專利名稱：適于大規模生產流感疫苗的無血清培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及現代生物技術之培養基研發技術領域，具體地說，是一種適于動物細胞大規模微載體懸浮培養以及病毒擴增生產疫苗(大規模生產流感疫苗)的無血清培養基。
背景技術：
世界衛生組織(WHO)的數據顯示全世界每年約有5 15%的人感染季節性流感，其中會有300 500萬個嚴重病例，有高達25 50萬人死亡。流感給人類造成的損失不僅僅是超額的死亡率，更涉及到各種形式的直接或間接的經濟損失；其中，直接的經濟損失包括醫院成本、醫藥消費增加以及企業因工作缺勤率而導致效率低下等；有人在1999年就統計過，流感每年給美國造成的直接經濟損失高達1000億美元。而間接損失包括直接經濟損失的放大效應及流感引起的基本經濟行為、投資行為和消費行為的變化等等，這些損失是無法估量的。目前公認的預防流感 的最佳方法是接種流感疫苗。對大多數國家和地區而言，安全有效的滅活疫苗一直是預防流感的基礎。在發達國家，若能保證疫苗的抗原性與流感易發季節有較高的匹配度，便可保護70% 80%的健康成人免于出現流感臨床癥狀。對于未居住在養老院、護理機構的老人，在流感易發季節接種疫苗后不僅可減少25% 39%的住院人數，而且可使總死亡率降低39% 75%。因此，流感疫苗已成為當今受人重視的、銷售額最大的疫苗品種之一。有研究表明，流感疫苗是過去10年中疫苗市場增長的主要推動者，也是未來10年疫苗市場增長的主要品種之一。目前就世界范圍而言，流感疫苗的接種率還比較低，但是，隨著各國生活水平的提高，流感疫苗的接種率會持續增長，對流感疫苗的需求將持續擴大。目前，流感疫苗的制備多采用傳統的雞胚培養工藝。但是，該工藝是一種勞動密集型工藝，存在諸多缺陷，例如第一，對雞胚的要求嚴格，必須是SPF (Specific PathogenFree無特定病原)級潔凈雞胚。因此，準備合格雞胚所需要的周期長，對流感大流行的應急能力差。第二，所飼養的種雞個體的差異可能導致雞胚存在差異，使得各批次疫苗間的質量均一性差。第三，疫苗的生產過程時間長、易污染。此外，雞胚生產的疫苗還可能導致對雞蛋過敏的人群發生嚴重的超敏反應。因此，克服現有技術的不足，研究基于細胞培養的可高效生產流感疫苗的體系成為目前流感疫苗研制的重要方向之一，世界衛生組織及各國相關部門也在積極倡導利用細胞培養技術生產疫苗，以替代雞胚培養工藝。近年來，將各種動物細胞用于疫苗生產的研究也在不斷推進之中。有大量文獻報道了 MDCK細胞(Madin-Darby canine kidney cells)被廣泛用于病毒的擴增和純化，因其增殖快，且流感病毒對其感染效率高、不易變異，因此被公認為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產的細胞系之一。目前，基于動物細胞(MDCK細胞)培養流感疫苗的生產過程多采用兩階段操作工藝，即前期在有血清的培養基中使細胞增殖至所需密度；后期通過洗滌去除血清成分及代謝廢物，更換為無血清培養基以支持病毒在細胞中感染和復制。然而血清的應用可能存在很多問題例如第一，批次間組分和質量的差異易造成生物制品批次間質量的不均一；第二，易污染支原體、病毒、BSE-因子和其它傳染因子的風險；第三，大量血清蛋白的存在增加了后期分離純化的難度，并且部分物質無法徹底去除，會影響最終產品的質量；此外，血清來源受限、價格昂貴，大大增加了生產成本。因此，許多研究組織都在開發無需血清的培養條件或者血清來源產品的有效宿主系統。在細胞增殖的方式中，懸浮培養模式因具有規模易放大、培養條件易控制等優點，大規模的細胞增殖多采用該模式。懸浮培養模式又分為微載體懸浮培養和單細胞懸浮培養方式。前者與后者比較具有一定的優勢首先，易更換培養基，無需專用細胞過濾器，可避免濾器堵塞等問題；其次，細胞與培養液易分離，易于洗滌細胞；再次，便于濃縮細胞密度，易制備高濃度、高效價生物產品，可降低產品分離純化成本；最后，細胞可保持貼壁生長屬性，避免懸浮細胞引起的致瘤性等安全問題。因此，目前流感疫苗的生產工藝中多采用微載體懸浮培養的模式。綜上所述,在基于MDCK細胞通過微載體懸浮培養的模式大規模培養并生產流感疫苗的工藝中，無血清培養基的開發和應用具有非常重要的意義。近年來，對無血清培養基的研究已取得了一些長足的進展
1979年，美國加利福利亞大學Taub等人開發出了 MediumK-1無血清培養基，以SF-DMEM/F12 (1:1)為基礎培養基，添加多種激素和抗生素，其能支持貼壁MDCK細胞生長，每天增殖1. 5倍，最大細胞密度可達2. 6 X IO5細胞/平方厘米。1994年，法國巴斯德研究所Merten等人開發了無血清培養基MDSS2，其蛋白總含量為40毫克/升，含有多種動物源蛋白和蛋白水解物。1996年，他們繼續開發了 MDSS2N，用植物來源組分替代動物來源組分，以大豆蛋白水解物替代酪素蛋白胨，可用于MDCK細胞的貼壁培養。
2001年，美國Sigma-Aldrich公司的Johnson等人開發了無血清培養基MDCK-LP和MDCK-LPM，它們適于MDCK細胞的貼壁生長和乙肝病毒疫苗的生產。2005年，日本Kyoritsu Seiyaku集團的Mochizuki等人開發了無血清低蛋白培養基RPMI/SP，在經典培養基RPMI1640的基礎上添加了大豆蛋白水解物、谷氨酰胺以及抗生素混合液，該培養基可以維持MDCK細胞的貼壁穩定生長以及幾種犬病毒疫苗的生產。2006年,德國Max Planck研究所Genzel等人在病毒滴度方面,用JRH Bioscience的商業培養基Ex-Cell MDCK培養貼壁的MDCK細胞生產流感病毒疫苗，其病毒滴度為199. 5-398.1血凝單位/100微升。2001年,英國應用微生物研究中心Tree等人用Gibco公司的無血清商業培養基EpiSerf培養MDCK細胞生產流感病毒疫苗，其病毒滴度為1. O X IO9病毒空斑形成單位/毫升。2006年,美國Sigma-Aldrich公司的分公司推出了一種無血清無動物蛋白的MDCK細胞培養基Ex-Cell MDCK,它含有重組蛋白和大豆蛋白水解物，并宣稱該培養基能夠支持MDCK細胞貼壁培養和細胞懸浮培養以生產流感病毒疫苗，其病毒滴度為1.0X109半數組織感染劑量/暈升。上述商業培養基雖能支持細胞穩定生長和用于生物制品的生產，但是也存在一些明顯的不足，將其用于某些研究或者用于大規模細胞培養和生物制品的生產會有不少困難。其主要問題是①價格昂貴，只適用于部分小規模的實驗研究，而不適于大規模的細胞培養及生物制品的生產。②大部分組分未公開，化學成分不明確，給科研和生產帶來一定的困難。③有些培養基不能支持細胞的高密度生產，有些培養基用于MDCK細胞培養時延滯期過長，且細胞的生長緩慢，從而在一定程度上增加了生產成本。④大部分培養基只能支持MDCK細胞的貼壁生長，不支持流感病毒的增殖，即使能夠支持流感病毒增殖的話，得到的病毒滴度也不高。基于MDCK細胞通過無血清微載體懸浮培養的模式大規模生產流感疫苗的工藝，既可避免有血清培養的種種不利因素，又可解決靜態貼壁培養帶來的工作量大、成本高的問題，提高了 MDCK細胞培養的生產效率并降低了流感疫苗的生產成本，能確保產品的質量，因而它具有巨大的前景。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種適于大規模生產流感疫苗的無血清培養基，它組分明確，能去除血清對流感疫苗生產過程的干擾，能降低生產成本,并能解除在利用MDCK細胞培養法生產流感疫苗過程中對血清的依賴，為流感疫苗的產業化生產帶來極大方便。在研究中，發明人確定為，本發明要提供的適于大規模生產流感疫苗的無血清培養基應該包括基礎代謝營養物、核酸類化合物、維生素、無機鹽類化合物、剪切力保護劑、酸堿度緩沖劑、酸堿度指示劑、病毒增殖促進劑以及添加物；其中，基礎營養代謝物應包括基礎碳源和氮源物質，要為細胞生長、正常代謝和維持生命提供物質基礎；核酸類化合物是細胞物質能量代謝所必須的構件分子，同時也是RNA和DNA等遺傳物質合成的物質基礎；維生素是細胞代謝中必不 可少的有機化合物，許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子，細胞的各種生長代謝活動都需要維生素；無機鹽類化合物能調節細胞膜的通透性，控制水分，維持正常滲透壓和酸堿平衡，維持細胞的形態和功能，有些無機或有機化合物以構成酶的輔基、激素、維生素、蛋白質和核酸的成分，或作為多種酶系統的激活劑，參與許多重要的重理功能；剪切力保護劑可削弱生物反應器中因攪拌、通氣等機械外力對細胞的損傷作用；酸堿度緩沖劑能調控反應系統的酸堿度平衡，避免過酸性或過堿性環境對細胞核病毒的損傷作用；酸堿指示劑能在線指示細胞培養液的酸堿度變化，方便更換新鮮培養液、細胞傳代等操作；病毒增殖促進劑能調控細胞生理狀態、維持病毒活性、促進病毒增殖過程；(其它)添加物則包含血清替代物和為細胞生長提供重要的氨基酸、短肽等營養物的蛋白水解物。為實現上述目的，本發明采取了以下技術方案。一種適于大規模生產流感疫苗的無血清培養基，其特征在于，包含23種基礎代謝營養物、2種核酸類化合物、6種維生素、9種無機鹽類化合物、I種剪切力保護劑、2種酸堿度緩沖劑、I種酸堿度指示劑、10種病毒增殖促進劑以及3種添加物；
—所述的基礎代謝營養物為葡萄糖、丙酮酸鈉、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸；—所述的核酸類化合物為次黃嘌呤、胸苷；
—所述的維生素為生物素、葉酸、煙酰胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸；
—所述的無機鹽類化合物為硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硒酸鈉；
——所述的剪切力保護劑為嵌段式聚醚F68 ；
—所述的酸堿度緩沖劑為碳酸氫鈉、羥乙基哌嗪乙磺酸；
—所述的酸堿度指示劑為酚紅；
—所述的病毒增殖促進劑為膽固醇、生育酚醋酸酯、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬
脂酸、氯化鎂、氯化鈣、丁酸鈉、二甲基亞砜；
-所述的添加物為轉鐵蛋白、胰島素、大豆水解物。進一步，所述適于大規模生產流感疫苗的無血清培養基，在無熱源超純水中溶解
以下組分，其各種成分的含量為(以下濃度按MDCK培養基的總體積計算)，單位為毫克/升
權利要求
1.一種適于大規模生產流感疫苗的無血清培養基，其特征在于，包含23種基礎代謝營養物、2種核酸類化合物、6種維生素、9種無機鹽類化合物、I種剪切力保護劑、2種酸堿度緩沖劑、I種酸堿度指示劑、10種病毒增殖促進劑以及3種添加物；——所述的基礎代謝營養物為葡萄糖、丙酮酸鈉、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸；——所述的核酸類化合物為次黃嘌呤、胸苷；——所述的維生素為生物素、葉酸、煙酰胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸；——所述的無機鹽類化合物為硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硒酸鈉；——所述的剪切力保護劑為嵌段式聚醚F68 ；——所述的酸堿度緩沖劑為碳酸氫鈉、羥乙基哌嗪乙磺酸；——所述的酸堿度指示劑為酚紅；——所述的病毒增殖促進劑為膽固醇、生育酚醋酸酯、豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、氯化鎂、氯化鈣、丁酸鈉、二甲基亞砜；-所述的添加物為轉鐵蛋白、胰島素、大豆水解物。
2.根據權利要求1所述的適于大規模生產流感疫苗的無血清培養基，其特征在于，在無熱源超純水中溶解以下組分，其各種成分的含量為，單位為毫克/升葡萄糖1000 6000丙酮酸鈉50 200丙氨酸4 9 ；精氨酸40 200天冬酰胺5 20 ；天冬氨酸2 20 ；胱氨酸5 50 ；半胱氨酸10 50 ；谷氨酸3 30 ；谷氨酰胺100 2000甘氨酸5 50 ；組氨酸10 50 ；異亮氨酸20 70 ；亮氨酸30 80 ；賴氨酸50 200甲硫氨酸10 50 ；苯丙氨酸20 50 ；脯氨酸2 --40 ；絲氨酸10 -- 60 ；蘇氨酸10 --70 ；色氨酸5，-20 ；酪氨酸30 --80 ；纈氨酸30 -- 90 ；次黃嘌呤3 --15 ；胸苷O.1 --1 ;生物素O. 001 --O.1 ；葉酸2 -- 5 ；煙酰胺2 --10 ；吡哆醇I ’- 5 ；硫胺素I ’-8 ；硫辛酸O.1 --1 ;硫酸銅5 ’-30 ；硝酸鐵10 --100 ；硫酸亞鐵O.1 --1 ;硫酸鎂20 --120 ；氯化鉀300 --550 ；氯化鈉1000 --7000磷酸氫二鈉 50 120磷酸二氫鈉 50 120亞硒酸鈉50 200 ；嵌段式聚醚F68220 碳酸氫鈉1000 4000羥乙基哌嗪乙磺酸1000 5000 ；酚紅5 10膽固醇I 5 ;生育酚醋酸酯O. 01 O. 2 ;豆蔻酸O.01 O.2 ；棕櫚酸O.01 O.2 ；棕櫚油 酸O. 01 O. 2 ；硬脂酸O. 01 O. 2 ；氯化鎂1000 5500氯化鈣150 200 ；丁酸鈉10 200 ；.~-甲某亞碩,5 20 ；轉鐵蛋白5 50 ；胰島素5 40 ；大豆水解物 1500 4000。
全文摘要
本發明涉及生物技術之培養基研發技術領域，是一種適于大規模生產流感疫苗的無血清培養基，它包含23種基礎代謝營養物、2種核酸類化合物、6種維生素、9種無機鹽類化合物、1種剪切力保護劑、2種酸堿度緩沖劑、1種酸堿度指示劑、10種病毒增殖促進劑以及3種添加物；本發明的無血清培養基可采用常規的制備方法將上述組分溶解于無熱源超純水中即可配制得到所述的無血清培養基。其使用方法也為常規方法。本發明的積極效果是不含血清，總蛋白含量低于10毫克/升，有利于產物的分離純化，適于流感疫苗的生產，支持動物細胞的正常生長和長期傳代培養，無需適應即可使用，因組分明確而配制方便，成本可控，適于流感疫苗的大規模生產。
文檔編號C12N5/02GK103045533SQ201310011998
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月14日 優先權日2013年1月14日
發明者譚文松, 劉旭平, 趙亮, 范里, 黃錠 申請人:華東理工大學