核酸的定量、高度多重檢測的制作方法

核酸的定量、高度多重檢測的制作方法
【專利摘要】本發明提供了在多重單腔室反應中檢測和定量樣品中靶核酸的方法。提供了整合經優化腔室以降低高效陣列附近的信號背景的耗材，及其使用方法。本發明的特征是設置以使用所述耗材來實施所述方法的裝置和系統。
【專利說明】核酸的定量、高度多重檢測
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2012年2月17日提交的美國專利申請號13/399,872的優先權，其要 求2011年2月18日提交的美國臨時專利申請號61/463,580和2011年11月17日提交的 美國臨時專利申請號61/561，198的優先權，各所述專利申請通過引用全文納入本文以用 于所有目的。
[0003] 聯邦資助的研究與開發下作出發明的權利聲明
[0004] 本發明在美國國土安全部第HSHQDC-10-C-00053號基金資助下進行。政府可享有 本發明的某些權利。 發明領域
[0005] 本發明屬于實時DNA擴增、檢測和定量領域，以及相關耗材（consumable)、裝置和 系統（包括陣列）領域。
[0006] 發明背景
[0007] 實時PCR常規用于對生物樣品中感興趣核酸的檢測。實時PCR的綜述參見，例如Μ Tevfik Dorak(編）（2006) Real-time PCR(Advanced Methods)(《實時 PCR(高級方法）》）， TF 公司（Taylor & Francis)，第一版 ISBN-10 :041537734X ISBN-13 :978-0415377348, 和 Logan 等（編）（2009)Real_Time PCR :Current Technology and Applications(《實 時PCR :新編技術和應用》），Caister學術出版社，第一版ISBN10 :1904455395, ISBN-13 : 978-1904455394。其他細節還可參見例如 Gelfand 等，"Homogeneous Assay System Using The Nuclease Activity ofA Nucleic Acid Polymerase (使用核酸聚合酶的核酸酶活性的 均勻分析系統），'USP5, 210, 015 ;Leone 等，（1995) " Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA(分子信 標探針與NASBA擴增的結合能均勻實時檢測RNA) " Nucleic Acids Res. 26:2150-2155; 以及 Tyagi 和 Kramer(1996) "Molecular beacons ：probes that fluoresce upon hybridization (分子信標：基于雜交的突光探針），^NatureBiotechnologyl4 :303_308。傳 統上，用于在單一反應容器（如多孔板的孔）中檢測多于一種靶核酸/樣品的單孔多重技 術（multiplexing)利用對各擴增子具有特異性的自淬滅PCR探針（諸如TAQMAN?或分子 信標探針的）來實現。在與溶液中的擴增子結合后，或在PCR過程中的探針降解后，所述探 針不淬滅（unquench)，生成可檢測信號。所述探針用不同波長的熒光團標記，從而允許單 個"單罐式"反應中至多約5個靶標的多重技術能力。由于實際光譜范圍和標記物發射的 限制，很難實現超過約5個探針/反應。這嚴重限制了單一反應的多重化，進而嚴重限制了 能被篩選的靶標數量/樣品，并提高了檢測多種感興趣靶標的成本和設備復雜性。
[0008] 核酸陣列代表另一種使擴增產物的檢測多重化的方法。最常見地，對樣品進行擴 增反應，然后在核酸陣列上分別檢測擴增子。例如Sorge "Methods for Detection of a Target Nucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure (使用包含二級 結構的探針檢測靶核酸的方法）"US6, 350, 580提出了通過從擴增混合物純化探針并隨后 檢測該探針來捕獲擴增后釋放的探針。這種生成和檢測擴增子的多步法使對于擴增混合物 的實時分析變得不切實際。
[0009] 也提出了在捕獲核酸存在下擴增反應物的多種方法。例如，Kleiber等 "Integrated Method and System for Amplifying And Detecting Nucleic Acids(擴 增和檢測核酸的綜合方法與系統）"US6, 270, 965提出了通過逐漸消失（evanescence)誘 導的突光來檢測擴增子。相似地，Alexandre 等"Identification and Quantification of a Plurality of Biological (Micro) Organisms or Their Components (多種（微）生物 體或其成分的鑒定和定量）"US7, 829, 313,提出了在陣列上檢測擴增子。在另一個示例 中，通過檢測作為擴增結果生成的探針片段來檢測靶多核苷酸，所述檢測例如通過結合至 電極，然后進行電化學檢測。參見，例如Aivazachvilli等，"Detection of Nucleic Acid Amplification(核酸擴增的檢測）"US2007/0099211 ;Aivazachvilli 等，"Systems and Methods for Detecting Nucleic Acids (檢測核酸的系統和方法）"US2008/0193940,和 Scaboo 等，"Methods And Systems for Detecting Nucleic Acids (檢測核酸的方法和系 統）"US2008/0241838。
[0010] 所有這些方法均受到限制其用于多重靶核酸檢測的實踐限制。例如 Kleiber(US6270, 965)依靠逐漸消失（evanescence)誘導的突光以檢測陣列表面處的擴增 子的熒光，并且需要復雜和昂貴的鏡片和陣列。Alexand re(7,829,313)提出在陣列上檢測 擴增子；如Kleiber所述，這顯著增加了陣列成本，因為各陣列必需個體化設計以檢測各擴 增子。如Alexandre所述，實踐中，對于陣列上的不同擴增子可能難以實現相似的雜交動力 學，特別是當擴增子相對較大時。另外，本領域對于如何在其中有同樣包含高水平信號背景 的伴隨溶液相的陣列上或者在通過原位熱循環保持穩定的陣列上檢測信號幾乎沒有提供 引導。
[0011] 本發明克服了本領域中這些問題和其他問題。通過完整閱讀以下內容可以更完整 地理解本發明。


【發明內容】

[0012] 本發明提供了允許高度多重檢測感興趣核酸的方法及相關裝置、系統和耗材，例 如用于檢測病毒、細菌、痕原蟲（Plasmodium)屬、真菌或生物樣品中的其他病原體。所述耗 材包含信號優化的腔室，所述信號優化的腔室在該腔室內表面具有高效熱穩定核酸檢測陣 列。所述陣列被設置以檢測多至約1〇〇種或更多種不同通用標記的探針。所述方法在感興 趣核酸部分的擴增過程中產生帶標記的通用探針（如"探針片段"），所述擴增反應在腔室 中進行。所述通用探針在少數擴增循環后與陣列雜交，并隨后進行選擇的擴增循環，允許對 樣品中的一種或多種感興趣核酸進行實時檢測和定量。
[0013] 因此，在第一個方面，提供了檢測靶核酸的方法。該方法包括提供檢測腔室，所述 檢測腔室在該腔室的至少一個表面上具有至少一個高效核酸檢測陣列。所述高效陣列通常 包含非速率限制數量的捕獲核酸，其允許增加對腔室中反應生成的可檢測探針片段的捕獲 速率，并且所述捕獲核酸被設置以捕獲相對小的探針核酸，這也增加陣列效率。對于探針與 陣列的結合的檢測優選在選擇或設置以降低所述陣列附近的背景信號水平（如由未結合 的游離探針所產生）的條件下進行。例如，在某些實施方式中，設置腔室本身以降低陣列附 近的信號背景，例如，通過使腔室成型來降低背景（如通過使陣列附近的腔室相對薄，如所 述腔室通常是陣列之上約500 μ m或更薄）。較薄的腔室也具有較少的熱質量，從而相較較 厚的腔室，其溫度循環更快且更有效。下文詳細討論了其中設置所述系統和方法以降低背 景號水平的其他方式。
[0014] 將具有待檢測靶核酸的一個或多個拷貝的樣品加載到該檢測腔室中。使擴增引物 和帶標記的探針與一種或多種靶核酸拷貝雜交。在擴增引物依賴的擴增反應中擴增至少一 種或多種靶核酸拷貝的至少一部分。擴增反應導致帶標記的探針的切割，這例如歸因于擴 增酶的核酸酶活性。這造成帶標記的探針片段的釋放，其待由所述陣列檢測。使帶標記的 探針片段與高效陣列雜交（通常在進行少數擴增循環以擴增腔室中釋放的探針片段的量 之后）。然后檢測由帶標記的探針片段和陣列結合生成的標記物信號，從而檢測靶核酸。
[0015] 所述檢測腔室的確切構造是可以改變的。選擇所述構造以降低陣列附近的腔室中 的信號背景。通常，腔室中信號的至少1%，和常常約5%或更多在陣列區域中的陣列處集 中（如約6%、8%或甚至10%或更多）。盡管常希望更低的水平，可使總體信號99%或更 少的背景通過系統標準化。在本文所述的典型實施方式中，通過對陣列附近的腔室構造進 行優化來達到95%或更小的總體背景水平。例如，通過將陣列上方的腔室深度保持至最小 值來實現這種構造優化。在典型實施方式中，所述陣列附近的腔室深度或其他維度上小于 約1mm，更典型地在所述陣列附近的至少一個維度上是約500 μ m或更小，優選約250 μ m或 更小，例如約10 μ m-約200 μ m，并且在一些實施方式中，所述陣列附近的腔室在某一維度 上是約150 μ m。在本文一個實例中，所述陣列之上的所述腔室的深度為約142 μ m。在本文 另一個實例中，所述腔室深度為約l〇〇ym。相應的腔室維度取決于檢測系統的信號檢測路 徑，例如當光通過陣列生成信號，其中一些光從陣列溢出陣列并進入陣列之上的液體中時， 所述相應維度是陣列上腔室的深度。除了降低檢測到的背景信號水平以外，減小腔室厚度 也有利于減小背景噪音成分的影響，例如，與陣列點信號的特異性檢測無關的檢測器響應 和來自反應流體的背景信號。特別地，一個主要的噪音來源是所用檢測器的散射噪音，其通 常隨著檢測到的信號總量的平方根而增加，其進而與反應腔室的厚度成比例。因而，通過減 小反應腔室的厚度，降低背景噪音，并因而增加整體系統的信號-背景噪音之比（SNR)。其 他可能的噪音來源包括對過量的光（如未過濾的激發光、不希望的環境光、散射熒光、系統 組分的自發熒光等）的檢測。很多這些噪音來源可以通過傳統方法減輕，例如通過使用合 適的光學過濾器（如消除或降低過量激發光）、在檢測器處降低或防止環境光的封閉的光 學系統，和通過設置陣列點的大小和位置以降低或消除檢測器上的信號交互作用。在特別 優選的方面，本發明測定方法和系統的SNR通常是2. 5或更大，優選大于3、大于4、大于5、 大于10,并且在一些不例中大于20或更大。
[0016] 用于設置本發明系統和方法以降低背景信號的替代或其他方法也可與本發明裝 置和方法聯用。例如，可以使用全內反射熒光顯微鏡（"TIRF"）構造來設置本發明裝置和系 統以向捕獲陣列提供激發光照，其中將激發光導向捕獲陣列下面的基材上，從而其完全內 反射（參見 M.Tokunaga 等，Biochem.and Biophys.Res.Comm.235,47(1997)和 P.Ambrose， Cytometry，36, 244 (1999))。盡管如此，在陣列的基材-液體界面生成漸消波，所述漸消波 離開表面后指數衰減，這造成臨近該表面（如100nm深度）的有效光照，而沒有激發剩余溶 液中的熒光團。
[0017] 在另一個替代性或其他方案中，設置本發明分析方法中使用的反應物以降低相對 于實際探針/陣列結合信號的背景信號。例如，可以通過在捕獲陣列探針和帶標記的探針 片段上使用協同熒光團（如FRET構建物）來降低背景信號。具體而言，可使具有第一激發 光譜和第一發射光譜的供體熒光團與捕獲探針或帶標記的探針片段之一偶聯。使具有與供 體發射光譜重疊且不同于供體激發光譜的激發光譜的受體熒光團與其他探針偶聯。當捕獲 探針和帶標記的探針片段雜交時，所述供體和受體被帶至足夠近以供能量轉移，生成對應 于受體熒光團發射光譜的不同的熒光信號。通過設置光學系統以僅在供體激發光譜中激 發，并且過濾供體的發射光譜，能選擇性檢測雜交后由來自受體的能量轉移信號生成的信 號。之前已經描述了多種FRET標記物對（參見例如Waggoner的美國專利號6, 008, 373和 Lee 等的 7,449,298)。
[0018] 在一種替代性設置中，采用相互作用的標記基團來進一步減少可能的背景信號。 具體地，在本發明的一個方面，由熒光團標記捕獲探針，使得產生信號的標記物連接至陣列 的表面。在該內容中，帶標記的探針和帶標記的探針片段攜帶與熒光團互補的猝滅劑基團， 艮P，其能夠猝滅捕獲探針標記物的熒光團。所述帶標記的探針片段的某一位置上具有猝滅 齊IJ，從而當與捕獲探針雜交時，其足夠靠近捕獲探針上的熒光團以猝滅熒光信號。例如，當 所述帶標記的探針在其5'端用猝滅劑標記時，捕獲探針將在3'處或其他互補位置上荷 帶熒光團。在本發明的試驗內容中，靶序列的擴增導致產生帶標記的探針片段，當其與帶標 記的捕獲探針雜交時猝滅來自陣列的熒光信號，產生指示靶標信號存在的負信號事件。具 體地，陣列上的捕獲探針在未雜交狀態下產生信號。靶序列擴增之后，釋放荷帶猝滅劑的探 針片段以與陣列上的互補捕獲探針雜交，淬滅來自其相關熒光團的信號，并導致陣列上比 未雜交的陣列位置顏色深的位置。通過提供在試驗檢測條件下不產生熒光信號的猝滅劑基 團，消除了任何來自未切割的探針或未結合的帶標記探針片段的背景熒光。
[0019] 應理解，本發明中可以使用多種方法來降低相對于從結合的帶標記的探針片段檢 測到的信號而言的反應溶液中來自未結合的完整帶標記探針的信號或背景信號的影響，例 如包括設置反應腔室以集中檢測器焦面內的信號，使用在溶液中結合陣列對比未被結合時 具有不同發射光譜的相互反應標記技術，或者在相同完整探針中存在時對比切割的探針片 段中分離時熒光減少的自淬滅探針。
[0020] 如本文所述，陣列通常包含非速率限制數量的捕獲核酸，所述捕獲核酸與帶標記 的探針片段雜交。這意味著所述擴增反應在擴增過程中產生許多探針片段，這導致反應混 合物中探針片段的濃度不使陣列上可用于結合探針片段的位點數量（如可用的互補捕獲 核酸）飽和。再次聲明，陣列上結合位點的數量保持過量，并且優選過量很多，可在擴增反 應中生成的探針片段濃度飽和。因為陣列上位點的數量是非速率限制性的，因而優化了陣 列上探針片段與溶液中背景探針片段的比例。典型陣列密度是約350fm 〇l/cm2或更大，如 約 2000fmol/cm2 或更大、2500fmol/cm2 或更大、3000fmol/cm2 或更大、4000fmol/cm2 或更 大、4500fmol/cm2或更大，或者5000fmol/cm2或更大。在一些實施方式中，陣列上結合探針 的位點數量是是可能在擴增中產生的探針片段濃度中飽和的位點數量的至少1倍，并且任 選5倍、10倍、50倍或更多。所述比例將隨著擴增循環數量和生成的探針量而變化。所述 陣列效率也與待捕獲的探針片段長度呈函數關系。盡管所述探針確實需要足夠長以在雜交 過程中的給定T m下結合，但較短片段通常顯示更有效的雜交。通常待由陣列捕獲的探針片 段的長度為約50個核苷酸或更短；所述陣列包含具有對應的互補捕獲核酸序列（所述捕 獲核酸也可任選地包含其他序列，例如，以隔開表面上的互補位點，例如，以降低表面影響） 的位點。更典型地，所述探針和捕獲序列的長度為約40個核苷酸或更短，如長度為約30、約 20或約15個核苷酸或更短。
[0021] 在一些示例中，選擇用于給定分析的所述捕獲陣列探針和互補性帶標記探針片 段，從而提供覆蓋陣列的所有成員的窄范圍Tm。特別地，為了確保與捕獲陣列的最優和穩定 的雜交，給定陣列中的捕獲探針將各自具有該陣列各其他成員的約l〇°C內的T m，并且優選 該陣列的各其他探針約7°C、5°C或：TC內的Tm。這樣窄的Tm范圍使得雜交穩定，并且所得 信號生成涵蓋陣列的所有成員。
[0022] 在典型的實施方式中，雜交溫度低于擴增反應的溫度，所以捕獲核酸的探針片段 Tm可低于該探針的分子內Tm(例如，當探針包含淬滅劑以降低背景時），和/或低于靶核酸 探針的^。即，在典型熱循環實施方式中，在高于雜交步驟的溫度下進行擴增反應；因此，通 常探針對于靶核酸具有高于探針片段對于陣列的T m。帶標記的探針通常包含不與靶核酸互 補的第一正交折翼；該折翼從所述帶標記探針上切下以產生帶標記的探針片段。所述帶標 記的探針任選地包含第二正交折翼，例如與淬滅劑部分偶聯的第二正交折翼，該第二正交 折翼與第一折翼至少部分互補（例如，以提供第一折翼上標記物的基于鄰近的淬滅）。當第 二折翼結合第一折翼的T m高于第一折翼結合陣列的Tm時，背景降低。在這種設置中，延伸 反應在第一溫度下發生，即低于靶核酸的完整探針的T m，但是高于完整探針的分子內Tm以 及陣列上捕獲探針的探針片段的^。延伸后，隨著反應溫度降低，其低于探針的分子內T m， 允許形成探針的二級結構，并且造成熒光團的淬滅。進一步冷卻到低于探針片段對捕獲探 針的Tm，允許探針片段與陣列雜交和對其相關的熒光團的檢測。因為所述完整探針已經先 形成了其二級結構，其結合至捕獲探針和淬滅的可能較小，因而減少了對完整探針的不希 望的捕獲并降低了溶液中完整探針上存在的熒光團的背景信號（或其可能已經結合至捕 獲探針陣列）。盡管在某些方面，在本發明的完整探針上使用淬滅劑，在某些實施方式中，令 人驚訝地確定探針上不需要淬滅劑，因為甚至當背景因省略探針的淬滅劑而增加時，優化 的腔室設計和高效陣列能實現對陣列信號和背景的區分。
[0023] 在其他實施方式中，設計或選擇高于延伸反應溫度（如高10度或更多）的帶 標記探針片段及其互補性捕獲核酸。因此，當例如在55°C?60°C下進行延伸反應時，帶標 記的探針片段和捕獲核酸的T m通常是例如71°C。這種示例中，帶標記的探針片段與陣列上 捕獲核酸的雜交在與延伸反應相同的溫度下進行，因而無需進一步降低溫度以與陣列雜交 并檢測所得信號。結果，可以使用兩步溫度法而不是三步法。
[0024] 就完整的帶標記的探針而言，正交帶標記的探針片段相對于結合靶序列探針部分 的方向是可以變化的。特別地，釋放的帶標記探針片段可以與陣列上的捕獲探針雜交，以從 所述探針的靶標特異性部分切割的末端處于捕獲探針偶聯到陣列表面位點的近端或遠端 的方向進行所述雜交。在一些示例中，例如，通過確保任何完整探針僅以一定方向結合至捕 獲探針（所述結合方向使探針的靶標特異性部分朝向陣列表面），能夠隨后利用對該結合 的潛在表面干擾來進一步減少所述陣列對完整探針的不需要的捕獲的可能。這種方法在陣 列上固體表面的情況中（例如二氧化硅基材等）特別有用。
[0025] 根據耗材的確切設置，可通過任何不同機制將樣品載入腔室。在一個方便的應用 中，通過與腔室可操作連通的至少一個端口或流體通道來加載樣品。例如，可在耗材的頂表 面制造端口，所述端口引導進入所述腔室。這使加載簡化，例如通過移液管或其他液體遞送 裝置加載。或者，流體或微流體通道、毛細管等可用于樣品遞送。
[0026] 所述方法可用于檢測樣品中感興趣核酸和/或對核酸定量（例如實時定量）。因 此，一方面，在檢測信號前于多個擴增循環中任選地擴增靶核酸，信號檢測后額外擴增靶核 酸部分（即在帶標記的探針的其它拷貝存在下）。然后，所得的釋放的帶標記的探針片段與 陣列雜交并且被檢測，檢測的信號強度與樣品中存在的靶核酸的存在和/或量相關聯。通 常，所述樣品在初始檢測前擴增超過1輪循環，以通過增加由擴增釋放的探針片段數量來 增加信號水平。例如，在檢測來自陣列的信號之前，任選擴增靶核酸至少例如2、3、4、5輪或 更多輪擴增循環。
[0027] 帶標記的探針通常包含熒光或發光標記物，盡管也可使用諸如量子點的其他標記 物。在一個優選實施方式中，所述標記物是熒光染料。由探針片段產生的信號通常是光學 信號。帶標記的探針任選地包含標記物和標記淬滅劑；帶標記的探針的切割造成所述標記 物和淬滅劑的分離，從而不淬滅該標記物。然而，如上述，在本發明的實踐中不需要淬滅劑。
[0028] 通常通過檢測對應于探針或探針片段上的光學標記物的一種或多種光學信號波 長來檢測信號。因為陣列上探針片段的結合位置能用于區分不同探針，所以不需要在不同 探針上采用不同標記物以區分多重擴增反應（在樣品中存在超過一種的靶標時，設計以擴 增多種靶核酸的擴增反應）中的探針。然而，可以使用多種探針標記物來增強多重能力。當 使用多種探針時，檢測信號可包括檢測來自由多種不同標記物（如不同探針上的不同熒光 染料部分）生成的多種信號的多種光學信號波長。
[0029] 雖然以與結合陣列的探針片段相連的標記物基團（例如，帶標記的探針片段）的 方式進行一般描述，但應理解可以使用不需要使用預先標記的探針的其他檢測方案。例如， 在一些實施方式中，可以使用插入染料。插入染料通常在整合到或插入到雙鏈核酸之后產 生可檢測信號事件。在本發明的內容中，經切割的探針片段與陣列上互補性探針的雜交在 陣列表面處產生雙鏈體，該雙鏈體可以納入插入染料，并且提供指示該雜交的獨特信號。插 入染料為本領域熟知，并且包含描述于如Gudnason等，Nucleic Acids Research, (2007)， 第35卷，第19, el27中的那些，其通過引用納入以用于所有目的。相似地，雖然特別優選 光學信號檢測方法，通常也可以使用非光學標記和/或檢測方法來進行探針設計和測試方 法，例如使用電化學檢測方法，例如ChemFETS、ISFETS等，任選地與電化學標記物基團聯 用，例如具有大帶電基團以在檢測器表面或其附近擴增探針片段與陣列探針雜交的檢測。
[0030] 可就陣列的一個或多個區域來檢測局部背景，通過針對所述背景進行校正來使信 號強度測量值標準化。通常，所述標準化的信號強度小于總體信號的10%，如總體信號的約 1-約10%。在實施方式的一類示例中，所述標準化的信號強度是總體信號的約4-約7%。 通常，當約1%或更多信號定位于陣列時，例如當約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%或更多信號定位于腔室某一區域的陣列上時，可以區分背景和陣列信號。能夠區 分相對于背景的甚至更低水平的信號，但這一般不是優選的。所述方法也可包括通過對陣 列上捕獲核酸斑點差異進行校正（如通過校正斑點大小和/或斑點密度）、或對陣列不同區 域的不均勻視野進行校正，來使信號強度標準化。
[0031] 同時檢測樣品中多種靶核酸的能力代表了本發明的優選方面。樣品可以具有一種 或多種靶核酸，而陣列包含能夠檢測超過一種靶標/樣品的多種捕獲核酸類型。捕獲核酸 類型在陣列上空間分隔，不需要使用多種標記物（雖然，如上所述，可以使用多種標記物）。 在多重方案中，使各自對不同核酸靶標具有特異性的多種擴增探針與樣品一起孵育，所述 樣品可包含一種或多種靶核酸。例如，可以存在約5-約100種或更多種捕獲核酸類型。待 檢測的各可能靶標也會采用不同的探針，例如在擴增反應中任選地存在約5-約100種或更 多種帶標記的探針類型，其各自對可能的感興趣靶標具有特異性。陣列包含相應的捕獲核 酸，例如，約5-約100種或更多種捕獲核酸類型。這允許通過陣列檢測和處理相應的大量 信號。例如，在探針片段與陣列雜交后，可以根據陣列上信號位置檢測約5-約100種或更 多種不同的信號。應理解，通常在單個反應體積內多重化的不同擴增反應的數量能指示陣 列上捕獲探針類型的數量。然而，也能在一些情況中使用具有較大數量不同捕獲探針（如 大于100、大于1000、10000種或更多種捕獲探針類型）的捕獲陣列，例如，當擴增反應被匯 集用于通過陣列的研究時。
[0032] 本發明的優勢是，一種捕獲陣列設置可以用于多種不同的靶核酸序列組。具體地， 第一組的探針集將包含具有對組中靶標有特異性的第一靶標特異性部分和與捕獲陣列上 單一探針互補的第二捕獲部分的探針。第二個不同組（部分重疊或完全不同）的探針集將 包含供于該組的靶標特異性部分，而捕獲部分將與第一組的探針集相同。再次聲明，對任何 靶標組而言，探針集將包含供于該組的探針的半固定部分，其總與捕獲陣列的成員互補。所 述探針也將包含就靶核酸特定組選擇的可變部分。例如，在分析過程中，使用第一探針集， 其中該第一個集中的各探針具有對應于捕獲探針陣列上不同捕獲探針的第一固定部分。各 探針也包含與第一組中給定靶序列互補的靶標特異性部分。就第二組而言，使用第二探針 集，其中該集中的各探針包含相同第一固定部分，但具有對組中靶標有特異性的第二靶標 特異部分。
[0033] 參照圖1A，帶標記探針的部分A對應可變部分，而部分B可以對應將與陣列上探針 互補的固定部分。使用通用的或常見的捕獲陣列和捕獲探針集允許更有效且以更低成本制 備本發明所用的耗材。
[0034] 因此，在一個樣品包含多種靶核酸的實施方式中，所述方法包括將各自對不同靶 核酸具有特異性的多種帶標記的探針與靶核酸孵育。在擴增引物依賴的擴增反應中擴增 至少部分靶核酸導致多種帶標記的探針類型的切割，從而導致釋放多種帶標記的探針片 段類型。多種探針片段類型與陣列雜交。不同的探針片段類型各自分別與空間上分離的 捕獲核酸類型雜交。檢測標記物信號包括檢測來自多個空間上分離的區域的多種標記物 信號，所述多個區域對應于陣列上空間上分離的捕獲核酸。任選地，在數個優選實施方式 中，所述帶標記探針類型包含相同的標記物部分，但是其他多重化和/或不同對照或對準 (registration)探針的應用可包括使用多種不同的標記物部分。通常，帶標記的探針類型 可以包含一種或多種不同的標記物部分，而不同標記物部分的數量小于帶標記的探針類型 的數量。
[0035] 用于進行所述方法的裝置和系統是本發明的特征。所述裝置或系統可包含檢測腔 室，所述檢測腔室包含在該腔室的至少一個表面上的至少一個高效核酸檢測陣列。如關于 所述方法所述，設置該腔室以降低相對于從陣列檢測到的信號的背景信號。所述裝置或系 統通常包含可操作聯接到所述檢測腔室的熱調節模塊，其在裝置運行過程中調節腔室內溫 度。光學系統檢測所述裝置運行過程中陣列上產生的信號。
[0036] 任選地對該裝置應用關于該方法所述的用以降低背景的所述腔室的所有維度特 性。例如，所述裝置在所述陣列附近在至少一個維度上的深度小于約500μπι，例如，在所述 陣列附近的至少一個維度上的深度為約10 μ m-約200 μ m。所述陣列形成的腔室表面能由 任何合適材料組成，例如陶瓷、玻璃、石英或聚合物。在如使用落射熒光的數個實施方式中， 所述表面至少部分透明。
[0037] 如關于該方法所述，裝置操作中所述陣列上的捕獲核酸通常以非速率限制性的密 度存在。該陣列任選地包含多種捕獲核酸類型，例如，定位于空間上不同的陣列區域。例如， 該陣列上可以存在5種或更多種不同捕獲核酸類型，如多至約100種或更多種不同類型。任 選地使捕獲核酸聯接至腔室表面的熱穩定涂層，以促進陣列的熱循環。示例性涂層可任選 地包括：化學反應基團、親電基團、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、單硝基苯基酯或二硝 基苯基酯、硫酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、酰基疊氮、環氧、氮雜環丙烷、醛、α，β-不飽和酮 或包含乙烯酮或馬來酰亞胺的酰胺、酰基鹵化物、磺酰鹵、亞酰胺、環酸酐、環加成反應中的 活性基團、烯烴、二烯、炔烴、疊氮化物或其組合。
[0038] 熱調節模塊任選地包含促進熱循環的結構（feature),例如熱電模塊、Peltier裝 置、冷卻風扇、散熱器、設置以與所述腔室外表面部分匹配的金屬板。通常，該熱調節模塊具 有反饋控制系統，其可操作地連接到計算機，該計算機控制該模塊或是該模塊的一部分。
[0039] 所述光學系統可包含落射熒光檢測系統或可操作地連接到落射熒光檢測系統。典 型的光學系統組件包括下列任何組件：激發光源、弧光燈、汞弧光燈、LED、透鏡、光學過濾 器、棱鏡、相機、光檢測器、CMOS相機、和/或CCD陣列。該裝置也可以包含或聯接至陣列讀 取模塊，該模塊使陣列上信號位置與待檢測的核酸相關聯。
[0040] 所述裝置或系統可以包含或可操作地偶聯至系統指令，例如在計算機或計算機可 讀介質中執行的系統指令。該指令可以控制該裝置或系統的任何方面，例如將信號強度的 一個或多個測量值與熱調節模塊進行的許多擴增循環相關聯，以確定由該裝置檢測的靶核 酸的濃度。
[0041] 系統可以包含例如可操作地連接到計算機的裝置。該計算機可以包含，例如通過 控制熱調劑模塊控制熱循環和/或指定光學系統何時成像或讀圖的指令，和/或可將圖片 信息轉化成隨時間變化的信號強度曲線，確定由所述裝置分析的靶核酸的濃度的指令等。 該計算機可以包含使信號強度針對背景標準化的指令，例如，用于檢測陣列的一個或多個 區域的局部背景，和用于通過校正該背景來使陣列信號強度測量值標準化。相似地，該計算 機可以包含通過對陣列上捕獲核酸點樣差異、或對陣列不同區域的視野不均進行校正等來 使信號強度標準化的指令。
[0042] 本發明一方面包括核酸檢測耗材，例如用于本發明裝置和系統的例如以用于實踐 本發明的方法的核酸檢測耗材。該耗材可以包含，例如深度小于約500 μ m的薄腔室，其中 該腔室包含光學透明的窗，該窗在窗內表面設置有高效捕獲核酸陣列。所述耗材還可包含 至少一個試劑遞送端口，例如，與所述腔室流控聯接的試劑遞送端口。通常，該耗材被設置 以允許該腔室內的流體熱循環。
[0043] 同樣對所述耗材應用關于本發明的裝置、系統和方法內容中所述的陣列和腔室的 所有特征（反之亦然）。例如，該核酸陣列可以包含多種不同捕獲核酸類型，該類型位于陣 列的不同空間區域上。捕獲核酸的密度可以約為，例如2000fmol/cm2或更大、2500fmol/cm2 或更大、3000fmol/cm2 或更大、4000fmol/cm2 或更大、4500fmol/cm2 或更大，或者 5000fmol/ cm2或更大。
[0044] 相似地，所述腔室可以包含第一上表面和透明底表面，所述第一上表面包含試劑 遞送端口，所述透明底表面包含窗，例如，其中該頂表面和底表面通過壓敏粘合材料形成的 側壁接合。也可以使用接合該頂表面和底表面以形成腔室的其他結構。例如，頂表面和底 表面可以通過上表面和/或下表面上的襯墊或成形結構接合在一起。該襯墊或結構任選地 融合或附著至上表面和/或下表面的相應區域。在一些實施方式中，所述襯墊或結構引導 紫外線可固化粘合劑的流動，其中粘合劑在上表面和下表面之間流動并且暴露于紫外光， 從而使上表面和下表面接合。在其他實施方式中，上表面和下表面可以通過超聲融合在一 起，采用襯墊或結構劃定融合區域的界限。在另一個實例中，該結構是上表面或下表面上的 透明區域以及相關上表面或下表面上的對應陰影區域。在這個實施方式中，所述上表面或 下表面可通過引導激光穿過透明區域并到陰影區域上來激光焊接在一起。
[0045] 通常使捕獲核酸陣列聯接至窗上的熱穩定涂層。例如，該涂層可以包含：化學反應 基團、未電基團、NHS醋、四氣苯基醋或五氣苯基醋、單硝基苯基醋或_硝基苯基醋、硫醋、異 氰酸酯、異硫氰酸酯、酰基疊氮、環氧、氮雜環丙烷、醛、α，β-不飽和酮或包含乙烯酮或馬 來酰亞胺的酰胺、酰基鹵化物、磺酰鹵、亞酰胺、環酸酐、環加成反應中的活性基團、烯烴、二 烯、炔烴、疊氮化物或其組合。該窗本身可以包含，例如玻璃、石英、陶瓷、聚合物或其他透明 材料。
[0046] 將上文關于所述方法、系統和裝置所述的的所有特征應用于所述耗材中腔室設 置。例如，腔室的深度可以是約10 μ m-約200 μ m,例如深度為約140 μ m。該腔室可在其他 尺寸上明顯更寬，如平均直徑約1mm-約50mm。在一個特定的實施方式中，所述腔室的平均 直徑為約l〇mm-約20mm。
[0047] 本發明包括試劑盒，所述試劑盒如包含本發明的耗材。所述試劑盒還可包含包裝 材料、實施所述方法的說明書、對照試劑（如結合到耗材陣列的對照位點上的例如對照模 板、探針或引物）。
[0048] 所述方法、系統、裝置、耗材和試劑盒也可以組合使用以實施本發明的方法，如所 述試劑盒提供了在本發明系統或裝置中使用的耗材。除非另有表述，本發明步驟可選有所 述系統、裝置、耗材或試劑盒中相應的結構特性，并且反之亦然。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049] 圖1A和1B是本發明PCR探針的示意圖。
[0050] 圖2是本發明PCR腔室的示意圖。
[0051] 圖3顯示了三步擴增反應的拷貝數滴定的基于陣列的實時PCR曲線。
[0052] 圖4顯示了由溶液等分試樣生成的基于溶液的實時PCR曲線。
[0053] 圖5顯示了用未淬滅探針生成的基于陣列的實時PCR曲線。
[0054] 圖6顯示了多重擴增的實時PCR曲線。
[0055] 圖7顯示了無靶標添加的10重反應的基于陣列的實時PCR曲線。
[0056] 圖8顯示了 10重的組和各自以104個拷貝存在的3種靶標的基于陣列的實時PCR 曲線。
[0057] 圖9顯示了 5'折翼模擬雜交的實時動力學。
[0058] 圖10A和10B顯示了本發明的方面的示意圖。
[0059] 圖11是系統示意圖。
[0060] 圖12顯示了兩步擴增反應的拷貝數滴定的基于陣列的實時PCR曲線。
[0061] 圖13顯示了反應腔室厚度與信號-背景之比的關系。
[0062] 圖14顯示了本發明的移動基材實施方式的整體檢測系統。
[0063] 圖15是使用荷帶猝滅劑的探針的實時PCR的曲線圖，其在反應過程中熒光信號衰 減。
[0064] 發明詳述
[0065] 進行靶核酸擴增、檢測和實時定量的方法是本發明的特點。在該方法中，靶核酸的 擴增釋放與陣列雜交的靶標特異性的帶標記探針片段；該陣列在發生擴增的腔室中分布。 從所述陣列檢測信號，提供了對靶核酸的檢測和實時定量。
[0066] 本發明還提供反應腔室，通常的形式是在腔室中包含核酸檢測陣列的耗材，以及 與所述耗材相互作用的裝置和系統。
[0067] 方法
[0068] 本發明提供了用于實時檢測和定量樣品中的一種或多種靶核酸的方法。所述方法 高度適合多重技術，該方法能夠用一個腔室反應和檢測的特異性檢測和定量不同靶核酸， 所述不同靶核酸的數量比采用現有基于溶液的實時核酸檢測方法所能實現的數量更大。這 是因為本發明使用基于陣列的分析物檢測（陣列與分析物接觸），而不是溶液相光譜檢測。 相較于例如溶液中不同染料標記物的區分能力而言，通過陣列位置區分的核酸檢測陣列分 辨分析物的能力明顯更強。通過比較，能夠構建同時檢測數千種不同分析物的陣列，而通常 在溶液中不可能檢測超過約5種帶不同標記的熒光團。
[0069] 圖10A提供了該方法的部分概況。如圖所示，引物102與模板或靶序列100與帶 標記的探針104 -起雜交。探針104包含與靶標或模板序列100互補的部分104a，和不與 模板互補的正交序列l〇4b ( "折翼"），其聯接至標記物部分106。該正交序列104b或探針 片段在擴增反應（如PCR擴增循環）過程中被切割。在一個方便的方法中，利用聚合酶的 天然核酸酶活性來切割折翼-在這個方法中，通過聚合酶的引物延伸導致折翼l〇4b被該聚 合酶的核酸酶作用切割，因為該酶遇到折翼l〇4b和模板100之間的連接。這釋放該折翼為 帶標記的探針片段l〇4b，然后，其雜交至荷帶與釋放的探針片段104b互補的捕獲探針112 的陣列110,例如，在將溫度調節至允許特異性雜交的條件下進行所述雜交。對陣列上標記 物的檢測提供對模板的實時檢測和定量。
[0070] 通常，待測試一種或多種靶核酸是否存在的樣品經過擴增反應。該反應可易于用 多重形式在單個反應腔室中對約10-約100種或更多種不同核酸進行擴增、檢測和定量。例 如，單個擴增/檢測腔室中可以檢測約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約 90或約100種或更多種核酸。下文顯示了在反應/檢測腔室中同時擴增、檢測和定量10種 不同靶核酸的工作實施例。這個實施例和本方法的容量超過傳統光譜限制的、基于溶液的 多重檢測的容量。
[0071] 在這個方法中，使用至少一種、一般兩種擴增引物來特異性地擴增待檢測的各靶 核酸（與單一引物相比，使用兩種引物增加反應的特異性，并且加速產物形成的速率）。引 物通常與樣品中的靶核酸特異性雜交，并且例如在標準聚合酶鏈反應（PCR)中使用聚合酶 來延伸。按照已知方法來設計和構建可用于擴增感興趣的靶核酸的擴增引物。關于PCR 引物設計的細節，參見例如 Anton Yuryev(編者）（2007)PCR Primer Design(Methods in Molecular Biology)《PCR引物設計（分子生物學方法）》[精裝書]Humana出版公司；第 1 版，ISBN-10 :158829725X，ISBN-13 :978-1588297259,以及下面引用的參考文獻。
[0072] 可以使用合適的反應條件來實施在靶核酸上使用引物的PCR擴增，所述條件包 括使用標準的擴增緩沖液、酶、溫度和循環次數。對于PCR技術的概述，包含雜交條件、緩 沖液、試劑、反應循環次數等，參見，例如Yuryev(上述），van Pelt-Verkuil等，（2010) Principles and Technical Aspects of PCR Amplification(《PCR 擴增的原理和技 術方面》）Springer 出版社；第 1 版，ISBN-10 :9048175798, ISBN-13 :978-9048175796 ; Bustin(編）（2009)The PCR Revolution :Basic Technologies and Applications (《PCR 革命：基礎技術和應用》），劍橋大學出版社（Cambridge University Press);第1 版，ISBN-10 :0521882311, ISBN-13 :978-0521882316 ;Viljoen 等，（2005)Molecular Diagnostic PCR Handbook (《分子診斷PCR手冊》），施普林格出版社（Springer), ISBN1402034032;Kaufman 等，（2003)Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine (《生物學和醫學中分子和細胞方法手冊》）第2版，Ceske (編） CRC 出版社（Kaufman) ;The Nucleic Acid Protocols Handbook(《核酸方法手冊》）Ralph Rapley (編）（2000)冷泉港實驗室出版社，Humana出版社公司（Rapley) ;Chen等（編）PCR Cloning Protocols (《PCR 克隆方案》），第 2 版（Methods in Molecular Biology (分子生 物學方法），第 192 卷）胡馬納出版社（Humana) ;PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (《PCR方案：方法和應用手冊》）（Innis等編），加利福尼亞州圣地亞哥市學術 出版社公司（1990) (Innis)。可用于實時PCR方法的擴增條件、引物設計和其他細節描述于 例如 Logan 等（編）（2009)Real-Time PCR:Current Technology and Applications(《實 時PCR :新編技術與應用》），凱斯特學術出版社（Caister)，第1版，ISBN-10 :1904455395, ISBN-13:978-1904455394,和 M Tevfik Dorak(編者）（2006) Real-time PCR (Advanced Methods)(《實時 PCR(高級方法）》）TF 公司（Taylor & Francis),第 1 版，ISBN-10 : 041537734X ISBN-13 :978-0415377348。
[0073] 使對樣品中各靶核酸有特異性的帶標記的探針和擴增引物一起與靶核酸雜交。所 述擴增反應切割雜交模板的帶標記探針以釋放帶標記探針片段。然后使該帶標記片段在反 應腔室中與陣列雜交，如圖10A所示。
[0074] 圖1A示意性顯示用于本發明的方法的探針。該探針包含與靶核酸互補的區域A。 該探針也包含不與靶核酸互補的"折翼" B。使標記物E連接到折翼B。在末端位置顯示標 記E，但是實際上該標記物可被安排在沿折翼B的任何位點上。例如，任何不同的核苷酸可 以被標記，并且用于標準或稍微改良的核酸合成方法中以在探針的任何所需位置上提供標 記物。
[0075] 圖1A中，包含標記物淬滅劑D的任選區域C與折翼B的部分互補。在合適的溶液 條件下，區域C與折翼B堿基配對，把標記物E引到淬滅劑D附近，由此淬滅標記物E。這 降低了反應/檢測腔室中的溶液相的信號背景，但是探針淬滅對于本發明的實踐不是必需 的。本發明一個令人驚訝的方面是能夠特異性地檢測結合到陣列的探針片段，甚至當陣列 附近的溶液中有未淬滅的探針時。本文描述了這個實施方式的一個工作實施例。通常，反應 /檢測腔室中使用設置以降低溶液相背景的高效陣列允許在本發明的方法、耗材、裝置和系 統的溶液中區分陣列處信號和信號背景。
[0076] 根據實驗設置，可采用多種不同標記物基團來標記帶標記的探針。如上所述，這 種標記物通常包含熒光標記基團，所述熒光標記基團可以包含單個熒光團或相互作用的染 料對或組，如FRET對，以及供體/淬滅劑對。適于標記核酸探針的不同突光標記基團的范 圍描述于，例如Molecular Probes Handbook(《分子探針手冊》），第11版（生命技術公司 (Life Technologies, Inc. ))〇
[0077] 盡管本文的很多討論是關于基于PCR的擴增，但可用其他擴增反應來替代。例 如，可使用包含與擴增反應結合的切割反應的多酶系統，例如包含易切斷的鍵的切割的那 些（參見，例如 US5, 011，769 ;US5, 660, 988 ;US5, 403, 711 ;US6, 251，600)和叉狀核酸結構 (US7, 361，467 ;US5, 422, 253 ;US7, 122, 364 ;US6, 692, 917)的那些。也可以使用與 TaqMan 樣切割結合的解旋酶依賴性擴增（Tong，Y等，2008BioTechniques45 :543-557)。可以使 用基于核酸序列的擴增（NASBA)或連接酶鏈式反應（LCR)。在NASBA方法中，探針可以和 擴增引物一起與模板雜交，如PCR中的那樣。探針可以通過逆轉錄酶或加入的內切核酸 酶的核酸酶作用切割，以與由PCR中聚合酶釋放相似的方式釋放探針片段。NASBA的一個 潛在優勢是不需要熱循環。這簡化了整體裝置和系統的要求。對NASBA的描述參見，例 如，Compton(1991) " Nucleic acid sequence-based amplification(基于核酸序列的 擴增）"Nature350(6313):91-2。對于使用NASBA來檢測例如致病性核酸，參見，例如 Keightley 等（2005) "Real-time NASBA detection of SARS-associated coronavirus and comparison with real-time reverse transcription-PCR(實時 NASBA 檢測 SARS 相 關的冠狀病毒及與實時逆轉錄PCR的比較）"，Journal of Medical Virology77(4) :602-8。 當使用LCR型反應時，可以使用內切核酸酶切割探針，而不是依賴于擴增酶的核酸酶活性。
[0078] 本文所述的方法中，提供了一種檢測腔室，所述檢測腔室在其至少一個內表面上 有至少一個高效核酸檢測陣列。該高效陣列通常具有非速率限制數量的捕獲核酸，其允許 有效捕獲通過腔室中的擴增反應產生的探針片段。所述捕獲核酸被設置以捕獲相對小的探 針核酸，這也增加了陣列效率。該腔室被設置以降低該陣列附近的信號背景，如通過使所述 腔室成形以降低背景。例如，通過使所述陣列（如上方或下方）處的腔室薄（淺）來降低 背景；例如，通常在陣列上方或下方的所述腔室為約500 μ m或更薄，盡管在深至1_或更深 的腔室中也能進行檢測。參照該方法中使用的耗材，下面描述了關于反應腔室和陣列的其 他細節。
[0079] 檢測由陣列捕獲的信號并測量信號強度。信號強度與樣品中靶核酸的存在和/或 量相關聯。通常，樣品在初始檢測之前擴增超過1輪循環，以通過增加由擴增釋放的探針片 段的數量來增加信號水平。例如，從陣列檢測信號之前，可任選地將靶核酸擴增至少，例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10輪或更多輪擴增循環。
[0080] 圖10B提供了本發明試驗的替代性設置。如圖所示，同樣提供了具有正交折翼部 分104b的靶標特異性探針，如上述圖10A所示。然而，與圖10A中用熒光標記部分106標 記產生熒光信號不同，折翼l〇4b含有猝滅劑基團116。相反，用相應的熒光基團114標記陣 列110上的捕獲探針112,即該熒光基團由折翼104b上的猝滅劑基團116猝滅。當折翼部 分104b在靶序列100的擴增后從全長探針104上切割并釋放時，折翼能夠與捕獲探針112 雜交并且猝滅來自其相關的熒光團114的信號。結果，感興趣的靶序列的存在導致該序列 的擴增并且從探針104上切割下猝滅劑-折翼104b，其繼而能夠與陣列110上的捕獲探針 112雜交，導致位于陣列上的給定捕獲探針的熒光信號降低或缺失。通過將猝滅劑和熒光團 分別定位于折翼或探針片段和捕獲探針的互補部分，可以確保這些基團足夠靠近來傳輸能 量并猝滅。
[0081] 可以聯接至折翼和捕獲探針的熒光團-猝滅基團對為本領域熟知，例如，諸如黑 洞粹滅劑 2/Cy3 和 Iowa Black RQ/Cy3。
[0082] 應理解，之前的猝滅劑探針試驗設置消除了液體荷帶的熒光組分以及因而可能從 液體中產生的任何背景熒光信號。相反，信號事件是歸因于表面結合的熒光團的猝滅的熒 光信號缺失。
[0083] 在一個典型的實施方式中，擴增反應期間，以選定的時間、溫度和擴增循環間隔從 陣列捕獲熒光或其他光學圖像。分析這些圖像以確定靶核酸是否在樣品中存在，并且提供 對樣品中起始靶核酸濃度的定量。結合使用平均灰度強度測量值、背景校正和基線調整來 分析圖像。可以對陣列中的各斑點局部測量背景。通過測量感興趣陣列區域（例如，陣列 點）周圍溶液的同心環的圖像強度來計算背景。然后校正各個區域的信號以計算該區域的 局部背景。還可以使來自各區域的經校正的信號進一步標準化以計算視野中的斑點以及不 均勻光照的變化。從前幾輪循環（通常5-15輪循環）中獲得的經校正強度測量值的平均 值用于調整基線并對來自各區域的測量值標準化。
[0084] 關于基于擴增后信號強度測量值定量核酸方法的其他細節可以在上文所述的 參考文獻和如下文獻中找到：Jang B. Rampal (編者）（2010)Microarrays(微陣列）：第 2 卷，Applications and Data Analysis(應用和數據分析）（Methods in Molecular Biology (分子生物學方法））胡馬納出版社；第2版，ISBN-10 :1617378526, ISBN-13 : 978-1617378522 ;Stephen A.Bustin(編者）（2004)A-Z of Quantitative PCR(定量 PCR 大全）（IUL Biotechnology (IUL 生物技術），第 5 卷）（IUL 生物技術系列）International University Line ;第 1 版，ISBN-10 :0963681788, ISBN-13 :978-0963681782 ;和 Kamberova 和 Shah(2002)DNA Array Image Analysis :Nuts & Bolts (DNA 陣列圖像分析：基本要 點）（Nuts & Bolts series (基本要點系列））DNA 出版社；第 2 版，ISBN-10 :0966402758, ISBN-13 :978-0966402759〇
[0085] 在其他設置中，可任選地使捕獲探針聯接到移動基材（例如珠、樹脂、顆粒等（一 般與本文中的"珠"互換使用）），而不是靜態基材。例如，如本文其它地方所述，可以使用 平面基材來提供陣列的捕獲探針，其與樣品材料中的一個或多個靶核酸序列的擴增中產生 的經切割的探針片段雜交。通過檢測陣列上哪個捕獲探針位點與探針片段雜交來檢測給定 靶核酸序列的存在。因為各探針片段對特定靶序列具有特異性，如果該探針片段存在，其指 示靶標存在并且被擴增。在移動相基材中，使給定分析中的各不同類型的捕獲探針偶聯到 同樣含有唯一標記物的不同移動基材上。然后使所述移動基材通過檢測通道以鑒定珠并隱 含地鑒定捕獲探針，以及該帶標記的探針片段是否存在。如果在對應特定捕獲探針的給定 珠上檢測到帶標記的探針，則指示了與探針片段（和互補捕獲探針）相關聯的靶序列在樣 品中存在并且被擴增。本發明的這個方面可以在如完成整體擴增反應之后的終點檢測中使 用，但是也可以在定量分析中使用，例如，一輪或多輪擴增循環后用虹吸管從擴增混合物中 吸出珠部分，并從珠上測量帶標記的探針片段信號強度。
[0086] 給定珠上捕獲的帶標記的探針片段的濃度提供了檢測通道中足夠高的信號-背 景比，從而不需要將珠與反應混合物分開。另外，有基于陣列的基材時，在完整探針和/或 任選的淬滅劑基團中納入二級結構使得不論是在溶液中還是無意結合到移動基材上均更 能區別探針片段和完整探針背景信號。在一些示例中，也期望完整探針二級結構的特性在 移動基材上結合捕獲探針時生成位阻，造成一些情況中完整探針結合珠的可能性降低。 [0087] 多種不同珠類型可以與本發明這個方面聯用。例如，可以使用聚苯乙烯、纖維素、 丙烯酸、乙烯、二氧化硅、順磁或其他無機顆粒、或任意各種其他類型的珠。如所述，珠通常 用獨特標記特征分別標記。再者，可以使用多種不同標記物類型，包含有機熒光標記物、無 機突光標記物（如量子點）、發光標記物、電化學標記物等。大量的這種標記物市售可得，并 且設置以易于偶聯到合適的活性珠上。在熒光標記基團的情況中，可以通過2、3、4種或更 多種不同空間熒光標記基團和不同水平的各種標記物的不同組合來提供大量的標記物信 號，從而提供不使用寬的激發輻射光譜就能提供寬范圍的獨特標記物信號，如多重激光。 [0088] 所述方法通常使用本文所述的裝置、系統、耗材和試劑盒來進行。能提供所述裝 置、系統和耗材的所有特征以實踐本文所述方法，并且本文所述方法可與所述裝置、系統、 耗材和試劑盒聯用。
[0089] 耗材
[0090] 設置本發明的單罐式反應腔室以降低信號背景。在該腔室的至少一個內表面上形 成高效陣列。在該方法的擴增和陣列雜交步驟過程中，陣列通常與擴增反應物和產物接觸。 這允許用戶進行一輪或多輪擴增反應循環，通過實時監測來自陣列的信號來檢測結果，然 后另進行一輪或多輪擴增反應，再檢測。因此，陣列的信號強度可以用于實時檢測和定量感 興趣核酸。
[0091] 本發明的耗材包含腔室和該腔室內表面上的高效陣列。該腔室通常較薄（淺），如 深度小于約1_。通常，腔室越薄，陣列上的溶液越少，這降低了來自溶液中帶標記的探針或 探針片段的信號背景。通常所需腔室深度的范圍是約1 μ m-約500 μ m。就耗材制造的容易 性而言，該腔室在陣列之上的深度范圍通常是約10 μ m-約250 μ m,例如,深度約100 μ m-約 150 μ m。該腔室可以包含具有試劑遞送端口的表面，例如用于通過手工或自動移液器遞送 樣品。
[0092] 圖2提供了示例性耗材的放大（blow-up)示意圖。在這個實施例中，底表面層1 和上表面層2通過中間層3接合。在組裝層1、2和3后切口 4形成腔室。端口 5形成便利 通道以將緩沖液和試劑遞送到組裝成的腔室中。可以切口頂表面或底表面形成的區域的頂 層或底層上形成高效陣列。在一個方便的實施方式中，當采用落射熒光檢測來檢測結合到 陣列的標記物時，在下表面上制造陣列，設置耗材以通過定位于下表面下的本發明裝置和 系統的檢測光學器來觀察。通常，頂表面和/或底表面會包含窗口，檢測光學器可以通過該 窗口觀察到陣列。
[0093] 中層3可以根據待使用的耗材組裝方法采用任何不同形式。在一個方便的實 施方式中，頂表面和底表面1和2通過壓敏粘合材料形成的層3來結合。壓敏的粘合層 (例如，帶）是熟知的并且廣泛可用。參見，例如，Benedek和Feldstein(編者）（2008) Handbook of Pressure-Sensitive Adhesives and Products (《壓敏粘合劑和產品手 冊》）：卷 1 :Fundamentals of Pressure Sensitivity (壓敏的基本原理），卷2 :Technology of Pressure-Sensitive Adhesives and Products (壓敏粘合劑和產品技術），卷3: Applications of Pressure-Sensitive Products (壓敏產品的應用），CRC 出版社；第1 版， ISBN-10 :1420059343, ISBN-13 :978-1420059342。
[0094] 也可以使用用于接合頂表面和底表面以形成腔室的其他制造方法。例如，頂表面 和底表面可以通過頂表面和/或下表面上的襯墊或成形結構接合在一起。所述襯墊或結 構任選地融合或附著到上表面和/或下表面的相應區域。硅和聚合物芯片制造方法可用 于形成頂表面或底表面的結構。對結構制造（包含微結構制造）方法的介紹，參見，例如 Franssila(2〇10) Introduction to Microfabrication(《微制造介紹》），Wiley 出版社；第 2 版，ISBN-10 :0470749830, ISBN-13 :978-0470749838 ;Shen 和 Lin(2009) "Analysis of mold insert fabrication for the processing of microfluidic chip (〈〈用于微流體芯 片處理的模塑插入制造的分析》）"，聚合物工程和科學出版社，塑料工程協會公司（Polymer Engineering and Science Publisher ：Society of Plastics Engineers, Inc.),卷 49, 第 1 期，第 104(11)頁；Abgrall(2009)Nanofiuidics(《納米流體》）ISBN-10 :159693350X, ISBN-13 :978-1596933507 ；Kaajakari(2009)Practical MEMS ：Design of microsystems, accelerometers, gyroscopes, RF MEMS, optical MEMS, and microfluidic systems(《實 踐MEMS :設計微系統、加速度計、陀螺儀、RF MEMS、光學MEMS和微流體系統》），小齒輪 出版社（Small Gear Publishing)，ISBN-10:0982299109, ISBN-13 :978-0982299104 ; Saliterman(2006)Fundamentals of BioMEMS and Medical Microdevices(《BioMEMS 和醫 學微型裝置的基本原理》），SPIE 出版社，ISBN-10 :0819459771, ISBN-13 :978-0819459770 ; Madou (2002)Fundamentals of Microfabrication ：The Science of Miniaturization(《微 制造的基本原理：小型化的科學》），第2版，CRC出版社；ISBN-10 :0849308267, ISBN-13 : 978-0849308260。這些制造方法可用于基本形成頂表面或底表面所需的任何結構，消除了 對中間層的需要。例如，在所述頂表面和/或底表面形成下陷，并將這兩個層接合，由此形 成腔室。
[0095] 在一些實施方式中，所述襯墊或結構引導紫外線或輻射可固化的粘合劑的流動。 這種粘合劑在上表面和下表面之間流動，并且接受紫外光或輻射（如電子束或"EB"福射）， 從而使上表面和下表面彼此接合。可用的粘合劑（包含UV和可輻射固化的粘合劑）的 描述，參見，例如 Ebnesajjad(2010)Handbook of Adhesives and Surface Preparation: Technology,Applications and Manufacturing(《粘合劑和表面制備手冊：技術、應用和生 產》），威廉姆斯安德魯出版社（William Andrew);第 1 版，ISBN-10 :1437744613, ISBN-13 : 978-1437744613 ;Drobny (2010) Radiation Technology for Polymers (《聚合物的福射技 術》），第 2 版，CRC 出版社，第 2 版，ISBN-10 :1420094041, ISBN-13 :978-1420094046。
[0096] 在其他實施方式中，所述上表面和下表面可通過超聲融合在一起，而襯墊或表面 結構劃定耗材中融合的區域和待產生的腔室或其他構造結構。用于融合材料的超聲焊接和 相關技術在如下文獻中有描述，例如Astashev和Babitsky(2010)，Ultrasonic Processes and Machines ：Dynamics, Control and Applications(Foundations of Engineering Mechanics)(《超聲處理和機械：動力學、控制和應用（工程機械的基礎）》），Springer出版 社；第 1 版，ISBN-10 :3642091245, ISBN-13 :978-3642091247 ;和 Leaversuch (2002) "How to use those fancy ultrasonic welding controls (怎樣使用那些奇特的超聲焊接控 制），'Plastics Technology48 (10) :70_76。
[0097] 在另一個實例中，所述結構是上表面或下表面上的透明區域，和相應的上表面或 下表面上的對應陰影區域。在這個實施方式中，上表面或下表面可通過引導激光通過透 明區域并且到陰影區域上由激光焊接在一起。激光焊接方法在如下文獻中有描述：例如 Steen 等，（2010) Laser Material Processing (《激光材料處理》）Springer 出版社；第 4 版， ISBN-10 :1849960615, ISBN-13 :978-1849960618 ;Kannatey-Asibu(2009)Principles of Laser Materials Processing(Wiley Series on Processing of Engineering Materials) (《激光材料處理原理（Wiley工程材料處理系列）》），Wiley出版社，ISBN-10 :0470177985, ISBN-13 :978-0470177983 ;和 Duley (1998) Laser Welding (《激光焊接》）韋利科學公司， ISBN-10 :0471246794, ISBN-13 :978-0471246794。
[0098] 通常使捕獲核酸陣列偶聯到窗上的熱穩定涂層上。窗本身可以包含，例如玻璃、 石英、陶瓷、聚合物或其他透明材料。可購得適用于涂覆該窗的多種涂層。通常，基于以下 因素選擇涂層：與陣列基材的相容性（例如，陣列連接的腔室表面是玻璃還是聚合物），衍 生或處理以包含適于連接陣列成員的活性基團的能力和與處理條件的相容性（例如，熱 穩定性、光穩定性等）。例如，該涂層可以包含：化學反應基團、親電基團、NHS酯、四氟苯 基酯或五氟苯基酯、單硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、酰基疊 氮、環氧、氮雜環丙烷、醛、α，β-不飽和酮或包含乙烯酮或馬來酰亞胺的酰胺、酰基鹵化 物、磺酰鹵、亞酰胺、環酸酐、環加成反應中的活性基團、烯烴、二烯、炔烴、疊氮化物或其組 合。對表面涂層和其用于生物分子和表面連接的描述，參見，例如，Plackett (編者）（2011) Biopolymers :New Materials for Sustainable Films and Coatings(《生物聚合物：可持 續膜和涂層的新材料》），Wiley 出版社，ISBN-10 :0470683414, ISBN-13 :978-0470683415 ; Niemeyer (編者）（2010)，Bioconjugation Protocols :Strategies and Methods (Methods in Molecular Biology)(《生物偶聯方案：策略和方法（分子生物學方法）》），Humana出 版社；第 1 版，ISBN-10 :1617373540, ISBN-13 :978-1617373541 ;Lahann(編者）（2009)， Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science (《生物技術和材料 科學的點擊化學》），Wiley 出版社，ISBN-10 :0470699701, ISBN-13 :978-0470699706 ; Hermanson (2008)，Bioconjugate Techniques (《生物偶聯技術》），第2版，學術出版社； 第 2 版，ISBN-10 :0123705010, ISBN-13 :978-0123705013 ;Wuts 和 Greene (2006) Greene ' s Protective Groups in Organic Synthesis (《有機合成中的保護基團》），韋利科學公 司（Wiley-Interscience);第 4 版，ISBN-10 :0471697540, #ISBN-13 :978-0471697541 ; Wittmann (編者）（2006), Immobilisation of DNA on Chips II (Topics in Current Chemistry)(《芯片上DNA的固定II (現代化學專題）》），Springer出版社，第1版， ISBN-10 :3540284362, ISBN-13 :978-3540284369 ；Licari (2003), Coating Materials for Electronic Applications ：Polymers,Processing,Reliability,Testing(Materials and Processes for Electronic Applications)(《電子應用的涂層材料：聚合物、處理、可靠 性、測試（電子應用的材料和處理）》），威廉姆斯安德魯出版社，ISBN-10 :0815514921, ISBN-13 :978-0815514923 ；Conk(2002), Fabrication Techniques for Micro-Optical Device Arrays Storming Media(微型光學陣列基質的制造技術），ISBN-10 :1423509641, ISBN-13 :978-1423509646,以及石油和顏色化學協會（Oil and Colour Chemists' Association) (1993), Surface Coatings-Raw materials and their usage (《表面涂 層-原材料及其應用》），第3版，Springer出版社；第3版，ISBN-10 :0412552108, ISBN-13 : 978-0412552106。
[0099] 制造核酸陣列的方法是現有的并且能通過在內腔室表面上形成陣列來適用于本 發明。可以用于在內腔室表面形成陣列的核酸微陣列形成技術描述于，例如，Rampal(編 者),Microarrays ：Volume I ：Synthesis Methods(Methods in Molecular Biology) (《微陣列》：卷I:合成方法（分子生物學方法）），胡馬納出版社；第2版，ISBN-10: 1617376639, ISBN-13 :978-1617376634 ;MUller 和 Nicolau(編者）（2010)，Microarray Technology and Its Applications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering)(《微陣列技術及其應用（生物和醫學物理、生物醫學工程）》），施普林格 出版社；第 1 版，ISBN-10 :3642061826, ISBN-13 :978-3642061820 ;Xing 和 Cheng (編者） (2010)Biochips ：Technology and Applications(Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering)(《生物芯片：技術和應用（生物和醫學物理、生物醫學工 程）》），施普林格出版社；第 1 版，ISBN-10 :3642055850, ISBN-13 :978-3642055850 ; Dill 等（編）（2010)Microarrays :Preparation, Microfluidics, Detection Methods, and Biological Applications(Integrated Analytical Systems)(《微陣列：制備、微 流體、檢測方法和生物應用（集成分析系統）》），施普林格出版社，ISBN-10 :1441924906, ISBN-13 :978-1441924902 ；Whittmann(2010)Immobilisation of DNA on Chips II(Topics in Current Chemistry)(《芯片II上DNA的固定（現代化學專題）》），Springer出版 社；第 1 版，ISBN-10 :3642066666, ISBN-13 :978-3642066665 ;Rampal (2010)，DNA Arrays : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (《DNA 陣列：方法和方案（分子 生物學方法）》），胡馬納出版社；第 1 版，ISBN-10 :1617372048, ISBN-13 :978-1617372049 ; Schena (作者，編者）（2007)，DNA Microarrays (Methods Express)(《DNA 微陣列（方 法表達）》），Scion 出版社；第 1 版，ISBN-10 :1904842151, ISBN-13 :978-1904842156 ; Appasani (編者）（2007)，Bioarrays :From Basics to Diagnostics (《生物陣列：從基礎到 診斷》），胡馬納出版社；第 1版，ISBN-10 :1588294765，ISBN-13 :978-1588294760 ;和 Ulrike Nuber (編者）（2007)，DNA Microarrays (Advanced Methods)(《DNA 微陣列（高級方法）》） TF 公司（Taylor & Francis)，ISBN-10 :0415358663, ISBN-13 :978-0415358668。把 DNA 連 接到表面以形成陣列的技術可包含任何不同斑點法、使用化學反應表面或涂層、光導向的 合成、DNA印刷技術，和很多本領域可用的其他方法。
[0100] 定量陣列密度的方法在上面引用的參考文獻以及Gong等 (2006) "Multi-technique Comparisons of Immobilized and Hybridized Oligonucleotide Surface Density on Commercial Amine-Reactive Microarray SI ides (商業胺反應性微陣列載玻片上固定和雜交寡核苷酸表面密度的多技術比 較）"Anal. Chem. 78 :2342-2351 中描述。
[0101] 耗材可以在容器中包裝，或包裝材料以形成試劑盒。該試劑盒也可以包含可用于 使用該耗材的組分，例如，對照試劑（例如，對照模板、對照探針、對照引物等）、緩沖液等。
[0102] 裝置和系統
[0103] 使用耗材和/或實踐本發明的方法的裝置和系統也是本發明的特點。裝置或系 統可以包含耗材的特征，例如，反應腔室和陣列（以耗材形式或者裝置的專用部件）。最典 型地，該裝置通常具有接收器，例如安置上述耗材的平臺，以及用于監測陣列的檢測光學器 件，用于熱循環腔室的模塊，和具有控制熱循環、檢測和信號后處理的系統指令的計算機。
[0104] 示例性系統的示意圖示于圖11。如圖所示，耗材10安置在平臺20上。環境控制 模塊（ECM) 30 (例如，包括Peltier裝置，冷卻風扇等）提供環境控制（例如，溫度的熱循 環）。由光源40 (如燈、電弧燈、LED、激光等）提供照明光。光學系統50將光從光源40導 向耗材10。由光學系統監測來自耗材10的信號，并且將信號信息傳遞給計算機60。計算 機60也任選地控制ECM30。可以由計算機60來處理信號信息，并且輸出至用戶可觀察的顯 示器70和/或打印機。可將ECM30安置在耗材10的上方或下方，并且可以包含其他觀察 光學器件80 (位于平臺20的上方或下方）。
[0105] 設置平臺/接收器以安置用于熱循環和分析的耗材。該平臺可以包含與耗材的相 應特性件匹配的對準（registration)和對齊結構，例如對齊臂、扳手、孔、栓等。該平臺可 包含接收和定向耗材的盒，將其以與其他裝置元件可操作連接的方式放置，盡管這在很多 實施方式中不是必需的，例如將耗材直接安置在平臺上的情況中。設置裝置元件以操作耗 材，并且裝置元件可包含用于向耗材遞送緩沖液和試劑的流體遞送系統、熱循環或其他溫 度控制或環境控制模塊、檢測光學器件等。在所述腔室制于裝置內而不是整合到耗材中的 實施方式中，通常設置裝置元件以在腔室上或腔室附近處操作。
[0106] 可以通過該裝置或系統來對耗材進行流體遞送，或可以在將耗材加載到該裝置或 系統中之前來進行所述流體遞送。流體處理元件可被整合到該裝置或系統上，或可以配置 成與該裝置或系統分開的單獨處理器。流體處理元件可以包含將試劑或緩沖液（手工或自 動化）遞送到耗材中端口的移液器，或可以包含毛細管、微制造的裝置通道等。可用于加載 所述耗材的手工和自動化移液器和移液器系統可從各種來源購得，所述來源包括賽默科技 公司（Thermo Scientific)(美國）、Eppendorf 公司（德國）、Labtronics 公司（加拿大） 等。一般來說，可購得各種流體處理系統，并且可將其整合到本發明的裝置和系統中。參見， 例如，Kirby (2010)Micro-and Nanoscale Fluid Mechanics transport in Microfiuidic Devices(《微米級和納米級流體力學：微流體裝置中的運輸》），ISBN-10 :0521119030, ISBN-13 :978-0521119030 ；Bruus (2007)Theoretical Microfluidics(Oxford Master Series in Physics)(《理論微流體》（牛津物理大師叢書），美國牛津大學出版社，ISBN-10 : 0199235090, ISBN-13 :978-0199235094 ；Nguyen(2006)Fundamentals And Applications ofMicrofluidics (《微流體的基礎和應用》），第2版，（Integrated Microsystems (整合的微 系統）），ISBN-10:1580539726, ISBN-13 :978-1580539722 ;Wells(2003)High Throughput Bioanalytical Sample Preparation :Methods and Automation Strategies(Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis)(《高通量生物分析樣品制備：方法和 自動策略（藥學和生物醫藥分析中的進展）》），埃爾斯威爾科學公司；第1版，ISBN-10 : 044451029X，ISBN-13 :978-0444510297。耗材任選地包含設置以與遞送系統匹配的端口，例 如，用于通過移液器或毛細管遞送裝置進行加載的合適尺寸的端口。
[0107] ECM或熱調節模塊可以包含促進熱循環的結構，諸如熱電模塊、Peltier裝置、冷 卻風扇、散熱器、設置以與所述腔室的外表面部分匹配的金屬板、流體浴等。很多這種熱調 節組件可用于整合到本發明的裝置和系統中。參見例如Kennedy和Oswald(編者）（2011) PCR Troubleshooting and Optimization :The Essential Guide(《PCR 解決問題和優 化：基本手冊》），凱斯特學術出版社，ISBN-10 :1904455727 ;ISBN-13 :978-1904455721 ; Bustin(2009)The PCR Revolution :Basic Technologies and Applications (《PCR 革命：基本技術和引用》），劍橋大學出版社；第1版，ISBN-10 :0521882311, ISBN-13 : 978_〇52l8823l6;Wittwer 等（編者）（2〇〇4)Rapid Cycle Real-Time PCR-Methods and Applications(《快速循環實時PCR方法和應用》），施普林格出版社；第1版， ISBN-10 :3540206299, ISBN-13 :978-3540206293 ；Goldsmid(2009)Introduction to Thermoelectricity(Springer Series in Materials Science)(〈〈熱電性介紹 (Springer材料科學系列）》），施普林格出版社；第1版，ISBN-10 :3642007155, ISBN-13 : 978-3642007156 ;Rowe(編者）（2005)Thermoelectrics Handbook :Macro to Nano(《熱電手 冊：宏觀到納米》），CRC 出版社；第 1 版，ISBN-10 :0849322642, ISBN-13 :978-0849322648。 熱調節模塊例如可以被制成接收耗材的盒的形式，或可以被安置在與耗材可操作附近處的 平臺上。
[0108] 通常，ECM或熱調節模塊具有反饋控制系統，該系統可操作地連接到計算機，該 計算機控制該模塊或是該模塊的一部分。計算機指導的反饋控制是儀器控制的現有方 法。參見，例如，Tooley(2005)PC Based Instrumentation and Control(《基于 PC 的 儀器和控制》），第 3 版，ISBN-10 :0750647167, ISBN-13 :978-0750647168 ;Dix 等（2003) Human-Computer Interaction(《人-計算機互動》）（第3版），普倫蒂斯?霍爾出版社 (Prentice Hall)，第 3 版，ISBN-10:0130461091，ISBN-13:978-0130461094。通常，通過 計算機實施系統控制，計算機可以使用例如作為輸入的腳本文件以生成目標溫度和循環時 程，以及指定何時檢測光學器件觀察/拍攝圖像。圖像通常在反應過程中的不同時間點拍 攝，并且通過計算機分析以生成強度與時間關系的曲線，由此得到靶標的濃度。
[0109] 所述光學系統可以包含任何典型光學系統組件，或可以可操作地連接至此類 組件。該光學系統將光導向耗材，例如，集中到耗材陣列或陣列區域上。該光學系統還 可以檢測從陣列發射的光（例如，熒光或發光信號）。可任選的現有光學組分的描述 參見，例如，Kasap 等（2009)Cambridge Illustrated Handbook of Optoelectronics and Photonics(《劍橋光電子和光子圖不手冊》），劍橋大學出版社；第1版，ISBN-10 : 0521815967, ISBN-13 :978-0521815963 ;Bass 等（2009) Handbook ofOptics (《光學手冊》）， 第 3 版，卷 I :Geometrical and Physical Optics, Polarized Light, Components and Instruments (set)(幾何和物理光學，偏振光、組分和儀器（組）），MHP公司（McGraw-Hill Professional);第 3 版，ISBN-10 :0071498893, ISBN-13 :978-0071498890 ;Bass 等 (2009) Handbook of Optics (《光學手冊》），第 3 版，卷 II :Design，Fabrication and Testing, Sources and Detectors, Radiometry and Photometry(設計、制造和測試，來 源和檢測，輻射度學和光度測定法），MHP公司；第3版，ISBN-10 :0071498907, ISBN-13 : 978-0071498906 ;Bass 等（2009) Handbook ofOptics (《光學手冊》），第 3 版，卷 III : Vision and Vision Optics (視覺和視覺光學），MHP 公司，ISBN-10:0071498915，ISBN-13: 978-0071498913 ;Bass 等（2009) Handbook of Optics (《光學手冊》），第 3 版，卷 IV : Optical Properties of Materials, Nonlinear Optics, Quantum Optics(光學屬性材 料，非線性光學、量子光學），McGraw-Hill Professional，第 3 版，ISBN-10 :0071498923, ISBN-13 :978-0071498920 ;Bass 等（2009)Handbook ofOptics(《光學手冊》），第 3 版，卷 V ：Atmospheric Optics, Modulators, Fiber Optics, X-Ray and Neutron Optics (大氣光 學、調節劑、光纖、X-射線和中子光學），MHP公司；第3版，ISBN-10 :0071633138, ISBN-13 : 978-0071633130 ;以及 Gupta 和 Ballato (2006) The Handbook ofPhotonics (《光子手冊》）， 第 2 版，CRC 出版社，第 2 版，ISBN-10 :0849330955, ISBN-13 :978-0849330957。典型的光 學系統組件包含任何下列組件：激發光源、弧光燈、萊弧光燈、LED、透鏡、光學過濾器、棱鏡、 相機、光檢測器、CMOS相機和/或CCD陣列。在一個理想的實施方式中，使用落射突光檢測 系統。該裝置也可以包含或聯接至陣列讀取模塊上，該模塊使陣列中信號的位置與待檢測 的核酸相關聯。
[0110] 在本發明的移動基材實施方式的內容中，在某些方面，所述反應容器可以直接聯 接到檢測通道，例如，在整合的微流體通道系統內，或通過擴增混合物和檢測通道之間的合 適流體界面。或者，可以在檢測通道上提供例如傳統流式細胞儀中存在的流體界面，以從擴 增反應混合物中取樣。該檢測通道通常設置以在給定時間基本上僅允許單個珠穿過通道的 尺寸。該檢測通道通常包含檢測窗，該檢測窗允許對珠的激發，并且收集從珠發出的熒光信 號。在很多示例中，采用融合的二氧化硅或玻璃毛細管或其他透明微流體通道作為檢測通 道。
[0111] 本發明的光學檢測系統通常包含能夠遞送一種或多種激發波長的激發光的一種 或多種激發光源。也包含了設置為收集從檢測通道發出的光并且過濾來自熒光信號的激發 光的光學系統。所述光學系統也通常包含其他分離元件，用于傳送熒光信號，以及用于將從 珠發出的熒光信號成分與從捕獲的探針片段發出的信號成分分開。
[0112] 圖14提供了整體檢測系統1400的示意圖。如圖所示，該系統包含第一和第二激 發光源，諸如激光1402和1404,其各自提供不同波長的激發光。或者，可以使用單個寬光譜 光源或多個窄光譜光源以在一個或多個合適波長范圍內遞送激發光以激發樣品中的可檢 測標記物，例如，與珠相關聯的那些和與帶標記的探針片段相關聯的那些。
[0113] 實線箭頭指示來自各激光的激發光束被導向檢測通道1408,例如，通過使用定向 光學器件（如分色鏡1406)進行所述導向。通過收集光學器件例如物鏡1412收集檢測通道 1408中的珠1410發出的光。然后使收集的光通過濾鏡1414,該濾鏡被設置以使虛線箭頭 所示的發出的熒光通過，但排除收集的激發輻射。收集的熒光包括由第一發射光譜處的捕 獲的探針片段上的標記物發出的熒光，以及取決于珠中使用的標記物的數量的由一種或多 種不同發射光譜處的珠標記物信號發出的熒光信號。然后使收集的熒光通過分色鏡1416， 該分色鏡將來自捕獲的探針片段的熒光反射到第一檢測器1420。然后，使來自珠的剩余熒 光信號經歷進一步的分離，該分離通過使該信號通過第二分色鏡1418來進行（其將第一珠 信號組分反射到第二檢測器1422)，并且使第二珠信號組分通過到達第三檢測器1424。該 檢測器通常聯接至合適的處理器或計算機上以存儲與經檢測的珠相關聯的信號數據，并分 析信號數據以確定珠的特性，以及因而的捕獲探針和相關靶核酸序列的特性。另外，該處 理器或計算機可以包含對定量信號數據編程和對靶序列拷貝數量的發信，其中進行時程實 驗，如在整體擴增反應中一輪或多輪擴增循環后對珠取樣。
[0114] 該裝置或系統可以包含或可操作地聯接到如在計算機或計算機可讀介質中實施 的系統指令。該指令可以控制該裝置或系統的任何方面，例如，將信號強度的一個或多個測 量值與由熱調節模塊實施的多個擴增循環相關聯，以測定由裝置檢測到的靶核酸的濃度。
[0115] 系統可以包含可操作地聯接至其他裝置組件的計算機，例如，通過合適的配線或 通過無線連接。該計算機可以包含如下指令，例如由熱調節模塊控制熱循環的指令（例如 使用上述反饋控制），和/或指定何時由光學系統拍攝或觀察圖片的指令。該計算機可以接 收或將圖像信息轉化成數字信息和/或信號強度與時間的關系曲線，測定由該裝置分析的 靶核酸的濃度等。該計算機可以包含用于使信號強度標準化來計算背景的指令，例如就陣 列的一個或多個區域檢測局部背景，并通過針對所述背景校正來使陣列信號強度測量值標 準化。相似地，該計算機可以包含通過對陣列捕獲核酸斑點上的差異、或對陣列不同區域的 視野不均進行校正，來使信號強度標準化的指令。
[0116] 其他定義
[0117] 在進一步詳細描述本發明之前，應理解，本發明不限于本文所述的特定裝置或生 物系統，因為它們當然可能變化。還應當理解本文所使用的術語僅為了描述特定的實施方 式而不是限制性的。在本說明書和權利要求書中所用的單數形式"一個"、"一種"和"該"包 括多個指示物，除非上下文中有明顯的表示。因此，例如，關于本文所討論的耗材腔室的"一 個表面"，任選地包含兩個或多個表面的結合等。
[0118] 除非另有限定，在此使用的所有技術和科學術語均與本發明所屬領域技術人員的 通常理解一致。雖然也可采用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本發 明，但下面描述了優選的方法和材料。在說明和要求保護本發明的過程中，將依據以下定義 使用以下術語。
[0119] "擴增引物"是可以在模板依賴性擴增反應中延伸的部分（例如，分子）。最典型 地，所述引物會包含或是在擴增條件下結合到模板的核酸。通常，所述引物會包含通過聚合 酶（如通過聚合酶鏈反應中的熱穩定聚合酶）或通過（如連接酶鏈反應中的）連接酶延伸 的末端。
[0120] "檢測腔室"是部分或全部封閉的結構，其中分析樣品或檢測靶核酸。所述腔室可 完全封閉，或可包含流控偶聯到所述腔室的端口或通道，例如用于遞送試劑或反應劑。所 述腔室的形狀可根據本發明和可用的系統設備而變化。當其尺寸上成形以降低信號背景， 例如通過在陣列附近處包含的較窄尺寸（例如，腔室深度）（從而降低靠近陣列處的溶液 生成的信號的量）時，或者當另外設置腔室以降低背景，例如通過使用涂層（例如，光學涂 層）或結構（例如，擋板或靠近所述陣列的其他形狀結構）時，腔室被"設置以在陣列附近 降低信號背景"。通常，設置該腔室以在陣列附近具有某一尺寸（例如，深度），從而溶液中 的信號足夠低以允許檢測陣列處的信號差異。例如，在一個實施方式中，該腔室在陣列之上 的深度小于約1mm ;理想地，腔室深度小于約500 μ m。通常，該腔室在陣列之上深度小于約 400 μ m，小于約300 μ m，小于約200 μ m，或小于約150 μ m。在本文提供的一個實施例中，該 腔室深度為約142 μ m。
[0121] "高效核酸陣列"是在雜交條件下與探針或探針片段高效雜交的捕獲核酸的陣列。 在典型的實施方式中，陣列被設置在反應/檢測腔室的內表面上。該陣列可以通過從斑點 法到化學或光化學合成的任何傳統陣列技術在表面上形成。通過控制捕獲探針的區域長度 (較短的探針比較長的探針更有效地雜交，小到供于雜交條件的最小雜交長度），并通過控 制各陣列區域中捕獲核酸的數量來實現高效。可以通過在捕獲位點和表面之間包含連接序 列或結構來產生供于雜交的更高效/更有用的捕獲位點（因而在距離表面的選擇距離上形 成捕獲位點，其可以降低表面對雜交的影響）。例如，可以使用核酸序列和/或聚乙二醇接 頭。捕獲核酸的數量在各陣列區域中分布，從而對典型擴增反應產生的給定探針或片段而 言，可用于雜交的位點數量是非速率限定的。如上所述，這意味著可用于結合在擴增反應中 產生的帶標記的探針片段的位點數量是過量的，并且優選位點數量明顯過量，該位點數量 在擴增反應后的反應混合物中可以由探針片段的濃度所飽和。
[0122] "帶標記的探針"是分子或化合物，其在擴增條件下與靶核酸特異性雜交，并且包 括可檢測的部分或可以變得可檢測的部分。最通常地，帶標記的探針是包含光學標記物的 核酸，所述光學標記物例如熒光團、染料、發光團、量子點等。標記物可以是可直接檢測的， 或可以處于淬滅狀態，例如探針包含淬滅劑部分的情況。在本文的很多實施方式中，在靶核 酸擴增中切割帶標記的探針以釋放包含可檢測標記物的探針片段。例如，帶標記的探針可 以包含熒光團和淬滅劑，例如，其中擴增反應造成探針切割以釋放帶標記的探針片段。最典 型地，探針包含"折翼"區域。這種折翼區域在雜交中不與靶堿基配對，并且通過核酸酶（如 聚合酶的核酸酶活性）從探針的其余部分切下，因而形成探針片段。 實施例
[0123] 提供以下實施例用于說明而非限制本發明的權利要求。應理解，本文所述的實施 例和實施方式僅用于說明目的，本領域技術人員應了解據此作出的各種修飾或改變，且它 們包括在本申請的主旨和權益以及所附權利要求書的范圍內。
[0124] 示例性檢測系統
[0125] 這個實施例的檢測系統能進行對靶核酸的單腔室、多重、實時PCR檢測。該系統擴 大了實時PCR的多重性容量，該擴大通過從傳統的光譜區分變化為基于陣列的空間區分以 生成對正擴增的各靶標具有特異性的實時信息來實現。
[0126] 傳統上，通過使用對各擴增子具有特異性的PCR探針（諸如TAQMAN?)和用不同波 長熒光團標記的PCR探針來實現單孔多重性。由于染料釋放光譜和光譜窗的限制，這種方 法將單個反應多重性容量限制在最多約5個靶標。
[0127] 在這個實施例中描述的方法使用帶標記的PCR探針，該PCR探針作為擴增子的代 替在該過程中將關于擴增進展的信息轉移到表面結合的陣列上。保留了關于擴增的動力學 信息，從而允許根據循環數量閥值方法來獲得檢測和定量信息。
[0128] 在PCR循環的延伸步驟中，Taq聚合酶的5' -3'核酸酶活性切割PCR探針以釋放 折翼核酸，然后該折翼核酸可以優先與陣列表面上的捕獲探針雜交。各折翼和相應的捕獲 探針對于測試組中的潛在靶標是唯一的。
[0129] 反應腔室深度
[0130] 進行實驗以評價腔室厚度與給定陣列中信號與背景噪音之比的關系。基材用不同 深度的腔室機械加工，并且用官能化的聚合物被覆。測量腔室的實際深度。所述基材然后 用捕獲探針點樣，并且使用紫外線固化環氧樹脂組裝成封閉的反應腔室。將含有45nM的與 陣列上各捕獲探針互補的帶標記的探針片段的合成模擬和255nM的相應完整探針（以模擬 15%切割）用移液器轉移到各封閉反應腔室中，并且在30°C下雜交3分鐘后測量所述信號 對比背景信號。一項試驗的結果示于圖13。如圖所示，反應腔室的厚度從600微米減小到 小于200微米顯示出信號與背噪之比的顯著增加，最優比率是厚度小于300微米的情況下， 并且優選小于200微米厚度。
[0131] PCR腔室和陣列
[0132] 大部分實驗中使用的PCR腔室示于圖2。如圖所示，該腔室由含有與PCR探 針折翼序列互補的捕獲寡核苷酸的陣列的底表面組成。捕獲探針由整合DNA技術公司 (Integrated DNA Technologies Inc)(愛荷華州克拉威爾）合成，并且具有共價連接到形 成PCR腔室底部的基材的5'端氨基基團，以及連接化學和寡核苷酸序列之間的聚乙二醇接 頭。序列長度與對應的PCR探針折翼相同。從市售可得的載玻片形成PCR腔室的底部。這 種載玻片具有含有活性NHS酯的聚合物涂層，該涂層用于捕獲探針的后續連接物。載玻片 包含用聚合物被覆的玻璃和塑料基材。兩種類型的載玻片得到相似的實驗數據。根據標準 方法，使用SP0TB0T TM(Arrayit技術公司（加利福尼亞州薩尼維爾））方案來辨認捕獲探針。 該捕獲探針斑點直徑通常是100 μ m，點之間中心與中心的距離是200 μ m。在對該捕獲探針 進行定點測定和洗滌之后，使用壓敏粘合劑（PSA)和具有如圖2所示的進端口和出端口的 聚碳酸酯頂部部件組裝成PCR腔室。該腔室具有142 μ Μ的最終深度/厚度（或高度）和 15mm的直徑。該腔室裝載約45uL體積的PCR試劑。
[0133] 熱循環儀和光學線路板。
[0134] 熱循環儀和光學檢測系統包含落射熒光、單通道檢測系統，該系統包含（1)激發 光源（例如，汞弧光燈或LED)，（2)用于激發光和發射光的干擾光學過濾器，從而檢測熒光 團的特定組合，如Cy3、Cy5等，和（3)光檢測器，其為C⑶或CMOS照相機。
[0135] 該系統還包含熱循環組件，諸如一對熱電模塊、金屬板、散熱器和強力冷卻風扇， 這些組件用于將封閉的耗材（例如，上述的陣列和腔室）快速熱循環至需要的溫度并持續 所需時間。通過使用反饋控制系統來控制熱電模塊至特定的溫度持續特定的時間，該系統 使用靠近耗材的熱敏電阻器作為控制系統的反饋。
[0136] 通過計算機進行系統控制，其使用作為輸入的腳本文件來生成靶標溫度和時間， 并且指定何時通過光探測器拍攝圖像。并且通過計算機分析在熱反應中的不同時間點拍攝 的所得圖像來生成強度與時間的關系曲線，從而得到靶標濃度。
[0137] 在熱反應過程中的不同時間和溫度下捕獲單通道熒光圖像。然后分析這些熒光圖 像以生成對起始靶核酸濃度的定量。使用平均灰度強度測量值、背景校正和基線調整的組 合來分析熒光圖像。在陣列中對各點局部測量背景。通過測量感興趣點的周圍溶液的同心 環的熒光強度來計算背景。然后校正來自各斑點的信號以計算局部背景。進一步標準化來 自各斑點的經校正的信號以計算視野中的斑點以及不均勻光照中的變化。然后將從前幾輪 循環（通常5-15輪循環）中獲得的經校正的強度測量值的平均值用于調整基線和對各斑 點測量值的標準化。
[0138] 實施例1 :三步擴增反應
[0139] 擴增試劑混合物包含標準PCR試劑，該試劑包含對擴增的各靶標有特異性的兩條 PCR擴增引物，以及對擴增的各靶標具有特異性的PCR探針。典型探針的結構示于圖1A。如 圖所示，圖1A探針區域（A)表示與靶標擴增子互補的探針的核酸區域，使用如通常對傳統 實時PCR探針（例如，在TAQMAN?探針中）相同的規定來設計。探針區域（B)表示與相應 捕獲探針（下文討論）互補但是不與靶核酸互補的正交核酸"折翼"序列。為了說明，在一 個實施例中設計該序列以具有40°C -461：的Tm，盡管能用其他探針設計來取代。在一個實 施例中，序列長度是約13或14個堿基。探針區域（C)表示具有與核酸區域（B)的序列的 部分互補的序列的核酸。設計該序列以促進形成全長探針的二級結構，例如具有47?51°C 的^。淬滅劑（D)表示任選的淬滅劑分子。標記物（E)表示熒光團或其他任選的可檢測標 記物。熒光團Cy3用于下文顯示的數據。
[0140] 對這個實施例中的數據而言，用下列試劑制劑進行PCR:200nM引物，IX FAST START1"1 PCR 緩沖液（可購自羅氏公司（Roche))，2-6mM MgCl2,0.5mg/mL BSA，0.2 單位/uL FAST START1"1 Taq聚合酶（羅氏公司）和150nM PCR探針。
[0141] 使用上述制劑制備lOOuL PCR反應物。
[0142] 用于這個實施例的PCR探針序列是：
[0143] NN NMNNNNMNM NNCCTGTTGCCAATTTCAGAGTGTTTTGCTTAAC NNNNNNNNN GAT(SEQ ID NO ：1)〇
[0144] 5'和3'折翼用下劃線/雙下劃線表示，而傳統TaqMan序列用黑體表示。雙下 劃線序列表示設計形成二級結構的同源區域。二級結構的預測融合溫度是51°C，如由 mFold(idtdna. com)使用PCR緩沖液條件所測定。用5' Cy3熒光團和黑洞猝滅物（Black Hole Quencher) 2部分在3'端標記PCR探針。
[0145] 連接到PCR腔室的底表面的捕獲探針序列是：NNN NNN NNN NNN N(SEQ ID NO :2)， 使用PCR緩沖液條件的Tm是42°C。
[0146] 將包含靶序列的DNA質粒以ΙΟ6、104和10 2拷貝/uL的濃度加入到各PCR反應中。 然后所述溶液通過加熱到95°C脫氣。脫氣后，加入聚合酶，并且將所述反應用移液器加載到 PCR腔室中。剩余溶液加入應用生物系統（Applied Biosystems)7500用于平行分析。
[0147] 用于基于PCR的陣列的循環條件如下：
[0148] 溫度 時間 目的 95 °C 120 秒 FAST START 酶激活 95 °C 15秒 變性 60 °C 60秒 聚含Si延仲 30Γ 120秒 折翼雜交和光學讀取
[0149] (變性和延伸進行5輪循環，然后變性/延伸/折翼雜交和光學讀數重復8輪循 環）。
[0150] ABI7500的循環條件如下：
[0151] 溫度 時_ __ 951： 120 秒 FAST START _激活 951： 15秒 變性 60V 60秒 聚介陶延仲和光，速収
[0152] 變性/延伸和讀數進行40輪循環。
[0153] 對基于PCR陣列的拷貝數量滴定的結果示于圖3,溶液相PCR的結果示于圖4。如 圖所示，結果是相當的，得到相似的滴定表現。
[0154] 實施例2 :二步擴增反應
[0155] 如上述實施例1，擴增試劑混合物含有標準PCR試劑，該試劑包含與擴增的各靶標 互補的兩條PCR引物（200nM)和具有與擴增的各靶標互補的序列的PCR探針（300nM)。典型 探針的結構示于圖1B。如圖所示，帶標記的探針還包含與靶標擴增子互補的核酸片段（A)， 使用如通常對傳統實時PCR探針（例如，TaqMan)相同規則設計。還包含與捕獲陣列上相 應捕獲探針互補的正交核酸"折翼"序列（B)。該探針還包含偶聯到折翼部分B上的熒光標 記物（C)和偶聯到靶標特異性部分（A)上的淬滅劑部分（D)。
[0156] 對兩步擴增而言，該正交折翼（B)包括設計以具有與捕獲陣列上的互補物的70°C 的^的序列。序列長度通常是25?27個堿基。如上述實施例1，設計整體探針，從而最穩 定的二級結構在用于PCR的緩沖液條件下具有不高于比延伸和測量溫度低10°C的溫度的 Tm。使用www. idtdna. com上可用的unafold軟件設計寡核苷酸。用于這個實施例的下面 PCR探針序列是：
[0157] KNN NNN NMM NNM NNN NNN N/Cv3/MN NNN NNN ATG GCC GTT AGC TTC AGT CAA TTC AAC AG/BHQ_2/(SEQ ID NO ：40)
[0158] 其中雙下劃線序列組成正交折翼，并且非下劃線序列與擴增子同源。最穩定的探 針二級結構的熔融溫度是45°C。正交折翼的1' 111是711：。用內部Cy3熒光團C(購自新澤 西州皮斯卡特維的GE健康護理生物科學公司）和黑洞猝滅物2部分D (購自加利福尼亞州 諾瓦托的生物探索公司（Biosearch，Inc.))在3'端上標記該PCR探針。
[0159] 定點測定與PCR探針的折翼部分同源的捕獲探針。如上述進行PCR，除了使用下述 循環條件：
[0160] 溢度 時M U的 95V 60 秒 FAST START ft激活 95V 15 秒 變fl·: 55eC 60秒 聚介II延伸、折翼雜交和 光學讀取
[0161] 進行40輪循環，在各延伸步驟結束時測量熒光信號。圖12顯示對兩個靶標的基 于陣列的PCR的拷貝數滴定，其中第一個在靶標DNA質粒的10 4拷貝時開始出現，而第二個 在106拷貝時出現。
[0162] 實施例3 :使用未淬滅PCR探針的基于陣列的PCR曲線
[0163] 除了以下不同，使用與實施例1相同的方法。如下使用PCR探針序列：
[0164] NNNMNNNNM NNNNTCGCTGAACAAGCAACCGTTACCC NNNNNMNM (SEQ ID NO ：3)
[0165] 用5' Cy3熒光團標記這個序列，但是不包含3'淬滅劑。
[0166] 加入106拷貝的靶標并運行PCR。實時數據示于圖5。
[0167] 實施例4 :基于多重陣列的擴增
[0168] 這個實驗建立了在相同PCR腔室中檢測和擴增多個靶標的能力。PCR條件與實施 例1所示相同，除了以下例外：第一，將5組引物和5種單獨的PCR探針加入到對待測的各 靶標有特異性的PCR反應中。第二，將5種單獨捕獲探針置于PCR腔室的底部基材上，該腔 室對應5種PCR探針各自的5'折翼序列。第三，在第10輪PCR循環后，使溫度降低到各2 輪循環而不是如實施例1的各5輪循環的表面雜交溫度30°C。這使得PCR擴增過程中光學 研究的效率更高。
[0169] 所述PCR探針和捕獲探針效率如下所示：
[0170] PCR 探針：
[0171] F 1 u A ： N N N NNMNNNMMNN CCCCAT GGAATGTTAT CTCCCTTTTAAGCTTCTNNNNNNNN (SEQ ID NO :4) (50. 3。的 TJ
[0172] A/HI ：NNNN NNNNNNNNN. ACCTTGGC GCTATTAGAT TTCCATTTGC CMMMMNNMM (SEQ ID NO :5) (51. 2。的 TJ
[0173] A / H 3 ： N N NNNNNNNNNNMN C C T G T T GCCAATTT CAGAGTGTT TTGCTTAAC NNNNNNNNMMMN (SEQ ID NO :6) (51。的 Tj
[0174] FluB ：NNNNNNNNNNNNMNTCAAAGC CAATTCGAG CAGCTGAAAC TMNNNNNNN (SEQ ID NO :7) (51。的 TJ
[0175] p h i M S 2 ： N. NNNNNNNNNNNN TCGCTGAA CAAGCAACC GTTACCC NNNNNNNNNNMN (SEQ ID NO :8) (52。的 Tj
[0176] 捕獲探針 FluA: NNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 8) (46。的 Tm) AMI: NNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 9) (45°ft T||J) A/H3; NNNNNNNNNMNNN (SEQ Π 3 NO: 10) (420的 Tm) FluB: NNN NNN NNN MNN N (SEQ ID NO: 1 】）（46°的 Tm) phiMS2: NNN NNN NNN NNN N (SEQ ID NO; 12) (43^3 Tm)
[0177] 將包含對上述引物和PCR探針有特異性的序列的5種靶標質粒加入lOOuL PCR反 應中，并且如上述準備并加載該溶液。所得的基于實時陣列的PCR數據示于圖6。
[0178] 實施例5:高水平多重
[0179] 這個實施例顯示了檢測多個靶標的單個腔室多重，所述靶標能是包含在這個實施 例的組中的任何10個可能的靶標。無法在傳統溶液相PCR中實現該水平的多重（超過5 個潛在靶標的組）。
[0180] 所述實驗材料和方法與上述相同，除了以下例外：第一，將10個引物組和PCR探針 以與上述相同的濃度納入到PCR反應中。PCR探針和捕獲探針的序列如下所示：
[0181] PCR 探針：
[0182] FluA ：NNN NNNNMNNN NNCCCCATGG AATGTTATCT CCCTTTTAAG CTTCTNNNNNNNN(SEQ ID NO : 13) (50.3。的 Tj
[0183] A/HI ：NNNNNNNNNNNNNN ACCTTGGCGCT ATTAGATTTC CATTTGCC NNNNNNNN (SEQ ID NO :14) (51.2。的 TJ
[0184] A/H3 :祖 NNNNNNNNNNN CCTGTTGCCA ATTTCAGAG TGTTTTGCT TAAC NNNNNNNNNNN (SEQ ID NO :15) (5Γ 的 Tm)
[0185] F 1 u B - V 2 ： N^. NNNNNNNNNNN TCAAAGCC AATTCGAGCA GCTGAAACT NNNNNNNN (SEQ ID NO :16) (51° 的 Tj
[0186] phiMS2 ：NNNNNNNNNNNNNTCGCTG AACAAGCAA CCGTTACCC NNNNNNNN (SEQ ID NO :17) (52° 的 TJ
[0187] MPV ： NNNNNNN NNNNNNNATGG CCGTTAGCTTCAGTCAATTC AACAG NNNNNNN (SEQ ID NO :18) (48. 4° 的 TJ
[0188] PIV1 ：NNN NNNNNNNNN NTTOGAATT GTCTCGACA ACAATCTTTG GCCTNNNNNNNNN(SEP ID NO : 19) (50.4° 的 Tj
[0189] PIV2 ：NN NNMMNNMNN NNCCATTT ACCTAAGTGA TGGAATCAAT CGCAAAAGNNNNNNNN(SEQ ID NO :20) (48.8° 的 Tj
[0190] PIV3 ：NNN NNNNNNNNNNN ΝΑΓΑΤΑΑ GCTTTGATC AACCCTATG CTGCACNNNNNNNNN(SEP ID NO :21) (49.9。的 Tj
[0191] RSV ；N NNNNNNNNN NNNTTCGAAGGCTC CACATACACAG CTGCTGNNNNNNNNN (SEQ ID NO :22) (49. 9° 的 TJ
[0192] RSY-V2 ：NNNNN NNNNNMN NTCGAAGGC TCCACATACA CAGCTGCTGNNNNNNNN (SEQ ID NO :23) (5Γ 的 Tm)
[0193] 0PC1 ： NNNNNNNN NNNNNTTCGGCAT TTCCTGGATTGAGT CGGTACTANNNNNNNN (SEQ ID NO :24) (48. 7° 的 TJ
[0194] 捕獲探針 捕獲探針Tm FluA NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 26 ( 460的 A/Hl NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO·· 27 (45° 的 fTP*· \ i HI J A/IB NNNNNNNNNNNNN eEQ ID NO: 28 (42° 的 fTr% \ i HI J FluB-v2 NNN NNN NNN NNN N gEQ ID NO: 29 (46。的 Tm) phiMS2 NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 30 (43° 的 Tm) MPV NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 31 PIVI NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 32 PIV2 NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 33 PIV3 NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 34 RSV NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 35 RSV-v2 NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 36 OPC1 NNN NNN NNN NNN N SFQ ID NO: 37
[0195] 圖7顯示了當沒有靶標加入到PCR反應（沒有模板對照）時，所得基于實時陣列 的PCR曲線。如圖所示，從含有除了靶標以外的所有PCR組分的溶液中沒有得到信號。圖 8顯示了具有以10000拷貝/uL加入的3種質粒靶標（MPV、0PC-1、PIV2)的相同的實驗。
[0196] 實施例6 :快速雜交動力學的示范
[0197] 如上所述構建PCR腔室。將下列胺、PEG化的捕獲探針序列置于底部基材上：NNN NNN NNN NNN N(SEQ ID NO :38)。
[0198] 制備含有上述PCR緩沖液的溶液，其含有以下寡聚序列（ΙΟΟηΜ)，該寡聚序列模擬 PCR探針的5'折翼部分，用Cy3熒光團在5'端上標記并與捕獲探針互補：NNN NNN NNN NNN N(SEQ ID NO :39)。
[0199] 將該溶液加入到PCR腔室中，并且將該腔室加熱到60°C (比雙鏈體Tm高15度）， 然后冷卻到30°C。這模擬了 PCR方案擴增步驟的條件。每20秒光學讀取持續2分鐘。所 得數據示于圖9。
[0200] 數據的一個有趣的方面顯示了內部溫度達到30°C時已經發生了大量雜交。
[0201] 實施例7:暗試驗設置
[0202] 使用包含購自整合DNA技術公司的Iowa Black RQ猝滅基團的探針的折翼部分重 復上述實施例1所述的三步驟擴增試驗，將該基團偶聯于其5 '端，并且沒有任何其他的標 記物或猝滅基團與探針相連。陣列表面上設置的捕獲探針攜帶與3 '末端偶聯的Cy3熒光 團。
[0203] 所有的引物和探針序列訂購自IDT并經凍干。然后使其在水中重懸至儲液濃度 (100uM-200uM)并且用于制備PCR反應的引物/探針儲液。將H03NVSPCR緩沖液與引物和 探針合并以制備PCR主混物。
[0204] 通過Array-It spotbot2用傳統微陣列定點測定技術在官能化的表面（由官能化 聚合物被覆的C0P基材）上定點測定。定點測定的載玻片在75%濕度下孵育8-15小時，然 后用DI水沖洗并用氬氣干燥。帶標記的捕獲探針以在50mM的pH8. 5的定點測定緩沖液中 100nM-50uM范圍的濃度定點測定，產生信號強度的范圍。
[0205] 如上述實施例，將基于芯片的反應腔室使用雙側壓敏粘合劑墊圈、聚碳酸酯蓋 和任選的透明密封構建在官能化、陣列的表面之上。反應腔室的總體積為約30uL，高度 150um〇
[0206] 向PCR主混物中加入已知濃度的靶序列并將所得的溶液加載到反應容器中。對容 器進行密封并且裝載到上述的熱循環儀上。從質粒儲液中得到靶序列或者從包括這些擴增 子儲液的之前反應中得到所得的擴增子。在NanoDrop儀器上使用UV-Vis光譜定量所有的 革巴標分子。
[0207] 熱循環條件包含在95°C下85秒的熱起始步驟，之后是40輪分別為5秒和20秒的 熔融（95°C)和延伸（55°C)的循環。在第10、15和18輪循環以及之后每2輪循環時，向 循環添加用以收集數據的額外步驟。在延伸后使溫度降至30°C并持續30秒。在這些雜交 步驟結束時收集表面的圖像。計算各試驗中的斑點的平均像素強度并且針對循環數繪制曲 線以產生實時PCR曲線。溶液和表面探針的設計示于試驗模式3。對于雙重PCR反應：力口 入用于H3和0PC1試驗的600nM引物和300nM探針。圖15顯示基于折翼部分和它們相關 聯的猝滅劑與Cy3標記的捕獲探針的增加雜交的實時PCR反應的過程的曲線。熒光信號以 負信號的絕對值作圖，其顯示信號隨著反應進行而降低。
[0208] 本文所列的方法具有之前的方法中未發現的多種優勢。本發明系統使得能通過在 擴增過程中從溶液相PCR向表面限制的陣列實時有效傳遞信息來進行單腔室、高度多重、 定量的PCR。這允許實現更高水平的多重性，同時保持效率并影響關于溶液相實時PCR所積 累的大量認識。為了實現這個方法，開發了該系統的多個新方面。
[0209] 例如，本發明的一個特征是使用擴增子代替物來橋連溶液相和固相。之前針對基 于陣列的實時PCR的教導通常依賴于擴增子本身對固相陣列的雜交。這提出了多個問題， 所述問題使系統復雜化、阻礙效率并且需要更昂貴的組件以闡明所需信息。在多重PCR環 境中，非常難于設計相似長度和雜交效率的擴增子。使用有可切割的5'折翼的PCR探針使 得物質均質化，通過使用對雜交動力學理想的非常短的序列將信息從各擴增子轉移到表面 上。這種方法也在不依賴待檢測的擴增子序列的陣列上制備捕獲探針序列。這使得能選 擇最有利的捕獲序列和可用于很多不同靶標組的通用陣列的可能性，簡化了設計和制造方 法。
[0210] 如本文所述，PCR探針也影響了已開發的對基于探針的溶液相實時PCR的設計規 貝1J。使用對于雜交的非常短的序列（例如，13-14個堿基）使得雜交非常高效，使得在標準 PCR緩沖液的低鹽環境生成陣列的高信號。因此，所述系統能在單腔室中獲得非常良好的效 果，其中表面雜交必需與最優溶液相PCR偶聯。
[0211] 本發明的另一個特征是從溶液相背景熒光中區分表面雜交信號。本發明的這個方 面對于從該陣列中提取相關信息很重要。之間的教導使用復雜或昂貴的光學方法以克服這 個問題，諸如使用內全反射或共聚焦顯微以從溶液背景中分離表面信號。相反，本發明提供 了不需要光學"竅門（trick)"來實現區分的簡單標準光學設備的用途。從多個來源區分信 號的能力。在陣列中使用的表面化學提供了非常高的捕獲探針密度，并且因此非常高的經 雜交的靶標密度。已顯示表面可以接近100%的靶核酸捕獲效率。這種高捕獲密度和效率 作用以集中表面信號，以輔助表面/溶液相的區分。使用短靶核酸以顯著增加這種效果。
[0212] 本發明輔助信號區分的另一方面是使用非常薄的PCR腔室。來自溶液的背景信號 與陣列之上的溶液的高度線性相關。使用薄腔室利用這種效果。
[0213] 本發明的另一方面是使用快速雜交動力學以使得從溶液相信息向表面陣列實時 轉移。這些實施例中所述的系統顯示了極快的固相雜交。這種現象促進了該技術，并且能 對本發明的多個方面發揮作用，包含短5'折翼靶標、最優固相表面化學、薄耗材和熱循環溫 度程序中生成溫度梯度。
[0214] 盡管已經出于闡述和理解的目的在某種程度上詳細地描述了本發明，但是本領域 技術人員通過閱讀本說明書可清楚地了解，可在不背離本發明真實范圍的情況下進行各種 形式和細節的變化。例如，上述所有的技術和設備都可以用于各種組合。本申請中提到的 所有公開出版物、專利、專利申請和/或文獻都通過引用全文納入本文中，相當于所述各單 獨的公開出版物、專利、專利申請和/或文獻都獨立地通過引用納入本文用于所有目的。
【權利要求】
1. 一種檢測樣品中靶核酸的方法，所述方法包括：用具有核酸酶活性的聚合酶對所述 樣品進行擴增反應，所述擴增反應在包含第一探針的試劑的存在下進行，所述第一探針包 含與所述靶核酸序列互補的第一部分和不與該第一靶核酸序列互補的第二部分，所述第二 部分包含第一位置上的與所述第二部分偶聯的第一猝滅劑部分，從而當所述靶核酸序列被 擴增時，所述第二部分從所述第一部分被切下成為第一探針片段； 使所述第一探針片段與固定在基材上的捕獲探針雜交，其中所述捕獲探針包含被所述 第一猝滅劑部分至少部分猝滅的熒光團，所述熒光團偶聯至所述捕獲探針上的第二位置， 從而在所述探針片段與所述捕獲探針雜交之后，所述熒光團至少部分被所述猝滅劑猝滅； 以及 基于所述捕獲探針上所述熒光團的猝滅來檢測所述靶序列的存在。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于： 所述擴增試劑包括多種不同的探針，所述多種不同的探針具有與不同靶核酸序列互補 的多種不同的第一部分和不與多種靶核酸序列互補的不同的第二部分，所述第二部分各自 包含偶聯至所述第一位置上的猝滅劑部分，所述多種第二部分在所述多種靶核酸序列擴增 后被切割成探針片段；以及 其中所述基材包含在所述基材上排列的多種不同的捕獲探針區域，各捕獲探針區域包 含與所述多種不同的探針的不同第二部分互補的捕獲探針，并且各捕獲探針包含被所述猝 滅劑部分猝滅的熒光團。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一位置包含所述探針片段的5'端， 而所述第二位置包含所述捕獲探針的3'端。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，各捕獲探針區域包含與所述探針片段雜交 的非速率限制數量的捕獲核酸。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，與所述捕獲探針雜交的所述第一探針片段 的長度小于約30個核苷酸。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，與所述捕獲探針雜交的所述第一探針片段 的長度小于約20個核苷酸。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，與所述捕獲探針雜交的所述第一探針片段 的長度小于約15個核苷酸或更短。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述檢測前將所述靶核酸擴增至少5輪擴 增循環。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述檢測前將所述靶核酸擴增多輪擴增 循環，其中，所述檢測后在該探針的額外拷貝的存在下另擴增所述靶核酸部分，所得釋放的 第一探針片段隨后與所述陣列雜交并被檢測，其中檢測到的信號強度與所述樣品中存在的 革巴核酸的量相關聯。
10. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述雜交溫度低于所述擴增反應的溫度。
11. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括檢測所述陣列的一個或多個 區域的局部背景，和通過針對所述背景校正來使信號強度測量值標準化。
12. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述樣品包含多種靶核酸。
13. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述多種不同的捕獲探針在所述陣列上空 間分離。
14. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，在所述擴增反應中存在約5-約100種不同 的捕獲探針，和約5-約100種對應的探針，其中基于所述信號在所述陣列上定位可以檢測 多至5-100種不同的信號。
15. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針以約350fmol/cm2-約 5000fm〇l/cm 2或更大的密度排列在所述基材上。
16. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針以超過2000fm〇l/cm2的密度 排列在所述基材上。
17. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述多種不同的捕獲探針包含相同的標記 物部分，并且所述多種不同的探針片段包含相同的猝滅劑部分。
18. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增步驟和將所述第一探針片段與所 述基材雜交的步驟在相同溫度下進行。
【文檔編號】C12Q1/34GK104093857SQ201280067273
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年8月16日 優先權日:2011年11月17日
【發明者】K·斯卡布, P·馬丁, B·塔弗特, J·拉 申請人:Nvs技術股份有限公司