用于前列腺癌分類的標志物基因的制作方法

用于前列腺癌分類的標志物基因的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于對受試者中的前列腺癌進行分類的方法，該方法包括以下步驟：a)確定基因F3和IGFBP3在來自受試者的樣品中的基因表達水平或基因表達模式，以及b)通過將a)中所確定的基因表達水平與在已知分別患有高風險或低風險腫瘤的參考患者中相同基因的參考基因表達比較對腫瘤進行分類。此外，本發明涉及用于確定被診斷為前列腺癌的受試者的預后的方法，用于為被診斷為前列腺癌的受試者制定治療決策的方法以及用于對被診斷為前列腺癌的受試者中的腫瘤進行分類的固體支持體或試劑盒。
【專利說明】用于前列腺癌分類的標志物基因
發明領域
[0001]本發明涉及癌癥，特別是前列腺癌的分類、預后和治療的領域。
[0002]發明背景
[0003]前列腺癌診斷時的總生存和癌癥特異性生存的精確預后和預測對改善在根治性前列腺切除術、放射療法、閹割療法和觀察等待之間的個性化治療選擇的目前狀況是最重要的(Shariat 等人，Cancer2008, 113:3075-3099 ；Toui jer 等人，Cancer2009，115:3107-3111 ；Freedland, Cancer 2011，117:1123-1153)。對于患有局限性前列腺癌的男性，根治性前列腺切除術和治愈性放射療法可降低患有侵襲性癌癥的患者的死亡率并延長生命。另一方面，對于患有較少侵襲性癌癥的患者，其可能全然不需要根治性治療或治愈性治療，此類療法可能會導致不必要的并發癥和副作用。對于患有較少侵襲性癌癥的患者，觀察等待或主動監測可能是適合的選擇。然而，基于常見臨床參數，包括診斷時的年齡、血清PSA水平、活組織檢查的Gleason評分和臨床分期的當前預后和預測的方法，不能在局限性分期時準確地區分較少侵襲性癌癥與侵襲性癌癥。它們也不能鑒定當疾病變得危險時什么樣的癌癥仍然可以通過閹割療法得到有效控制。
[0004]對于其癌癥在診斷時已是晚期或在治愈性治療后復發的患者，化學閹割或外科手術閹割可以緩和癥狀，并減緩疾病的進展。不幸地，閹割療法的效果和副作用在患者中顯示強烈的變化。有的患者可以以極小的副作用生存超過五年，然而其他患者可能在三年內死于閹割抵抗性轉移或死于心血管疾病及閹割治療的其他副作用。目前，不存在可以預測什么樣的患者將會從閹割療法中獲益最多的方法。
[0005]大部分前列腺癌進展如此緩慢，以至于其可從未達到危及生命的階段，主要是由于老年期和其他競爭性疾病。然而，小部分的前列腺癌進展非常迅速，并在不到五年的時間里導致患者死亡。在診斷時，通過常規的臨床參數包括年齡、腫瘤分級、Gleason評分、臨床分期和共存疾病，癌癥特異性和總生存的預測可以達到高達60% -70%的準確度。甚至具有相同臨床預后參數的患者可以顯示生存以及治療響應的強烈差異。因此前列腺癌是病理學的(形態學的)診斷，其可以包括幾種不同的生物學亞組或亞型。
[0006]存在對可以區分前列腺癌患者的這些生物學亞組或亞型的方法的需要。還存在對可以將這些亞型分為侵襲性或高風險腫瘤和較少侵襲性或低風險腫瘤的方法，以及可預測患有相應亞型腫瘤的患者的生存的方法的需要。此外，存在對可用于為患有相應亞型的腫瘤的患者制定治療決策的方法的需要，治療決策可能還考慮臨床參數。
現有技術
[0007]專利文獻W02008/013492 Al公開了用于鑒定表示為ES腫瘤預測因子基因(EStumor predictor gene, ESTP基因)的胚胎干細胞相關基因的方法,這些基因可能對癌癥干細胞功能是重要的。鑒定了 641個ESTP基因并發現其有助于前列腺癌腫瘤的分類。
[0008]專利文獻W009021338A1公開了用于通過檢測剪接事件的標簽(signature)預后受試者中的癌癥，例如前列腺癌的方法。F3被記載為可以被使用的許多基因中的一個。[0009]專利文獻W00171355公開了 PSA、IGF_I和IGFBP-3在血漿中的同步分析以預測男性患有前列腺癌的風險。
[0010]US2003054419A1公開了用于在治療后確定前列腺癌患者的進展的風險的方法，其中測量了 TGF-β 1、IGFBP-2、或IGFBP-3在血漿中的水平。
[0011]專利文獻W010006048A和US2009298082分別公開了用于預測前列腺癌確診患者的生存能力和具有PSA復發的患者是否稍后將形成為全身性疾病的方法。在這兩個公開內容中，IGFBP3被記載為可以連同其他分子標志物一起被使用的許多基因中的一個。
[0012]文獻W009105154和W006028867A公開了用于確定患有癌癥的個體的預后的方法，和用于診斷多發性骨髓瘤的方法。c-MAF被記載為可以被使用的許多基因中的一個。
[0013]WO10101888Α公開了用于干擾CTGF的活性的方法，其中CTGF的活性與前列腺癌轉移相關。
[0014]發明目的
[0015]本發明的目的是提供有助于受試者中的前列腺癌分類、預后預測和治療決策指導的分子標志物。
[0016]本發明的另一個目的是提供在受試者中用于對前列腺癌進行分類，以及用于使用該分類用于預測受試者的預后和用于為受試者制定治療決策的新方法。
[0017]本發明的另外的 目的是提供基于受試者的腫瘤亞型來治療患有前列腺癌的受試者的方法。
[0018]本發明的又另一個目的是提供用于對受試者中的前列腺癌或腫瘤進行分類的工具。
[0019]發明的公開內容
[0020]與前列腺癌受試者中的生存顯著相關的基因和基因標簽的鑒定
[0021]為了支持生物學亞型的概念，使用全基因組cDNA微陣列的先前研究已將乳腺癌以及前列腺癌分類為具有不同臨床和病理特征的分子亞型。本公開內容進一步擴展了該概念和重要性。代替僅使用統計分析，在本研究中候選基因標志物的選擇通過癌癥干細胞(CSC)/胚胎干細胞(ESC)假說驅動，旨在有效鑒定僅少數最重要的ESC/CSC基因標志物。證明了此方法是有效的，因為在本研究中所鑒定的最顯著的預測基因標志物是來自已鑒定的胚胎干細胞的基因預測因子(ESCGP)的列表。
[0022]本發明人假設，前列腺癌的生物學侵襲性和對閹割療法的反應能力主要通過主要基因在前列腺癌干細胞(CSC)中的表達模式來確定(Visvader，Nature2011, 469:314-22 ；Ratajczak 等人，Differentiation 2011, 81:153-161 ；Lang 等人，JPathol 2009, 217:299-306)。還假設，在胚胎干細胞(ESC)中具有重要功能的基因還可在前列腺CSC中具有重要性。因此，ESC相關基因在前列腺癌細胞中的表達模式的直接測量將反映癌癥的生物學侵襲性，并能夠預測閹割療法的效果以及預測患者生存。
[0023]基于這一假設，本發明人先前已鑒定了在ESC系中具有一致性高水平或一致性低水平表達的基因，即胚胎干細胞基因預測因子(ESCGP) (W02008/013492 A1)。簡言之，ESCGP通過使用簡單的一類SAM來分析先前公開的源自5個人ESC系和來自不同器官的115個人正常組織的全基因組cDNA微陣列數據來鑒定，據此基因根據其在ESC中的表達水平的一致性程度來排列順序。這是基于在所有ESC系中具有一致性高表達水平或具有一致性低表達水平的基因在維持ESC狀態中可具有重要的功能，并且其在不同模式中的表達變化可導致分化朝著不同方向的概念。這些ESC基因還可在維持CSC的不同狀態中具有功能，并因此ESC基因在CSC中的不同表達模式可將腫瘤分為具有不同的生物學侵襲性和對不同類型的治療具有不同靈敏度的不同的亞型。從ESCGP的這個列表開始，本研究鑒定了用于前列腺癌的一些重要的預后和預測性基因標志物。
[0024]在本研究中，選擇來自在W02008/013492A1中鑒定的641個ESCGP的列表的33個ESCGP的亞集作為可以使得能夠使用較少ESCGP對前列腺癌進行分類的候選者。根據如實施例2A中描述的3個標準(還見圖1)選擇候選者:即根據其在ESCGP列表中的排序位置，以及根據其在來自先前的研究(Lapointe等人，Proc Natl Acad Sci USA2004，101:811-816)的基因列表中的排序位置，該先前的研究鑒定了可以潛在地用于對前列腺癌亞型進行分類的基因和可以區分前列腺癌與正常組織的基因。
[0025]另外，根據第4個標準選擇了不是來自ESCGP列表的5個基因；它們已被報道并已知在前列腺癌中是重要的。報道的基因用作對照以評估在前列腺癌的分類中ESCGP基因相對于非ESCGP基因的重要性。此外，它們可以潛在地被包括在用于在前列腺癌分類中使用的分子標志物標簽中。
[0026]通過RT-PCR研究了 33個選擇的ESCGP基因和5個報道的基因在3個不同的前列腺癌細胞系中的表達(參見實施例2B)。在這33個基因中，鑒定了 24個基因(19個ESCGP基因和5個報道的基因)在較少侵襲性細胞系LNCap中與在侵襲性細胞系DU145和PC3中相比具有不同的表達模式(參見圖2)。認為這24個基因更可能有助于腫瘤分類以區分較少侵襲性癌癥與較多侵襲性癌癥。因此，選擇這24個基因(25個基因標志物)用于優化多重qPCR并評估在來自具有已知臨床結果的189例前列腺癌患者的細針穿刺(fine needleaspiration, FNA)樣品中對前列腺癌進行分類的能力(參見實施例3A)。首先通過在訓練集，即189例患者的全隊列(full cohort)的子集中分析鑒定表達譜與生存相關的基因。然后通過在整個患者隊列中分析來證實已鑒定的顯著基因對腫瘤進行分類的能力。
[0027]在本隊列中的所有患者患有臨床上顯著的前列腺癌，并且當該疾病變成晚期時，病人中的大多數(80% )未通過根治性前列腺切除術或全劑量放射療法來治療而僅通過閹割療法來治療。因此，生存數據并不受根治性治療的治療效果的影響，根治性治療在患有生物學侵襲性癌癥的某些患者的早期階段使用時可以消除癌癥并因此消除生命威脅。在本隊列中，隨訪時間為7-20年，且患者中的大部分(94.5% )已故，使得能夠完整分析真正的總生存時間而具有極少截尾數據(censored data)。這些特征保證了用于生存預測的新的生物標志物的發現，并且與大多數先前的研究相比是獨特的，在大多數先前的研究中使用無PSA復發生存或無進展生存作為總生存和癌癥特異性生存的替代。
[0028] 在本研究中，使用總生存和腫瘤特異性生存兩者來評估預后生物標志物的臨床價值。癌癥特異性生存主要通過癌細胞的生物學侵襲性來確定。然而，預后參數以及預測性參數(諸如臨床參數和/或生物標志物的表達)與癌特異性生存之間的相關性的準確度和重要性可受以下的影響:如何定義癌特異性生存、如何收集數據以及多少數據由于死亡率的其他競爭原因而截尾。在另一方面，總生存是沒有進行死因的任何截尾并包括所有死因的生存數據。因此，總生存不僅反映了癌細胞的生物學侵襲性，而且反映了很多其他因素，諸如競爭性疾病或共存疾病、治療的并發癥及副作用、年齡和預期壽命。對于前列腺癌患者，總生存可能比癌癥特異性生存具有更多的重要性，因為大多數患者在老年時被確診，并且通常患有其他競爭性疾病,諸如心血管疾病、糖尿病或其他惡性疾病(Daskivich等人，Cancer 2011, Apr8.do1: 10.1002/cncr.26104.[印刷版之前的電子版])。
[0029]10個分子標志物基因在通過單變量分析進行分析時顯示與總生存和/或癌特異性生存的顯著相關性(參見表1)，并可以用于對前列腺腫瘤進行分類，用于根據患者的腫瘤的分類進行預后預測，且還用于根據患者的腫瘤的分類為患者制定治療決策。這些分子標志物基因是F3 (凝固因子III)、WNT5B (無翅型MMTV整合位點家族，成員5B)、VGLL3 (退變樣蛋白3(果蠅))、CTGF (結締組織生長因子)、IGFBP3(胰島素樣生長因子結合蛋白3)、c-MAF-a(v-maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物的長形式(禽))、c-MAF-b (v-maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物的短形式(禽))、AMACR( α -甲基酰基輔酶A消旋酶)、MUC1 (粘蛋白1，細胞表面相關的)和EZH2(zeste的增強子同源物2(果蠅))。這10個基因中的5個(F3、WNT5B、CTGF、VGLL3和IGFBP3)是從在胚胎干細胞中具有一致性高表達或一致性低表達的基因的列表中鑒定的ESCGP。2個基因(c-MAF-a和c-MAF-b)是先前報道過的已知在骨髓瘤中具有重要的功能的基因。
[0030]3個顯著基因(EZH2、AMACR和MUC1)是先前已報道過的與前列腺癌相關的基因。一些先前的研究已鑒定了的生物標志物像AMACR、EZH2、MUCl和AZGPl和干性標簽(sternness signature)(Varambally 等人，Nature 2002, 419:624-9 ； Rubin 等人，JAMA2002, 287:1662-70 ；0on 等人，Nat Rev Urol 2011, 8:131-8 ；Lapointe 等人，Cancer Res2007, 67:8504-10 ； Rub in 等人,Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005, 14:1424-32 ；Strawbridge 等人,Biomark Insights2008, 3:303-15 ；Glinsky 等人，J Clin Oncol2008，2846-53 ;Glinsky等人，J Clin Invest 2005，115:1503-21)。本結果顯示，MUCl、AMACR和EZH2在前列腺癌FNA樣品中的表達水平確實與癌癥特異性生存或與總生存相關。然而，在先前報道過的基因標志物中，僅通過c-MAF-a的相關性與通過本研究中鑒定的ESCGP F3、IGFBP3和VGLL3的相關性一 樣強。
[0031]
【權利要求】
1.一種對受試者中的前列腺癌進行分類的方法，所述方法包括: a)確定基因F3和IGFBP3在來自所述受試者的樣品中的基因表達水平； b)通過將a)中所確定的基因表達水平與在已知分別患有高風險或低風險腫瘤的參考患者中相同基因的參考基因表達比較對所述腫瘤進行分類；以及 c)如果a)中確定的基因表達水平與患有聞風險腫瘤的參考患者的參考基因表達匹配，則推斷所述受試者中的腫瘤是高風險腫瘤，并且如果在a)中確定的基因表達水平與患有低風險腫瘤的參考患者的參考基因表達匹配，則推斷所述受試者中的腫瘤是低風險腫瘤。
2.如權利要求1所述的方法，其中a)還包括確定基因VGLL3和c-MAF中的一個或多個，優選VGLL3的基因表達水平。
3.如權利要求1-2所述的方法，其中a)還包括確定基因WNT5B和CTGF、EZH2、AMACR和MUCl中的一個或多個的基因表達水平。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述基因表達水平通過對由所述基因表達的RNA或mRNA的量進行定量來確定。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述RNA或mRNA的量通過使用選自以下的方法來確定:微陣列技術、RNA印跡和定量PCR(qPCR)，諸如實時定量PCR(qrt-PCR)，任選地多重PCR。
6.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述基因表達水平通過對由所述基因編碼的蛋白的量進行定量來確定。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述蛋白的量通過使用選自以下的方法來確定:免疫組織化學、蛋白質印跡、ELISA、RIA和質譜法。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述樣品是獲自所述受試者的腫瘤樣品O
9.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述樣品是獲自所述受試者的血液樣品O
10.一種用于確定診斷為前列腺癌并患有腫瘤的受試者的預后的方法，所述方法包括 a)使用根據權利要求1-9中任一項所述的方法對所述腫瘤進行分類；以及 b)推斷，低風險腫瘤指示所述受試者具有良好預后，而高風險指示所述受試者具有不良預后。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述不良預后為與所述良好預后相比生存可能性的降低。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述不良預后為與所述良好預后相比總生存時間的減少。
13.如權利要求10所述的方法，其中所述不良預后牽涉與所述良好預后相比癌癥特異性生存時間的減少。
14.如權利要求10所述的方法，其中所述不良預后牽涉與所述良好預后相比增加的死亡風險。
15.一種為診斷為前列腺癌并患有腫瘤的受試者制定治療決策的方法，所述方法包括 a)使用根據權利要求1-9中任一項所述的方法對所述腫瘤進行分類；以及 b)根據在a)中獲得的分類為所述受試者制定治療決策。
16.如權利要求15所述的方法，其中對于患有局限性癌癥和高風險腫瘤的患者，所述治療決策是給予根治性治療或治愈性治療。
17.如權利要求15所述的方法，其中對于患有局限性癌癥和低風險腫瘤的患者，所述治療決策是等待治療或給予激素療法，諸如閹割療法或抗雄激素療法。
18.如權利要求15所述的方法，其中對于患有晚期癌癥和高風險腫瘤的患者，所述治療決策是給予化療。
19.如權利要求15所述的方法，其中對于患有晚期癌癥和低風險腫瘤的患者，所述治療決策是給予閹割療法。
20.一種治療診斷為前列腺癌并患有腫瘤的受試者的方法，所述方法包括 a)使用根據權利要求15-19中任一項所述的方法制定治療決策；以及 b)根據所述治療決策治療所述受試者。
21.基因F3和IGFBP3以及任選地，VGLL3和c-MAF中的任一個，或由其編碼的蛋白作為用于前列腺癌的預后標志物的用途。
22.—種固體支持體或試劑盒，用于對診斷為前列腺癌的受試者中的腫瘤進行分類，所述固體支持體或所述試劑盒包含有助于確定基因F3和IGFBP3以及任選地，VGLL3和c-MAF中的任一個的基因的表達，諸如RNA或蛋白表達的核酸探針或抗體。
23.如權利要求2 2所述的固體支持體或試劑盒，所述固體支持體或試劑盒還包含有助于確定基因WNT5B、CTGF、EZH2、AMACR和MUCl中的一個或多個的基因表達的核酸探針或抗體。
24.如權利要求22-23中任一項所述的固體支持體，其中所述固體支持體是陣列諸如微陣列或蛋白質陣列。
25.如權利要求22-24中任一項所述的試劑盒，其中所述核酸探針選自SEQIDNO:21-68。
【文檔編號】C12Q1/68GK104024436SQ201280064273
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年10月24日 優先權日:2011年10月24日
【發明者】李純德, 彭卓淳, 蘭伯特·斯科格 申請人:純德賽爾醫藥公司