專利名稱：一種昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段及其dsRNA和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段及其dsRNA和dsRNA致死害蟲的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
害蟲危害極大地制約了我國(guó)農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的提高，目前控制害蟲的主要手段是施用化學(xué)殺蟲劑，但是大量施用化學(xué)殺蟲劑會(huì)導(dǎo)致一系列問(wèn)題，諸如:1)害蟲抗藥性增強(qiáng)，防治成本提高；2)農(nóng)藥殘留引起一系列環(huán)境污染和食品安全問(wèn)題；3)破壞生態(tài)平衡，對(duì)非靶標(biāo)生物有較大的影響?，F(xiàn)有的生物防治方法如生物殺蟲劑等作用時(shí)間長(zhǎng)且起效慢，而敲除害蟲生長(zhǎng)發(fā)育的特異性基因的方法是將來(lái)害蟲綜合治理的發(fā)展趨勢(shì)之一。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指外源或內(nèi)源的雙鏈RNA(double2stranded RNA, dsRNA)特異性地引起基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。它具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子、清除異常RNA、調(diào)節(jié)基因表達(dá)等功能，且RNAi沉默基因的高效率、高特異性以及能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行人工誘導(dǎo)，使RNAi作為一種反向遺傳技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因功能的研究。RNAi—直廣泛應(yīng)用于基因功能的研究，在利用該技術(shù)成功鑒定了多種昆蟲基因功能的同時(shí)，科學(xué)家們?cè)噲D將該技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治領(lǐng)域，目前已在鱗翅目和鞘翅目昆蟲中試驗(yàn)成功。通過(guò)對(duì)棉鈴蟲幼蟲飼喂表達(dá)P450基因(CYP6AE14))和谷胱甘肽基因GSTldsRNA的棉花，誘導(dǎo)RNAi并阻礙了幼蟲發(fā)育，這一技術(shù)為田間害蟲控制開(kāi)辟了新領(lǐng)域(Mao etal.,2007);采用RNA干擾技術(shù)，開(kāi)展翅盤異常發(fā)育基因dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用具有重要的意義。相比于傳統(tǒng)的害蟲控制策略，害蟲基因沉默控制的優(yōu)勢(shì)在于:(I)根據(jù)害蟲基因序列的特異性，可以設(shè)計(jì)使目的基因 沉默的專一性基因，同時(shí)由于RNA分子的不穩(wěn)定性，不會(huì)出現(xiàn)殘留污染問(wèn)題，因此對(duì)環(huán)境生態(tài)安全和食品安全沒(méi)有任何影響；(2)防治對(duì)象的特異性極高，不會(huì)對(duì)其他昆蟲特別是害蟲天敵產(chǎn)生負(fù)面影響，有利于害蟲生物防治和綜合治理體系的實(shí)施；(3)對(duì)由于基因突變產(chǎn)生的抗性問(wèn)題，很容易通過(guò)改變小RNA的序列來(lái)解決，以變制變，因此不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段。本發(fā)明的另一目的在于提供上述的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA。本發(fā)明的再一目的在于提供上述的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA的用途。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1。上述的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段(SEQ ID NO:1 )，是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)上游引物(序列如SEQ ID NO:2所示)和下游引物(序列如SEQ ID NO:3所示)，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得 SEQ ID NO:lo一種昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA，是以上述的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段(SEQ ID NO:1)為模板，通過(guò)試劑盒合成。上述的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA可以用于致死害蟲，即將dsRNA注射到昆蟲體腔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:上述的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA可以特異性地沉默昆蟲體內(nèi)翅盤異常發(fā)育基因的mRNA表達(dá)，使昆蟲在蛻皮化蛹和羽化過(guò)程中死亡。在RNAi過(guò)程中，只有導(dǎo)入到生物體內(nèi)的dsRNA被Dicer酶切割成siRNA后才能發(fā)揮作用。一般而言，具有功能性的siRNA分子其最小剪輯長(zhǎng)度為19bp。即設(shè)計(jì)的能夠沉默目標(biāo)基因的dsRNA與這個(gè)物種之中的其他基因相比，沒(méi)有連續(xù)19bp以上的堿基完全相同，那么就能保證降低特異性目的片段的轉(zhuǎn)錄水平。但是，如果設(shè)計(jì)的dsRNA是針對(duì)同一物種的很多基因共有保守序列，特別是對(duì)具有大于19bp以上完全相同的連續(xù)堿基的兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因，那么則有可能會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)基因的“脫靶效應(yīng)”。根據(jù)上述理論，我們就可以利用“脫靶效應(yīng)”沉默一個(gè)基因家族的多個(gè)基因或不同物種的同類基因。本發(fā)明根據(jù)上述dsRNA設(shè)計(jì)的基本原則，在斜紋夜蛾AWD mRNA序列(即JF690666)上選取了 537bp的片段作為dsRNA的表達(dá)區(qū)域，通過(guò)序列分析和單一性檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)連續(xù)19bp以上堿基序列完全相同的基因，因此確定該序列可以作為靶標(biāo)基因序列。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明通過(guò)人工合成斜紋夜蛾AWD基因片段的dsRNA沉默AWD基因，使蛹期斜紋夜蛾致死或使其成蟲的翅發(fā)育畸形。將斜紋夜蛾AWD基因極高的特異性作為害蟲控制的靶標(biāo)防治害蟲，對(duì)環(huán)境生態(tài)安全和食品安全沒(méi)有任何影響，同時(shí)，有效避免產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性問(wèn)題。本發(fā)明為以該基因序列為靶標(biāo)的新型生物殺蟲劑的研發(fā)提供分子生物學(xué)技術(shù)，有利于鱗翅目食葉性害蟲綜合治理體系的建立。
相比于傳統(tǒng)的害蟲控制策略，害蟲基因沉默控制的優(yōu)勢(shì)在于:(I)根據(jù)害蟲基因序列的特異性，可以設(shè)計(jì)使目的基因沉默的專一性基因，同時(shí)由于RNA分子的不穩(wěn)定性，不會(huì)出現(xiàn)殘留污染問(wèn)題，因此對(duì)環(huán)境生態(tài)安全和食品安全沒(méi)有任何影響；(2)防治對(duì)象的特異性極高，不會(huì)對(duì)其他昆蟲特別是害蟲天敵產(chǎn)生負(fù)面影響，有利于害蟲生物防治和綜合治理體系的實(shí)施；(3)對(duì)由于基因突變產(chǎn)生的抗性問(wèn)題，很容易通過(guò)改變小RNA的序列來(lái)解決，以變制變，因此不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性問(wèn)題。
圖1是實(shí)施例1合成的dsRNA的純度檢測(cè)結(jié)果示意圖；其中，M-Marker, 1、2泳道-dsRNA，箭頭所指為合成的SLAWD dsRNA。圖2是dsRNA注射24h后對(duì)6齡斜紋夜蛾發(fā)育的影響。圖3是注射dsRNA后對(duì)6齡斜紋夜蛾蛹發(fā)育的影響。圖4是注射dsRNA后對(duì)6齡斜紋夜蛾翅發(fā)育的影響。圖5是注射dsRNA后對(duì)6齡斜紋夜蛾翅盤異常發(fā)育基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1斜紋夜蛾翅盤異常發(fā)育基因片段的獲得及其dsRNA的合成，包括以下步驟:(1)斜紋夜蛾翅盤異常發(fā)育基因片段的獲得根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為JF690666的斜紋夜蛾翅盤異常發(fā)育基因序列，采用primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,上游引物序列為SEQ ID NO:2，下游引物序列為SEQ ID NO:3，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。SEQ ID NO:2:ATGATTGCCACTTTGCTATACCSEQ ID NO:3:TTATTCATAAACCCAGTTTTCGGC斜紋夜蛾總RNA的提取按照OMEGA公司的Trizol kit試劑盒進(jìn)行。利用反轉(zhuǎn)錄TaKaRa 試劑盒 PrimerScript Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄成第一條鏈的 cDNA,以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得斜紋夜蛾翅盤異常發(fā)育基因片段(即SEQID NO:1)，并對(duì)所獲得的翅盤異常發(fā)育基因片段進(jìn)行表達(dá)純化。(2)以步驟(I)所獲得的翅盤異常發(fā)育基因片段為模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5 為引物(SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5 是按照 T7RiboMAX Express RNAiSystem試劑盒的說(shuō)明在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的5’端多加一個(gè)T7啟動(dòng)子序列TAATACGACTCACTATAGGG后得到的)，擴(kuò)增合成dsRNA。得到的dsRNA用酶標(biāo)儀OD26tl檢測(cè)，確定其濃度。并用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)其單一性。結(jié)果如圖1所示。上游引物SEQ ID NO:4:5’ -TAATACGACTCACTATAGGGATGATTGCCACTTTGCTATACC-3’下游引物SEQ ID NO:5:5’ -TAATACGACTCACTATAGGGTTATTCATAAACCCAGTTTTCGGC-3’實(shí)施例2斜紋夜蛾翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA致死斜紋夜蛾實(shí)驗(yàn)1)斜紋夜蛾翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA注射選取同一批次發(fā)育良好的6齡第三天斜紋夜蛾幼蟲，用玻璃毛細(xì)針吸取5 μ L實(shí)施例I合成的dsRNA，順著昆蟲血液流動(dòng)的方向?qū)sRNA溶液注射入幼蟲近第一腹足處，要避開(kāi)氣門。每批次20頭，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)，設(shè)dsGFP的對(duì)照組。注射完畢后，將斜紋夜蛾幼蟲置于人工氣候箱中進(jìn)行飼養(yǎng)(溫度26±1°C,光照L14:D10,濕度60 70%)。每隔6小時(shí)觀察其發(fā)育狀況。2)注射dsRNA對(duì)斜紋夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育的表型觀察dsRNA注射24h后，蟲體進(jìn)入預(yù)蛹期。圖2中，對(duì)照組(注射dsGFP)和dsRNA實(shí)驗(yàn)組的蟲體均能正常生長(zhǎng)(自然死亡除外)。dsRNA注射48h后，斜紋夜蛾幼蟲完成最后一次蛻皮化蛹。比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的化蛹畸形表型發(fā)現(xiàn)(圖3)，對(duì)照組蛹的個(gè)體飽滿，外表無(wú)損傷，生長(zhǎng)發(fā)育正常；而dsRNA處理組多表現(xiàn)為蛹體頭胸部干癟，頭胸部器官的形成和發(fā)育受阻而死亡。比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的畸形羽化表型發(fā)現(xiàn)(圖4):dsRNA實(shí)驗(yàn)組的斜紋夜蛾成蟲翅的發(fā)育存在缺陷，發(fā)育較短或畸形，并最終死亡。3)注射dsRNA對(duì)斜紋夜蛾翅盤異常發(fā)育基因的干擾效應(yīng)檢測(cè)
在注射dsRNA后，分別提取對(duì)照組和處理組的預(yù)蛹、雌蛹、雄蛹、雌成蟲、雄成蟲總RNA進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)斜紋夜蛾AWD基因(S.1itura AffD,簡(jiǎn)稱SLAWDM^] mRNA表達(dá)水平變化。以斜紋夜蛾Actin基因?yàn)閮?nèi)參，熒光定量PCR結(jié)果如圖5。對(duì)照組中AWD基因mRNA水平的表達(dá)在誤差范圍內(nèi)符合斜紋夜蛾不同發(fā)育階段的正常表達(dá)。而經(jīng)dsRNA實(shí)驗(yàn)組的斜紋夜蛾預(yù)蛹、雌蛹、雄蛹、雌成蟲、雄成蟲中AWD基因mRNA水平均顯著降低。該結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)微注射dsRNA的方法在斜紋夜蛾中可以誘導(dǎo)系統(tǒng)性RNAi，從而沉默斜紋夜蛾AWD基因。4)注射dsRNA后斜紋夜蛾的死亡情況統(tǒng)計(jì) 注射dsRNA的斜紋夜蛾實(shí)驗(yàn)組死亡率為70.00 土 3.16%。這與微注射dsGFP的對(duì)照組相比(死亡率為34.17±2.39%)，致死效果明顯。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段，其特征在于核苷酸序列是SEQ ID N0:1。
2.一種昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA，其特征在于:是以權(quán)利要求1所述的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段為模板合成的。
3.權(quán)利要求2所述的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段的dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用，其特征在于:將dsRNA注射到昆蟲體腔。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段及其dsRNA和應(yīng)用。本發(fā)明的昆蟲翅盤異常發(fā)育基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO1，以其為模板合成的dsRNA能夠用于致死害蟲。本發(fā)明通過(guò)人工合成斜紋夜蛾AWD基因片段的dsRNA沉默AWD基因，使蛹期斜紋夜蛾致死或使其成蟲的翅發(fā)育畸形。將斜紋夜蛾AWD基因極高的特異性作為害蟲控制的靶標(biāo)防治害蟲，對(duì)環(huán)境生態(tài)安全和食品安全沒(méi)有任何影響，同時(shí)，有效避免產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性問(wèn)題。本發(fā)明為以該基因序列為靶標(biāo)的新型生物殺蟲劑的研發(fā)提供分子生物學(xué)技術(shù)，有利于鱗翅目食葉性害蟲綜合治理體系的建立。
文檔編號(hào)C12N15/12GK103088031SQ20131000820
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月9日
發(fā)明者孟翔, 任順祥, 金豐良, 胡俊杰 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)