通過質譜法直接檢測金黃色葡萄球菌菌群的δ-溶血素的方法

通過質譜法直接檢測金黃色葡萄球菌菌群的δ-溶血素的方法
【專利摘要】本發明涉及采用特定質譜技術研究含有金黃色葡萄球菌菌群的樣品的方法，該方法能夠特異性地檢測在獲得的質譜上存在或不存在m/z值為3005±5Th或3035±5Th的峰，并依據該結果作出相應的決定。
【專利說明】通過質譜法直接檢測金黃色葡萄球菌菌群的S-溶血素的方法
[0001]本發明涉及分析金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的【技術領域】。金黃色葡萄球菌是造成定殖和感染的細菌(Wertheim，Melles等人，2005)，由占人口的20至30%的帶菌者攜帶。感染可以被分為兩大類型:涉及粘著因子“識別粘著基質分子的微生物表面組分”或MSCRAMM(血纖蛋白原的結合蛋白(FnBP)、蛋白A、凝固酶等)的化膿性感染；和需要分泌外毒素的毒素性感染,其中最出名的外菌素是溶血素、Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)、葡萄球菌腸毒素和剝脫性毒素(0tto2010)。所有的金黃色葡萄球菌菌株都不具有全部的毒力因子，并且這些因子在細菌生長期間不會被同時表達。在指數生長期，存在粘著因子的表達，這是定殖和侵入宿主所需要的。相反，在指數生長期結束時且在穩定期過程中，大多數細菌表達破壞宿主細胞(其生長所必需的營養物質的來源)所需的毒素。金黃色葡萄球菌具有許多控制這些進程的調節因子(Dufour, Jarraud等人，2002)。其中，“附屬基因調節子”(agr)系統是最重要的系統之一。
[0002]金黃色葡萄球菌的agr系統調節大量毒力基因和細菌的新陳代謝。其由基因座中分配在兩種趨異轉錄物RNA II和RNA III中的5個基因(agrBDCA和hid)組成。RNA II是操縱子P2的信使，其含有agrBDCA基因；RNA III含有hld，其為溶血素δ的基因。agrC編碼 組氨酸激酶，agrA是雙組分系統的受體。agrD編碼通過agrB加工成熟并分泌的肽。所產生的肽是一種自誘導肽，其激活刺激agrA的agrC。一旦其被激活，agrA受體通過各自的啟動子P2和P3誘導RNA II和RNA III的轉錄。RNA III含有hid(—種編碼溶血素δ的基因)，但首先是一種RNA調節子，該agr系統的真正的效應子。因此，這種RNA III在轉錄和翻譯水平上都調節大量基因(Verdon, Girardin等人，2009 ；Felden, Vandenesch等人，2011)。誘導該agr系統功能失常的突變導致自溶素和溶血素的表達改變；以及對細菌表型的作用，尤其是在致病潛力中所涉及到的細菌表型(Schweizer, Furuno等人，2011)。
[0003]金黃色葡萄球菌的溶血素δ，也稱為δ -毒素或δ -溶素，由屬于agr系統的hid基因編碼。其定位在RNA III(agr系統的效應子)內。RNA III翻譯成溶血素δ被延遲(^ I小時),并在指數生長期結束時發生(Balaban和Novickl995 ；Somerville, Cockayne等人，2003)。溶血素δ由此反映了 RNA III的轉錄，因此反映了 agr系統的功能性(Felden, Vandenesch等人，2011)。其屬于金黃色葡萄球菌的溶血毒素家族,并在細胞膜中產生孔。尤其是，其通過破壞細胞膜的磷脂造成人、兔、羊、馬、貓、雞的紅細胞等等的細胞裂解(Kreger, Kim等人，1971)。其還參與阻止生物膜的形成并參與在人嗜中性粒細胞中引發氧化應激(Somerville, Cockayne等人，2003)。其由圖1中顯示的26種氨基酸組成并具有
2.9kDa的質量(Fitton，Dell等人，1980)。其表現為兩種形式:1)在蛋氨酸殘基上的N-末端甲酰化形式，其為天然的并且為主要形式，在本文件中被命名為溶血素S jPii)脫甲酰化形式(Verdon, Girardin等人，2009)。通過酶鐵依賴性脫甲酰基酶肽確保脫甲酰化。在指數期和后指數期早期過程中，溶血素S被脫甲酰化以獲得弱趨化實體(chemoattractingentity) (Somerville, Cockayne等人，2003)。在細菌生長過程中，鐵濃度逐漸降低，導致脫甲酰基酶活性逐漸降低。從而存在溶血素δ的累積，提供嗜中性粒細胞的趨化性；并誘發炎癥反應，其為將來細菌生長的營養物來源(Somerville, Cockayne等人，2003)。最后，已經描述了多態性:在犬來源的菌株中發現了一種變體。其存在氨基酸的變化；在胰蛋白酶作用下消化降低；對羊紅血細胞的溶血潛力降低以及在低于25°C的溫度下溶血活性降低(Turnerl978)。在人來源的菌株中，在 Genebank?(Figueiredo, Jarraud 等人,2000)中描述了將位置10處的甘氨酸替換為絲氨酸(GlOS)的多態性類型，但是該突變的流行率是未知的。
[0004]根據研究，金黃色葡萄球菌的agr系統缺陷型菌株的出現頻率估計為15%至22%(Traber, Lee 等人，2008 ；Schweizer, Furuno 等人，2011 ；Tsuji, Maclean 等人，2011)。與社區MRSA相比，這些菌株在耐甲氧西林的醫院金黃色葡萄球菌(MRSA)中是更常見的(Tsuji, Maclean等人，2011)。但是，已經在所有的agr基因池1、I1、III和IV中發現了agr缺陷型菌株,不支持克隆假設(Rose, Rybak等人，2007)。
[0005]這些菌株具有實際臨床相關性，因為它們是在已對其施以最少操作的生物樣品中分離出來的，并且不是由于連續再植過程中發生的突變的結果(Traber，Lee等人，2008)。在agr系統功能異常與不存在溶血素δ之間已經建立了不同的臨床聯系。
[0006]例如，在2011年，在2003年至2007年間進行的處理814例金黃色葡萄球菌菌血癥的回顧性研究再次發現22%的菌株具有agr系統的功能異常。在18%的病例中，感染這些菌株的患者在30天內死亡，而對于agr系統是功能性的菌株為12% (p = 0.03)。因此，對agr缺陷型金黃色葡萄球菌菌株感染能夠預測死亡率，靈敏度為30%、特異性為79%、陽性預測值為18%和陰性預測值為88% (Schweizer, Furuno等人，2011)。
[0007]此外，處理MRSA持續性菌血癥(BP)的回顧性臨床研究(即在超過7天的合適的抗生素療法下帶有MRSA的陽性血培養物的存在率)表明，與消散型菌血癥(RB)相比，在持續性菌血癥(BP)的過程中更 頻繁地發現agr系統功能異常的MRSA菌株(通過在瓊脂糖上尋找溶血素S來體現)(BP組中菌株為71.4%，RB組中菌株為38.9% ;p = 0.057)。因此，不產生溶血素δ (表明agr系統功能異常)可能是持續性菌血癥的標志，需要加強管理(即最佳抗生素療法)(Fowler, Sakoulas等人，2004)。
[0008]還建立了與細菌自溶的聯系。agr系統控制許多基因尤其是IytS與IytR的表達。因此，agr系統的功能異常與在液體介質中聚集體的形成；細胞表面的改變，變得粗糙和擴散；以及自溶的傾向性有關(Brunskill和Baylesl996)。
[0009]Vuong等人,依他們的看法，已經表明在對聚苯乙烯的粘附模型中，78%的agr-缺陷型菌株形成生物膜，而僅有6%的菌株表達agr。這一現象還通過加入agr抑制劑得以證實并似乎是由于溶血素δ的表面活性劑性能引起的(Vuong, Saenz等人，2000)。但是，由于生成生物膜要求agr系統功能異常，而生物膜的擴散似乎依賴于agr系統，強調agr系統缺陷型菌株與功能型菌株在慢性感染過程中可能共存(Boles和HOrswill2008)。累積的這些結果支持在慢性感染過程中或在血管內設備上尋找agr-缺陷型菌株。
[0010]還建立了與囊腫性纖維化的聯系。在2000年，Goerke等人研究了 RNA III在從患有囊腫性纖維化的患者呼吸道樣品中分離的金黃色葡萄球菌菌株中的表達。顯示了agr-缺陷型菌株的優勢。因此在囊腫性纖維化過程中agr系統的功能性對于定殖與感染而言不是必需的(Sakoulas, El1poulos 等人,2005)。
[0011]最后，還已經報道了與糖肽耐藥表型(即糖肽中間型金黃葡萄糖球菌(Glycopeptide Intermediate Staphylococcus aureus), GISA)的聯系。被具有功能性agr系統的MRSA菌株感染的患者長期服用(即超過9個月)萬古霉素誘導溶血素δ表達減少，但后者不是被完全消除。在停止治療后，測量到溶血素δ的表達的顯著增加(Sakoulas, Gold等人，2006)。此外，agr系統功能異常的菌株表現出降低的萬古霉素敏感性，盡管后者的藥效動力學并未發生改變(Tsuji，Maclean等人，2011)。在2002年，Sakoulas等人證明了包括在他們實驗室的GISA收集物中包括的所有菌株具有功能異常的agr系統(Sakoulas, El1poulos等人，2002)。在2005年，證實了異質GISA表型的出現與agr系統缺陷型菌株長期暴露于萬古霉素之間的聯系。對萬古霉素的敏感性的這種降低也與細菌裂解減少和對血小板抗微生物肽的敏感性較低相關(Sakoulas, El1poulos等人，2005)。這種關系也得到了 Rose等人的研究的證實，Rose等人的研究表明agr-缺陷型菌株提高其對萬古霉素的最低抑制濃度(MCI)的能力提高，并由此成為GISA。相反，用屬于另一類抗生素的另一種抗金黃色葡萄球菌抗生素達托霉素(daptomycin)并未發現這種現象(Rose, Rybak等人，2007)。由此證明溶血素δ的產生的缺乏可能是檢測趨向GISA表型或異質性GISA表型的時間依賴性變化的早期標志，特別是在用萬古霉素治療期間(Fowler, Sakoulas 等人，2004)。
[0012]同樣，考慮到檢測溶血素δ的臨床益處，已經描述了用于測量金黃色葡萄球菌的溶血素S的不同方法。可以提及溶血試驗、在動物模型上的生物測試、反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、RNA 印跡(Northern blot)、測序和高效色譜法(HPLC)。
[0013]在溶血試驗中，可以通過在抗溶血素α和β抗體的存在下測量在瓊脂糖上培養的金黃色葡萄球菌菌株誘導的對血液的溶血作用，檢測溶血素S。還可以通過尋找溶血素δ與溶血素β之間的溶血協同作用來檢測溶血素δ (Verdon, Girardin等人，2009)。描述了不同的方法學:Sakoulas等人使用由溶血素β誘導產生大面積溶血的RN4420金黃色葡萄球菌菌株來檢測溶血素δ。Schweitzer等人也已經描述了一種派生方法學。這些方法容易進行，但是需要進行“專用”測試并具有主觀讀數:尋找溶血協同作用，這有時難以觀察到。最后，與RNA印跡和與agr基因測序相比，這些測試可能受假陰性的影響(Traber，Lee等人，2008)。
[0014]以往，已經使用了在動物模型上的生物測試。在這種情況下，可以通過測量對小鼠或豚鼠的最小致死劑量(MLD)來檢測溶血素δ的活性。但是這需要大劑量(小鼠MLD =110mg/kg,豚鼠MLD = 30mg/kg)。另一方法學包括研究溶血素δ誘導兔皮膚壞死的能力。大約Img溶血素δ在24小時后誘導大的紅斑(直徑>28mm)和硬結,在第3天(D+3)時形成壞死區。在較小劑量下還可以觀察到脫皮(Kreger, Kim等人，1971)。
[0015]還可以通過靶向RNA III的RT-PCR評估溶血素δ的表達。從菌株中提取總RNA，并進行競爭性RT-PCR。為了使結果標準化，Goerke等人使用編碼促旋酶(gyr)的管家基因，其表達是恒定的，與生長階段無關。RNA III RT-PCR代表一種靈敏、特異性和定量的技術。但是，由于高污染風險，其應用僅限于專業實驗室(Goerke, Campana等人，2000)。
[0016]通過使用靶向RNA III的RNA印跡可以間接檢測溶血素δ的表達(Kornblum, Projan 等人,1988 ；Goerke, Campana 等人,2000 ；Traber 和 Novick2006)。
[0017] 某些作者還使用了 agr基因座的完整測序以便鑒定可以解釋其功能異常的點狀突變(Traber 和 Novick2006)。[0018]還已經使用了幾種HPLC技術。在2000年，Otto和Gotz描述了一種通過高效液相色譜法(HPLC)測量溶血素δ的定性和定量方法。將在胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉湯中制作的細菌培養物的上清液以19000g離心5分鐘。隨后在ImL的PHE ( “苯基衍生化的”)柱上通過HPLC分析上清液，并隨后用10至90%的溶劑B梯度洗脫，溶劑A是0.1 %的三氟乙酸(TFA) /水混合物，溶劑B是0.1 %的TFA/乙腈混合物。用具有214或280nm 二極管線陣列的UV光譜儀實現檢測(Otto和Gotz2000)。在2002年，Somerville等人,依他們的看法，描述了一種與Otto和Gotz的方法類似的方法學，使用HPLC檢測和測量溶血素δ但是與具有電噴霧源的質譜法檢測聯用。他們由此獲得了溶血素δ的天然與脫甲酰化形式的m/z 為 3007Th(Thomson)和 2972Th(Somerville, Cockayne 等人,2003)。
[0019]在這種背景下，發明人著眼于一種研究金黃色葡萄球菌菌落的新方法，其有可能根據是否存在溶血素δ作出診斷和/或與是否存在溶血素δ建立關聯。這種方法應當快速和容易使用，并且尤其不需要任何提取蛋白質的繁瑣步驟。
[0020]本發明涉及采用質譜技術研究含有金黃色葡萄球菌菌群的樣品的方法，其包括以下步驟:
[0021]a)使樣品與介質接觸，以通過激光束的作用使樣品中存在的分子離子化，
[0022]b)用激光束離子化樣品中存在的分子，
[0023]c)通過電勢差加速獲得的離子化的分子，
[0024]d)使加速的離 子化分子在至少一個減壓管中自由運動，
[0025]e)檢測至少一部分已自由運動的加速的離子化分子，以便測量它們穿過至少一個減壓管所花費的時間并獲得對應于給定時刻下檢測到的離子化分子的數量的信號，
[0026]f)計算所檢測的分子的質荷比(m/z)，以便根據所檢測的分子的m/z比獲得對應于具有相同質荷比(m/z)的離子化分子的數量的信號，
[0027]g)直接或間接地確定在步驟b)中獲得的離子化分子中是否存在質荷比(m/z)等于3005±5Th或等于3035±5Th的離子化分子，
[0028]h)根據步驟g)中獲得的結果作出相應的判斷。
[0029]根據第一替代實施方案，步驟h)對應于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與分析的金黃色葡萄球菌菌群不存在溶血素δ及其變體GlOS關聯在一起的步驟。
[0030]具有序列SEQ ID N0.1 的溶血素 δ:XaaAQDIISTI⑶LVKWIIDTVNKFTKK，其中 Xaa =在N-末端位置甲酰化的蛋氨酸，具有3005，6Th的質子化單一同位素質量(MH+)。
[0031]其具有序列SEQ ID N0.2 的變體:XaaAQDIISTISDLVKWIIDTVNKFTKK，其中 Xaa =在N-末端位置甲基化的蛋氨酸，具有3035，6Th的質子化單一同位素質量(MH+)。
[0032]根據第二替代實施方案，步驟h)對應于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與分析的金黃色葡萄球菌菌群的agr系統(“附屬基因調節子”)的功能異常關聯在一起的步驟。
[0033]根據第三替代實施方案，分析的金黃色葡萄球菌菌群來自于患者的生物樣品，并且步驟h)對應于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與對所述患者作出已知與agr系統功能異常有關的臨床診斷關聯在一起的步驟。
[0034]根據第四替代實施方案，分析的金黃色葡萄球菌菌群來自于患者的生物樣品，并且步驟h)對應于將不存在m/z等于3005 ±5Th的離子化分子和m/z等于3035 ±5Th的離子化分子與患者患有慢性感染的診斷關聯在一起的步驟。基于臨床生物學標準定義慢性感染，其是指在多達6個月前分離出具有與研究過程中的分離菌株相同的抗菌譜的金黃色葡萄球菌菌株。作為此類慢性感染的實例，可以提及骨關節感染、慢性糖尿病足感染、可植入血管設備上的感染。
[0035]根據第五替代實施方案，步驟h)對應于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與將分析的金黃色葡萄球菌菌群分類為具有表現出糖肽敏感性降低的風險(即GISA)關聯在一起的步驟。
[0036]可以應用本發明的方法的樣品可以是生物來源的，特別是動物或人類來源的。其可以對應于生物流體樣品(例如全血、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、有機分泌物)，對應于組織樣品或對應于分離的細胞。該樣品可以原樣使用，或在研究前可以根據本領域技術人員已知的方法施以富集或培養類型的制備。
[0037]在本發明的范圍內，待研究的樣品對應于包含菌群的細胞培養基，不對應于在提取或提純步驟后獲得的一種或多種蛋白質。優選地，研究的樣品含有菌群，即其含有至少10個細菌。
[0038]檢測尤其可以由來源于生物樣品的細菌培養物的肉湯或由血液培養物進行。通常，質譜獲自從瓊脂糖上的細菌培養物獲得的樣品。 [0039]細胞培養物直接懸浮在基質中或懸浮在基質上。此類技術被稱為對全細胞的質譜法(WC-MS，“全細胞質譜法”)，并可以在沒有任何事先的、乏味的和耗時的提取程序的情況下進行。該技術過去已經被廣泛用于細菌鑒定，但是考慮到樣品的復雜性，其在蛋白質鑒定中的應用極為有限。在大多數情況下，指定對應于通過WC-MS獲得的表達譜(profile)的蛋白質是未知或不明確的。僅通過比較蛋白質表達譜進行細菌鑒定，而不知道這些表達譜的蛋白質組成(即峰與蛋白質之間的對應關系)(Welker和Moore2011)。但是,某些作者已經提出使用這種方法學檢測生物標志物和/或在細菌致病機制中所涉及的毒力因子(Bizzini和Greub2010)。對于金黃色葡萄球菌而言，某些作者已經表示，有可能將MSSA與MRSA區分開。但是，所用的菌株收集物有限(n= 10個菌株)，并需要使用初步程序來制備樣品(即化學和機械提取)(Edwards-Jones, Claydon等人，2000)。其它作者已經指出有可能檢測金黃色葡萄球菌的PVL(Bittar, Ouchenane等人，2009)。但是,這些結果證明是非特異性的，并可能反映屬于分析菌株收集物的相同克隆(Dauwalder, Carbonnelle等人,2010 ；Szabados, Becker 等人,2011)。
[0040]在本發明的范圍內，發明人由此以完全預料不到的方式證明，在獲得的質譜上存在具有m/z值等于3005±5Th或3035±5Th的峰以及不存在位于3005±5Th和位于3035±5Th的峰可以分別與存在和不存在溶血素δ或其變體相關聯，并因此有可能作出臨床診斷。
[0041 ] 優選地，在本發明的方法的范圍內，不考慮應用的替代方案，有利地是，對含有10至19個細菌、優選15至16個細菌的細菌群的樣品實施質譜法。如果將施以質譜法的樣品沉積在標準瓊脂糖培養基上以便在35±2°C下孵育18至48小時后生長金黃色葡萄球菌，則細菌數量將與菌落形成單位(CFU)的計數同化。
[0042]以一般方式，在本發明的范圍內可以使用任何采用測量飛行時間的基質輔助解吸-離子化質譜法。
[0043]根據一個具體實施方案，使用的質譜法使基質輔助解吸和離子化/飛行時間(MALD1-T0F)質譜法(MS)，其特別具有相對簡單應用的優點。
[0044]根據另一具體實施方案，使用的質譜法是MALD1-T0F-T0F串聯MS，其根據飛行時間具有兩次連續的分離，并且特別具有特異性極佳的優點。
[0045]在其離子化之前，樣品優選與基質接觸。
[0046]所用基質有利地含有選自3，5_ 二甲氧基-4-羥基肉桂酸(即芥子酸或白芥子酸)氰基-4-羥基肉桂酸(即^-氰基、^-基質或0?^)，阿魏酸和2，5_二羥基苯甲酸(即DHB)中的化合物。
[0047]存在幾種可以在本發明范圍內用于使樣品與基質接觸的沉積技術:在干基質層上沉積，所謂“薄層”沉積；用基質液滴沉積，所謂“干液滴”沉積；在基質層上沉積，隨后添加基質液滴，所謂“夾心(Sandwich) ”沉積。
[0048]通常，基質是光敏性的并在樣品存在下結晶，同時保持分子的完整性。此類基質，尤其是適于MS MALD1-T0F的，是公知的，并選自:3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸；α-氰基-4-羥基肉桂酸，阿魏酸和2，5- 二羥基苯甲酸。許多其它化合物是本領域技術人員已知的。甚至存在液體基質，其既不會在大氣壓下結晶，甚至也不會在真空中結晶(Tholey和Heinzle2006)o可以使用允許樣品分子在激光束作用下離子化的任何其它化合物。值得注意的是，靶標，即樣品沉積在其上的載體，可以直接起到基質的作用，類似“納米輔助激光解吸/離子化” (NALD I)或“硅上解吸/離子化” (D1S)技術的情況。激光束可以具有促進基質升華或蒸發的任何類型的波長。優選使用紫外或甚至紅外波長。
[0049]在基質中，將此類化合物溶解，最通常使用水，優選具有“超純”質量的水，或溶于水/有機溶劑混合物中。作為常規使用的有機溶劑的實例，可以提及丙酮、乙腈、甲醇或乙醇，有時可以加入三氟乙酸(TFA)。基質實例例如由含20mg/mL芥子酸的乙腈/水/TFA的50/50/0.1 (v/v)混合物組成。有機溶劑使樣品中存在的疏水性分子溶解在該溶液中，而水允許親水性分子溶解。諸如TFA的酸的存在通過捕獲質子(H+)促進樣品分子的離子化。
[0050]優選地，將樣品沉積在稱為靶標的載體上，最通常以斑點的形式。可以將基質直接沉積在樣品上并隨后與樣品混合。
[0051]任選地，本發明的方法在步驟b)之前進一步包括使樣品分子被吸附在其上或其中的基質結晶的步驟。
[0052]通常，結晶基質通過使其中或其上沉積有樣品分子的基質干燥來獲得。
[0053]根據一個具體實施方案，與樣品接觸的基質相當于沉積在靶標上的適于MALDI MS的基質，并且該方法在步驟b)之前包括獲得樣品分子被吸附在其上或其中的基質的結晶。在這種情況下，基質優選含有選自3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸、阿魏酸和2，5- 二羥基苯甲酸中的化合物。
[0054]可以預先將樣品在肉湯中或在瓊脂糖上培養以使其富含金黃色葡萄球菌細菌。此類培養基瓊脂糖或肉湯是本領域人員公知的。例如，可以提及含有(馬或羊)血的瓊脂糖；
哥倫比亞瓊脂糖；Polyvitex'K “巧克力”瓊脂糖；來自b1Merieux的用于尋找金黃色葡萄球菌的ChromID Staph顯色瓊脂糖等等。在瓊脂糖上的富集是特別有利的，因為有可能獲得可以沉積在靶標上的金黃色葡萄球菌的純菌落。隨后例如通過將樣品留置在例如17至300C的溫度下、尤其是在室溫(22°C )下幾分鐘(例如5分鐘至2小時)，從而將基質中存在的溶劑蒸發。溶劑蒸發允許樣品分布于其中的基質結晶。接著，對放置在結晶基質內的樣品施以溫和離子化。優選用發射337.1nm的UV光束的氮激光器實現這種離子化。
[0055]在離子化過程中，通過激光對樣品施以激發。基質晶體隨后吸收光子能量，該能量的釋放造成基質升華、樣品解吸和出現處于被描述為等離子體的狀態的材料。在這種等離子體內，基質與樣品分子之間發生電荷交換。例如，質子可以從基質中脫離并轉移至樣品的蛋白質和轉移至樣品的肽。該步驟允許溫和離子化生物分子，而不會增加它們的破壞程度。樣品由此釋放不同大小的離子。后者隨后通過電場加速并在減壓管(稱為飛行管)中自由飛行。在離子化過程中和在加速生成的離子的過程中施加的壓力通常為10_6至10_9毫巴(mbar)。最小的離子隨后將比較大的離子更快速地“行進”，由此能夠將它們分離。檢測器位于飛行管末端。使用離子所花費的飛行時間(或T0F)來計算它們的質量。由此，獲得質譜，代表根據撞擊檢測器的分子的m/z比對應于具有相同質荷比(m/z)的離子化分子的數量的信號強度。質荷比(m/z)以Th (Thomsons)表示。一旦被引入到質譜儀中，非常快速地獲得樣品的質譜，通常在不到一分鐘的時間內。
[0056]可以在MALD1-TOF MS之前通過測試或同時借助于MALD1-TOF MS譜來確定分析的樣品實際含有金黃色葡萄球菌細菌的事實。在此情況下，將總MALD1-TOF MS譜(其通常包含70至200個峰)與光譜數據庫進行比較，其提供確定分析的細菌群是否實際對應于金黃色葡萄球菌的可能性。這種比較基于使用不同的算法(這取決于供應商)，并由此實現細菌鑒定(Cherkaoui, Hibbs 等人,2010 ；ffelker 和 Moore2011)。
[0057]上文詳細描述的所有實施方案均適用，而不考慮使用的質譜技術，特別是MALD1-TOF 或 MALD1-T0F-T0F 類型。 [0058]當所用質譜法是MALD1-TOF MS時，步驟g)的確定優選從獲得的質譜上存在m/z值等于3005±5Th或3035±5Th的峰或不存在3005±5Th和3035 ±5Th的峰來直接推斷出。
[0059]當所用的質譜法是MALD1-T0F-T0F MS時，在步驟d)中優選使離子化分子)在第一減壓管中運動，選擇具有m/z等于3005±5Th的質量和/或具有m/z等于3035±5Th的質量的離子，這些離子化分子在它們碎片化(例如通過碰撞)后再次被加速，使碎片化的或未碎片化的離子化分子在第二管中自由運動。
[0060]采用MALD1-TOF-TOF MS,步驟g)的確定優選由下列y和b離子碎片中存在至少5種碎片、優選至少10種碎片來間接地推斷:
[0061]-對于3005±5Th處的峰，具有以下質量的y離子碎片:147.113,275.208、376.255,523.324,651.419,765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773、1492.852,1620.947,1720.016,1833.100,1948.127,2005.148,2118.232,2219.280、2306.312、2419.396、2532.480、2647.507、2775.565、2846.603 和 2976.635，公差為±1.5Th ;以及具有以下質量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247、671.331,758.363,859.410,972.494,1029.516,1144.543,1257.627,1356.695,1484.790、1670.870,1783.954,1897.038,2012.065,2113.112,2212.181,2326.224,2454.319、2601.387,2702.435,2830.530 和 2958.625，公差為 ± 1.5Th,和 / 或
[0062]-對于3035±5Th處的峰，具有以下質量的y離子碎片:147.113,275.208、376.255,523.324,651.419,765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773、1492.852,1620.947,1720.016,1833.100,1948.127,2035.159,2148.243,2249.290、2336.322、2449.406、2562.491、2677.517、2805.576、2876.613 和 3006.646，公差為±1.5Th ;以及具有以下質量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247、671.331,758.363,859.410,972.494,1059.526,1174.553,1287.638,1386.706,1514.801、1700.880,1813.964,1927.048,2042.075,2143.123,2242.191,2356.234,2484.329、2631.398,2732.445,2860.540 和 2988.635，公差為 ± 1.5Th。
[0063]根據本發明可以使用的MALD1-TOF質譜法可以特別包括下列連續步驟以獲得質譜:
[0064]-將待研究的樣品放置在基質表面或基質中，所述基質適合于根據飛行時間的基質輔助解吸-離子化質譜法，
[0065]-獲得其上或其中吸附有樣品分子的基質的結晶，
[0066]-借助激光束將結晶的基質/樣品混合物離子化，
[0067]-借助電勢差加速獲得的離子化分子，
[0068]-使加速的離子化分子在減壓管中自由運動，
[0069]-在管出口處檢測離子化分子，以便測量它們通過減壓管所花費的時間并獲得對應于給定時刻下到達檢測器的離子化分子的數量的信號，
[0070]-計算所檢測的分子的質荷比(m/z)，以便根據所檢測的分子的m/z比獲得對應于具有相同質荷比(m/z)的離子化分子的數量的信號。
[0071]通常，考慮到所用質譜儀的初步校準，以關聯離子化分子的質荷比(m/z)與減壓管中的飛行時間的方程式形式獲得m/z比的計算。
[0072]可以在本發明范圍內使用的MALD1-TOF MS是基于暴露于電場的具有不同電荷與不同質量的離子由A點行進至B點的時間的測量。該行進時間的測量取決于離子的質量和電荷，由此允許其分離(Welker和Moore2011)。
[0073]可以在本發明范圍內使用的MALD1-T0F-T0F方法可以特別包括下列步驟以便獲得質譜:
[0074]-將待研究的樣品放置在適于MALD1-TOF-TOFMS的基質表面或基質中，
[0075]-使在其上或其中吸附有樣品分子的基質結晶，
[0076]-借助激光束將結晶的基質/樣品混合物離子化，
[0077]-借助電勢差加速獲得的離子化分子，
[0078]-使加速的離子化分子在第一減壓管中自由運動，
[0079]-在通過第一管后，選擇具有待碎片化的分子離子的質量的離子化分子，并除去所有其它離子，例如借助于靜電偏轉器，
[0080]-使離子化分子碎片化，任選借助于惰性氣體來進行，
[0081]-例如借助電勢柵格再次提高電勢以便加速離子化分子，以便向碎片離子和向前體離子提供不同的動能，
[0082]-使碎片化或未碎片化的離子化分子在第二減壓管中自由運動，
[0083]- 在該管出口處檢測離子化分子，以便測量它們通過減壓管所花費的時間并獲得對應于給定時刻下到達檢測器的離子化分子的數量的信號，[0084]-計算所檢測的分子的質荷比(m/z)，以便根據所檢測的分子的m/z比獲得對應于具有相同質荷比的離子化分子(m/z)的數量的信號。
[0085]通常，考慮到所用質譜儀的初步校準，以關聯離子化分子的質荷比(m/z)與減壓管中的飛行時間的方程式形式計算m/z比。前體離子的質量可用于實現這種校準。
[0086]任何類型的MALD1-TOF或MALD1-T0F/T0F質譜儀可用于產生質譜。此類光譜儀包括:
[0087]i)用于離子化樣品/基質混合物的離子化源(通常為UV激光器)；
[0088]ii)通過施加電勢差的使離子化分子加速的加速器，
[0089]iii)加速的離子化分子在其中運動的減壓管，
[0090]iv)用于根據它們的質荷比(m/z)分離形成的分子離子的質量分析儀；
[0091]V)用于測量由分子離子直接產生的信號的檢測器。
[0092]MALD1-TOF-TOF質譜儀與MALD1-TOF質譜儀相同，區別僅在于減壓管被分為位于彼此延伸部的兩個部分(在本文中也稱為第一減壓管和第二減壓管)。這種幾何形狀允許兩次連續地根據飛行時間分離分子離子:第一減壓管允許選擇將在該管的第二部分中分離為碎片的分子離子。碎片指的是通過破碎所選分子離子獲得的任何分子結構。
[0093]可以在初始 離子化過程中或在位于管的上述兩部分之間的碰撞室中獲得離子的碎片化。在初始離子化過程中，可以直接由被分子吸收的激光束能量進行碎片化，或者通過分子等離子體中的中性或離子化分子之間的碰撞進行碎片化。如果在加速離子的階段之前發生碎片化，碎片根據它們各自的質量移動。如果碎片化發生在加速階段，所謂亞穩離子的分離較差。如果碎片化在初始加速后發生，碎片離子及其離子化的母體分體(前體離子)具有相同的動能并以相同的速度移動。后一種類型的碎片化，稱之為源后碎片化，用于MALD1-TOF-TOF MS技術。該管的第一部分(或在本文中還被稱為第一減壓管)可能選擇包含感興趣的前體離子質量并受到質量差(mass delta, delta de masse)的限制的質量窗。前體離子及其碎片隨后在減壓管的兩部分之間再次被加速。離子隨后根據其質量獲得動能。它們最終根據其各自的質量移動到減壓管的第二部分(或在本文中還被稱為第二減壓管)中。由此可能檢測給定的前體離子生成的全部碎片。
[0094]這種方法的一個替代方案包括在減壓管的兩部分之間的碰撞室中加入惰性氣體，如氬氣。離子化分子隨后在與惰性氣體碰撞時發生碎片化。它們隨后可以如前所述被加速和分離。
[0095]MALDI T0F/T0F MS優選地在肽鍵附近使蛋白質碎片化，根據通常命名法(Paizs和Suhai2005)其基本上生成類型b和類型y的離子。其它碎片也是可能的，亞銨離子、碎片a
坐坐寸寸ο
[0096]本領域技術人員習慣使用碎片峰生成關于蛋白質的氨基酸序列的信息并試圖鑒定該蛋白質序列。他/她為此特別使用諸如來自Matrix Science (倫敦,英國)的Mascot的軟件包。
[0097]由此，SEQ ID N0.1的溶血素δ將主要導致:
[0098]?具有以下質量的 y 離子碎片:147.113,275.208,376.255,523.324,651.419、765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773,1492.852,1620.947、1720.016,1833.100,1948.127,2005.148,2118.232,2219.280,2306.312,2419.396、2532.480,2647.507,2775.565,2846.603 和 2976.635 ；
[0099]?具有以下質量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247、671.331,758.363,859.410,972.494,1029.516,1144.543,1257.627,1356.695,1484.790、1670.870,1783.954,1897.038,2012.065,2113.112,2212.181,2326.224,2454.319、2601.387,2702.435,2830.530 和 2958.625。
[0100]而且，SEQ ID N0.2的溶血素δ GlOS將主要導致:
[0101]?具有以下質量的 y 離子碎片:147.113,275.208,376.255,523.324,651.419、765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773,1492.852,1620.947、1720.016,1833.100,1948.127,2035.159,2148.243,2249.290,2336.322,2449.406、2562.491,2677.517,2805.576,2876.613 和 3006.646 ；
[0102]?和具有以下質量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247、671.331,758.363,859.410,972.494,1059.526,1174.553,1287.638,1386.706,1514.801、1700.880,1813.964,1927.048,2042.075,2143.123,2242.191,2356.234,2484.329、2631.398,2732.445,2860.540 和 2988.635。
[0103]結合附圖，該實施例在下文中闡述本發明，但是不具有限制性。
[0104]圖1描述了溶血素δ的一級序列(Fitton，Dell等人，1980)。 [0105]圖2顯示了采用MALDI TOF MS檢測來自金黃色葡萄球菌的同基因菌株的溶血素
δ ο
[0106]圖3研究了培養期(18至48小時)對采用MALDI TOF MS檢測3種同基因菌株和2種臨床菌株的溶血素δ的作用。
[0107]圖4顯示了采用MALDI TOF MS檢測來自金黃色葡萄球菌的臨床菌株的溶血素δ及其變體GlOS。
實施例
[0108]1.設備
[0109]?基質
[0110]使用即用型α -氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質(代號411071，b1Merieux, Marcy I’ Etoile,法國)。
[0111]?靶標和內部對照物
[0112]使用一次性祀標Vitek MS DS'_ (代號 410893b1M6rieux, Marcy I’ Etoile,法國)。在每次分析時使用ATCC8739大腸桿菌(Escherichia coli)菌株以便允許校準并檢查質譜儀的校準的有效性。
[0113]?沉積物類型
[0114]金黃色葡萄球菌菌株以菌落尖端(colony spike,pointe de colonie)的薄涂片形式(薄層形式的涂片)沉積。該涂片在室溫下干燥5至15分鐘。隨后沉積一微升CHCA基質并隨后在室溫下干燥大約5至15分鐘。
[0115]MALDI TOF 質譜儀
[0116]使用MALDI TOF類型質譜儀，型號 Axima Assurance?，來自 Shimadzu, Champs surMarne,法國。
[0117]?在MALDI TOF質譜儀上分析過程中使用的參數設定
[0118]在分析金黃色葡萄球菌菌株的過程中，使用質譜儀的下列調節參數:
[0119]-質量的檢測范圍:2000-20000Th
[0120]-激光功率:80伏
[0121]-激光頻率:50赫茲
[0122]-激光類型:N2
[0123]-質譜儀模式:線性，正離子
[0124]-提取功率:8330Th
[0125]-激活的“自檢(self-quality,auto qualit6) ” 模式
[0126]-最小強度:1OmV
[0127]-最小信噪比:10
[0128]-最小可接受分辨 率:300
[0129]-擊中次數:5擊中 / 峰(profiles, profils)
[0130]-每譜圖峰數量:100
[0131]?軟件包
[0132]借助Sirweb-Mald1- Tof? 版本 11 軟件包(I2A, Peyrols,法國)或Target IVI an age 版本 1.12 軟件包(b1M6rieux, Marcy I’ Etoile,法國)進行板計劃
(plate plans, Ies plans de plaque)。質譜儀通過LaunchPad?,版本 2.8.4.20081127 軟件
包(Shimadzu, Champs sur Marne,法國)驅動。
[0133]2.方法學
[0134]?分析前參數
[0135]在有氧氣氛、35±2 °C下在含有馬血的瓊脂糖(TSH，代號43061，b1Merieux, Marcy I’ Etoile,法國)上傳代培養18至24小時后進行菌株分析。
[0136]使用由聚乙二醇PEG(3000)組成的質譜法校準標準品在2800至3200m/z范圍內進行質譜儀的初始校準(除了用于細菌鑒定的校準之外)。
[0137]?分析參數
[0138]根據細菌鑒定過程中常規使用的“涂片技術”由菌落尖端在一次性靶標上生成沉積物。
[0139]在室溫下干燥5-15分鐘。
[0140]在之前的沉積物上添加I μ L CHCA基質。
[0141]干燥5-15分鐘。
[0142]通過Sirweb-Mald1- Tof 或 Target Manager'' 軟件包生成“板計劃”。
[0143]采用MALDI TOF MS 通過控制質譜儀 Axima Assurance'1 的 Launchpad軟件包啟
動分析。
[0144]3.結果
[0145]a.檢測的驗證[0146]1.使用金黃色葡萄球菌的同基因菌株
[0147]對通過agr基因座的等位置換獲得的agr/rnalll/hld系統的等基因菌株的分析有可能證實具有功能性agr系統的菌株在3005±5Th處存在峰。相反，除突變的agr系統之外與先前的親本菌株相同的等基因菌株在3005±5Th處沒有任何峰。受試RN6390菌株具有功能性agr系統，并且是溶血素δ的一個產生者；菌株LUG950衍生自RN6390菌株，其中編碼RNAIII的基因是無效的:該菌株對合成溶血素δ是缺陷型的；RN6911菌株是通過完全刪除RN6390菌株的agr基因座(RNA II和RNA III)獲得的菌株:該菌株對合成溶血素δ是缺陷型的。表1和圖2概括了獲得的結果。圖2顯示了用三種受試菌株獲得的包含2800至3200之間的m/z比的WC MALD1-TOF MS質譜。
[0148]表1:采用WC-MALDI TOF MS以及通過對同基因菌株收集物研究在瓊脂糖培養基中的溶血來檢測溶血素δ
[0149]
【權利要求】
1.通過質譜技術研究含有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)菌群的樣品的方法，包括以下步驟: a)使樣品與介質接觸，以通過激光束的作用使樣品中存在的分子離子化， b)用激光束離子化樣品中存在的分子， c)通過電勢差加速獲得的離子化分子， d)使加速的離子化分子在至少一個減壓管中自由運動， e)檢測至少一部分已自由運動的加速的離子化分子，以便測量它們穿過至少一個減壓管所花費的時間并獲得對應于給定時刻下檢測到的離子化分子的數量的信號， f)計算所檢測的分子的質荷比(m/z)，以便根據所檢測的分子的m/z比獲得對應于具有相同質荷比(m/z)的離子化分子的數量的信號， g)直接或間接地確定在步驟b)中獲得的離子化分子中是否存在質荷比(m/z)等于3005±5Th或等于3035±5Th的離子化分子， h)根據步驟g)中獲得的結果作出相應的判斷。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟h)對應于將不存在m/z等于3005 ±5Th的離子化分子和m/z等于3035 ±5Th的離子化分子與分析的金黃色葡萄球菌菌群不存在溶血素S及其變體GlOS關聯在一起的步驟。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟h)對應于將不存在m/z等于3005 ±5Th的離子化分子和m/z等于3035 ±5Th的離子化分子與分析的金黃色葡萄球菌菌群的agr( “附屬基因調節子”)系統的功能異常關聯在一起的步驟。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:分析的金黃色葡萄球菌菌群來自于患者的生物樣品，以及步驟h)對應于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與對所述患者作出已知與agr系統功能異常相關的臨床診斷關聯在一起的步驟。
5.根據權利要求1或4所述的方法,其特征在于:分析的金黃色葡萄球菌菌落來自于患者的生物樣品，以及步驟h)對應于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與患者患有慢性感染的診斷關聯在一起的步驟。
6.根據權利要求1或4所述的方法，其特征在于:步驟h)對應于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035 ±5Th的離子化分子與將分析的金黃色葡萄球菌菌群分類為具有表現出糖肽敏感性降低的風險(即GISA)關聯在一起的步驟。
7.根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于:對含有10至19個細菌、優選15至16個細菌的細菌群的樣品實施質譜法。
8.根據前述權利要求之一所述的方法，其特征在于:所用質譜法是采用基質輔助解吸離子化并測量飛行時間(MALD1-T0F)的質譜法(MS)。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于:步驟g)的確定由在獲得的質譜上存在m/z值等于3005±5Th或等于3035±5Th的峰或不存在3005±5Th和3035±5Th的峰直接推斷出。
10.根據權利要求1至7之一所述的方法，其特征在于:所用的質譜法是MALDIT0F/T0F質譜法。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于:在步驟d)中，使離子化分子在第一減壓管中運動，選擇m/z等于3005±5Th和/或m/z等于3035±5Th的離子，這些離子化分子在其碎片化后再次被加速，并且使碎片化的或未碎片化的離子化分子在第二管中自由運動。
12.根據權利要求10或11所述的方法，其特征在于:步驟g)的確定由在下列y和b離子碎片中存在至少5種碎片間接推斷出: -對于3005±5Th處的峰，具有以下質量的y離子碎片:147.113,275.208,376.255、523.324,651.419,765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773,1492.852、1620.947,1720.016,1833.100,1948.127,2005.148,2118.232,2219.280,2306.312、2419.396,2532.480,2647.507,2775.565,2846.603 和 2976.635 ；以及以下質量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247,671.331,758.363,859.410,972.494、1029.516,1144.543,1257.627,1356.695,1484.790,1670.870,1783.954,1897.038、2012.065,2113.112,2212.181,2326.224,2454.319,2601.387,2702.435,2830.530 和2958.625，公差為 ± 1.5Th,和 / 或 -對于3035±5Th處的峰，具有以下質量的y離子碎片:147.113,275.208,376.255、523.324,651.419,765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773,1492.852、1620.947,1720.016,1833.100,1948.127,2035.159,2148.243,2249.290,2336.322、2449.406,2562.491,2677.517,2805.576,2876.613 和 3006.646 ；以及以下質量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247,671.331,758.363,859.410,972.494、1059.526,1174.553,1287.638,1386.706,1514.801,1700.880,1813.964,1927.048、2042.075,2143.123,2242.191,2356.234,2484.329,2631.398,2732.445,2860.540 和2988.635，公差為 ±1.5Th。
13.根據權利要 求1至12之一所述的方法，其特征在于:與樣品接觸的介質相當于沉積在祀標上的適合于MALDI MS的基質，以及所述方法包括在步驟b)之前獲得其上或其中吸附有樣品分子的基質的結晶。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于:所述基質含有選自3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸、α -氰基-4-羥基肉桂酸、阿魏酸和2，5- 二羥基苯甲酸中的化合物。
【文檔編號】C12Q1/04GK104039975SQ201280066377
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年11月6日 優先權日:2011年11月8日
【發明者】F·凡德恩奇, O·多瓦爾代, J-P·沙里耶, M·韋爾克 申請人:生物梅里埃公司, 里昂奧斯皮思民用公司, 克洛德·貝納爾-里昂第一大學