專利名稱：草莓潛隱環斑病毒的rt-lamp檢測方法
技術領域：
本發明涉及草莓潛隱環斑病毒的檢測技術，具體涉及草莓潛隱環斑病毒的RT-LAMP檢測方法。
背景技術：
草莓潛隱環斑病毒virus,SLRSV)隸屬于紅豆花葉病毒科線蟲傳多面體病毒屬[1]，是薔薇科果實類作物上的重要病害之一，也是國家質檢總局發布的重要檢疫性有害生物。SLRSV能侵染種子、種球、塊莖和苗木等，病毒侵染植株后，主要表現為葉片褪綠、畸形、植株矮化、產量下降以及品質下降等現象，嚴重時可引起毀滅性災害。目前SLRSV的檢測方法主要有指示植物小葉嫁接法、血清學檢測和分子生物學檢測等。SLRSV的癥狀表現比較復雜，同種病毒在不同的指示植物上，癥狀變化比較大，而上述方法對于病毒種類的鑒定檢測耗時長，靈敏度較低。環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)作為一種新穎的核酸擴增方法，同樣具有檢測速度快、操作簡單和靈敏度高等優點；該技術依賴于能夠識別靶序列上6個特異區域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴增的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速和特異地擴增靶序列。由于LAMP呈瀑布式擴增，因此其擴增效率非常高；同時，LAMP識別靶序列上的6 8個特異性位點，其特異性也很強；LAMP只在60°C 65°C進行恒溫擴增，只要水浴鍋即可，無需特殊的儀器，操作非常簡單；而且LAMP的整個檢測反應只需I h 2.5 h，檢測周期非常短。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測速度快、操作簡單、檢測結果判斷容易和靈敏度高的草莓潛隱環斑病毒的RT-LAMP檢測方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:草莓潛隱環斑病毒的RT-LAMP檢測方法，其步驟如下:
a、總RNA提取:檢測樣品經液氮處理后研碎成粉末狀，用Trizol核酸提取試劑提取總RNA，得到樣品總RNA ;具體提取方法依Trizol核酸提取試劑的說明書進行；
b、RT-LAMP擴增:20μ L的RT-LAMP擴增反應體系為2 X反應緩沖液10 μ L，濃度5 U/μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，濃度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，樣品總RNAl μ L，引物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量為ddH20，該擴增反應體系中，引物F3和B3的終濃度各為0.2μΜ，引物Loopl和Loop2的終濃度各為0.8 μ M，引物FIP和BIP的終濃度各為1.6 μ Μ,其中引物F3的核苷酸序列為gagaatcacc gttactggaa agg,引物B3的核苷酸序列為acagcaaaca gagaaccact acc,引物Loopl的核苷酸序列為gcaaagcccatttccacagt,引物Loop2的核苷酸序列為ggttgctacg tgccaaggtt,引物FIP的核苷酸序列為 cgataggcat cgctctccct ttttagaggt gatctttaac ctccc,引物 BIP 的核苷酸序列為tactttggtt cgacagtggt ggattttccc attagataac caccataacc a,反應條件為 60 65°C 的恒溫水浴鍋中擴增I 1.5 h，得到擴增產物；
C、在擴增產物中加入0.1 μ L的熒光染料SYBR green I，若呈綠色則樣品中感染有草莓潛隱環斑病毒，若呈橙紅色則樣品中無草莓潛隱環斑病毒。與現有技術相比，本發明的優點在于草莓潛隱環斑病毒的RT-LAMP檢測方法，通過樣品RNA提取，RT-LAMP擴增，就可以得到檢測結果，整個檢測反應不超過2.5 h，又由于LAMP呈瀑布式擴增，因此其擴增效率非常高，靈敏度是RT-PCR檢測的100倍，且無需復雜的檢測儀器和檢測過程，操作簡單，可現場實時檢測，因此本發明是一種檢測速度快、操作簡單、檢測結果判斷容易和靈敏度高的草莓潛隱環斑病毒的RT-LAMP檢測方法。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例1
1、根據GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中已登錄的草莓潛隱環斑病毒的外殼蛋白基因序列(AY860979)，采用Blast程序進行同源性比較，在序列的保守區，使用Primer Express 3.0 軟件,設計得到 F3、B3、FIP、BIP、Loopl 和 Loop2 共 6 條引物，分別識別外殼蛋白編碼基因的8個位點；引物F3、B3、FIP、BIP、Loopl和Loop2由上海英駿生物技術公司合成，引物F3的核苷酸序列為gagaatcacc gttactggaa agg,引物B3的核苷酸序列Sacagcaaaca gagaaccact acc,引物 Loopl 的核昔酸序列為 gcaaagccca tttccacagt,引物Loop2的核苷酸序列為ggttgctacg tgccaaggtt,引物FIP的核苷酸序列為cgataggcatcgctctccct ttttagaggt gatctttaac ctccc,引物 BIP 的核苷酸序列為 tactttggttcgacagtggt ggattttccc attagataac caccataacc a ；
2、RT-LAMP擴增反應體系建立:2X反應緩沖液10 μ L，濃度5 U/ μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，濃度5 U/ μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，樣品總RNAl μ L，引物F3和Β3終濃度各為0.2 μ Μ，引物Loopl和Loop2終濃度各為0.8 μ M，引物FIP和BIP終濃度各為1.6 μ Μ，ddH20補充至20 μ L ; Bst DNA聚合酶和AMV RNA聚合酶均購于北京美萊博醫學科技有限公司；
3、反應條件優化:用上述RT-LAMP擴增反應體系對草莓潛隱環斑病毒標準樣品(購于美國Agdia公司)進行擴增,擴增反應時間分別設定為:30min、60min和90min,結果30 min未看到沉淀，60min和90min都可以看到沉淀,擴增產物加0.1 μ L的突光染料SYBR greenI (購自上海生物工程公司)，都呈綠色，因此選取60 90 min的反應時間；擴增反應水浴溫度分別設定為60°C、63°C和65°C，結果都可以看到沉淀，擴增反應溫度優選較低的60°C ；
4、RT-LAMP特異性試驗:用上述RT-LAMP擴增反應體系分別對草莓潛隱環斑病毒二個樣品、煙草環斑病毒一個樣品(TbAacco ringspotTRSV)、香石竹環斑病毒一個樣品(.Carnation ringspot virus, CRSV)、黃瓜綠斑駁病毒一個樣品green mottlemosaic virus，CGMMV)、南芥菜花葉病毒一個樣品 ClraAi1S mosaic Firw1S, ArMV)和馬鈴薯V病毒一個樣品OdWo virus K, PVV)進行擴增,上述樣品均購于美國Agdia公司，反應時間60 min,水浴溫度為60°C，結果草莓潛隱環斑病毒二個樣品都可以看到沉淀，擴增產物加0.1 μ L的熒光染料SYBR green I，都呈綠色，其它樣品無沉淀，SYBR green I染色后為橙紅色，說明RT-LAMP擴增反應體系對草莓潛隱環斑病毒特異。
實施例2
1、2克草莓潛隱環斑病毒陽性百合葉樣品(樣品由上海檢驗檢疫局提供)經約50毫升液氮處理后研碎成粉末狀，用Trizol核酸提取試劑(購自上海生物工程公司)提取總RNA，得到樣品總RNA ;具體提取方法依Trizol核酸提取試劑的說明書進行；
2,RT-LAMP靈敏性試驗:用RT-PCR反應體系和上述RT-LAMP擴增反應體系分別對樣品總RNA進行擴增反應，RT-PCR反應體系引物為F3和B3，試劑盒為One-st印RNA PCR kit(購自大連TaKaRa公司)，PCR反應條件如下:50°C cDNA合成30 min，94°C預變性2 min ；94°C變性30 s，58°C復性30 s，72°C延伸I min，35個循環；最后72°C延伸5 min。樣品總RNA濃度分別為原液，原液的10 — \ 10 —2、10 —3、10 —4和10 —5稀釋液，RT-LAMP擴增反應時間60 min,水浴溫度為60°C，結果原液及原液的10 —1和10 —3稀釋液看到沉淀，擴增產物加0.1 μ L的熒光染料SYBR green I，原液及原液的10 一 1UO +2、10 —3、10 —4稀釋液都呈綠色；RT-PCR只有原液和10 — 1稀釋液有熒光反應，因此RT-LAMP擴增靈敏度是RT-PCR的100倍以上，也說明百合葉中感染有草莓潛隱環斑病毒。實施例3
上述RT-LAMP擴增反應體系分別對薔薇、玫瑰、和水仙葉樣品進行檢測。檢測方法同實施例2，只是水浴溫度為65°C，結果薔薇葉擴增產物有沉淀，0.1 μ L的熒光染料SYBR greenI后呈綠色，玫瑰葉擴增產物混濁，0.1 μ L的熒光染料SYBR green I后呈綠色，水仙擴增產物無沉淀，0.1 μ L的熒光染料SYBR green I后呈橙紅色，說明薔薇、玫瑰葉中感染有草莓潛隱環斑病毒，水仙葉中未感染 草莓潛隱環斑病毒。
權利要求
1.莓潛隱環斑病毒的RT-LAMP檢測方法，其特征在于步驟如下: a、總RNA提取:檢測樣品經液氮處理后研碎成粉末狀，用Trizol核酸提取試劑提取總RNA，得到樣品總RNA ;具體提取方法依Trizol核酸提取試劑的說明書進行； b、RT-LAMP擴增:20μ L RT-LAMP擴增反應體系為2 X反應緩沖液10 μ L，濃度5 U/ μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，濃度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，樣品總RNAl μ L，引物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量為ddH20，該擴增反應體系中，引物F3和B3的終濃度各為0.2 μ M，引物Loopl和Loop2的終濃度各為0.8 μ M，引物FIP和BIP的終濃度各為1.6 μ Μ,其中引物F3的核苷酸序列為gagaatcacc gttactggaa agg,引物B3的核苷酸序列Sacagcaaaca gagaaccact acc,引物 Loopl 的核昔酸序列為 gcaaagccca tttccacagt,引物Loop2的核苷酸序列為ggttgctacg tgccaaggtt,引物FIP的核苷酸序列為cgataggcatcgctctccct ttttagaggt gatctttaac ctccc,引物 BIP 的核苷酸序列為 tactttggttcgacagtggt ggattttccc attagataac caccataacc a,反應條件為 60 65°C 的恒溫水浴鍋中擴增I 1.5 h，得到擴增產物； C、在擴增產物中加入0.1 μ L的熒光染料SYBR green I，若呈綠色則樣品中感染有草莓潛隱環斑病毒，若呈橙紅色則樣品中無草莓潛隱環斑病毒。
全文摘要
本發明公開了草莓潛隱環斑病毒的RT-LAMP檢測方法，通過樣品RNA提取，RT-LAMP擴增，就可以得到檢測結果，整個檢測反應不超過2.5h，又由于LAMP呈瀑布式擴增，因此其擴增效率非常高，靈敏度是RT-PCR檢測的100倍，且無需復雜的檢測儀器和檢測過程，操作簡單，可現場實時檢測，因此本發明是一種檢測速度快、操作簡單、檢測結果判斷容易和靈敏度高的草莓潛隱環斑病毒的RT-LAMP檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK103088160SQ201310011970
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月14日 優先權日2013年1月14日
發明者張吉紅, 陳先鋒, 余澍瓊, 聞偉剛 申請人:寧波檢驗檢疫科學技術研究院