通過單分子雜交和操作進行的dna檢測和定量的方法

通過單分子雜交和操作進行的dna檢測和定量的方法
【專利摘要】本發明涉及用于檢測和定量核酸、DNA或RNA的快速方法。具體地，本發明提供基于物理和電子處理的用于檢測和定量特異核酸分子存在的方法。本發明的方法特別適用于檢測染色體異常分布或基因表達分析的多種應用。
【專利說明】通過單分子雜交和操作進行的DNA檢測和定量的方法

【背景技術】
[0001] 本發明涉及用于檢測和定量核酸、DNA或RNA的快速方法。具體地，本發明提供基 于物理和電子處理的用于檢測和定量特異核酸分子存在的方法。本發明的方法特別適用于 檢測異常的染色體分布或基因表達分析的多種應用。
[0002] 對大范圍通常利用的生物應用而言，檢測和定量核酸序列是重要的。所述應 用包括體外診斷領域，包含臨床診斷、在分子生物學領域的研究、高通量藥物篩選、獸醫 診斷、農業遺傳學測試、環境測試、食品測試、工業工程監控和保險測試。具體地，證明 在生理樣本中特異DNA序列的存在構成目前診斷方法發展的主線，例如，用于鑒定發展 出抗生素抗性的細菌的可能性、基因異常、與遺傳修飾相關的癌癥風險和病毒感染，例如 與HIV或與肝炎病毒相關的感染（參見，例如Zhang等人，Nature, 358:591-593, 1992 ; Turner 等人，J Bacteriol，176 (12): 3708_3722，1994;Weston 等人，Infection and Immunity.，77(7) :2840-2848, 2009)。檢測和/或定量特定核酸序列對于以下各種應用也是 至關重要的，所述應用例如產前診斷、研究基因表達、獲得古代DNA、診斷遺傳病、檢測序列 多態性、定量DNA重復、檢測病原體、鑒定遺傳修飾的生物體等。（參見，例如W0 02/31463 ; W0 2006/058395 ；US 5,705,365 ；US 5, 840, 487 ；US 5, 858, 658 ；U S 6, 453, 245 ；US 7, 919, 247 ;Ver jat 等人，Biotechniques, 37 (3) : 476-481，2004 ;Vural, Afr. J. Biotechnol .,8(20):5163-5168,2009 ;van der Meide 等人，J. Clin. Microbiol. ,43(11) :5560-5566 ; 2005 ;Fan 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(42) :16266-16271，2008 ;Buehler 等 人，Methods, 50: S15-S18, 2010 ;Clark 等人，Genome Res·, 11:1594-1602,2001 ;Vernon 等 人，BMC Infect Dis, 3:12, 2003 ;Pi印enburg 等人，PLoS Biol.，4 (7) : e204, 2006)。
[0003] 幾種技術已經發展了多年，其都依賴于檢測在靶核酸分子和特異標記探針之間的 雜交分子。今天，用于檢測核酸的最廣泛使用的方法基于聚合酶鏈式反應（PCR)。例如，實 時PCR用于放大和同時定量靶DNA分子。
[0004] 核酸的任何檢測和/或定量方法中的關鍵方面是靈敏度。開發的第一技術需要 大樣本尺寸。這種問題通過在PCR方法中的擴增步驟得到緩解。因此，基于PCR的方法允 許通過擴增靶核酸來檢測非常少量的核酸（Haque等人.，BMC Biotechnol.，3:20, 2003)。 在生物研究中，PCR因此加速了對傳染性疾病檢測的研究。PCR的醫療應用包括在人體組 織中鑒定病毒、細菌和癌細胞。在稱為原位（原位點）PCR的步驟中，甚至可以在單個細 胞內使用PCR以鑒定特異細胞類型。PCR也可以應用到RNA擴增中，此方法稱為逆轉錄酶 PCR(RT-PCR)。RT-PCR類似常規PCR，其具有增加的起始步驟，其中使用稱為逆轉錄酶的酶 從RNA靶合成DNA。各種RNA分子，包括核糖體RNA、信使RNA和基因組病毒RNA，已用于 RT-PCR 中。
[0005] 然而，到目前為止所有開發方法具有嚴重缺點。具體地，它們全都使用標記的核苷 酸（例如，使用熒光的標記），因此造成整體成本的劇烈增加。另外，擴增靶序列是費時的、 增加錯誤的可能性并是高度易污染的。


【發明內容】

[0006] 根據本發明的方法基于物理技術和電子處理，不同于目前的化學或生物化學方 法。其優勢是：
[0007] 1)它不需要在檢測和定量之前的PCR步驟；
[0008] 2)它不使用昂貴的標記核苷酸（用熒光素或一些其它基團標記）。
[0009] 此外，本發明的方法與沿發夾上全局（電子或光學）檢測阻礙的位置相結合，允許 對基因組DNA的快速大規模診斷并提供對目前DNA芯片技術的競爭性替代。
[0010] 本發明涉及用于檢測核酸序列的方法，其中與所述核酸序列相對應的變性雙鏈核 酸的復性被阻斷。
[0011] "核酸序列的檢測"在本文表示導致直接或間接獲得一些關于特異核酸序列存在 或不存的信息的所有活動，其包括但不限于檢測核酸分子中的特定序列，或檢測兩個不同 核酸分子序列之間的差異。核酸序列的檢測可包括所述核酸序列的實際確定，即破譯在所 述核酸中實際連續的堿基；但是，在大多數實施方式中，可以不測序所述核酸而進行本發 明。
[0012] 本發明基于這樣的觀察，即變性雙鏈核酸的兩條鏈在適當的條件下將重新雜交。 如果在復性步驟期間一些分子結合至所述變性雙鏈核酸的任意鏈，則重新雜交僅是部分 的。本發明人目前已發現，在某些條件下，在重新雜交中這種永久或瞬時的暫停可用于檢測 變性雙鏈核酸分子中所包含的序列。根據本發明，有可能檢測雙鏈核酸分子重新雜交的阻 斷；與這種阻斷相關的物理參數（如，阻斷的持續時間，在雙鏈核酸分子上阻斷的位置）從 而允許確定核酸序列。
[0013] 因此，本發明涉及用于檢測核酸序列的方法，所述方法包括步驟：檢測與所述核酸 序列相對應的變性雙鏈核酸復性的阻斷。
[0014] "變性"在本文表示當所述鏈之間的大部分氫鍵斷裂時發生的雙鏈核酸分子的兩 條鏈分離的過程。變性過程產生變性核酸分子，其在本文表示雙鏈核酸分子變性所產生的 兩條分離的互補鏈。"復性"在本文指兩條分離的互補鏈通過雜交重新形成雙螺旋的過程。 如本文所用，"雜交"是核酸的兩條或多條互補鏈之間建立非共價的、序列特異性的相互作 用從而形成單個雜交體的過程。
[0015] 本領域技術人員已知有幾種可能性來變性核酸。在一個最優選的方式中，通過向 兩條鏈施加物理力將其分開。根據本發明的"物理力"是導致物體經歷某種改變的任何影 響力，該改變關于其運動、方向或幾何構造。本領域技術人員將清楚根據本發明的力與其它 物理參數如溫度（這是直接的物質屬性而不是施加于其上的影響力）不同。根據本發明的 物理力包括這樣的力如摩擦力、拉力、法向力、空氣阻力、作用力、和彈力。最優選地，根據本 發明的物理力是拉力。根據本實施方式，所述雙鏈核酸的游離端可被拉開，因此使配對堿基 之間的所有鍵斷裂從而打開雙鏈核酸。
[0016] 因此，在一個實施方式中，本發明的方法涉及用于檢測核酸序列的方法，所述方法 包括以下步驟：
[0017] ?通過向雙鏈核酸分子施加物理力使對應于所述核酸序列的所述雙鏈核酸分子變 性；以及
[0018] ?檢測所述雙鏈核酸復性的阻斷。
[0019] 在這種類型的序列檢測方法中，為了促進重新配對，安排雙鏈DNA的游離端（即沒 有附著至支持物的端）在被拉開之前共價或準共價彼此連接是有利的。在一個優選的實施 方式中，雙鏈核酸分子是發夾。在本發明的上下文中如果需要圖表地表示雙鏈核酸，可能將 其比作打開（或關閉）的"拉鏈"（zip fastener):雙鏈核酸的變性就是打開拉鏈，復性是 拉上拉鏈。
[0020] 本發明人已經觀察到，在一定條件下，當分子結合至變性雙鏈核酸分子時，所述分 子的復性被阻斷。結合的分子可以是對所述變性雙鏈核酸分子上的特異性序列具有親和性 的任何類型的分子，如核酸、蛋白質或小分子。然而，優選使用單鏈核酸，因為所述單鏈核酸 可以與變性雙鏈核酸鏈的一條鏈上的互補序列雜交。只要這種單鏈核酸長到足以阻斷復性 過程，它可以是任何長度的。優選地，單鏈核酸的長度包括在3和50個核苷酸之間；更優 選地，在3和45個核苷酸之間，在3和40個核苷酸之間，在3和35個核苷酸之間，在3和 30個核苷酸之間，在3和25個核苷酸之間，在3和20個核苷酸之間，在3和15個核苷酸之 間，甚至更優選3和12個核苷酸之間。本發明的單鏈核酸尤其可以是天然的或修飾的DNA 或RNA分子。所述單鏈核酸也可以由修飾的核苷酸構成，如鎖核酸（LNA)，它是其中核糖部 分修飾有連接2'氧和4'碳的額外橋的核苷酸，或者肽核酸（PNA)，其中骨架由通過肽鍵連 接的重復的N-(2-氨乙基）-甘氨酸單元組成。
[0021] 在復性之前向變性雙鏈核酸添加單鏈核酸分子時，重新雜交的阻斷表明單鏈核酸 分子序列與雙鏈核酸分子的至少部分序列是互補的。
[0022] 因此，本發明的方法還涉及用于檢測核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟：
[0023] 1)通過向所述分子施加物理力使雙鏈核酸分子變性；
[0024] 2)提供與所述核酸序列相對應的單鏈核酸分子；
[0025] 3)在所述單鏈核酸分子存在時使所述雙鏈核酸分子復性；以及
[0026] 4)檢測雙鏈核酸復性的阻斷。
[0027] 本發明適用于任何類型的雙鏈核酸。大多數情況下，雙鏈核酸將是DNA，但應當理 解，本發明也適用于單鏈DNA-單鏈DNA雙鏈體，完全配對的或者不完全配對的；或可選擇地 適用于單鏈DNA-單鏈RNA雙鏈體，完全配對的或者不完全配對的；或可選擇地適用于單鏈 RNA-單鏈RNA雙鏈體，完全配對的或者不完全配對的。此外，雙鏈體可由獲自不同來源樣本 的兩條單鏈的至少部分重新配對所組成。最后，本發明也適用于僅有單鏈DNA或僅有單鏈 RNA的二級結構。
[0028] 在典型的構型中，雙鏈核酸分子可以特異性地錨定在兩種固體基質上（如顯微鏡 載玻片、微量移液器、微粒）。末端之一可直接或間接地附到表面，而另一個末端直接或間接 附到可移動的表面。在本實施方式中，當移開支持物時拉力施加到雙鏈核酸的兩個末端。當 拉力高于閾值時，兩條鏈分離而核酸分子變性。施加的拉力優選高于或等于15pN ;更優選 高于或等于16pN ;甚至更優選高于或等于17pN ;在非常優選的方面，拉力高于或等于18pN。 這種力可隨溫度、核苷酸類型和緩沖液而變化，但本領域技術人員根據這些參數將很容易 調整所述力以獲得兩條鏈的分離。另一方面，當拉力下降到低于最小值時，變性雙鏈核酸的 兩條鏈可以重新雜交。為獲得所述兩條鏈的重新雜交，優選施加小于或等于12pN的拉力； 更優選地，其小于或等于llpN ;甚至更優選地，其小于或等于10pN。
[0029] 最優選地，雙鏈核酸是發夾。如本文所用，"發夾"是指這樣的雙螺旋，其中一條鏈 的5'端通過未配對的環物理連接到另一條鏈的3'端。所述物理連接可以是共價或非共價 的。優選地，所述物理連接是共價鍵。因此，發夾由雙鏈莖和未配對的環組成。在發夾中， 兩條鏈的未參與到環中的端是游離的，因此可被拉開。這導致雙鏈核酸的未配對，從而產生 變性雙鏈核酸分子。有可能通過用高于閾值的力拉所述核酸分子的每一末端而完全打開發 夾雙鏈核酸分子。當施加到分子的拉力下降到低于最小值時，核酸分子重新雜交并重新形 成發夾。雜交至核酸鏈之一的單鏈核酸分子的存在導致重新雜交的暫停。因此，檢測到這 樣的暫停表明單鏈核酸分子包含與至少部分的雙鏈莖相互補的序列。
[0030] 在這方面，有利的是設計環序列和長度以便發夾在短瞬間之后，如1秒后重新折 疊。在現有技術中已經描述了達到這種效果的方法，如在Woodside等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，103 (16) : 6190-6195, 2006中。當力從打開降低至測試值時，打開的發夾的延伸 因為單鏈DNA的彈性而變化。發夾重新折疊前的小延遲允許用戶確定在與用于檢測阻斷狀 態所用力相同的力下發夾的延伸。
[0031] 特別是，使用發夾使得有可能進行配對和解除配對的循環，從而改善信號/噪音 比率。
[0032] 已知允許雙鏈核酸的游離端連接在一起的技術，一些技術將在以下更詳細地描 述。
[0033] 確定阻斷在本文意味著確定與阻斷相關的物理參數。一個有用的參數是在雙鏈核 酸分子上阻斷的位置，所述位置對應于單鏈核酸分子在雙鏈核酸分子上雜交的位置。事實 上，本發明人已經發現可精確確定復性中在雙鏈核酸上暫停發生的位置：使用發夾為本領 域技術人員提供一種手段，以便確定在變性/復性過程期間的任何時間上發夾兩個游離端 之間的物理距離。
[0034] "游離端"在本文表示沒有共價連接到另一條鏈末端的一條鏈的端；如上面所解釋 的，這些游離端中的每個均可以結合至不同的表面。例如，這些表面中的一個可以是可移動 的，而另一個可以是靜止的。因此，本領域技術人員將很容易地認識到，為測量發夾雙鏈核 酸游離端之間的距離，有可能僅簡單地測量兩個表面之間的距離。
[0035] 當發夾分子完全變性時這種距離最大（Zs (FiTff))，因為那時發夾核酸完全延伸； 當所述發夾分子完全復性時，這種距離最小（Zis(F Wi))。有利地，在相同力進行所 有長度的比較，以使得單鏈核酸具有相同的彈性性能。通過使用環關閉中的延遲，有技能的 用戶可以測量z s (F_a)。同樣地，當復性過程臨時性地暫停時可以測量兩個游離端之間 的距離：如預期地，這種距離z介于Z^PZ ffi (所有z以F = F#W進行測量）之間。很清楚 地，隨著單鏈核酸序列所互補的序列在發夾分子中的定位變化而距離z變化。如果所述單 鏈核酸和位于靠近發夾游離端的序列相雜交，則自我重新雜交的過程就剛好在重新形成完 整發夾之前被阻斷；在這種情況下，是最小值。另一方面，如果所述單鏈核酸和靠近未 配對環的發夾部分相雜交，復性過程將被阻遏在這樣種情況：其中發夾是完全或幾乎完全 變性的；在這種情況下，最大（圖1)。
[0036] 在另一個實施方式中，將一個或更多參考單鏈核酸雜交至DNA發夾上的已知序列 (例如，靠近其基部或靠近其環），并且相對于所述參考單鏈核酸的雜交位置來測量探測的 單鏈核酸的雜交位置。
[0037] 有可能精確地將雙鏈核酸分子中的物理距離與若干堿基相關聯。例如，在10pN力 下，0.8nm的距離對應于核酸中由兩個核苷酸（lbp)所跨越的距離。由單鏈核酸的彈性給出 相對于力的準確校準。因此，通過簡單測量雙鏈核酸分子兩個游離端（或在所述分子上的 任意兩個參考位置）之間的距離有可能精確地確定復性在何處被阻斷。
[0038] 因此，在一個實施方式中，本發明由用于檢測核酸序列的方法組成，其中對應于待 檢測序列的雙鏈核酸分子首先通過施加物理力變性，然后在單鏈核酸存在下重新雜交，以 及檢測重新雜交中阻斷的存在。在一個方面中，當復性過程被阻斷時，確定雙鏈分子兩端之 間的距離。優選地，當分子完全變性時，確定所述分子兩端之間的距離。更優選地，比較兩 個距離并確定阻斷的位置。更優選地，測量在完全延伸的環和參考雜交位置之間的距離，并 用其確定阻斷的位置。甚至更優選地，測量兩個參考雜交位置之間的距離，并用其確定阻斷 的位置。
[0039] 除了其在分子上的位置，與復性阻斷相關的最有用的參數是復性被阻斷期間的時 間長短（本文稱為復性暫停的持續時間）。事實上，有可能測量重新雜交被阻斷期間的時間 長短。例如，本領域技術人員可以確定以下期間的時間長短：其間雙鏈核酸的兩端之間距離 為如上所定義的z，即中間值在2胃和Z ffi之間。
[0040] 阻斷的持續時間取決于兩條序列之間的互補程度。互補性越高，兩分子之間建立 的鍵的數目越多，并且因此持續時間越長。還清楚的是，阻斷時間將取決于兩條序列之間互 補性區域的長度。區域越長，兩分子之間建立的鍵的數目越多，因此持續時間越長。因此容 易想到，在某些條件下復性暫停的持續時間將幾乎是永久的。特別是，當單鏈核酸包含多于 20個，優選多于25個，甚至更優選多于30個能夠與變性雙鏈核酸雜交的核苷酸時，即使當 向所述雙鏈核酸施加的力降低到？ 3^時，單鏈核酸仍然與雙鏈發夾雜交（許多分鐘），從而 防止所述雙鏈發夾的自己重新雜交。在這樣的情況下，使用酶去除單鏈核酸分子可能是有 利的。因此，去除所述單鏈核酸分子使得可能進行配對和解除配對的循環，從而改善信號/ 噪音比。作為合適的酶的實例,可以舉出例如解旋酶，包括UvrD解旋酶、大腸桿菌UvrD解 旋酶、Tte-UvrD解旋酶、T7 Gp4解旋酶、RecBCD解旋酶、DnaB解旋酶、MCM解旋酶、Rep解旋 酶、RecQ解旋酶、PcrA解旋酶、T4 UvsW解旋酶、SV40大T抗原解旋酶、皰疹病毒解旋酶、酵 母Sgsl解旋酶、DEAH_ATP依賴的解旋酶和乳頭狀瘤病毒解旋酶E1蛋白及其同源物。優選 地，使用T4 UvsW解旋酶。
[0041] 暫停的持續時間也可隨著反應條件變化。所述持續時間將隨著溫度的升高而降 低。同樣，緩沖條件也可以調節暫停的持續時間：例如，鎂、甜菜堿和氯化四甲銨（以摩爾濃 度使用的TMAC)增加阻斷時間。與GC相比，這些化合物更加加強AT配對，從而減少這些配 對之間強度的差異。然而，當溫度和緩沖液固定時，暫停的持續時間將僅取決于拉動變性雙 鏈核酸的力以及其與單鏈核酸的互補性。
[0042] 因此，在一個具體方面，本發明的方法包括以下步驟：
[0043] ?通過向所述雙鏈核酸分子施加物理力使與所述核酸序列相對應的所述雙鏈核酸 分子變性；
[0044] ?提供單鏈核酸分子；
[0045] ?在所述單鏈核酸分子存在下使所述雙鏈核酸分子復性；以及
[0046] ?檢測所述雙鏈核酸分子復性的阻斷；以及
[0047] ?確定暫停的持續時間。
[0048] 鑒于現有技術的方法全都使用熒光核苷酸，但本發明的方法只涉及核酸分子延伸 的機械檢測。因此，本發明的方法不受與現有技術方法相關的任何弊端所困。
[0049] 在優選的方面中，檢測所述雙鏈核酸分子復性的阻斷包括確定雙鏈核酸分子上阻 斷的位置，如上所述。
[0050] 在這個【具體實施方式】中，根據本發明的方法可用于診斷目的，從而允許特別是測 序與尋找的異常相對應的核酸的變異區。
[0051] 然而，基于觀察到的寡核苷酸和DNA序列之間的錯配導致更短暫的雜交，有可能 提供一種簡化的技術。在第一方面，利用上述任何方法使發夾雙鏈核酸分子的復性被單鏈 核酸阻斷，并確定阻斷的持續時間。在優選的方面中，該值和參考值進行比較。在另一優選 的方面，所述參考值對應于如通過上述任何方法所確定的通過參考單鏈核酸所觀察到的暫 停長度。
[0052] 出于診斷目的，如尋找基因組DNA中的突變，所述技術可以以兩種方式實施：
[0053] 1)在溶液中用寡核苷酸探測含有被尋找的突變的基因組DNA所形成的發夾。
[0054] 2)通過在溶液中以固定大小的單鏈DNA片段存在的基因組DNA來探測發夾，所述 發夾包含具有被尋找突變的序列。這將是顯而易見的，即如果分析的目標只是找到這種序 列中特異性序列或可能突變的存在，則把該序列置于發夾環中提供一種非常簡單的檢測方 案。如果寡核苷酸在環中雜交，則寡核苷酸完全阻止發夾重新折疊，從而導致非常大的延伸 改變，因此可以輕易檢測到所述延伸改變，如下文所述。
[0055] 鑒于現有技術的方法須使用熒光或放射性核苷酸來標記探針，而本方法僅依賴機 械檢測核酸分子延伸。此外，不需要檢測前的擴增步驟。因此，本發明的方法允許檢測在一 整群核酸分子內的一個單一分子。因為用本發明的方法可獲得單分子分辨率，可以檢測每 個攜帶特異序列的分子。因此，本發明使得本領域技術人員能夠計數攜帶所述序列的核酸 分子的數目。本發明的方法允許簡單和精確地定量在整群核酸分子中的特異核酸序列。
[0056] 因此，在本發明的另一方面提供定量樣本中含有特異序列的一個種類（species) 的雙鏈核酸分子的方法，所述方法包括以下步驟：
[0057] a)通過向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性；
[0058] b)提供與所述序列相對應的單鏈核酸分子；
[0059] c)在所述單鏈核酸分子存在時使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復性；以及
[0060] d)檢測在其中復性被阻斷的雙鏈核酸分子；以及
[0061] e)計數步驟d)的雙鏈核酸分子。
[0062] 待定量的核酸種類（species)是含有所述特異序列的核酸分子的群。因此，它們 與其它核酸分子的不同之處在于它們含有這種特異序列。雖然這些分子都具有這種序列， 它們可以相同或可以不相同。在某些實施方式中，本領域技術人員可優選測量在所述特定 序列之外不相同的核酸種類的數量；例如，可令人感興趣的是本領域技術人員測量G1細胞 周期蛋白轉錄物CLN1和CLN2的數量，所述CLN1和CLN2在出芽酵母細胞進入細胞周期時 表達。在一些其它實施方式中，可更優選的定量一群相同的核酸分子，例如，由差異剪接所 得的基因的不同亞型。這可以通過仔細選擇所述特異序列來容易地實現：在可公開獲得的 序列數據庫（例如，Genbank)的幫助下，本領域技術人員知道如何設計與上述情況中的一 個或其它相對應的序列，而無須在此進一步詳述。
[0063] 也可能使用一個以上的單鏈核酸，所述一個或更多個單鏈核酸能夠與在變性雙鏈 核酸分子上的一個或更多個不同序列進行雜交。
[0064] 當使用一個以上單鏈核酸分子時，有利地是所述一個或更多個單鏈核酸對應于一 個或更多個不同的序列。在這種情況下，可以同時或相繼地將所述單鏈核酸分子加至變性 雙鏈核酸分子中。所述不同的單鏈核酸可在不同位置阻斷所述變性雙鏈核酸的復性。基于 每個單鏈核酸序列與所述雙鏈核酸序列的相似程度，重新雜交期間的阻斷數量和位置限定 出獨特的指紋。因此，指紋是阻斷的模式，其在所述變性雙鏈核酸分子復性階段期間作為一 個或更多個單鏈核酸與雙鏈核酸分子相雜交的結果被觀察到。這種指紋可用于在DNA樣本 中鑒定和計數各種雙鏈分子。
[0065] 所建議的方法學不需要使用熒光標記的探針，并提供額外的位置信息（超出僅僅 的探針雜交）。例如，使用這種方法可以比較地檢查成千上萬的個體文庫片段。將具有類似 指紋的cDNA分成群集，從而其提供關于表達基因數目以及基因相對表達水平的信息。
[0066] 因此，在一個【具體實施方式】中，本發明的方法涉及用于定量在樣本中的含有一個 或更多個特異序列的一個種類的雙鏈核酸分子的方法，所述方法包括以下步驟：
[0067] a)通過向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性；
[0068] b)提供與所述一個或更多個序列相對應的一個或更多個單鏈核酸分子；
[0069] c)在所述單鏈核酸分子存在時使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復性；
[0070] d)檢測在其中復性被所述一個或更多個單鏈核酸分子阻斷的雙鏈核酸分子；以 及
[0071] e)計數步驟d)的分子。
[0072] 優選地，在步驟b)提供至少2種單鏈分子；更優選地，至少3種；又更優選地，至少 5種；甚至更優選地，至少10種；最優選地至少15種。
[0073] 本發明的樣本是任何類型的樣本，其可含有所需核酸種類（species)，如，例如反 應混合物。其也可以是，例如生物樣本。"生物樣本"可以是可含有生物有機體的任何樣本， 如，例如細菌、病毒、植物、酵母等。根據本發明的"生物樣本"還涉及可從生物有機體獲得 的樣本，如獲自細菌、病毒、植物、酵母等的細胞提取物。具體地，生物樣本可以是取自受試 者的任何樣本，如血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、血液樣本、淋巴樣本、或活檢樣本。這樣的 樣本必須允許定量染色體序列。用于定量基因組序列的優選生物樣本，包括樣本如血液樣 本、血漿樣本、淋巴樣本、或活檢樣本。優選地，所述生物樣本是血液樣本。實際上，可以通 過完全無害的血液采集從孕婦獲得這種血液樣本，從而因此允許，例如胎兒非整倍體的非 侵入性診斷。另外，可以使用來自癌癥患者的血液樣本，例如用于通過本發明的方法來表征 液體腫瘤。
[0074] 當癌癥是實體癌癥時，本文所用的"生物樣本"還包括待測患者的實體癌癥樣本。 這樣的實體癌癥樣本允許技術人員通過本發明的方法進行所需核酸水平的測量。在一些情 況下，根據本發明的方法可進一步包括從患者取出實體癌癥樣本的預備步驟。"實體癌癥樣 本"指腫瘤組織樣本。即使在癌性患者中，腫瘤位點的組織仍然包含非腫瘤健康組織。因 此，"癌癥樣本"應當限制為取自患者的腫瘤組織。所述"癌癥樣本"可以是活檢樣本或取自 手術切除治療的樣本。根據一方面，來自患者的樣本是癌細胞或癌組織。
[0075] 根據本發明的樣本可僅含有待定量種類的核酸，但其也可含有其它分子。在優選 的實施方式中，所述樣本含有其它種類的核酸分子。根據這種實施方式，本發明還涉及用于 定量含有不同種類核酸分子的樣本中一個種類含有特異序列的核酸分子的方法，所述方法 包括以下步驟：
[0076] a)通過向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性；
[0077] b)提供與所述特異序列相對應的單鏈核酸分子；
[0078] c)在所述單鏈核酸分子存在時，使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復性；
[0079] d)檢測在其中復性被阻斷的雙鏈核酸分子；以及
[0080] e)計數步驟d)的雙鏈核酸分子。
[0081] 如上所述，還可能使用與一個或更多個序列相對應的一個或更多個單鏈核酸分 子，從而允許確定特異指紋。在這種實施方式中，本發明的方法基于定量顯示這種指紋的雙 鏈分子。因此，根據這種實施方式，本發明還涉及用于定量含有不同種類核酸分子的樣本中 含有一個或更多個特異序列的一個種類的核酸分子的方法，所述方法包括以下步驟：
[0082] a)通過向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性；
[0083] b)提供與所述一個或更多個序列相對應的一個或更多個單鏈核酸分子；
[0084] c)在所述單鏈核酸分子存在時使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復性；
[0085] d)檢測在其中復性被所述一個或更多個單鏈核酸分子所阻斷的雙鏈核酸分子； 以及
[0086] e)計數步驟d)的分子。
[0087] 優選地，在步驟b)提供至少2種單鏈分子；更優選地，至少3種；又更優選地，至少 5種；甚至更優選地，至少10種；最優選地至少15種。
[0088] 因此，每當需要定量核酸序列時可使用本發明。應用包括體外診斷領域，包括臨床 診斷、分子生物學領域的研究、高通量藥物篩選、獸醫診斷、農業遺傳學測試、環境試驗、食 品測試、工業過程監測、生物安全、法醫和保險領域測試。體外診斷和臨床診斷涉及分析由 身體提取的核酸樣本以便檢測疾病或病癥的存在、其發展階段和/或嚴重性、以及患者對 治療的反應。在高通量藥物篩選和開發中，將核酸類似地用于其它試劑，例如抗原、抗體、受 體等，以便分析在高樣本數量設置中生物系統在暴露至化合物文庫時的反應，鑒定藥物先 導物。獸醫診斷和農業遺傳學測試涉及來自非人類動物或植物物品種的樣本，其類似體外 診斷，并提供農業遺傳產品和加工過程的質量控制方法。在環境測試中分析表明環境介質 如土壤、水、空氣等污染的生物體及其毒素。食品測試包括定量生物體如細菌、真菌等作為 質量控制的方法。在工業過程監控中，檢測和/或定量核酸以便表示生產過程的合適控制 和/或如果過程失控則生成信號。在保險測試中生物體和/或其毒素在篩選測試中鑒定以 確定客戶的風險類別或幫助審批候選人。已經有核酸的檢測和/或定量的其它各種應用， 并且正在不斷地開發新應用。
[0089] 這些應用之一是基因表達的分析。許多用于分析基因表達的方法已經描述在本領 域中。然而，最常用的方法，例如RT-PCR和DNA-微陣列使用昂貴的熒光核苷酸。此外，為 獲得所需的靈敏度必需進行之前的PCR擴增。通過比較，本發明提供不需擴增或熒光核苷 酸的在單分子水平上測量基因表達的方法。
[0090] 因此，在第一個實施方式中，本發明涉及用于測量樣本中基因表達的方法。"基因 表達"在本文中指所述基因的轉錄，即通過RNA聚合酶從基因 DNA模板合成信使RNA(mRNA) 分子；本文所用的"測量基因的表達"意為測量與所述基因相對應的特異mRNA的量。
[0091] 因此，根據本實施方式，通過上述定量方法之一來測量與所述基因相對應的所述 mRNA的量。
[0092] 對技術人員將是顯而易見，有利地在雙鏈核酸分子上進行所述定量方法。優選地， 在第一步驟中通過RNA轉錄物的復制來獲得雙鏈核酸分子。因此，根據本實施方式，本發明 提供用于測量在樣本中基因表達的方法，其包括以下步驟：
[0093] a)通過復制存在于樣本中的RNA分子來合成雙鏈核酸分子，以及
[0094] b)通過上述方法之一定量與所述基因相對應的mRNA分子種類。
[0095] 已知一些酶，其使用單鏈RNA為模板以生成雙鏈核酸。例如，可通過RNA依賴性RNA 聚合酶的作用來獲得雙鏈RNA分子。優選地，所述轉錄物首先通過逆轉錄酶逆轉錄成cDNA。 技術人員將認識到逆轉錄具有幾個優點。例如，其可以從已錨定到固體表面上的聚-T寡核 苷酸啟動。此外，可以將所得的RNA/cDNA雜合體先用RNA酶處理，然后用DNA聚合酶處理， 從而導致RNA部分降解以及新的互補DNA鏈合成。有利地，發夾序列被連接在cDNA鏈的游 離端，并且發夾序列可以用作新DNA鏈合成的引物。
[0096] 在另一實施方式中，本發明涉及用于確定染色體異常的方法。"染色體異常"在本 文中指染色體的非典型數目或在一條或更多條染色體中的結構異常。染色體的非典型數目 被稱為"非整倍體"：因而其是具有少于或多于正常染色體二倍體數目的病狀。當個體從染 色體對中缺失一條色體（單倍體）或具有多于兩條染色體的染色體對時，發生非整倍體。 "三體"是非整倍體，其中有特定染色體的三個拷貝而不是正常的兩個拷貝。"染色體中結構 異常"在本文中意為影響部分染色體拷貝數的事件，例如缺失、易位、重復、成環等。
[0097] 在細胞分裂期間當全部或部分染色體沒有正確分離時，這樣的染色體異常發生。 例如，當在腫瘤發生中癌性細胞進展時，其積累染色體異常，例如缺失、易位，得到或失去整 條染色體。這些染色體異常被認為是與癌性表型的獲得相關聯并且對每種癌癥類型特異。 癌癥越晚期則染色體異常的數目越多。因此，檢測這種染色體異常通常提供關于腫瘤侵襲 性和患者預后的很多信息。
[0098] 在本實施方式中，本發明因而提供用于檢測來自受試者的生物樣本中特定染色體 部分的異常分布的方法。更具體地，所述方法包括以下步驟：
[0099] a)通過上述方法之一來定量所述特定染色體部分的水平；
[0100] b)通過上述方法來定量另一染色體部分的水平；
[0101] c)計算在a)中獲得的水平與在b)中獲得的水平之間的比率；以及
[0102] d)確定所述特定染色體部分是否異常分布。
[0103] 如上所述，癌細胞在腫瘤發生的不同階段進展時積累染色體異常。因此，染色體在 腫瘤細胞中異常分布的檢測是所述腫瘤侵襲性的指征：染色體部分異常分布得越多，則腫 瘤侵襲越強。
[0104] 根據優選實施方案，因此本發明的受試者是患癌癥的患者。在本實施方式中，本發 明提供用于在患癌癥患者的癌癥樣本中診斷癌癥侵襲性的方法，所述方法包括以下步驟：
[0105] a)定量在所述患者癌癥樣本中第一特定染色體部分的水平；
[0106] b)定量在所述患者癌癥樣本中第二染色體部分的水平；
[0107] c)計算在a)中獲得的水平與在b)中獲得的水平之間的比率；
[0108] d)確定所述特定染色體部分是否異常分布；以及
[0109] e)如果所述染色體部分是異常分布，則診斷為侵襲性。
[0110] 根據本發明的"染色體部分"指整個染色體或染色體的重要片段。例如，中度唐氏 綜合癥已與部分三體21q22. 2 - qter相關聯。因此，本發明提供一種方法，其用于定量疑 似異常分布的染色體部分（步驟a)的染色體部分）并將此定量與參考染色體部分之一相 比較。因此，根據本發明的"參考染色體部分"是已知的非異常分布的染色體部分。在本發 明的本實施方式中，步驟b)的染色體部分為參考染色體部分。
[0111] 當然，重要的是選擇用于定量步驟a)和b)的染色體部分的序列以使得所述序列 對于對應的染色體部分是特異的。本領域技術人員將容易地認識到需要的信息可獲自可公 開獲得的序列數據庫，例如Genbank。
[0112] 通過稀有切點的限制性酶消化第一染色體從而方便地獲得雙鏈核酸分子的群。如 本領域技術人員所知，稀有切點的限制性酶是在基因組中識別非常稀有地存在的序列的限 制性酶，例如識別序列含有7或8個堿基。這種罕見切點酶的實例包括Sfi I、Xma I、Asc I、AsiS 1(同裂酶 Sgf I)、Not 1(同裂酶 CciN I)、Sbf 1(同裂酶 Sse8387 I、Sda I)、Fse I、Pac I等。所有這些酶都是商業上可獲得的。在第二步驟中，將因此獲得的限制性片段 通過常見的6堿基限制性酶，如EcoRI、BamHI、Xhol等進行消化。隨后，所得線性雙鏈片段 可以被轉化成發夾。已知允許雙鏈的游離端連接在一起的技術，并且一些將在下文中進一 步詳述。
[0113] 胎兒非整倍體通常是在父母生殖細胞系中減數分裂期間染色體分離缺陷的結果。 雖然胎兒非整倍體不像其它影響1000出生者中9個的出生缺陷一樣常見，其檢測仍然提供 了相當大的技術挑戰。
[0114] 母體血液中含有游離的母方DNA和游離的胎兒DNA，所述胎兒DNA作為 細胞死亡、剪切等的結果結束在血液中（Herzenberg等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:1453-1455, 1979 ;Bianchi 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3279-3283, 1990)。 已知無細胞的胎兒DNA僅代表母體血漿中存在的DNA的3-6 % (Lo等人，Am J Hum Genet, 62:768-775, 1998)。已描述了用于從母體血液診斷胎兒非整倍體的方 法；然而，這些方法需要遺傳材料的擴增步驟或使用鳥槍法測序，其是使用基于之 前 PCR 富集的方法（Lo，BJ0G，116:152-157, 2009 疋&11等人，？1'〇(3.恥七1.六。&(1.5(^· USA，105(42):16266-16271，2008;Chiu 等人，BMJ, 342: c7401, 2011 doi :10.1136/bmj. c7401)，因此這些方法易受潛在偏見的影響。
[0115] 在另一優選的實施方式中，因而所述受試者是孕婦。根據本實施方式，本發明提供 用于從所述孕婦的血液樣本中診斷胎兒非整倍體的方法，其包括：
[0116] a)定量在所述血液樣本中第一特定染色體部分的水平；
[0117] b)定量在所述血液樣本中第二染色體部分的水平；
[0118] c)計算在a)中獲得的水平與在b)中獲得的水平之間的比率；
[0119] d)確定所述特定染色體部分是否異常分布；以及
[0120] e)如果所述染色體部分是異常分布，則診斷為胎兒非整倍體。
[0121] 優選地，所述特定染色體部分是疑似在胎兒中異常分布的染色體部分。有利地，第 二染色體部分是參考染色體部分，即不受異常分布影響的染色體部分；因此，所述第二染色 體部分優選為在胎兒細胞中的二體。
[0122] 可通過本發明的方法來確定的優選的胎兒染色體非整倍體和伴發疾病或病癥包 括：特納綜合癥（性染色體單體性）、克氏綜合癥（XXY性染色體）、三X綜合癥（XXX性染 色體）、唐氏綜合癥（21三體）、愛德華茲綜合癥（18三體）或帕陶（Patau)綜合癥（13 三體）。已知針對15染色體的單親二體癥（uniparenteral disomy)為普拉德-威利 (Prader-Willi)綜合癥。如果待檢測這樣的單親二體癥，則還必須以對其是否為母方或 父方遺傳加以區分的方式來分析DNA。本文所用的非平衡易位包括，優選為非平衡的羅 伯遜三體rob (13q ;14q)。可通過本發明的方法優選地確定的其它結構畸變包括4q缺失 (Wolf-Hirschhorn (無對應中譯文）綜合癥）、5q_缺失（貓叫（cri du chat)綜合癥）或 微缺失綜合癥，特別是17ql 1. 2缺失（史密斯-馬蓋尼斯（Smith-Magenis)綜合癥）或 22ql 1. 2缺失（狄喬治（DiGeorge)綜合癥）。
[0123] 在優選的實施方式中，在步驟a)和b)中使用的序列是對胎兒DNA特異的序列。 例如，所述序列對應于來自父親遺傳的等位基因。在另一個實施方式中，序列對胎兒和母方 DNA都不特異。然而，因為血液中存在的DNA的10%是胎兒來源的，三體應導致1.05的步 驟c)的比率。對應每個染色體，需要大約100萬個小珠探測（通過掃描樣本）平均2 X104 個序列，其中約2X103個是胎兒來源的。預計的統計（計算）誤差將是大約1%，其允許對 診斷而言足夠大的S/N。
[0124] 本發明方法的實現已成為可能，特別是通過設計用于在單分子水平探測實時核酸 相互作用的裝置的存在。這種裝置描述于，例如美國專利No. 7, 052, 650和No. 7, 244, 391。 其中描述的設備使用磁阱來向微米尺寸的超順磁性珠施加皮牛頓尺度的力。簡要地說，所 述設備包括光學顯微鏡、磁體和PC。雙鏈核酸分子的一端在多個點上被錨定至靜止元件，如 表面，并且另一端被錨定至可移動的表面，在這種情況下所述可移動的表面是磁珠。提供磁 體以便作用于珠。特別是，磁體可用于拉動小珠離開表面。然而，本發明方法的實施并不限 于上述設備。任何允許完全延伸然后重新折疊雙鏈核酸分子并在同一時間同時監測所述分 子的延伸的裝置可用來實現本發明的方法。例如，可使用光鑷（optical tweezer);然而它 們需要事先進行力的校準，并且不容易進行并行化以便用于高通量測量。其它缺點是缺乏 核酸的總扭轉控制（total torsional control)以及可能的通過聚焦激光進行的溶液局部 加熱，其可改變雜交條件。
[0125] 雙鏈核酸在充足小珠（例如，鏈霉親和素包被的小珠）的溶液中孵育數分鐘，雙鏈 核酸通過其標記（例如生物素）端之一結合至小珠。如果之后使用光鑷進行操作，那么小 珠可以是透明的，或者如果使用磁阱或鑷子進行操作，那么小珠可以是磁性的。
[0126] 將組裝的小珠-核酸注射至流體室，其表面已被處理過，這樣以便結合分子的另 一標記端（例如抗地高辛包被的表面結合至核酸的地高辛標記端）。因此，小珠經由核酸發 夾錨定至表面，參見圖la。然后，通過本領域技術人員已知的各種手段監測小珠到表面的 距離：例如，其在相機圖像上的衍射環可用來推導其距離，或者當以隱失模式（evanescent mode)照亮時它們散射（或通過熒光發射）的光強度可以用來測量其距離。或者，（使用磁 傳感器，如GMR或Hall傳感器）可以測量它們所產生的磁場從而推導它們到錨定表面上的 傳感器的距離。
[0127] 為將牽拉將小珠錨定至表面的核酸分子，各種技術已被描述。可以使用聚焦激 光束的光來捕獲（trap)靠近聚焦點的透明珠。通過相對于錨定表面的相對光束平移 (translation)，可以向栓系分子施加力（典型的光鑷實驗）。施加的力與小珠從其平衡位 置的位移（displacement)成比例，為了對栓系分子施加恒定的力，需要捕獲束上的反饋環 路。
[0128] 為在小珠上施加恒定力，已描述使用通過環繞小珠的流動所產生的流體動力阻力 (hydrodynamic drag)，但它通常產生低的空間精確度（>100nm)。優選的實施方式使用磁講 來拉動通過如上所述的核酸發夾來錨定到表面上的超順磁性珠。在此構型中，放置在樣本 之上的小磁體用于在錨定的小珠上施加恒定的力，其位置可以以〈lnm的精確度來確定（取 決于拉力和歸因于流體動力阻力的損耗）。
[0129] 在每一個情況下，注意到可以通過用大于約16pN的力拉動小珠來機械地完全打 開栓系發夾。分子上的拉力降低至約llpN之下時允許發夾自發地重新拉上拉鏈（拉開拉 鏈的轉換盡管滯后但是可逆的）。如果在打開拉鏈階段期間，溶液中一些分子（例如蛋白 質或DNA、RNA、LNA或PNA的互補寡核苷酸）已結合至伸展開的單鏈核酸，當力降低到llpN 之下時這些分子將阻斷重新拉上發夾。因此，分析原理是兩種力之間的切換：大者FiTff用于 打開發夾以及較小者？_?用于允許重新拉上拉鏈以及測量在瞬時阻斷時分子的延伸。在完 全延伸和阻斷部分之間，阻斷位置和序列以線性關系相關聯。對于最佳的精確度，優選地在 測試力測量完全延伸。這通過設計這樣的發夾環來實現，即一旦力從F iTff降低到 ?，發夾環瞬間就重新折疊。
[0130] 可以使用本領域中已知的任一技術將核酸附至表面或支持物。實質上，核酸直接 錨定至支持物如微珠，其涉及所述表面的官能化，例如通過使用鏈霉親和素、C00H基團等對 所述表面進行包被，以便能夠與核酸官能化的末端進行作用。
[0131] 在一般情況下，這樣的方法必須官能化核酸，尤其在3'和5'端，也就是說在其上 接枝合適的化學基團。此外，優選通過環連接分子的另兩個游離端以防止鏈在操作結束時 解離，從而如果適當時可以重復后者。為了這個目的，可以采用不同的程序。
[0132] 最簡單的是使用合成的寡核苷酸用兩個不同的官能團（例如，生物素和胺）對雙 鏈核酸末端之一進行官能化，其允許錨定到兩個不同的預處理表面。使用部分配對的合成 核苷酸可以使兩條鏈在其另一端被連接成環的形狀。以這種方式，從雙鏈核酸產生配對的 單鏈核酸，即發夾。這種方法的優點在于它能夠官能化大核酸片段的異質群（如通過基因 或染色體的片段化（fractionation)所獲得的），然后可以對其進行同時分析。在這種情況 下，使用兩種（或更多）限制性酶將核酸樣本片段化，其使得能夠獲得在其端部具有兩種不 同的限制性位點的亞群這在所有片段中都是相似的。這使兩端能夠被差別處理（例如，通 過環的形式將在其端部具有適當的限制性位點的一端連接到寡核苷酸）。這種方法的缺點 在于兩個相鄰官能團之間的立體干擾，其可使得難以結合至表面。為了解決這個問題，有利 地可在發夾分子每個游離端添加堿基的"間隔"序列，然后向堿基"間隔"序列的末端加入官 能團；兩個間隔序列是非互補的，為每一個官能團提供足夠的空間來結合至其專門的表面。 更有利的是，設計每一個間隔序列的序列以便在本發明的測序方法中使用已知序列的單鏈 測序引物。可以用分子生物學中任何常用方法向雙鏈核酸分子添加環和/或間隔。這些方 法是本領域技術人員眾所周知的，因此沒有必要在此詳述。
[0133] 至于實際的錨定技術，有許多這種技術并且它們源自用于將大分子（蛋白質、DNA 等）錨定至的商業上可獲得的預處理表面的技術。大多數這些技術已被開發用于免疫學測 試以及將蛋白（免疫球蛋白）連接至表面，所述表面攜帶能夠與蛋白羧基（-COOH)或氨基 (-NH2)端反應的基團（-COOH、-NH 2、-0H 等）。
[0134] 可以通過分子5'端的游離磷酸直接完成核酸的共價錨定，其中游離磷酸與仲胺 (由斯特拉斯堡的Polylabo銷售的Covalink-NH表面）反應形成共價鍵。也可以用氨基將 DNA官能化，然后如同處理蛋白質一樣進行處理。
[0135] 也有鏈霉親和素包被的表面（Dynal小珠等），其許可鏈霉親和素和生物素化DNA 分子之間的準共價錨定。最后，通過將直接針對地高辛的抗體接枝到表面上（通過上面提 到的方法），用地高辛官能化的核酸可以錨定于此表面。這僅僅代表許多可能的錨定技術中 的一個示例。
[0136] 在附著與錨定技術當中還應該提到的是，例如在專利EP 152 886所描述的技術， 其使用酶偶聯用于將DNA附著到固體支持物如纖維素上。
[0137] 專利EP 146 815也描述了各種將DNA附著到支持物上的方法。
[0138] 相似地，專利申請W0 92/16659建議使用聚合物來附著DNA的方法。
[0139] 當然，核酸可以直接附著至支持物，但必要時，特別是考慮到限制表面的影響時， 核酸可以附著至肽或其他性質的惰性臂的末端，例如在歐洲專利EP 329 198中描述的。
[0140] 下面的實施例將帶出本發明的其它特征和優點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0141] 圖1 :檢測在重新雜交期間寡核苷酸誘導的阻斷。（a)具有在莖上預先安置的靶的 發夾構建設計。（b)在83 bp發夾上兩個寡核苷酸（SEQ ID NO. 1:5'-ACAGCCAGC-3'、SEQ ID N0.2:5'-ATGACAATCAG-3'）雜交引發的障礙實例（參見方法）。左側（panel):在F打開 =17. 8pN(橙色）和F#w= 11. 4pN(藍色；參見在頂部的力軌跡）記錄的實驗軌跡。觀察 到五個不同延伸水平從上到下對應于：（i)在FiTff處打開的發夾、（ii )在打開的 發夾、（iii)被第一寡核苷酸阻斷的部分退火的發夾、（iv )被第二寡核苷酸阻斷的部分退 火的發夾和（v)折疊的發夾。黑色曲線對應于平均1秒的原始數據。右側（panel):阻斷 (ii)-(iv)的直方圖。黑色曲線代表在F測試處重新雜交時在發夾的給定延伸中每個循環 的阻斷數的直方圖；其中在堿基對上的Λ Z = 獲自在單一發夾上?23個力循 環。數據的高斯擬合（Gaussian fits)顯示為紅色。這些擬合的方差（〇?lnm)定義設備 的分辨率。在發夾上的39. 60bp和28. 66bp處觀察到阻礙ZPM1和Z_2，這與40bp和29bp 處的預期位置（以綠色顯示）很好地吻合。
[0142] 圖2 :通過雜交的序列鑒定。通過2種不同寡核苷酸（標記為寡核苷酸1和2)鑒 定3種不同發夾（標記為分子1、2、3)(參見方法）。左側：在發夾打開-閉合循環過程中記 錄的實驗軌跡。為顯示對應的阻斷，將寡核苷酸1和2相繼加入溶液中：寡核苷酸1雜交在 分子2和3上，而寡核苷酸2雜交在分子1和2上。右側：寡核苷酸1 (桔色）和2 (藍色） 在每個分子上阻斷的直方圖，所述分子的完全延伸是灰色陰影。
[0143] 圖3 :照相機視野顯示許多小珠通過單發夾附著至玻璃表面。通過使用來自亮紅 LED的平行照明經由顯微鏡可看到這些。圍繞小珠的小衍射環用來測量其垂直位置。
[0144] 圖4 :顯示發夾設計的方案。
[0145] 圖5 :用于從mRNA生成cDNA發夾結構的方案。 實施例
[0146] 方法
[0147] DNA發夾構建
[0148] 如圖4所示，通過連接3個分離的合成寡核苷酸（Eurogentec and Integrated DNA科技）來構建短DNA發夾（在圖1和圖2中83bp，或在圖2中179bp)。在第一步，通 過加熱至95°C持續5分鐘，然后快速冷卻至80°C，接著每10秒緩慢降低0. 7°C直至4°C， 使得在dH20中的寡核苷酸（oligo)A-l(SEQIDN0·3:5'-生物素 -TTTTTTTTTTTTTTT τττ τττ τττ TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTT TTG GAT TCG CGG GTC TCT-3'）和寡核 苷酸 A-2(SEQ ID N0.4:5'-AAC CGT CCT TTA CTT GTC ATG CGC TCT AAT CTC TGG GCA TCT GGC TAT GAT GTT GAT GGA ACT GAC CAA ACG TCG GTG GG-3'）退火至互補的寡核苷 酸 A-3 (SEQ ID NO. 5:5' -磷酸化 AGG AAG AGA CCC GCG AAT CCC CCA CCG ACG TTT GGT CAG TT-3'）。使用NucleoSpin Extract II試劑盒（Clontech)來清洗這些退火產物，即標 記的部分A。對于對應于83 bp發夾的中間部分的寡核苷酸B-l (SEQ ID NO. 6:5'-磷酸化 的-TCC TGA TTG TCA TCG GCT GGC TGT TCG GTT AGT TTC GAA GAC TT-3'）和寡核苷酸 B-2(SEQIDN0·7:5'-磷酸化的-GCGMAGTCTTCGMACTAACCGAACAGCCAGCCGATGA CAA TC-3'），或者對應于179 bp發夾的中間部分的寡核苷酸B'-l (SEQ ID NO. 8:5'-磷酸化 的-TCC TCG TGC GTG AGC GAG CGC GGT CGG TCG GTC GGT AGC GAG CGC GTG CGT GCG TGC GTG GGC TGG CTG GCT GGC TCG GTC GGT CGT GCG TGC GGT CGG TGG CTG GCT AGC GAG CGA GCG AGC GGG CTG GCT GAA GAC TT-3'）和寡核苷酸 B'-2 (SEQ ID NO. 9:5'-磷酸化的-GCG AAA GTC TTC AGC CAG CCC GCT CGC TCG CTC GCT AGC CAG CCA CCG ACC GCA CGC ACG ACC GAC CGA GCC AGC CAG CCA GCC CAC GCA CGC ACG CAC GCG CTC GCT ACC GAC CGA CCG ACC GCG CTC GCT CAC GCA CG-3'），重復退火和清洗步驟。這些退火產物是標記的部分B或B'或 B〃。通過在25°C中在1XT4連接酶反應緩沖液中使用T4連接酶（5υ/μ I，Fermentas)持 續1.5小時，我們將部分A、部分B(或部分B'、B〃）連接至寡核苷酸C (SEQ ID NO. 10:5'-磷 酸化的-TCG CGC CTG ATC GTC CAC TTT TTT TTT AGT GGA CGA TCA GGC-3'），其是發夾的 環，然后通過加熱至65°C持續20分鐘來停止反應。使用NucleoSpin Extract II試劑盒來 清洗連接混合物。最后，在具有ImM地高辛-dUTP(R〇che)的1XNEB2緩沖液中使用克列諾 酶（Klenow) (3 - 5'外切）（New England Biolabs)在37°C持續15分鐘進行填充反應，由 此加入地高辛標記，然后通過加熱至75°C持續20分鐘來停止反應。再次使用NucleoSpin Extract II試劑盒來清洗發夾產物。
[0149] 對1241bp發夾（圖2)的制備方法描述在Manosas等人（似1:.〇16111· Biol.5:904-912, 2009)〇
[0150] 單分子分析
[0151] 在一端用地高辛標記、而在另一端用生物素標記的構建發夾被附著至顯微鏡流體 室的玻璃表面，所述玻璃表面預先使用抗-地高辛進行包被并使用牛血清白蛋白（BSA)進 行鈍化，所述構建的發夾還吸附至使用鏈霉親和素 （DYNAL MyOne)包被的Ιμπι超順磁性 珠。小磁體用于拉動附著在小珠上的單一 DNA分子。使用CCD照相機在31Hz獲得分子延 伸Z(t)。平均經過1秒的原始數據，達到?lnm的分辨率，同時伸展力F以10%的精確度 測量。數據收集過程中，我們從垂直位置軌跡Z(t)減去粘至表面的參考小珠的垂直位置 (Zref)，這有利于減少設置漂移。對于每一個打開/關閉循環，我們采用的高 斯擬合的中心作為關閉發夾的參考位置（延伸Onm)。類似的高斯擬合用于確定 在一個Z打開（F測試）和Z阻斷（F測試）循環的平均位置。誤差線代表s. e. m。
[0152] 對于圖2中的雜交鑒定，分子1是1214bp發夾，分子2是83bp發夾，以及分子3 是179bp發夾，而寡核苷酸1是SEQ ID NO. 11:5' -GAAGAGACCC-3'和寡核苷酸2是SEQ ID NO. 12:5'-CAGCCGATGAC-3'。
[0153] 結果
[0154] 檢測在發夾重新拉上拉鏈的途徑中的障礙
[0155] 在目前的方法中，DNA發夾在一端通過地高辛（Dig)-抗-地高辛鍵附著至蓋玻片， 在另一端通過生物素-鏈霉親和素鍵附著至磁性珠。可以以各種方式來生成所述DNA發夾。 例如，通過將基因組DNA片段在其一端連接至DNA環并在其另一端連接至使用生物素和地 高辛標記的DNA叉結構（圖la)。或者，可從在聚-T包被的小珠上俘獲mRNA并反轉錄后獲 得的cDNA來生成這種發夾（圖5)。
[0156] 樣本附近的小磁體用于對栓系小珠施加垂直力。小珠至表面的距離（即， 發夾的端至端的距離）可以從小珠的圖像實時推導出（Gosse&Croquette, Biop ys. J. , 82:3314-3329, 2002) 〇 或者，可以使用漸逝場照明（evanescent field illumination)從經由小珠分散的光強度來推斷出小珠至表面的距離。雖然設 置類似于使用光鑷進行的DNA拉開拉鏈實驗（Brower-Toland等人，？1"〇〇.似1:1· Acad. Sci. USA，99:1960-1965, 2002)，使用磁阱通過在許多分子同時應用相同 力允許高度并行（Gosse&Croquette, Biophys.J·，82:3314-3329, 2002 ;Strick 等，Science, 271:1835-1837, 1996)。
[0157] 我們調節力來周期性地打開和關閉在溶液中的DNA發夾（Essevaz-Roulet等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11935-11940, 1997)，溶液含有互補于部分發夾的寡核苷 酸。在圖lb中，通過施加力FiTff (>15pN)來周期性地展開83bp發夾，以及通過減少力至F (?10pN)來重新拉合上發夾。在展開或打開狀態，在溶液中的兩種不同的寡核苷酸可 以雜交至在發夾上的其各自的互補序列。其瞬時阻斷在低力下的發夾的重新折疊，這很容 易觀察到，因為在發夾的延伸中在其重新折疊的時間過程中的兩次暫停。
[0158] 這種測量方案提供兩件有價值的信息：沿發夾阻斷的位置和存在期。一個堿基對 的打開導致在發夾延伸上約〇. 85納米的改變。我們的設備目前具有的分辨率（?lnm)，我 們可因此記錄具有約一個核苷酸精確度的阻斷位置。應注意發夾的打開和關閉狀態之間的 切換提供對慢實驗漂移不敏感的差分延展測量。此外，只要所施加力保持恒定，所施加力的 精確值不是非常重要的。
[0159] 關于阻斷的存在期，其涉及到雜合體的穩定性，我們發現其取決于應用的拉力、互 補寡核苷酸的尺寸以及在寡核苷酸和發夾之間的錯配的存在與定位（數據未示出）。
[0160] 通過雜交指紋或單循環連接進行的序列鑒定
[0161] 在給定樣本中對所期望的DNA的鑒定是在許多情況下的相關問題，例如檢測基因 突變、基因復制、mRNA表達模式等。這種鑒定問題使用本方案非常容易。其需要在DNA發 夾樣本上檢測使用一組選擇的短（?lOnt)寡核苷酸獲得的給定的雜交指紋。這可以通過 在存在一個或幾個探針寡核苷酸時在發夾的重新雜交期間對阻斷進行測試來實現。如圖 2所示，可通過兩種不同寡核苷酸的雜交來實現三種不同DNA序列的鑒定。應當注意到因 為我們可以檢測雜合體的確切位置，沒有必要如通常所做的按順序測試每個探針。人們可 以鑒定幾個選擇的探針沿發夾的阻斷位置，并使用這種雜交模式，而不是僅僅鑒定作為DNA 序列指紋的雜交存在。
【權利要求】
1. 一種用于定量樣本中含有特異核酸序列的一個種類的雙鏈核酸分子的方法，所述方 法包括以下步驟： a) 通過向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性； b) 提供與所述序列相對應的單鏈核酸分子； c) 在所述單鏈核酸分子存在時使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復性； d) 檢測在其中復性被阻斷的雙鏈核酸分子；以及 e) 計數步驟d)的雙鏈核酸分子。
2. -種用于定量樣本中含有一個或更多個特異序列的一個種類的雙鏈核酸分子的方 法，所述方法包括以下步驟： a) 通過向雙鏈核酸分子施加物理力使在樣本中的所述雙鏈核酸分子變性； b) 提供與所述一個或更多個序列相對應的一個或更多個單鏈核酸分子； c) 在所述單鏈核酸分子存在時使步驟a)的所述變性雙鏈核酸分子復性；以及 d) 檢測在其中復性被所述一個或更多個單鏈核酸分子所阻斷的雙鏈核酸分子；以及 e) 計數步驟d)的雙鏈核酸分子。
3. 根據權利要求1或2中任一項所述的方法，其中所述雙鏈核酸分子是發夾。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中雙鏈核酸的一條鏈的至少一個堿基 直接或間接地附著至表面，并且其中雙鏈核酸的另一條鏈的至少一個堿基附著至可移動的 表面。
5. 根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中在步驟a)中通過移開支持物使雙鏈 核酸變性。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中通過移開支持物向雙鏈分子施加物理力，所述物 理力高于或等于15pN，優選地高于或等于17pN，更優選地高于或等于18pN。
7. 根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中在步驟c)中通過將支持物合在一起 使變性雙鏈核酸復性。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中通過使支持物合在一起將施加至雙鏈分子的力降 低至小于或等于12pN，優選地小于或等于llpN，更優選地小于或等于ΙΟρΝ。
9. 根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中雙鏈核酸未附著至支持物的末端彼 此共價或非共價地連接。
10. 根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中重復步驟a)至d)若干次（以便積 累測量并提高信號/噪音比率）。
11. 根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其中步驟d)的檢測包括測量附著至支 持物的雙鏈核酸分子的兩末端之間的距離（z)。
12. 根據權利要求11所述的方法，當所述雙鏈核酸分子變性時，所述方法包括測量附 著至支持物的雙鏈核酸分子的兩末端之間的距離（z s)的進一步的步驟。
13. 根據權利要求12所述的方法，其進一步包括以下步驟： a) 比較z和z ^，以及 b) 確定阻斷的位置。
14. 根據權利要求1至13中任一項所述的方法，其包括測量阻斷的持續時間的進一步 的步驟。
15. 根據權利要求14所述的方法，其包括將阻斷的持續時間與參考值進行比較的進一 步的步驟。
16. -種用于測量樣本中基因表達的方法，所述方法包括以下步驟： a) 通過復制在樣本中存在的RNA分子來合成雙鏈核酸分子，以及 b) 通過權利要求1-15中任一項所述的方法來定量與所述基因相對應的mRNA分子種 類。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述雙鏈核酸分子通過反轉錄合成。
18. 根據權利要求16或17中任一項所述的方法，其中從錨定至固體表面的聚T寡核苷 酸起始反轉錄。
19. 一種用于在來自受試者的生物樣本中檢測特定染色體部分的異常分布的方法，所 述方法包括以下步驟： a) 通過權利要求1至15中任一項所述的方法來定量所述特定染色體部分的水平； b) 通過權利要求1-15中任一項所述的方法來定量其他染色體部分的水平； c) 計算在a)中獲得的水平與在b)中獲得的水平之間的比率；以及 d) 確定所述特定染色體部分是否異常分布。
20. -種用于在患癌癥患者的癌癥樣本中診斷癌癥侵襲性的方法，所述方法包括以下 步驟： a) 根據權利要求19所述的方法來確定所述特定染色體部分是否在所述患者的癌癥樣 本中異常分布；以及 b) 如果所述染色體部分是異常分布，則診斷為侵襲性。
21. -種用于從所述孕婦的血液樣本中診斷胎兒非整倍體的方法，所述方法包括： a) 根據權利要求19所述的方法來確定特定染色體部分是否在所述血液樣本中異常分 布；以及 b) 如果所述染色體部分是異常分布，則診斷為胎兒非整倍體。
【文檔編號】C12Q1/68GK104254617SQ201280070163
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2012年12月21日 優先權日:2011年12月22日
【發明者】D·本西蒙, J-F·阿萊曼德, F-Y·丁, V·克羅凱特 申請人:國家科學研究中心, 巴黎高等師范學院, 皮埃爾和瑪利居里大學(巴黎第六大學)