專利名稱：大豆凝集素基因lec-s 的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，涉及大豆凝集素基因Iec-S的應用。
背景技術：
煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是一種植物正鏈RNA病毒,可侵染38科268種植物，引起多種重要的植物病毒病(Scholthof，2004)。由于TMV抗逆性極強，對寄主專性寄生，加上植物缺乏完整的免疫代謝系統，使得該病很難防治。甜菜夜蛾最初產生于東南亞，但在世界范圍內也是一種重要的蟲害，可以危害多種園藝作物及蔬菜(Smaggheet al，2003)。化學藥劑的使用是目前防治植物病蟲害的一種重要措施，但化學藥劑的濫用對環境和農產品安全造成了嚴重的影響。而近年來植物抗病蟲基因工程的發展則為防治植物病蟲害提供了一條新途徑，主要思路是將抗性相關基因通過基因工程手段轉入受體植物中，從而獲得植物抗病蟲新品種，而且較傳統育種具有基因資源多、育種周期短等特點(Kang et al,2005)。凝集素是一種能凝集紅細胞、多糖或糖復合物的非免疫來源的糖蛋白。目前為止，人們已經從多種植物、動物、細菌、病毒和真菌中分離出凝集素(Tateno et al，1998 ；ffanget al, 1996 ；Inamori and Saito, 1999 ；Leteux and Chai, 2000) 迄今為止已發現的許多凝集素中，植物凝集素是最大的一個家族。在這些植物中，尤以豆科植物的種子中凝集素含量最為豐富。植物凝集素在植物中具有重要的防御功能。以往的許多研究報道表明，植物凝集素可以提高植物對真菌、細菌、線蟲等多種病原物和有害昆蟲的抗性(Ye et al,2001 ；Ooi et al, 2000 ；Machuka and Oladapo, 2000)。但關于大豆凝集素抗植物病毒的研究還未見報道。在發明人的前期工作中，利用RACE和反向PCR技術從大豆品種合豐29號中分離得到一個新的大豆凝集素基因，命名為lec-s (DQ235094)。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種新的大豆凝集素基因lec-s的應用。本發明的目的通過如下技術方案實現:大豆凝集素基因lec-s在培育抗病和/或抗蟲的轉基因植物品種中的應用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登錄號為DQ235094。其中，所述的抗病為抗煙草花葉病毒，所述的抗蟲指抗甜菜夜蛾。含有大豆凝集素基因lec-s的重組質粒在培育抗病和/或抗蟲的轉基因植物品種中的應用其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登錄號為DQ235094。其中，所述的抗病為抗煙草花葉病毒，所述的抗蟲指抗甜菜夜蛾。
有益效果:轉基因煙草由于其基因轉化技術成熟，從侵染到獲得再生苗的周期較短，已被作為一個模式工作系統，常被用來進行植物抗病蟲性研究。本發明對大豆凝集素基因Iec-S進行了轉基因煙草及其抗病抗蟲性的研究，獲得的轉基因煙草對TMV表現出顯著的抗性，對甜菜夜蛾也表現良好抗性。qRT-PCR的檢測結果也表明，與轉空載體煙草相比，轉基因煙草接種TMV后12h和24h，煙草中防衛基因PR-la, Pal和GSTl和HR標志基因hsr515均顯著上調表達，并且最終表現為轉基因煙草對TMV的抗性增強。所以，我們推斷，lec-s基因在煙草體內表達，可能同時激活了煙草中的抗病性SA信號通路和過敏性細胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)信號通路,賦予了煙草對TMV的抗性。可見將大豆凝集素基因lec-s通過基因工程手段轉入農作物，能夠獲得具有抗病性以及抗蟲性的轉基因植物新品種。
圖llec-s 基因 RT-PCR 擴增圖(A)和 pMD18-T Simple:: lec-s (B)的酶切驗證圖A:M.分子量標記(DNA Marker DL2000);1 2.從大豆品種29中擴增lec_s; 3.清水對照B:M.分子量標記(DNA Marker DL2000) ; 1.Sma I 和 Xba I 酶切 pMD18_T Simple:: lec-s圖2大豆凝集素lec-s基因編碼的氨基酸同其它大豆凝集素的同源比較有*的位點是相似性高的位置圖3植物重組表達質粒pBI121::lec-s構建圖譜LB.T-DNA左邊界；RB.T-DNA右邊界；npt I1.新霉素磷酸轉移酶基因；Pr0.啟動子；Ter.終止子；gus.β -半乳糖醒酸酶基因圖4植物表達載體ρΒΙ 121:: lec-s構建酶切圖Ml.分子量標記(DNA Marker DL2000) ；M2.分子量標記(DNA Marker DL15000)；Γ2.質粒 pBI121:: lec-s 用 Sma I 和 Xba I 雙酶切；3.質粒 pBI121 用 Sma I 和 Xba I 雙酶切。圖5重組載體pBI121:: lec-s轉化農桿菌的PCR驗證M.分子量標記(DNA Marker DL2000) ;ff.陰性對照，清水；P.陽性對照，質粒pBI121:: lec-s ;1 3.不同的轉化子。圖6轉基因煙草Ttl代的PCR檢測A、B:Μ.分子量標記(DNA Marker DL2000) ；P.陽性對照，質粒 pBI121:: lec_s ;W.陰性對照，清水；CK.陰性對照，未轉化植株；f 45.轉基因植株；C:M.分子量標記(DNA Marker DL2000) ；P.陽性對照，質粒pBI121 ；ff.陰性對照，清水；CK.陰性對照，未轉化植株；f 24.轉空載體植株。圖7轉基因植株Ttl代的Southern雜交分析M.分子量標記(DNA Marker DL2000, λ -Hind III digest)； 1.陽性對照，lec_s PCR擴增產物；2.未轉化植株；3.轉空載體植株；4 8.轉基因植株圖8 \代轉基因煙草對TMV的抗性WT.未轉化煙草；VEC.轉空載體煙草；T1-11，Τ1-20.轉基因煙草圖OT1代轉基因煙草接種TMV后病 斑數差異比較WT.未轉化煙草；VEC.轉空載體煙草；T1-11，Τ1-20.轉基因煙草；數據表示為平均值土標準差表示與轉空載體煙草相比在0.05水平上差異顯著
圖1OqRT-PCR測定防衛反應相關基因表達A:接種TMV后12h ;B.接種TMV后24h ；WT.未轉化煙草；VEC.轉空載體煙草； B:T1-11，T1-20.轉基因煙草數據表示為平均值土標準差；*表示與轉空載體煙草相比在0.05水平上差異顯
著圖1lT1代轉基因煙草對甜菜夜蛾幼蟲體重的影響WT.未轉化煙草；VEC.轉空載體煙草；T1-11，Τ1-20.轉基因煙草圖12 \代轉基因煙草對甜菜夜蛾幼蟲化蛹率的影響WT.未轉化煙草；VEC.轉空載體煙草；T1-11，Τ1-20.轉基因煙草
具體實施例方式以下實施例中所涉及的材料及試劑:煙草品種為三生煙(Nicotiana tabacum cv.Samsun NN),取煙草葉片作為轉化材料。根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105、植物表達載體pBI121購自Invitrogen0煙草組織培養基以MS培養基為基礎，pH5.8，121°C滅菌15min。預培養培養基:MS+6BA0.5mg/L ;共培養培養基:MS+6_BAlmg/L ;篩選培養基:MS+6-BAlmg/L+Kml00mg/L+Cb500mg/L ;生根培養基:1/2MS+Kml00mg/L+Cb200mg/L+IAA0.2mg/L ;農桿菌培養用 YEB
培養基。Taq DNA聚合酶、限制性內切酶、T4連接酶、dNTPs、核酸分子質量標準、DNase 1、PrimeScript Reverse Transcriptase 和 SYBR Premix ExTaq Kit 均購自 TaKaRa 公司。質粒抽提和DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。植物RNA提取試劑盒Plant RNAKit購自Omega公司。卡那霉素(Kanamycin)、羧節青霉素(Carbenicillin)購自上海索萊寶生物科技有限公司。實施例1ρΒΙ121:: lec-s質粒的構建1.llec-s的克隆取大豆品種合豐29號葉片，使用Omega公司的Plant RNAKit植物RNA提取試劑盒提取大豆總RNA,用無RNase的DNase I處理純化。使用PrimeScript ReverseTranscriptase (Takara)進行RNA反轉錄合成cDNA。以I μ g總RNA經反轉錄酶獲得cDNA第一鏈為模板，lec-s-F/lec-s-R為引物，通過PCR反應擴增的到兩端含有Xba I/Sma I酶切位點的lec-s基因片段。采用Axygen公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對PCR電泳條帶進行回收。將回收的lec-s片段連接至測序載體pMD18-T Simple Vector,獲得質粒pMD_18T Simple vector:: lec_s。質粒 pMD_18T Simple vector:: lec_s 轉化 DH5 α 感受態細胞，使用Axygen公司的AxyPrep質粒DNA小量試劑盒提取初篩陽性克隆的質粒,經PCR篩選陽性克隆，從經PCR篩選的陽性克隆中提取的質粒，使用TaKaRa公司限制性內切酶進行酶切鑒定，將酶切驗證正確的質粒送測序。PCR反應體系為:
權利要求
1.豆凝集素基因Iec-S在培育抗病和/或抗蟲的轉基因植物品種中的應用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登錄號為DQ235094。
2.據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的抗病為抗煙草花葉病毒，所述的抗蟲指抗甜菜夜蛾。
3.有大豆凝集素基因lec-s的重組質粒在培育抗病和/或抗蟲的轉基因植物品種中的應用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登錄號為DQ235094。
4.據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的抗病為抗煙草花葉病毒，所述的抗蟲指抗甜菜夜蛾。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域，涉及大豆凝集素基因lec-s的應用。本發明對大豆凝集素基因lec-s(GenBank登錄號為DQ235094)進行了轉基因煙草及其抗病抗蟲性的研究，獲得的轉基因煙草對TMV表現出顯著的抗性，對甜菜夜蛾也表現良好抗性。可見，大豆凝集素基因lec-s可在培育抗病和/或抗蟲的轉基因植物品種中應用。
文檔編號C12N15/29GK103088035SQ201310008139
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月10日 優先權日2013年1月10日
發明者高學文, 郭佩佩, 伍輝軍, 張巖 申請人:南京農業大學