FITC (eBioscience)。
[0049]結果顯示:腫瘤細胞株轉染ppp-GLS 24 h之后，細胞表面1-型抗原遞呈分子表達均較OH-control及OH-GLS處理后有顯著增高。并且4條不同序列合成的ppp-GLS都有極強的上調1-型抗原遞呈分子的功能(見圖4)。
[0050]實施例5檢測ppp-GLS促進腫瘤細胞死亡的功能
ppp-GLS轉染不同的腫瘤細胞株48 h，轉染方案同實施例1，用臺盼藍染色計數的方法,計算ppp-GLS所誘導的腫瘤細胞死亡。
[0051]結果顯示:ppp_GLS轉染所誘導的細胞死亡率明顯高于ppp-control、OH-GLS>OH-control組,并且4條不同序列合成的ppp-GLS都具有非常優秀的促進腫瘤細胞死亡的功能(見圖5Α?))。表明我們設計的ppp-GLS有著比OH-GLS和ppp-control具有更顯著的腫瘤殺傷效應。
[0052]實施例6檢測ppp-GLS誘導細胞凋亡的功能
ppp-GLS轉染U251、patu-8988t腫瘤細胞48 h，轉染方案同實施例1，在流式細胞儀上用Annexin V/PI assay kit (Invitrogen)按照操作手冊檢測細胞凋亡率。
[0053]結果顯示:ppp-GLS轉染腫瘤細胞U251、patu_8988t 48 h后，細胞凋亡率明顯高于 OH-control, OH-GLS 和 ppp-control 組(見圖 6A/B)。
[0054]實施例7檢測ppp-GLS抑制腫瘤細胞能量代謝的功能
ppp-GLS轉染不同的腫瘤細胞株24 h，轉染方案同實施例1，用ATP檢測試劑盒(碧云天)按照操作手冊檢測細胞內ATP水平。
[0055]結果顯示:ppp-GLS轉染腫瘤細胞24 h之后，ppp-GLS處理的腫瘤細胞內ATP含量顯著低于OH-control, OH-GLS和ppp-control對照組，并且4條不同序列合成的ppp-GLS都具有非常優秀的降低腫瘤細胞內ATP含量的功能(見圖7k~C\
[0056] 實施例8檢測ppp-GLS抑制GSH并誘導腫瘤細胞內ROS大量積累
PPP-GLS轉染腫瘤細胞36 h之后，轉染方案同實施例1，用ROS檢測試劑盒(碧云天)按照操作手冊檢測細胞內ROS水平；用GSH/GSSG檢測試劑盒(碧云天)按照操作手冊檢測細胞內GSH/GSSG比率。
[0057]結果顯不:四種siRNA轉染36 h之后，ppp-control能夠顯著上調腫瘤細胞內R0S,但胞內ROS水平在ppp-GLS處理組較ppp-control顯著增加,其含量多少關系為，ppp-GLS>ppp-controI>0H-GLS>0H-controI,并且4條不同序列合成的ppp-GLS都具有非常優秀的誘導細胞內ROS水平的大幅上調的功能(見圖8Α?))。同時證實，GLS的抑制顯著降低細胞抗氧化關鍵分子GSH的胞內水平(圖8E和8F)。
[0058]實施例9在蛋白水平上用免疫印跡檢測ppp-GLS的基因沉默，激活抗腫瘤免疫，誘導細胞死亡，抑制腫瘤代謝的功能
腫瘤細胞patu-8988t和U251分別轉染ppp-GLS 48 h，轉染方案同實施例1，提取細胞總蛋白，檢測GLS, IPS-1 (IFN-β promoter stimulator I), RIG-1, caspase, P RAP,Noxa, p-AMPK等蛋白的表達。
[0059]結果顯示:在蛋白水平上，ppp-GLS明顯抑制GLS蛋白的表達(見圖9A);明顯上調腫瘤細胞內免疫信號通路分子RIG-1、IPS-1蛋白表達(見圖9B);顯著誘導線粒體凋亡途徑的caspase 3> caspase 9及Noxa蛋白的表達(見圖9C);同時顯著上調p-AMPK蛋白的表達(見圖9D)，表明腫瘤細胞能量代謝受到抑制。
[0060]實施例10檢測ppp-GLS對于正常細胞的毒性作用
人臍靜脈內皮細胞HUVEC，來自于ATCC。用含有5%FBS (胎牛血清)和1%青霉素鏈霉素的DMEM培養基培養在37°C，5%C02的細胞培養箱中。
[0061]臺盼藍計數和Annexin V/PI方法檢測ppp-GLS對于正常細胞的殺傷作用:方法同上述腫瘤細胞相同。
[0062]結果顯示:ppp-GLS處理人類正常細胞HUVEC48 h后并未對細胞的活性有影響，并且4條不同序列合成的ppp-GLS均未抑制細胞的生長增殖(見圖10A/B)。
參考文獻
1.Erickson JW and Cerione RA.Glutaminase: A hot spot for regulation ofcancer cell metabolism? Oncotarget.2010; I (8):734-740.2.Besch R et al.Proapoptotic signaling induced by RIG-1 and MDA—5 resultsin type I interferon -1ndependent apoptosis in human melanoma cells.J.Clin.1nvest.2009; 119(8):2399-2411.3.Wang JBj Erickson JW et al.Targeting mitochondrial Glutaminase activityinhibits oncogenic transformation.Cancer cell.2010; 18 (4):207-219.
【權利要求】
1.含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA，其特征在于該GLS特異性siRNA的反義鏈和正義鏈序列5’端均為鳥嘌呤核苷，該鳥嘌呤核苷的戊糖5’位點上修飾有一個自由三磷酸基團。
2.根據權利要求1所述的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA，其特征在于所述的GLS特異性siRNA序列選自:ppp-GLSl，其正義鏈序列如SEQ ID N0.1所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.2所示；ppp_GLS2，其正義鏈序列如SEQ ID N0.3所示，反義鏈序列如SEQ IDN0.4所示；ppp-GLS3，其正義鏈序列如SEQ ID N0.5所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.6所示;或PPP-GLS4,其正義鏈序列如SEQ ID N0.7所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.8所示。
3.權利要求1或2所述的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
4.權利要求3的用途，其中所述腫瘤選自胰腺癌、神經膠質細胞瘤、肺癌和肝癌。
5.治療腫瘤的藥物組合物，其包含權利要求1或2所述的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA。
6.權利要求5的藥物組合物，其用于治療選自胰腺癌、神經膠質細胞瘤、肺癌和肝癌的腫瘤。
7.含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA的制備方法，其包括以下步驟: (1)、siRNA的設計與篩選:依據GLS基因編碼序列，設計多條與之匹配的反義序列，合成后轉染細胞檢測 ，根據GLS的抑制效果篩選序列； (2)、模板合成:根據步驟(1)中篩選出siRNA的cDNA序列，在其3’端依次鏈接一個胞嘧啶核苷和一段T7RNA聚合酶啟動子序列，作為DNA模板，合成；利用DNA多聚酶合成模板雙鏈； (3)、體外轉錄:利用T7RNA聚合酶啟動體外轉錄并在新合成的RNA5’端加上三磷酸基團；將合成的正義鏈和反義鏈混合，置于37°C過夜,雜交形成穩定雙鏈； (4)、提純檢測:提取、純化步驟(3)獲得的RNA穩定雙鏈。
8.權利要求7的制備方法，其中步驟(2)中得到的DNA模板序列選自:ppp-GLSlDNA模板，其正義鏈序列如SEQ ID N0.11所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.12所示；ppp_GLS2 DNA模板，其正義鏈序列如SEQ ID N0.13所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.14所示；ppp_GLS3DNA模板，其正義鏈序列如SEQ ID N0.15所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.16所示；或ppp-GLS4 DNA模板，其正義鏈序列如SEQ ID N0.17所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.18所/Jn ο
9.權利要求7或8的制備方法，其中通過所述方法獲得的含自由三磷酸基團的GLS特異性siRNA序列選自:ppp-GLSl，其正義鏈序列如SEQ ID N0.1所示，反義鏈序列如SEQ IDN0.2所示；ppp-GLS2，其正義鏈序列如SEQ ID N0.3所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.4所示；ppp-GLS3,其正義鏈序列如SEQ ID N0.5所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.6所示；或PPP-GLS4，其正義鏈序列如SEQ ID N0.7所示，反義鏈序列如SEQ ID N0.8所示。
【文檔編號】C12N15/113GK103667287SQ201310012555
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年1月14日 優先權日:2013年1月14日
【發明者】魏繼武, 孟剛, 楊婷 申請人:南京大學