作為冰凍切片的替代物的超快診斷組織制劑的制作方法

作為冰凍切片的替代物的超快診斷組織制劑的制作方法
【專利摘要】用于處理所述實體組織的改進的方法和系統。該方法可人工或自動地實施。該系統具有諸如(i)切割模塊，其中將新鮮組織切片以制備組織標本，(ii)硬化模塊，硬化組織標本，(iii)浸滲模塊，浸滲硬化過的組織標本，和(iv)包埋模塊，其包埋硬化并浸滲過的組織標本。將新鮮的(即非固定或冰凍的)組織切割為約0.6mm，所述新鮮的組織被切割，以診斷疾病或評估外科手術治療。優選在通過與化學混合物接觸來切割期間開始但不完成新鮮組織的硬化。優選用干冰、熱電裝置或氣體冷凝器來冷卻含有已包埋的標本的金屬模具。將其切片，然后用顯微鏡檢測，作為冰凍切片的組織學檢測的替代物，以避免不一致和延遲診斷所針對的已知的問題。
【專利說明】作為冰凍切片的替代物的超快診斷組織制劑
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2011年9月29日提交的申請號為61/540947的美國專利申請的權益。
【技術領域】
[0003]本發明涉及用于診斷組織制劑的化學方法和機械裝置。在手術過程中從病人身體切下的實體組織的新鮮(即不是固定的或冰凍的)樣本可以作為冰凍切片的組織學檢測的替代品來制備(即切割后再加工)，并且不會遭遇后者的偽跡(artifact)。這些方法和這些系統使得能夠通過石蠟切片的組織學檢測來進行術中診斷，這避免了檢測冰凍切片時會遭遇的偽跡。
【背景技術】
[0004]用于組織處理的方法和系統已被描述(見W099/09390、WOO1/44783, WOO1/44784和W02005/40763)。它們需要一種至少為酮和醇的混合物，用于化學處理。在此，證明了并不需要醇。可從手術中的病人來獲得組織樣本。可將其樣品加工成組織塊，該組織塊被切片，組織切片由解剖病理學家檢測。所述組織切片的組織學檢測和診斷在病人離開手術之前完成。本發明相對于冰凍切片的優勢是在顯微鏡下觀測到的組織切片的形態保持在組織塊中。無論所述塊是通過常規處理法或本發明來制備，來自組織塊的切片的質量都顯得是相同的。主要由在冰凍切片的組織學檢測過程中觀察到的偽跡造成的不一致或延遲的診斷將通過本發明的應用而避免。
[0005]手術中病理學會診涉及在手術中從病人獲取的樣本的巨檢和鏡檢。最常見地，在顯微鏡下的組織切片的組織學檢測通過染料染色來實現，以檢測組織形態。常規地，這是在來自實體組織的“冰凍”切片上實現，以至于解剖病理學家在病人離開手術之前(即手術中)診斷是可能的。見Keeney&Leslie，JAMA300:1074-1075 (2008)。Wilson研發的冰凍切片技術的歷史在其發表一百周年由 Gal&Cagle，JAMA294:3135-3137 (2005)和 Lechago, Arch.Pathol.Lab.Med.129:1529-1530(2005)詳細敘述。
[0006]由美國病理學家學會(College of American Pathologists, CAP)認證的實驗室認證要求使用冰凍切片的手術中診斷通過從相同組織獲得的所謂“永久”切片的后續研究來確認，所述“永久”切片包埋在石蠟塊中，先前用來獲得冰凍切片。從CAP Q專題項目中的參與者的報告來看，在冰凍切片和永久切片之間存在至少約1% -2%的不一致(即手術中診斷中的足夠的冰凍切片研究，其與石臘切片存在診斷不一致)。見Raab et al., Arch.Pathol.Lab.Med.130:337-342 (2006) ?因為該原因以及由延遲診斷導致的延遲，將需要提供通過本發明制備的來自組織塊的切片的手術中診斷。但是，縮短制備源自手術樣本、用于組織學檢測的組織樣品所需的時間以使得能實現手術中診斷對于現有方法和系統已作出的大量修改。
[0007]現在描述對于組織制備的方法和系統的這些改進。其特征在于:(i)將實體組織切割成約0.6mm的均一的厚度，和/或(ii)至少為酮和油的化學混合物，以使組織樣品變硬，和/或(iii)冷卻劑，以固化包含組織樣本的塊。優選地，在切割期間，組織樣品先與化學混合物接觸，以啟動組織硬化，由此便于將它切成一個或多個組織樣品。無組織學偽跡是相對于冰凍切片的常規組織學檢測的改進，在現有技術中已知其可預期產生不一致和延遲的診斷。對永久切片的后續研究的要求變得毫無意義了，因為通過本發明獲得了一致的形態。
[0008]本發明的其他優點在下面討論或者通過該討論將對本領域技術人員來說是顯而易見的。

【發明內容】

[0009]本發明的一個目的是提供快速診斷組織制劑。在手術中從病人的身體切下的實體組織的樣本作為組織標本來處理而無需提前冰凍。來自處理過的標本的塊的組織切片具有與用常規處理法制備的石蠟塊相似或相同質量的形態學特征。這相對于冰凍切片的組織學檢測是一種改善，不會遭遇后者的形態偽跡，排除重新處理組織的需要并避免延遲。
[0010]本方法和系統與組織標本的加工是兼容的，以產生塊，將所述塊進行切片，來用于組織學、原位抗體結合、核酸雜交、其他蛋白質或遺傳分析(例如片段的指紋鑒定或確定其序列)、形態和核酸的存檔，以及其組合。
[0011]在第一個實施方式中，提供了一種方法，包括:(a)將組織標本在回音廊中硬化，其中所述標本與化學混合物以及微波能量接觸；(b)在真空下浸滲組織標本，其中所述標本與熔化的基質和熱能接觸；以及(C)將組織標本包埋在塊中，并使塊固化，其中固體塊可切片，用于在手術過程中組織學檢測。優選對手術獲得的組織標本切割為大體上均一的厚度(例如，最小尺寸約為0.6_)，與化學混合物接觸以開始(但不完全)硬化。該組織標本厚度可為約0.1mm或更厚、約0.2mm或更厚、約0.3mm或更厚、約0.4mm或更厚，或者約
0.5mm或更厚。組織標本厚度可為約Imm或更薄、約0.8mm或更薄,或者約0.7mm或更薄。
[0012]在第二個實施方式中，提供了一種系統，包括:(a)硬化模塊，以將組織標本硬化，
(b)浸滲模塊，以浸滲硬化的組織標本，以及(c)包埋模塊，以將經過硬化和浸透的組織標本包埋在固體塊中。硬化模塊包括(i)具有形狀為回音廊的內部的第一腔室；(ii)當閉合時關閉第一腔室，對微波輻射無透過性，當開啟時連通第一腔室的第一蓋子；(iii)將化學煙霧和蒸發保持第一腔室的內部的第一墊圈；以及(iv)將微波能量傳遞到第一腔室的內部的輻射源。組織標本在第一腔室中與化學混合物接觸。浸滲模塊包括(i)具有能夠提供相對于外部降低的壓力的內部的第二腔室；(ii)當閉合時關閉第二腔室，當開啟時連通第二腔室的第二蓋子；(iii)保持第二腔室的內部和外部之間壓差的墊圈；(iv)至少將第二腔室的內的壓力降低到小于I巴的泵；以及(V)將熱能傳輸至第二腔室的內部的加熱器。在第二腔室中，將硬化的鑄造標本與熔化的基質接觸。包埋模塊由從塊(其中將處理過的組織標本包埋在基質中)傳輸熱能致使基質固化的冷卻器構成。
[0013]任選地，固定器(例如，由互鎖的兩半組裝的卡盒，其側面穿孔以使得溶液能夠交換)可在第一模塊或第二模塊中，以及在其之間負載一個或多個相同類型的組織樣品。可卸載固定器，將處理過的組織樣品從固定器移除再放置于任選的模具的內部，組織樣品被包埋在灌注有熔化的基質的模具中，并被固定器的至少一部分所(一半具有標明組織樣品的標簽)覆蓋。優選模具通過冷卻器的導熱表面接觸，模具的被接觸的一面通過固定器部分與蓋體相對。包埋過后，將組織樣品脫模，含有組織樣品的塊保持與固定器部分相連，其可通過超薄切片機來使用以將所述塊移動穿過切片的刀。三個模塊可彼此獨立，優選至少第一模塊和第二模塊為相同系統的獨立的部分(即第三模塊不與其他兩個模塊結合)，但三個模塊均可為相同系統的獨立的部分。
[0014]任選地，化學混合物包括非水溶液，包括⑴至少一種酮，其可為丙酮，以及(ii)至少一種油，其可為礦物油或者松樹油；可進一步包括至少一種表面活性劑，其可為二甲亞砜。優選化學混合物不包括醛(例如，其為福爾馬林)、醇、二甲苯或其組合。用于切割和處理的化學混合物優選在組成上是相同的，但它們可包括不同化學物質或配比不同。任選地，基質包括至少一種石蠟。優選基質不包括油、二甲苯，或者兩者都不包括。
[0015]在第三個實施方式中，提供了切割系統和切割工具。
[0016]通過下列詳述和權利要求及其概述，本發明的更多方面和優點對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1顯示了將冰凍切片(例如，對切片并染色過的實體組織進行鏡檢)與通過不同方法制備的永久切片進行組織學比較的流程圖。對實體組織進行切割。常規處理固定在甲醛中，用一系列梯度乙醇脫水，在二甲苯中透明，包埋在蠟中。用微波能量快速處理在酮和醇中硬化，然后在真空下浸滲，并通過熱能包埋在石蠟中，以制備永久切片。冰凍切片的組織學檢測并不需要固定、浸滲，或者包埋。相反，通過冰凍使新鮮樣品硬化，然后不需包埋在蠟塊中就切片。根據非限制性實施例1的超快制備法顯示可用于被切割的組織樣本(例如，新鮮樣品與化學混合物接觸來開始硬化，并由此使將樣本切成組織標本變簡單)，處理組織標本，然后包埋入塊中，然后將塊冷卻以固化。將塊用超薄切片機處理，以提供組織標本的組織切片。對組織切片進行脫蠟，然后染色(例如抗體或染料)，并檢測其組織形態。
[0018]圖2是處理具有兩個儲藏室的處理系統的示意圖，儲藏室中分別含有硬化組織標本的化學混合物和浸滲硬化的組織標本的熔化的基質。
[0019]圖3為沒有儲藏室的另一處理系統的示意圖。
[0020]圖4為用于切割組織的系統的透視圖。
[0021]圖5為在組織切片之前的圖4的切割系統的透視圖。
[0022]圖6為在組織切片期間的圖4的切割系統的透視圖，所述圖4的切割系統從從本角度看不見。
[0023]圖7為在組織切片期間的圖4的切割系統的頂視圖，所述圖4的切割系統從本角度看不見。
[0024]圖8為切割系統通過圖7的直線8-8的橫截面圖，顯示了被固定并切片的組織。
[0025]圖9為切割工具的透視圖。
【具體實施方式】
[0026]對于實體組織的處理和組織學分析，組織切片必須為約2 μ m至10 μ m，以在顯微鏡下通過放大來檢測，然而用切割工具可以得到的新鮮組織的最薄的切片也超過其十倍厚。因此，為了制備適用于鏡檢的組織切片，有必要硬化組織以能夠得到更薄的切片(例如用超薄切片機切片)。厚度為約0.6mm的標本足以提供約75個組織切片。
[0027]對于多種組織類型，組織塊的超薄切片必須以一致且均一的方式來生產能接受的條帶(即一系列)組織切片，所述組織切片能懸浮在水浴中而不會“突散”，并被置于載玻片上用于組織學染色的而不會“破裂”。在用超薄切片機切割之后，組織切片的該處理是對于基于在染色的組織切片中觀察的形態來提供有效且可靠的組織學診斷來說必要的。缺失或者染色差的各部分組織切片均將推遲基于該切片中的組織形態的診斷，以此來降低診斷結果的可靠性。因此，用于病理學實驗室的步驟和儀器要求根據已建立的方法的確認，以使得它們可以一致地且有效地實施；可處理多種組織類型，包埋在塊中，并切片；可對它們應用用于多種疾病的不同診斷標準；并且能快速且準確地實施珍貴樣本的組織學診斷(即通過用抗體或染料染色的方式來顯現組織形態)。本發明具有下列優點:制備用于手術中診斷的具有識別的形態的“永久”切片取代具有高發生率的不一致或推遲的結果的冰凍切片。
[0028]在超薄切片期間，處理得很差的鑄造標本不形成一系列的組織切片的條帶，所述切片在懸浮在水浴中時會突散，并且在組織切片中存在破裂(即缺失部分)。可接受的處理結果不會有這樣的缺陷，因為超薄切片產生在后續組織學分析中具有保持形態(例如，細胞結構和組織構造)的組織切片。可變的結果(例如來自同樣組織標本的切片形態不一致，或者對于某些組織類型一致但對于其他組織類型則不令人滿意)對組織學診斷是不可接受的。
[0029]在第一個實施方式中，組織標本的硬化可通過在回音廊內與化學混合物和微波能量接觸來實施。然后可將硬化的組織標本在真空中通過熔化的基質和熱能接觸來浸滲。組織標本的硬化可通過在環境壓力(例如I巴)下使用微波能量輻射加熱來發生。化學混合物可包括至少一種酮和至少一種油(即在環境條件下是液態，且源自于動物、植物或石油的烷烴)。化學混合物可進一步包括至少一種表面活性劑。硬化組織標本的溶液優選不包括醇、醛、二甲苯，或其任意組合。化學混合物和/或微波能量可固定、脫水，以及任選地清洗組織標本。該組合可減少處理時間和/或可提高用于組織形態學檢測的組織的質量。浸滲組織標本可通過在少于一個大氣壓(I巴)下與熔化的基質接觸并利用熱能進行熱傳導(例如電阻加熱)來實施，以將化學混合物從組織標本抽出并將基質浸滲到組織標本內。真空通過促進擴散和降低可能存在于組織標本中的任何溶劑的蒸發溫度來促進浸透。基質可包括至少一種石蠟和/或其他蠟(即在環境溫度下是固態的并且來自動物、植物或石油的烷烴)，其任選地被脫氣和脫水。浸滲硬化的組織標本的溶液優選不包括礦物油、二甲苯，或者兩者。包埋組織標本可通過在模具中澆鑄它和熔化的基質來進行，以生產塊。然后，可通過冷卻來固化所述塊(例如冷凍劑壓縮機或者珀爾帖效應)。然后用超薄切片機來切片包埋的組織。將將組織切片懸浮于水上，以放在顯微鏡載玻片上。組織切片放在載玻片上之后，從載玻片去除基質，剩下的組織切片黏附在玻璃上。然后將載玻片染色并用蓋玻片蓋上。
[0030]在第二個實施方式中，組織標本通過在回音廊中與化學混合物和微波能量接觸來硬化，通過在真空中在腔室中與熔化的基質和熱能接觸來浸滲，并包埋在塊中。微波能量(例如磁控管、速調管、行波管)或熱能(例如電阻式加熱器或者熱泵)加熱化學混合物和熔化的基質，以及其他內容物，例如組織切片。可使用攪拌(例如通氣、真空的循環和增加的壓力，搖動等)來促進溶液(例如化學混合物或熔化的基質)和組織標本之間的交換。接下來，通過冷卻器單元將組織標本(例如熱電冷卻器或者氣體冷凝器)包埋在塊中。可將組織塊與冷卻器單元接觸來固化，以使得塊可以容易地切片，用于組織學檢測(例如在顯微鏡下對于與組織切片特異性相連的抗體或染料的檢測)。
[0031 ] 成功完成組織制備是由在超薄切片期間包埋在塊中的組織的易于切片和在組織切片的組織學檢測期間的形態的保持來表示的。盡管優選用手工轉入微波單元和在微波單元和真空單元之間自動轉移(任選自動轉移到真空單元以及卸載站外)的方法和系統的半自動操作，可在回音廊和任選的第一儲藏室(或腔室和任選的第二儲藏室)之間轉移化學混合物，所述第一儲藏室彼此間以流體相連(例如管子或管道、閥門，以及帶控制電路的泵，以確定時間、速度和溶液流動的方向)。
[0032]可用化學物質的混合物來硬化組織標本，所述化學物質的混合物可以是包括至少一種酮(例如丙酮、甲基乙基酮)以及至少一種油(例如礦物油、松樹油)的非水溶液。對于酮和油的非水溶液，兩種試劑的體積比可在約12:1至約6:1之間(盡管這些極值可改變處理時間，或者結果可能不可靠)；小于約12:1，小于約11:1，或者小于約10:1 ;大于約6:1,大于約7:1,或者大于約8:1 ;約9:1,或者其任何中間范圍(例如,在約10:1至約8:1之間)。化學混合物可進一步包括可加速硬化的表面活性劑:例如二甲亞砜(DMSO)、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(例如吐溫80)、二甲基磺基琥珀酸酯鈉(sodium dimethylsulfosuccinate)、溫和家用清潔劑等。化學混合物還可通過酸和堿的適當應用來緩沖，但非水溶液中不需要包括醋酸。
[0033]組織標本可在化學混合物中孵育在約3分鐘和約6分鐘之間的一段時間；超過約3分鐘，超過約4分鐘，或者超過約5分鐘；少于約4分鐘，少于約5分鐘，或者少于約6分鐘；或者其任何中間范圍(例如，從約4分鐘至約5分鐘)。溫度可為在約40°C和約60°C之間；高于約45°C，高于約50°C，高于約55°C，或者高于約60°C;低于約60°C，低于約65°C，低于約70°C，或者低于約75°C ;或者其任何中間范圍(例如，在約45°C和55°C之間)。
[0034]可用熔化的基質來浸滲組織標本，熔化的基質可為包括至少一種石蠟的蠟溶液。優選基質為市售的蠟配方、具有不同熔點的蠟的混合物(蠟在室溫下為固體，具有依賴于其鍵長的熔點，而礦物油在室溫下為液體)等。它們可進一步包括一種或多種添加劑，以改變基質的結晶性能。組織標本可在熔化的基質中孵育約3分鐘和約6分鐘之間的一段時間；超過約3分鐘,超過約4分鐘,或者超過約5分鐘；少于約4分鐘,少于約5分鐘,或者少于約6分鐘；或者其任意中間范圍(例如，從約4分鐘至約5分鐘)。蠟溶液可在室溫下為固體(例如，在約25°C以下，或者在約30°C以下)，在約55°C以上或者約60°C以上熔化。溫度可為在約50°C和約70°C之間；高于約50°C，高于約55°C，高于約60°C，或者高于約65°C;低于約65°C，低于約70°C，低于約75°C，或者低于約80°C ;或者其任意中間范圍(例如，在約55°C和65°C之間)。優選在減壓條件下(例如，高于約0.5巴，高于約0.6巴，或者高于約0.7巴；低于約0.7巴，低于約0.8巴，低于約0.9巴，或者低于約I巴；或者其任意中間范圍)實施孵育。
[0035]在切片前，可將浸滲過的組織標本包埋在同樣基質中，以形成組織塊。例如，可將浸滲過的組織標本置于金屬模具中，可加入更多熔化的基質來填充模具，并形成組織塊，將組織塊固定在平臺上(例如，前面所用的卡盒或者具有識別信息的其他固定器)，所述平臺與用于切片的超薄切片機相連。可通過在含有有機溶劑和干冰的液浴中，或者在含有有機溶劑和液氮的混合物的液浴中，或者在使用壓縮的制冷劑或珀爾帖效應冷源的冷卻器單元的表面，通過在干冰上冷卻模具來加速包埋。切片之后，可以通過在高于約100°c的溫度下熔化來去除基質(現在是固體)。
[0036]回音廊或者反應腔室可包括下列各項的任意組合:適于將其從其與周圍環境隔離并且提供通向其內容物的通路的蓋子(例如，由對微波輻射和/或可見光無透過性的材料制得)；在蓋子和回音廊或者反應腔室之間的墊圈(例如，由橡膠或硅樹脂制得)，以將化學煙霧保持在前者(回音廊)(以及任選地加熱儲藏室)中，和/或在后者(反應腔室)中保持減壓；熱絕緣材料，以將熱量保持在回音廊或者反應腔室中；至少一個溫度和/或壓力探頭，以監測其中的條件；密封條，以將電子元件與回音廊形或者反應腔室中的化學物質和冷凝隔離開來；以及控制電路，其接收來自至少一個探測器和/或計時器的輸入。類似地，儲熱器可包括熱絕緣材料、至少一個溫度探測器和/或壓力探測器、密封條，以及接收來自至少一個探測器和/或計時器的輸入的控制電路的任意組合。
[0037]在一個優選實施方式中，預混合化學混合物，并在使用前將其儲存在瓶子中。打開所述瓶子，并將其內容物的至少一部分通入一個(第一)儲藏室以進行預加熱，在加入組織標本之前，轉移入第一模塊的回音廊中，在組織標本移動(人工地或自動地)到第二模塊之前，轉移回(第一)加熱儲藏室以排空回音廊。可在第二模塊的腔室中直接融化固體基質。或者，固體基質可在(第二)加熱儲藏室中融化，然后通入那個腔室。化學混合物在組織處理期間可在(第一)加熱儲藏室和第一模塊的回音廊之間轉移。而熔化的基質在組織處理期間可保持在第二模塊的反應腔室中。在一天結束時，化學混合物可以轉移回瓶中，熔化的基質則可以轉移回第二腔室，然后它們可以安全地處理掉或者儲存以備再次使用。
[0038]或者，單個反應腔室可用于將微波和真空功能兩者結合在單個單元中的模塊中。化學混合物和熔化的基質可以分別從各自的第一儲藏室和第二儲藏室轉移到共同的反應腔室，然后再轉移回去。
[0039]這種系統可人工或自動操作(即在用機械傳送裝置在模塊之間傳遞組織標本)。該系統可進一步包括裝載和/或卸載站。組織標本可裝載到系統中，分批處理或作為單獨的標本來處理。組織標本可在裝載站加入系統，從卸載站離開系統，任選地它們可在卸載站被收集。控制電路(例如，電腦以及程序)可用于通過系統移動組織標本來防止操作期間進入反應模塊，以修改一個或多個反應參數(例如，本方法中的時間、溫度、壓力，或者溶液的量)，或者其任意組合。
[0040]組織標本是固體塊，可裝到超薄切片機上以生產在約I微米和約50微米之間的組織切片，或者在約2微米和約10微米之間的組織切片。組織切片可進一步處理用于組織學染色、結合抗體、原位核酸雜交或者擴增，或者其組合。例如，可將黏附于玻璃上的多個組織切片加熱到高于100°C的溫度，以熔化固化的基質，去除熔化的基質，將玻璃上余下的組織切片用抗體或染料染色，并在顯微鏡下通過放大來觀察。但是用于檢測細胞特性的其他技術可用來檢測處理過的組織標本(例如，片斷的指紋識別、分餾和印跡、測序)。組織塊可存儲用于存檔目的或者回顧性研究。
[0041]細胞表型(例如，與細胞特異性抗體的反應性、化學染色)可以通過移除固體基質(例如，脫蠟)和分割組織(例如，蛋白水解消化和機械消化)來進行分析。個體細胞通過噴射分散，并用流式細胞儀分析。或者，可將脫蠟的組織切片裝到顯微鏡載片臺上，用激光和/或顯微操作儀來分割成大致均勻的細胞群，并通過物理、化學或遺傳技術分析不同的細胞類型。
[0042]本發明與從處理過的組織制備核酸(DNA或RNA)是相容的。因此，對于在臨床病理學實驗室中常規收集的組織標本進行遺傳學研究是可能的。這些技術的組合的能力很好。組織學觀察可與通過由染色(例如，特異的抗體或染料)分析組織切片，并從鄰近組織切片制備核酸用于遺傳學分析的方式進行的遺傳學研究相關。例如，可比較相同組織切片的帶病的和正常的區域以檢測遺傳學差異(例如，突變，轉錄水平)，疾病進展可通過比較在幾個時間點采取的樣本中的遺傳學差異來表征，并且腫瘤進化可通過跟蹤從原發癌到轉移癌的遺傳學差異的積累來評估。實質上均一的或僅僅豐富的細胞可通過用流式細胞儀或者顯微切割從組織切片分選細胞來獲得。
[0043]突變可為生殖細胞突變，并用于追蹤疾病的遺傳傾向，或者突變可為體細胞突變，并用于確定疾病發病機理中的基因的改變。疾病可為代謝或神經失調、惡性(腫瘤)、發育缺陷，或由傳染原導致。本發明通過簡單步驟，在室溫下儲存來保存用于遺傳分析的材料。它可通過原位雜交來分析，或者可從組織提取核酸。
[0044]蘇木精-伊紅染色法常用于組織分析，并可認為是用于與其他解剖病理學家比較的標準。此外，其他可相容的染色法包括三色染色、網狀纖維染色、粘蛋白卡紅染色，以及彈性纖維染色法，諸如 Thompson (Selected Histochemical and HistopathologicalMethods, C.C.Thomas, Springfield, Illinois, 1966)、Sheehan 和 Hrapchak(Theoryand Practice of Histotechnology,C.V.Mosby,St.Louis, Missouri, 1973)以 及Bancroft 和 Stevens(Theory and Practice of Histological Techniques, ChurchillLivingstone, New York, New York, 1982)等文獻通常所描述的。這些染色方法將花30分鐘至幾小時來完成，但從飛世爾科技(Fisher Scientific)公司可獲得僅需要5分鐘的快速染色方法。
[0045]可由手術活體組織檢查或者切除獲得實體組織。在癌癥手術期間，從染色的組織切片提供病理診斷的能力將給外科醫生提供可在病人離開手術室之前(即，手術中診斷)使用的信息。例如，源自解剖病理學家的癌癥局限在被切除的組織的指示可允許外科醫生在治療中保守，并保存鄰近的健康組織。或者，源自解剖病理學家的癌癥不局限在被切除的器官的發現將在病人還在手術室中時允許進行更加積極的外科治療。與常規的冰凍切片的組織學檢查相反，新鮮標本的超快診斷制備可提供具有更好組織形態的組織切片，并降低對用來自與獲得冰凍切片相同的組織的石蠟切片后續確認的需求。
[0046]可處理的示例性的組織包括:闌尾、膀胱、骨、腸、腦、乳房、癌、子宮頸(鱗狀上皮)、膽囊、心臟、腎、肝、肺、卵巢、腮腺、胎盤、前列腺、皮膚、脾、睪丸、甲狀腺、扁桃體和子宮(子宮肌層和子宮內膜)。也可處理淋巴網狀內皮細胞組織和脂肪組織。礦化組織需要在用本發明的方法處理之前脫鈣。接下來的分析將包括檢測DNA突變和RNA表達、基因組分析、組織化學、免疫化學和蛋白質組分析。
[0047]可進一步處理組織切片，用于抗原修復和/或保存。阻斷非特異性結合位點，將抗原結合到特異性抗體(即一抗)上，去除未結合的特異性抗體。抗原可以是蛋白質、碳水化合物或神經節苷脂；其抗原決定簇可為直鏈或非直鏈的氨基酸、糖、其他修飾物，或者其組合。如果用探針或信號生成部分來標記抗體，可直接檢測一抗，但優選將探針與特異性結合一抗的擴增物(例如，二抗)相連。二抗可抗一抗的重鏈恒定區或者輕鏈恒定區。這擴增了由抗原-抗體結合產生的信號，因為每個一抗都將結合多個二抗。擴增可通過其他特異性相互作用(例如生物素-鏈親和素)來進行。抗體結合可以很小的量來進行，以降低昂貴試劑的使用，并保持高的結合速率；可通過在濕度箱中孵育來降低此少量的揮發。該信號生成部分優選為不存在于組織中的酶。例如，堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶可結合二抗或結合鏈親和素。這些底物對于那些產生可在視覺上觀察到的發色、發熒光或發冷光產物的酶都是可用的。
[0048]抗原的染色模式可用來定位通過復染的方式所揭示的細胞結構中的抗原的表達。抗原表達可識別細胞或組織類型、發育階段、腫瘤預后標記、退行性代謝過程或被病原體感染。
[0049]抗原-抗體結合還可通過熒光顯微鏡、放射性自顯影儀或電子顯微鏡利用熒光、放射性或膠體金屬探針來顯現。類似的探針可用于通過原位雜交來檢測組織切片中的核酸，以識別基因突變或轉錄物；或者，核酸(DNA或RNA)可從組織切片提取，并在進一步遺傳分析之前通過印跡法來直接分析或擴增。
[0050]組織制備可結合其他模塊:(i)從新鮮組織生產組織標本的切割模塊；(ii)產生基質包埋的組織標本塊及其組織切片的包埋和切片模塊；(iii)提供含有組織切片的玻片的超薄切片、染色和蓋玻片模塊；(iv)將有關組織切片的組織化學和/或免疫化學信號可視化的顯影模塊；(V )將組織切片的細胞分離成實質上均質的種群的顯微切割模塊；(Vi )在玻片上掃描組織切片的成像模塊，將通過顯微鏡可視化的信號數字化，然后處理，儲存，并傳送這些圖像；以及其任意組合。組織，尤其在分選和/或分離成實質上均質的種群之后，可通過其DNA或RNA序列、基因突變、基因表達的水平或方式的改變、蛋白質表達水平或方式的改變，以及其組合來進行分析。通過字母數字字符、條形碼、近場或射頻識別或其他標記來識別每個組織標本或其固定器來促進系統集成以及數據管理。隨著特定的組織標本通過一系列機械系統時，相同或不同的標記可用于識別所述特定的組織標本。關于組織標本的標記和其他信息(例如，病人名字、日期、在器官中的位置、疾病或其他病理癥狀、組織類型、診斷、表型、基因型、基因組或蛋白質組學表征)可進入數據庫管理系統，以儲存、處理和讀取數據。在數據庫中挖掘這些信息可證明或反駁依照統計標準的關聯性，并建議進一步的檢查。
[0051]可在手術室、病理實驗室或其他地方實施的本方法中的第一步用來提供適合超快診斷制備的組織的樣品。后續步驟在病人體外(活體外)進行，優選甚至在病人不在時。一般來說，切割提供了目標組織的薄片。或者，超薄片或針狀物可在活體檢查期間獲得。對于實體組織，由切割制備的樣品提供了從約0.4mm至約0.8mm,優選從約0.5mm至約0.7mm,最優選約0.6mm的組織標本，以最小尺寸(即厚度)測量。優選地，通過切割與化學混合物接觸的實體組織來啟動硬化，但不完全硬化。切割步驟可在約5秒和約5分鐘之間的時間段內實施；超過約I分鐘；超過約2分鐘；或超過約3分鐘；少于約3分鐘；少于約4分鐘；或少于約5分鐘；或其任何中間范圍(例如，從約10秒至約3分鐘)。例如，病人器官的切除的一塊可放在切割板的接受組織凹槽內，其含有化學混合物，組織被凹槽底部表面支撐。將處理的組織標本可通過板的頂部表面上的金屬滑軌導引的刀片切成大體均一的厚度，其大體上與頂部表面與凹陷平齊，任選地與化學混合物接觸以啟動硬化，并由此利于切成薄片。切割之后，組織標本可置于卡盒或其他固定器，其中在后續處理期間含有組織標本，直到組織標本包埋在準備切片的塊中。將塊通過冷卻固化，并由此利于通過超薄切片機的切片。或者，采用套管針(例如用于活檢)替代切割通過組織的打孔取樣和碎化來提供合適厚度的組織標本，然后將其放入卡盒或其他固定器。盡管優選人工處理，仍可將卡盒放入載體或籃子，以使操作簡便。然后將卡盒或固定器放置在化學混合物中，優選人工放置。
[0052]為了減少處理時間，建議減少切割板上的組織樣本厚度，如W001/96830或W02010/027430中所述，以提供組織標本，其中例如用作組織處理的化學混合物填充在切割板上的凹陷內，而組織樣品放在所述切割板的凹陷處，以切割成大體上均一的厚度(見實施例3)。為了簡潔起見，優選使用與用于切割和硬化的化學混合物相同的化學混合物。
[0053]將組織標本、卡盒或固定器暴露在化學混合物中，所述化學混合物硬化所述組織標本，同時采用微波能量加熱，可選擇的進行攪拌。需要僅僅單個微波單元，因為能使用一種化學混合物。在幾個處理周期中，可將硬化溶液保留在回音廊中，或者可相隔一段時間，硬化溶液在回音廊和儲藏室(例如，在每個硬化周期之后，當所有組織標本被處理后，或者在當天的處理結束時移至儲藏室)之間轉移。優選將標本的載體或含有組織標本的卡盒在各反應腔室之間通過人工轉移，或者通過電樞或軌道傳輸。
[0054]為了提供能加速處理的攪拌，可充入化學混合物或熔化的基質。為了通過空氣提供更均一的攪拌，在回音廊或反應腔室的底部并貫穿其大部分的擴散板可用于使得全部容量的溶液的均勻通氣。攪拌還可通過壓力和真空(P/V)循環(例如，各周期中在有壓力條件下占幾秒，降低到部分真空，并重新返回壓力條件下)，或者將溶液泵入和泵出回音廊或反應腔室(例如，自始至終循環溶液)或使用P/V循環來提供。
[0055]在一個優選的實施方式中，用于制備組織標本的系統可限制在3或4個分立的模塊中:任選的切割單元、微波單元、真空單元，以及任選的冷卻器單元。實體組織的新鮮樣品的切割通過與啟動硬化的化學混合物接觸并切割成大體上均一的厚度來提供一個或多個組織標本。組織標本在微波單元中與相同或不同的化學混合物和微波能量接觸以完成硬化。硬化的組織標本然后再在真空單元中與熔化的基質和熱量接觸來啟動浸滲。在反應腔室(也稱為反應罐或容器)中進行處理，其具有形狀為回音廊(例如，微波單元)或圓柱形(例如真空單元)的內部。僅僅需要一個微波單元和一個真空單元；它們可整合到同一單元中。其中攪拌可用導致向其中充氣、搖晃或振動、或者將超聲能量轉移到溶液中的機械裝置提供。或者，可使用泵來用Ρ/ν循環或循環溶液來進行攪拌。將硬化并浸滲過的組織標本包埋在塊中可在模具中澆鑄(通過額外的熔化的基質)。組織塊可通過與傳導來自組織塊的熱能的表面接觸的任選的冷卻器單元來固化。
[0056]微波單元可包括(i)微波能量源(例如，包括諧振腔和任選的波導的回路，其可將微波能量從所述發射源傳輸到回音廊，使其尺寸和形狀適應此目的)以及(ii)接收傳輸的微波能量并適應于通過硬化處理組織標本的回音廊。所述回音廊可包含多個不同標本。優選回音廊的內部幾何形狀被構造以實現微波能量和內容物加熱的均勻分布。通過考慮兩方面的因素來實現均勻性。
[0057]第一，回音廊的周長制成其中輻射的半波長的整數倍。通過波導的合適的安排進入回音廊，激發將在外壁周圍傳播的模式。該類型的模式通過主要在外壁附近的微波場來表征。類似的現象發生在聲學中，其中聲波非常有效地緊挨著實體墻傳播。這些類型的模式稱為回音廊模式。
[0058]第二個考慮是在回音廊中的溶液和其壁的邊界之間的徑向距離。最佳間距通過改變間距憑經驗確定。如果間距過窄，則微波能量主要在反應腔室的進口附近被吸收。如果間距過寬，則回音廊變成共振腔，并且對化學混合物和其中固體(例如標本、卡盒或載體)的量敏感。通過合適的間距，實現了在內容物的非常大范圍的高度下的溶液和固體的有效加熱，如通過在回音廊外的液位監測器所測量的(即其中的容積)。即使低至整個高度(即總容積)的10%也能提供內容物的有效加熱。
[0059]類似地，所述輻射源和波導被構造成能在微波能量的傳輸期間實現最小能量損失。用波導構造微波單元，以具有從所述輻射源到回音廊不超過約2%的能量損失。更高的能量損失將需要使用用于微波能量源的昂貴的屏蔽和其他保護裝置。
[0060]可通過在約10秒至25秒的循環中循環能量開-關來控制加熱，因為微波源的陰極的加熱特性要求最短的時間。但是這將燃燒組織，因此可通過可變電流源來控制加熱，以允許在微波源傳遞到反應腔室的能量能夠有連續的變化。這種燃燒或過煮以組織結構具有均質染色的特征而無需區別細胞特征。優選后者以降低峰值能量輸出。微波單元可進一步包括適用于配合反應腔室并接收至少一個組織標本的容器(例如籃子)的任意組合；至少一個溫度探測器和/或壓力探測器，以監控反應腔室中的條件；一個或多個能量探測器，以監控從所述輻射源發出、通過波導傳輸和/或由反應腔室接收的微波能量；適用于配合反應腔室并將反應腔室與操作者環境相隔離的隔離體；熱絕緣材料，以保持反應腔室中的熱量；屏蔽，以將電子元件與反應腔室中的化學物質相隔離；以及控制電路，以接收來自至少一個探測器或計時器的輸入數據，并由此調節至少一種來自所述輻射源、通過波導傳輸和/或由反應腔室接收的的微波能量。所述容器優選對微波輻射有透過性的，因此能量不會在其加熱時被消耗。
[0061]用于真空密封的材料可根據其將反應腔室或儲藏室與環境密封隔離的能力、保證與蓋子的緊密配合的柔韌性，以及對本方法的溶液的耐化學腐蝕性來選擇。反應腔室或儲藏室可用以下辦法進行改進(i)減少蒸發的蓋子和墊圈/封口，以及(ii)絕熱能夠將操作微波單元或真空單元所需的能量降低兩倍或三倍。
[0062]所述各模塊可在相同空間，和/或所述組織標本可保持固定。在本方法的不同時間中，可調整微波或熱能，并將其輸入相同空間，或到固定的組織標本上。可將化學溶液和/或蒸汽移入或移出相同空間，或使其與固定的組織標本接觸或不接觸。優選通過使用兩個反應腔室并通過管子或管道將不同的化學組合物從各自的儲藏室和/或廢料腔室轉移到一個反應腔室來使系統的空間要求最小化。控制器可接收來自反應腔室和/或來自對該處理循環的該部分計時的輸入數據，并由此調整不同化學組合物的傳輸。
[0063]將不同溶液輸入和輸出反應腔室，或者在含有不同溶液的反應腔室之間轉移籃子可導致處理步驟的改變。將籃子保持在上述反應腔室內部幾秒鐘，使得在轉移籃子之前，將多余的溶液通過底部和/或側壁的一個或多個開口流回。因此，籃子在各反應腔室之間轉移的順序(每個反應腔室都含有特定組成的組織處理化學物質)和籃子在每個反應腔室中孵育的時間將決定完成根據本發明的方法所必需的一系列化學反應。
[0064]可移去蓋子；可將墊圈貼附于蓋子上并隨蓋子移動。對含有組織標本的當前單元和將要隨后轉入組織標本的下一單元兩者都實施移去蓋子和墊圈的步驟。然后移去籃子，可將籃子和卡盒中包括的剩余的化學混合物從籃子和卡盒中通回反應腔室幾秒鐘，將籃子轉移到下一個含有熔化的基質的反應腔室中。不要求沖洗管子/管道和清潔反應腔室，因為剩下的溶液的量極少。最后，將蓋子和墊圈放回去。該轉移的總時間約為I分鐘。
[0065]根據本發明，可設想對上述實施方式的改變。組織處理系統的多種結構變化是可能的，任選的各模塊可被連接上，以形成該系統的一部分。所選的特定結構可取決于臨床實驗室每天要處理的組織標本的平均數量，和/或組織學或病理學報告必須被準備好的速度。
[0066]該系統可人工操作或自動操作。人工操作尤其適合于快速處理單個組織標本或少量組織標本的設備。對于自動系統，組織標本可通過機械傳輸設備(例如機械臂、由傳送帶和滾軸形成的軌道)來轉運，和/或化學組合物可通過抗腐蝕管道來轉移。因此，可通過將組織樣品在固定的模塊之間以特定順序轉移、進料和排空具有不同化學物質的模塊以使得固定的組織標本以特定的順序孵育，或其任意組合來自動地處理。控制組織處理參數的程序(例如，系統的開啟和關閉、裝載和卸載多個組織標本、諸如反應時間的條件、組織標本通過系統的進度)可在屏幕上監控；組織處理的參數(例如，一個或多個組織標本在反應腔室中約2、3、4、5、6或7分鐘，從約2至約7分鐘，或其間的任意中間范圍)可由操作者通過鍵盤來預先設置或選擇。
[0067]電樞傳送可例如通過類似鉗子的裝置抓取含有一個或多個組織標本的載體，或者通過類似鉤子的裝置抓住載體。機械臂可為鉸接的，以實施類似人的動作；或者可裝在固定的坐標軌道上，實施線性或二維運動，以及任選的由改變機械臂相對于該系統的高度來提供的另一維度的運動。軌道傳輸工具可由彈性或粘性材料制成，以通過摩擦來將載體固定在含有一個或多個組織標本的軌道上，或者可存在有規律的一系列隆起物或壁，以將載體限制在其間。軌道可制成作為搬運載體的連續傳送帶或者一系列傳送帶，所述傳送帶被滾軸或鏈輪齒裝置帶動。載體可為籃子，所述籃子包括多個卡盒，每個卡盒具有單個組織標本，并適用于傳送，所述傳送是通過具有要被抓住的桿(有或沒有結)或要被機械臂抓住的環，或嵌入軌道的凹槽或凹口中。或者，載體可含有單個或幾個組織標本(例如，一個卡盒)，載體適用于通過電樞傳送或軌道傳送的運輸。
[0068]可使用電動機和控制器來通過操作者的實時指令或者選擇儲存在計算機存儲器中的程序來運輸組織標本。控制組織標本花在每個模塊中的時間的一個簡單機械裝置將以一定速度移動組織標本或其載體，并調整通過每個模塊的路徑的長度，以達到所需的孵育時間。
[0069]撓性管或剛性管以及其他管道元件應由耐化學腐蝕性材料制得，以防止腐蝕(例如，玻璃、不銹鋼、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯)。可使用控制器和泵/閥門，以將化學組合物(例如，化學混合物和/或熔化的基質)從儲藏室腔轉運到反應腔室，從反應腔室轉運到儲藏室腔(如果組合物可以重復使用)，從反應腔室轉運到廢料腔室(如果組合物要從系統中沖洗掉)；以向儲存腔室進料；以通過操作者的實時指令或者選擇儲存在計算機存儲器中的程序來沖洗廢料腔室。蒸汽密封和/或冷卻可能是將化學混合物的腐蝕性蒸汽與系統的機械元件和電學元件隔離開所必需的。加熱的儲藏室和加熱的管道元件可能對維持組合物在反應溫度或保證熔化的基質保持在可運輸的流體狀態是必需的。[0070]所有專利、專利申請和其他出版物均通過引用的方式并入本文中。
[0071]下列實施例意在闡釋本發明，但這些實施例不能以任何方式限制或局限本發明的實施。
[0072]實施例
[0073]實施例1
[0074]將新鮮(即非冰凍的也非預先固定的)組織切割成約為0.6mm(例如從約0.4mm至約0.8mm)的大體均一的的厚度，以提供用于處理的一個或多個組織標本。優選當通過將新鮮組織與化學混合物接觸來將實體組織切片時，開始硬化，所述化學混合物可與在切割期間用于處理(見下文)的化學混合物相同或不同。按照新方法，將來自于多個不同的剩余的組織和患病皮膚、肺、脾、肝臟、子宮、胎盤、腸、卵巢、癌(例如乳房、腎、睪丸)、肉瘤和平滑肌瘤制成永久切片。
[0075]將組織標本在含有約90% (v/v)的丙酮、約10% (v/v)的礦物油和約0.1% (v/v)的二甲基亞砜(DMSO)的化學混合物中處理。在3.8L體積中混入兩種主要成分，往其中加入5ml的DMS0。將組織標本在該化學混合物中，在約50°C下孵育約4_5分鐘；通過攪拌化學混合物(例如，通氣)來促進溶液交換。將組織標本和化學混合物兩者都通過微波能量加熱。
[0076]在組織標本硬化之后，將其在約62°C減壓(約640mm Hg)條件下在熔化的石蠟中浸滲約4-5分鐘。利用P/V循環通過攪拌熔化的石蠟來促進浸滲。在約8-10分鐘的總處理時間之后，將組織標本包埋在熔化的石蠟中。硬化過以及最初浸滲過的組織標本和熔化的石蠟在金屬模具中澆鑄，然后將它們與干冰(約_78°C)接觸約1-3分鐘。將含有組織標本的固化塊用超薄切片機切片，將組織切片懸浮在液體中，在載玻片上作為系列切片收集，通過在烘箱(約104°C)中熔化來去除石蠟。脫蠟后的標本準備好了用于后續組織學分析(例如染色和蓋玻片)、化學分析(例如通過提取并至少部分純化來從組織切片或其一部分中分離蛋白質、DNA或RNA)，或者在室溫下穩定地儲存。
[0077]實施例2
[0078]可使用本發明的一個實施方式(在圖2中顯示)采用以下列方式進行組織處理。在微波單元中，在內部形狀為回音廊的腔室中，將化學混合物和微波能量與組織標本接觸，以硬化組織標本。輻射源M在硬化模塊中提供微波能量。在微波單元中的攪拌可通過通氣(泵BP)來提供。化學混合物可使用由閥門、液位監測器和泵LP調控的管線在其儲藏室和其腔室之間轉移。然后，在真空單元中，將硬化的鑄造標本與熔化的基質和熱能在真空(泵AP)下、在用于浸滲的腔室中接觸。焦耳熱源H提供在浸滲模塊中的熱源。真空單元中的攪拌可通過使用同樣的泵AP的P/V循環來提供，其還可將熔化的基質在其腔室和其儲藏室之間通過由閥門和液位監測器調控的管線來轉移。組織標本輸入和/或輸出一個單元的任何轉移可為手動或自動的；在微波單元和真空單元之間的轉移優選為自動的。在冷卻單元中，將硬化且浸滲過的標本包埋在模具中，所述標本在與導熱表面接觸時固化，直至形成了固體基質塊。通過在包埋模塊中的珀耳帖冷卻源C從模具中散熱。
[0079]可手動或自動地將化學混合物轉移到硬化模塊中，往浸滲的模塊中加入石蠟顆粒。將化學混合物預熱，在處理組織標本之前熔化石蠟。抽真空，升壓，以在需要的時候轉移溶液。分別通過鼓泡(泵BP)或P/V循環(泵AP)來攪拌回音廊2或反應腔室3中的溶液。可任選地使用空氣壓力來將溶液從儲藏室轉移到微波單元的回音廊或反應腔室中。可使用流體連接(例如撓性管)和連接上系統的不同元件的連接口來在第一儲藏室和回音廊之間用泵LP和電磁閥轉移溶液。在真空單元中僅浸滲需要用氣泵減壓，因為微波單元中的處理(例如硬化和開始浸滲)可在大氣壓下進行。
[0080]將溶液和反應腔室加熱到合適的操作溫度。例如，在轉移入其回音廊2之前，化學混合物可通過在微波單元的第一儲藏室I中的電加熱器來預熱，并且在將熔化的基質轉移到其反應腔室3之前，在真空單元的第二儲藏室4中用熱能(例如焦耳熱源)熔化固體基質。從儲藏室的所述轉移通常在(每天)操作的開始完成，然后在(每天)操作的末尾通回儲藏室。在微波單元中，通過微波熱源M將化學混合物的溫度保持在約50°C ;在真空單元中，通過輻射加熱源R將熔化的基質的溫度保持在約62°C。在⑴第一儲藏室I和回音廊2之間或(ii)第二儲藏室4和腔室3之間的管子和閥門提供了雙向流體連接。分別用于化學混合物和熔化的基質的儲藏室I和儲藏室4是分開的。在微波單元或真空單元中溶液和/或籃子的存在或缺失可使用一個或多個液位監測器檢測溶液的體積或位移來確定。
[0081]在卡盒中裝載打過孔的含有組織標本的籃子。裝載站是可選地，因此籃子可放在裝載站(如果有)的空反應腔室中，然后通過傳送裝置自動轉移到回音廊2。但是優選將籃子手動轉移到回音廊2 (即，沒有裝載站)。將含有化學混合物的回音廊2通過微波能量加熱。傳送裝置優選為能可逆地與籃子連接的帶鉤子的機械臂；將帶有可替換的吸收劑襯墊的盤子連在機械臂上，在籃子下面轉動以接住滴下的化學混合物或熔化的基質(未顯示)。將蓋子與回音廊或反應腔室通過鉸鏈相連；每個蓋子用橡膠墊圈與回音廊或反應腔室形成密封，并用電動機驅動鏈來開啟/關閉(未顯示)。優選在回音廊2和反應腔室3之間自動轉移籃子。最后，當組織處理完成時，將裝載的籃子從反應腔室3轉移。卸載站是可選的，因此可將籃子放在卸載站(如果存在)的空反應腔室中。在站之間轉移籃子所需的時間少于約10秒鐘。在處理后，可將組織卡盒從籃子移出，來進行后續超薄切片和染色(見圖1)。
[0082]可在本系統中使用實施例1中所述的方法。在將含有組織標本的籃子加入微波單元之前，將預熱過的化學混合物從第一儲藏室I轉移到回音廊2。類似地，在將含有組織標本的籃子加入真空單元之前，將熔化的基質從第二儲藏室4轉移到腔室3。將籃子轉移到回音廊2中，使得一個或多個組織標本與化學混合物接觸，關閉回音廊的蓋子，在微波輻射的作用下繼續硬化一個或多個組織標本。當孵育完成時(即組織標本已被恰當地硬化)，打開蓋子，并將籃子轉移到含有熔化的基質的反應腔室3，在其中孵育一個或多個組織標本，直到完成處理。
[0083]用焦耳熱源將含有熔化的基質的反應腔室3可傳導地進行加熱。或者，電加熱器保持與基質接觸的管子中的循環水的溫度，以使基質保持在熔化狀態。例如，管子可在反應腔室3中盤繞；然后該加熱盤管可將熱傳導給內容物。優選通過用將熱通過壁導入反應腔室的內容物的電線包裹反應腔室的外壁來去除加熱盤管。可通過P/V循環以0.35Kg/cm2的公稱壓力和500mm Hg真空來實施真空單元中的攪拌。
[0084]每個硬化以及初始浸滲過的組織標本在含有熔化的基質的模具5中灌注。然后灌滿的模具通過與具有表面6的冷卻單元接觸來冷卻，所述表面6用珀爾帖冷卻源可導熱的加熱。冷卻單元可以或者不可以整合到與微波和真空單元相同的系統中。類似地，切割單元(未顯示)可以或者不可以整合到與微波和真空單元相同的系統中。[0085]本文中描述了其他條件(例如孵育的時間和溫度)。系統可封入操作室中，以控制可能存在的任何煙霧，并將其排出(煙霧控制)。桌面系統可使用自動傳送裝置傳遞組織標本，或可將其人工傳遞。或者，當沒有籃子移動時，具有身體高度的帶玻璃窗的門使得操作者能夠接觸系統，以將籃子裝入系統或從系統卸載籃子，并觀察籃子的移動。出于安全起見，當回音廊或反應腔室上的機械臂或蓋子移動時，優選關閉門。具有膝蓋高度的另一扇門使得操作者能夠(i)將具有化學混合物的瓶子連接到通向第一儲藏室I的口，所述第一儲藏室與微波單元相連；并且(ii)在與真空單元相連的第二儲藏室4中熔化石蠟。
[0086]圖3顯示了一個可選的實施方式，與上述系統類似，不同之處在于，沒有儲藏室。
[0087]在圖2和圖3兩者中，所有單元可在單個裝置中實施，它們可在分開的裝置中實施，或者微波單元和真空單元可在一個裝置中實施，而冷卻單元在另一個裝置中實施。
[0088]實施例3:實體組織的切割
[0089]可以下列方式使用本發明的另一個實施方式(在圖4至圖9中顯示)來實施組織切割。切割系統包括可消毒的底座20、組織支持物30和組織固定器40。組織支持物30和組織固定器40可用彈性塑料材料(例如丙烯酸)來制備。每個都有大體上平坦的粗糙的表面(例如，具有與新鮮組織相近面積的多個倒鉤、釘或鋸齒)；在切割期間，兩個粗糙表面都與組織接觸。固定器在頂部有一手柄，在底部具有粗糙表面。或者，可用手指替代固定器，來給實體組織施加輕微的壓力，并將它推向支持物(未顯示)。
[0090]組織支持物30通過用手指推入可緊密地與接收孔24相配合，使得支持物30的上表面和底座20大體上互相平齊，并使得當在刀片導軌22的底部和底座20的頂部之間移動時，刀片能組織切片，其中導軌22的至少兩個刀鞘延伸到底座20的頂部表面之上。支持物30包括在接收組織的凹陷周圍形成的邊緣，所述凹陷的深度為約0.6mm(例如，從約0.4mm至約0.8mm,更優選從約0.5mm至約0.7mm)。在將實體組織放到接收組織的凹陷之前,凹陷中可填充用于硬化的化學混合物。作為與底座20分開的支持物30的替代物，支持物30和底座20可作為一個整體形成，從而沒有接收孔(未顯示)。
[0091]實體組織60可用切割工具50切割。當將組織60放到支持物30的接受組織的凹陷中時，化學混合物可與組織60接觸，從接收組織的凹陷中排出，并且溢入鄰近孔26。支持物30可通過摩擦保持在其接收孔24中，可通過穿越鄰近孔26并用手指撬動它來人工移除支持物30。在底座20中，可將孔26的底部設定得比孔24的底部更高/更低。通過在至少兩個在刀片導軌22的底部和底座20的頂部之間所形成的狹縫中移動刀片，切割工具50將組織60切割到約0.6mm (例如，從約0.4mm至約0.8mm,更優選從約0.5mm至約0.7mm)的厚度。切割實體組織提供了具有大體上均一的厚度的組織標本，因為支持物的底部表面和底座的頂部表面大體上互相平行。優選地，導軌22的至少兩個刀鞘至少分開成接受組織的凹陷的寬度，和/或延伸到底座的頂部表面以上，至少是接收組織的凹陷的長度。
[0092]手術刀或切割工具(圖9)可用于將實體組織切割成一個或多個組織標本。切割工具包括把手52、固定器54和可移動刀片58。固定器具有兩個相對的末端:一個末端永久固定在把手上，相對的末端具有在其中形成的間隙。刀片通過螺栓56固定在間隙中，以與刀片和把手的平面垂直的方向行進。將固定器的塊放在把手的手柄和刀片之間能通過工具的合適的重量來促進水平的切片運動。
[0093]實施例4:在組織切片中探測抗原[0094]在每個微波單元和真空單元中，將組織標本處理4-5分鐘。將每個組織標本都包埋在含有過量石蠟的單個模具中。可通過輔助冷卻使組織塊固化。在超薄切片機中將石蠟切片切成3微米的厚度，放在水浴中，并懸浮在載玻片上。組織切片中的蠟在玻片上熔化，然后將其在二甲苯浴中脫蠟。使玻片上的切片組織在一系列濃度依次降低的乙醇溶液中再水化，每種濃度一分鐘(兩個純乙醇浴，兩個95 %的乙醇浴，一個90 %的乙醇浴)，并通過浸沒在水中2分鐘來清洗。
[0095]用35ml的6%的過氧化氫(H2O2)和140ml的甲醇孵育15分鐘來阻斷內源性過氧化物酶。將玻片浸沒在水中2分鐘，然后浸沒在磷酸鹽緩沖液(PBS)中2分鐘來清洗，最后干燥。
[0096]將玻片轉移入濕度箱中，并與普通馬血清(NHS)接觸十分鐘，以阻斷非特異性結合位點。從玻片倒出過量的普通馬血清，在室溫下在濕度箱中，在組織切片上孵育特異性一抗30分鐘。使用含有PBS的塑料擠瓶并浸沒入PBS浴2分鐘，來回運動，來洗滌玻片。將過量的PBS從每個玻片干燥除去。往每個組織切片加入連接液(也稱為二抗或生物素化的抗兔或抗鼠)，并在室溫下在濕度箱中孵育25分鐘。兔、大鼠和小鼠二抗(例如，抗Ig-M，抗Ig-G)可從Dako公司(Carpinteria，CA)獲得，并以約1:600稀釋來使用。使用含有PBS的塑料擠瓶并浸沒入PBS浴2分鐘來洗滌玻片。將過量的PBS從每個玻片干燥除去。
[0097]根據生產商的指南(Vector Laboratories)來將信號進行顯影處理。往組織切片中加入抗生物素蛋白-生物素復合物(ABC)溶液，并在濕度箱中孵育25分鐘。使用含有PBS的塑料擠瓶并浸沒入PBS浴中的架子2分鐘來洗滌玻片。將架子浸沒入二氨基聯苯胺(DAB)色原中6分鐘，然后浸沒在流水中，輕輕洗滌4分鐘。在室溫下，將組織切片用蘇木精復染約15秒至90秒(染色時間將取決于蘇木精的使用年限)。將玻片在流水下洗滌3分鐘，以除去過量的復染劑，在從85%酒精到純酒精的酒精浴中脫水(每個中約10秒鐘)，在二甲苯中透明，并蓋玻片。
[0098]除了常用的組織化學染色(例如，H&E和三色染色)，還可實施細胞角蛋白、ER、PR、Her2、E-鈣粘蛋白、p63、PSA、EMA, HCA, RCA、AFP、HCG, CD10、CD30、CD31、CD45、CD68 和D2-40抗原的免疫組織化學染色。
[0099]實施例5:從處理過的組織切片提取DNA
[0100]將來自處理過的組織的固體塊的兩個石蠟切片(每個約5-10 μ m)用一次性刀片切碎。將它們放在1.5ml的微量離心管中，加入800μ I的二甲苯，并通過渦旋振蕩器混合，加入400 μ I純乙醇，并通過渦旋振蕩器混合。在微量離心機中將微量離心管離心處理5min,倒出上清液。往沉淀物中加入800 μ I純乙醇，并且通過渦旋振蕩器混合。
[0101]離心之后倒出上清液，然后往沉淀物中加入100 μ I清潔劑和蛋白酶K溶液(1%的ΝΡ40或Triton Χ-100,2.4μ I的2.5mg/ml的蛋白酶K)，在55°C孵育一小時。通過95°C孵育10分鐘來使蛋白酶K失活。在微量離心機中離心5分鐘后，收集含有DNA的上清液。該材料準備用于PCR。它可以被沉淀和/或進一步提取，如果打算進行Southern印跡。可能需要更多的組織切片，以獲得足夠的DNA以用于不涉及擴增的分析。對于擴增，則需要較少的切片。
[0102]實施例6:從處理過的鑄造切片提取RNA
[0103]將來自處理過的組織的固體塊的十個石蠟切片(每個約5-10 μ m)用一次性刀片切碎。將它們放在50ml的離心管中，用20ml的二甲苯脫蠟。將余下的組織用純酒精洗滌30分鐘兩次。將組織以0.5gm/ml的濃度懸浮在含有4M硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉pH7.0、
0.5%的N-十二烷基肌氨酸和0.1M的2-巰基乙醇的溶液中。通過渦旋振蕩器混合該溶液，通過穿過18至22G (gauge，規格)的注射器針頭來切取DNA。
[0104] 將含RNA溶液小心地鋪在5ml離心管(Sorvall)中2.8ml的5.7M CsCl上，通過在Beckman L8-53超速離心機、SW55Ti轉子，在18°C下以35000rpm的轉速離心14小時來沉積RNA。小心地移去最上層的部分，以在離心管的底部留下RNA沉淀。將沉淀用不含RNA酶的水在微量離心管(Eppendorf)中重懸，將微量離心管以HOOOrpm的轉速離心10分鐘。留下含有RNA的上清液，測量紫外(UV)吸收值:IOD28tZcm的消光系數預計相當于約40 μ I/ml的RNA，并且OD26tZOD28tl的比應在約1.8和約2.0之間。通過變性膠電泳來分離18S和28S rRNA帶。18S和28S rRNA條帶以預期的比例出現并沒有降解表示RNA純化的質量良好。
[0105]在表述數值范圍時,應注意,也描述了在范圍之內的所有值(例如，一至十還包括在一和十之間的每個整數值，以及諸如二至十、一至五和三至八的所有中間范圍)。用語“約”可指與數量值的測量或變化性相關的統計學不確定性，本領域的技術人員將理解它并不影響本發明的操作或其可專利性。
[0106]在權利要求的含義內和其法律等價物的范圍內的所有修改和替換將包括在其范圍內。使用連接詞“包括”的權利要求允許包括將在所述權利要求的范圍內的其他元素；本發明還通過使用連接短語“主要由……構成”(即允許包括將在權利要求的范圍內的其他元素，如果它們不實質上影響本發明的操作)和“由……構成”(即除了通常與本發明相伴的雜質或不重要的活動之外，只允許在權利要求中所列的元素)而非“包括”用語的這些權利要求來描述。可使用這三種連接用語中任意項來主張本發明。
[0107]應理解，在本說明書中所描述的元素不應理解為對所主張的發明的限制，除非在權利要求書中有明確說明。因此，所授權的權利要求是確定法律保護范圍的基礎而非對權利要求作曲解的說明書中的限定。相反，現有技術不包括可以預見本發明或者破壞本發明新穎性的【具體實施方式】，從這個意義上來說現有技術明顯不包括本發明。
[0108]此外，在權利要求的各限定之間或之中沒有特別的關系，除非這種關系是在權利要求中明確指出的(例如，在產品權利要求中的成分的排列或在方法權利要求中的步驟的順序并非對權利要求的限制，除非明確指出是限制性的)。在本發明中公開的個體元素的所有可能的組合和排列被認為是本發明的各個方面。類似地，本發明的說明書的概括被認為是本發明的一部分。
[0109]從上所述，對本領域技術人員來說將是顯而易見的是本發明可以不偏離其精神或實質性特征的其他特定形式體現。所述的實施方式應認為是解釋性的，而非限制性的，因為本發明所提供的法律包括的范圍將被所附的權利要求書而非本說明書來指明。
【權利要求】
1.一種用于處理來自于實體組織的標本的系統，所述系統包括: (a)用來硬化標本的硬化模塊，所述硬化模塊包括(i)具有形為回音廊的內部的第一腔室；(ii)當閉合時關閉第一腔室，對微波輻射無透過性，當開啟時連通第一腔室的第一蓋子；(iii)將化學煙霧和蒸發保持第一腔室的內部的第一墊圈；以及(iv)將微波能量傳遞到第一腔室的內部的輻射源；其中所述標本在回音廊中與化學混合物接觸； (b)用于浸滲硬化過的標本的浸滲模塊，所述浸滲模塊包括(i)具有能夠提供相對于外部降低的壓力的內部的第二腔室；(ii)當閉合時關閉第二腔室，當開啟時連通第二腔室的第二蓋子；(iii)保持第二腔室的內部和外部之間壓差的墊圈；(iv)至少將第二腔室的內的壓力降低到小于I巴的泵；以及(V)將熱能傳輸至第二腔室的內部的加熱器；其中，硬化的標本與熔化的基質在腔室中接觸；以及 (c)用于固化包含硬化及浸滲過的標本的塊的包埋模塊，所述包埋模塊包括從所述塊傳輸熱能的冷卻器。
2.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述硬化模塊進一步包括第一攪拌器，所述第一攪拌器可為通氣裝置，以在所述回音廊中促進化學混合物與標本之間的溶液交換。
3.根據權利要求1或2所述的系統，其特征在于，所述浸滲模塊進一步包括第二攪拌器，其可為循環壓力的閥門，以在腔室中促進在熔化的基質和標本之間的溶液交換。
4.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述標本實質上被化學混合物、微波能量，或者這兩者硬化。
5.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述標本實質上被浸滲，然后再用相同的基質包埋在塊中。
6.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，輻射源將第一腔室中的化學混合物保持在高于約45°C、高于約50°C、高于約55°C、高于約60°C、低于約60°C、低于約65°C、低于約70°C、低于約75°C或在其間任何范圍內的溫度下。
7.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，其中腔室中的壓力高于約0.0Ol巴、高于約0.01巴、高于約0.1巴、低于約0.2巴、低于約0.3巴、低于約0.4巴、低于約0.5巴、低于約I巴，或者為其間任何范圍內的壓力。
8.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，加熱器將第二腔室中的熔化的基質保持在高于約55°C、高于約60°C、高于約65°C、低于約65°C、低于約70°C、低于約75°C、低于約80°C、低于約85°C，或在其間任何范圍內的溫度下。
9.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，將冷卻器保持在低于約-50°C、低于約-25°C、低于約(TC、低于約+5°C、高于約-200°C、高于約-100°C、高于約-50°C、高于約_25°C，或其間任何范圍內的溫度下。
10.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，進一步包括至少連接硬化模塊和浸滲模塊、浸滲模塊和包埋模塊，或硬化、浸滲和包埋模塊的運送裝置。
11.根據權利要求10所述的系統，其特征在于，所述運送裝置包括連接連續模塊的軌道或者電樞。
12.根據權利要求10或11所述的系統，其特征在于，進一步包括具有能讓溶液在標本和混合物或基質之間交換的孔的多個載體，其中每個標本裝入多個載體中的一個，每個載體可逆地與運送裝置相連，使得成批的載體可以連續地被處理。
13.根據權利要求10至12中任一項所述的系統，其特征在于，進一步包括組織標本進入系統，然后被運輸至硬化模塊的起始模塊。
14.根據權利要求10至13中任意一項所述的系統，其特征在于，進一步包括終止模塊，包埋的標本從包埋模塊運輸至所述終止模塊，然后等待被收集。
15.一種用于處理來自于實體組織的標本的方法，包括: (a)在回音廊中硬化標本，其 中所述標本與化學混合物和微波能量接觸； (b)在真空下將標本進行浸滲，其中標本與熔化的基質和熱能接觸；以及 (C)將標本包埋在塊中，將所述塊固化，其中的固體塊被切片，用于手術中組織學檢測。
16.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，進一步包括將主體體外的新鮮組織切割以提供標本，其中最初將標本在化學混合物中硬化，所述化學混合物可與在切割期間處理時所用的化學混合物相同或不同。
17.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，標本的厚度小于約1mm，小于約0.8mm,或小于約0.6mm。
18.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述化學混合物為包括(i)至少一種可為丙酮的酮以及(ii)至少一種可為礦物油或松樹油的油的非水溶液。
19.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述化學混合物進一步包括至少一種表面活性劑，其可為二甲亞砜。
20.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述基質包括至少一種石蠟。
21.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述標本大體上被化學混合物、微波能量或者這兩者硬化。
22.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述標本大體上被浸透，然后再使用相同基質包埋在塊中。
23.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述化學混合物在高于約45°C、高于約50°C、高于約55°C、高于約60°C、低于約60°C、低于約65°C、低于約70°C、低于約75°C，或其間任何范圍內的溫度下。
24.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述真空為高于約0.001巴、高于約0.01巴、高于約0.1巴、高于約0.5巴、高于約0.6巴、高于約0.7巴、低于約0.2巴、低于約0.3巴、低于約0.4巴、低于約0.5巴、低于約0.6巴、低于約0.7巴、低于約0.8巴、低于約0.9巴或低于約I巴，或者其間任何范圍內的壓力。
25.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，熔化的基質的溫度為高于約55°C、高于約60°C、高于約65°C、低于約65°C、低于約70°C、低于約75°C、低于約80°C、低于約85°C，或其間任何范圍內的溫度。
26.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，將塊通過在低于約-50°C、低于約-25°C、低于約(TC、低于約+5°C、高于約-200°C、高于約-100°C、高于約-50°C、高于約_25°C，或其間任何范圍內的溫度下冷卻來固化。
27.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，將標本至少部分地或完全地人工處理。
28.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，將標本至少部分地或完全地自動處理。
29.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，在標本與化學混合物和微波能量接觸少于約10分鐘、少于約8分鐘、少于約6分鐘、多于約2分鐘、多于約4分鐘、多于約6分鐘或者期間任何范圍內的時間之后，標本大體上被硬化。
30.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，在標本與熔化的基質和熱能接觸少于約10分鐘、少于約8分鐘、少于約6分鐘、多于約2分鐘、多于約4分鐘、多于約6分鐘或者期間任何范圍內的時間之后，標本大體上被浸透。
31.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，在標本被固化少于約5分鐘、少于約4分鐘、少于約3分鐘、多于約I分鐘、多于約2分鐘、多于約3分鐘或者期間任何范圍內的時間之后，可切塊。
32.一種用于切割實體組織的模塊，包括:(a)底座，其包括具有長度和寬度的接收孔、大體上平坦的頂端表面，包括至少兩個延伸到頂部表面以上并在期間形成至少兩個狹縫的刀鞘的刀片導軌，和在接收孔旁邊的鄰近孔；以及(b)支持物，其具有與接收孔的長度和寬度大體上相同的長度和寬度，以使得支持物能很好地配合于接收孔內，所述支持物包括未延伸到底座的頂部 表面以上的邊緣，具有由邊緣形成的深度為約0.6mm的接收組織的凹陷，以及粗糙的大體上平坦的底部表面；其中，支持物的底部表面和底座的頂部表面大體上彼此平行；所述狹縫至少長為支持物的長度，至少以支持物的寬度分開。
33.根據權利要求32所述的模塊，其特征在于，進一步包括包含頂部手柄和底部的粗糙表面的組織固定器。
34.根據權利要求1至14中任意一項所述的系統，其特征在于，進一步包括權利要求32或33所述的模塊。
35.一種切割工具，其包括把手、固定器和可移動的刀片；其中所述固定器具有兩個相反的末端，所述固定器的一個末端永久固定在把手上，所述固定器的相反的末端具有在其間形成的縫隙，刀片被螺栓固定在縫隙之中，并且螺栓沿與刀片和把手平行的平面相垂直的方向行進。
【文檔編號】C12M1/42GK103975229SQ201280058253
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2012年9月28日 優先權日:2011年9月29日
【發明者】阿佐里徳·R·莫拉萊斯 申請人:邁阿密大學