纖維素分解酶組合物及其用途

纖維素分解酶組合物及其用途
【專利摘要】本發明涉及包含纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)的酶組合物，和所述纖維素分解酶組合物用于水解乙酰化纖維素材料的用途。最終，本發明亦涉及使用本發明的纖維素分解酶組合物從乙酰化纖維素材料產生發酵產物的工藝。
【專利說明】纖維素分解酶組合物及其用途
[0001]對于在聯邦資助的研究和開發下完成的發明的權利的聲明
[0002]該發明是在由能源部授予的批準號(Grant No):DE-EE0002870下以政府支持完成的。政府在該發明中具有一定權利。
[0003]涉及序列表
[0004]本申請包含計算機可讀形式的序列表，其通過提述并入本文。
[0005]發明背景
【技術領域】
[0006]本發明涉及纖維素分解酶組合物；使用此種纖維素分解組合物水解乙酰化纖維素材料的方法；和使用本發明的纖維素分解酶組合物產生發酵產物的工藝。
[0007]將含纖維素原料(cellulosic feedstock)轉化為乙醇具有以下優勢:大量原料現成可用，避免燃燒或填埋材料是理想的，以及乙醇燃料的清潔性。木材、農業殘余物、草本作物和城市固體廢物被認為是用于乙醇生產的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。一旦將纖維素轉化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母發酵成乙醇。
[0008]纖維素材料的酶促水解的速率和程度取決于多種結構特征如木質素含量，乙酰含量，和結晶度。在天然植物中，半纖維素材料如木糖具有部分的天然乙酰化程度，而纖維素材料(纖維素)則不具備。然而，當對纖維素材料進行用例如酸如乙酸的原材料，則發生乙酰化。此種纖維素材料的乙酰化影響酶促可消化性。
[0009]W02005/047499 公開了煙曲霉(Aspergillus fumigatus) β -葡糖苷酶及其基因。
[0010]W02006/078256公開了煙曲霉GHlO木聚糖酶。
[0011]W02008/151079公開了用于降解纖維素材料的組合物。
[0012]W02009/042846公開了來源于土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
[0013]W02011/041397公開了具有纖維素分解增強活性的青霉屬菌種(Penicilliumsp.)GH61 多肽。
[0014]W02011/057140公開了煙曲霉纖維二糖水解酶I ;煙曲霉纖維二糖水解酶II ;和煙
曲霉木糖苷酶。
[0015]存在對于可更有效地水解乙酰化纖維素材料的纖維素分解酶組合物的需求。

【發明內容】

[0016]本發明涉及包含纖維素分解活性的酶組合物；其用于水解乙酰化纖維素材料的用途；和使用本發明的纖維素分解酶組合物產生發酵產物的工藝。
[0017]在第一個方面，本發明涉及包含纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)的酶組合物。
[0018] 在第二個方面，本發明涉及水解乙酰化纖維素材料的方法，其包括對所述乙酰化纖維素材料施以本發明的酶組合物，所述酶組合物包含纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
[0019]在一個實施方案中,所述乙酰木聚糖酯酶來源于梭孢殼屬(Thielavia),如土生梭孢霉的菌株，如作為SEQ 10勵:2公開于冊2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或與W02009/042846中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90 %，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0020]在第三個方面，本發明涉及從乙酰化纖維素材料產生發酵產物的工藝，其包括:
[0021](a)通過對所述乙酰化纖維素材料施以本發明的酶組合物或根據本發明的水解方法水解所述材料；
[0022](b)使用發酵生物進行發酵；和
[0023](C)任選地回收所述發酵產物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1顯示在11日水解之后的葡萄糖產量(yield) (% ) ?
[0025]圖2顯示在11日水解之后的木糖產量(％ )。
[0026]圖3顯示來自經預處理的乙酰化玉米稻桿衆(corn stover pulp) (5%固形物，ρΗ5.2,50°C,6mg蛋白/g纖維素)的結果。
[0027]定義
[0028]乙酰化纖維素材料:術語“乙酰化纖維素材料“指與天然纖維素材料相比具有更高程度的乙酰化的纖維素材料。在一個實施方案中，靶纖維素底物的乙酰化％可高至30%(每糖單元平均乙酰基數)。在一個實施方案中，所述乙酰化纖維素材料為0.1-30%，如
0.5-20 %,優選1-10 %,如約5-10 %,如約8 %乙酰化。乙酰化可根據Technical ReportNREL/TP-510-42618 (2011年7月重新修訂)中所述的NREL步驟和如“材料和方法”部分中所述來確定。
[0029]纖維素材料:術語“纖維素材料”意指包含纖維素的任何材料。纖維素材料的初生細胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纖維素,其次最豐富的是半纖維素,而第三是果膠。次生細胞壁(secondary cell wall)在細胞停止生長后產生,其同樣含有多糖并通過共價交聯至半纖維素的聚合木質素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈i3-(l_4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復雜分支結構。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩定細胞壁基質。
[0030]纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，農業殘余物、草本材料(包括能量作物)、城市固體廢物、紙漿與造紙廠殘余物、廢紙和木材(包括林業殘余物)(參見，例如，Wiselogel等，1995，于Handbookon B1ethanol (Charles E.Wyman 編),pp.105-118, Taylor&Francis, Washington D.C.；Wyman,1994，B1resource Technology50:3-16 ；Lynd,1990，Applied B1chemistry andB1technology24/25:695-719 ；Mosier 等，1999，Recent Progress in B1convers1n ofLignocellulosicsj 于 Advances in B1chemical Engineering/B1technology, T.Scheper主編，Volume65, pp.23-40，Springer-Verlag, New York)。在本文中應理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質中包含木質素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優選的方面，纖維素材料是任何生物質材料。在另一個優選的方面，所述纖維素材料是木素纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質素。
[0031]在一個方面，纖維素材料是農業殘余物。在另一個方面，纖維素材料是草本材料(包括能量作物)。在另一個方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個方面，纖維素材料是廢紙。在另一個方面，纖維素材料是木材(包括林業殘余物)。
[0032]在另一個方面，纖維素材料是蘆竹(arundo)。在另一個方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個方面，纖維素材料是竹材。在另一個方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個方面，纖維素材料是橙皮。在另一個方面，纖維素材料是稻桿。在另一個方面，纖維素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一個方面，纖維素材料是麥桿。
[0033]在另一個方面，纖維素材料是白楊。在另一個方面，纖維素材料是桉樹。在另一個方面，纖維素材料是揪樹。在另一個方面，纖維素材料是松樹。在另一個方面，纖維素材料是楊樹。在另一個方面，纖維素材料是云杉。在另一個方面，纖維素材料是柳樹。
[0034]在另一個方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個方面，纖維素材料是細菌纖維素。在另一個方面，纖維素材料是棉線頭(cotton linter)。在另一個方面，纖維素材料是濾紙。在另一個方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面，纖維素材料是磷酸處理的纖維素。 [0035]在另一個方面，纖維素材料是水生生物質。如用于本文中，“水生生物質”意指在水生環境中由光合作用過程產生的生物質。水生生物質可為藻類、挺水植物(emergentplant)、浮葉植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
[0036]纖維素材料可以按原樣(as is)使用或進行預處理，使用本領域已知的常規方法，如本文所述。在一個優選的方面，預處理纖維素材料。
[0037]乙酰木聚糖酯酶:術語“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基從聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸ct -萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本發明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01 % TWEEN?20 (聚氧乙烯山梨坦單月桂酸酯)的50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM乙酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對硝基苯酹陰離子(p-nitrophenolate an1n)的酶量。
[0038]β -葡糖苷酶:術語“ β -葡糖苷酶”意指β -D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase) (E.C.N0.3.2.1.21),其催化末端非還原 β -D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。就本發明而言，葡糖苷酶根據Venturi等,2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophiIum var.coprophiIum:product1n, purificat1n and some b1chemical properties, J.BasicMicrob1l.42:55-66的方法使用對硝基苯基-β _D_葡糖吡喃糖苷作為底物確定。一個單位的β-葡糖苷酶定義為在25°C，pH4.8，在含有0.01(%TWEEN? 20 (聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯)的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β -D-葡糖吡喃糖苷每分鐘產生1.0微摩爾對硝基苯酚陰離子。
[0039]β -木糖苷酶:術語“ β -木糖苷酶”意指β -D木糖苷木糖水解酶(β -D-xy1sidexylohydrolase) (E.C.3.2.1.37)，其催化短 β (I — 4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續的D-木糖殘基。就本發明而言，一個單位的β_木糖苷酶定義為在40°C，pH5從ImM對硝基苯基-β -D-木糖苷作為底物在含有0.01 % TWEEN? 20的10mM檸檬酸鈉中每分鐘產生1.0 μ mo I對硝基苯酚陰離子。
[0040]纖維二糖水解酶:術語“纖維二糖水解酶”意指1，4- β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶(I, 4-beta-D-glucan cellob1hydrolase) (E.C.N0.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維寡糖，或任何包含β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradat1n:New insightinto the funct1n of cellob1hydrolases, Trends in B1technologyl5:160—167 ；Teeri等,1998, Trichoderma reesei cellob1hydrolases:why so efficient on crystallinecellulose ?，B1chem.Soc.Trans.26:173-178)。 根據 Lever 等，1972，Anal.B1chem.47:273-279 ；van Tilbeurgh 等，1982，FEBS Letters 149:152-156 ；vanTilbeurgh 和 Claeyssens, 1985,FEBS Lettersl87:283-288 ；以及 Tomme 等，1988，Eur.J.B1chem.170:575-581描述的方法確定纖維二糖水解酶活性。在本發明中，Tomme等的方法可用于確定纖維二糖水解酶活性。
[0041]纖維素分解酶或纖維素酶:術語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種(例如幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其組合。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括:(I)測量總纖維素分解活性，和(2)測量單獨的纖維素分解活性(內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如 Zhang 等,Outlook for cellulase improvement:Screening and select1nstrategies, 2006, B1technology Advances24:452-481 所綜述的。總纖維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括Whatman N0.1濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經預處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用Whatman N0.1濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由Internat1nal Un1n of Pureand Applied Chemistry(IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, PureApp1.Chem.59:257-68)確立的。
[0042]就本發明而言，纖維素分解酶活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進行的纖維素材料水解的增加來確定:l-50mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素(或其它經預處理的纖維素材料)在合適的溫度，例如50°C、55°C或60°C進行3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解相比較。通常條件為:1ml反應液，經洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH5，ImM MnSO4,50°C、55°C或60°C，72小時，通過AMINEX?HPX-87H 柱(B1-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)進行糖分析。
[0043]內切葡聚糖酶:術語“內切葡聚糖酶”意指內切-1，4-(1，3 ;l，4)-13_D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-Ι, 4_ β -D-glucan4-glucanohydrolase) (E.C.3.2.1.4),其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-β-D-糖苷鍵、混合的β_1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的β-1，4鍵的內水解(endohydrolysis)。內切葡聚糖酶活性可通過測量底物粘度的減少或由還原糖測定法(Zhang等，2006，B1technologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發明而言，根據Ghose, 1987, Pureand App1.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內切葡聚糖酶活性。
[0044]家族61糖苷水解酶:術語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定義為根據 Henrissat B., 1991, A classificat1n of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities, B1chem.J.280:309-316,及 Henrissat和 Bairoch,1996，Updating the sequence-based classificat1n of glycosylhydrolases, B1chem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。該家族中的酶原先基于在一個家族成員測量到的非常弱的內切-1，4-β-D葡聚糖酶活性而歸類為糖苷水解酶家族。這些酶的結構和作用模式是非經典的，且它們無法視為真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于當與纖維素酶或纖維素酶的混合物一同使用時，其增強纖維素分解的能力，它們被保留在CAZy分類中。
[0045]半纖維素分解酶或半纖維素酶:術語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(例如幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如 Shallom 和 Shoham, 2003, Microbial hemicellulases.Current Opin1n InMicrob1logy, 6(3):219-228)。半纖維素酶是植物生物質降解中的關鍵成分。半纖維素酶的實例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支化和直鏈多糖的混雜集團，這些多糖通過氫鍵鍵合于植物細胞壁中的纖維素微纖維，將其交聯為魯棒(robust)的網絡。半纖維素亦共價地附于木質素，與纖維素一同形成高度復雜的結構。半纖維素的可變的結構和組織形式需要許多酶的協同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH )，或水解乙酸或阿魏酸側基的酯連接的糖酯酶(CE)。這些催化模土夾，基于其一級結構的同源性，可指派為GH和CE家族。一些家族，具有總體上類似的折疊，可進一步歸類為宗族(clan)，以字母標記(例如，GH-A)。最具信息性和最新的這些和其他糖活性酶的分類可在Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)數據庫獲得。半纖維素分解酶活性可根據 Ghose 和 Bisaria, 1987，Pure&Appl.Chem.59:1739-1752 在合適的溫度，例如50。。、55。。或60。。，和pH，例如5.0或5.5進行測量。
[0046]具有纖維素分解增強活性的多肽:術語“具有纖維素分解增強的多肽”意指催化具有纖維素分解活性的酶對纖維素材料的水解的增強的GH61多肽。就本發明而言，通過測量來自由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強活性:l_50mg總蛋白/g PCS中纖維素，其中總蛋白包含50-99.5% w/w的纖維素分解酶蛋白，及0.5-50% w/w的具有纖維素分解增強活性的GH61多肽的蛋白質，在合適的溫度，例如50°C、55°C或60°C和合適的pH，例如5.0或5.5歷時1-7天，與用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強活性(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中纖維素)所進行的對照水解相比。在一個方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根據W002/095014在米曲霉中重組產生)或者總蛋白質量的2_3%的煙曲霉β-葡糖苷酶(如W02002/095014所述在米曲霉中重組產生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLAST? 1.5L(Novozymes A/S, Bagsvserd, Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。
[0047]具有纖維素分解增強活性的GH61多肽通過降低達到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優選降低至少
1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。
[0048]序列同一性:參數“序列同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。
[0049]就本發明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMB0SS:The European Molecular B1logy Open Software Suite, Rice等,2000, Trends Genet.16:276-277)，優選5.0.0版或更高版本的Needle程序中所執行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J.Mol.B1l.48:443-453)來測定。使用的參數為缺口罰分(gap penalty) 10,缺口延伸罰分(gap extens1n penalty) 0.5和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性(longestidentity)”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下:
[0050](同樣的殘基X100)/(比對長度一比對中缺口的總數)
[0051]就本發明而言，兩個核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS: The European Molecular B1logy Open Software Suite, Rice 等，2000,見上文)，優選5.0.0版或更高版本的Needle程序中所執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970，見上文)來測定。使用的參數為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下:
[0052](同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數)
[0053]變體:術語“變體”意指在一個或多個(例如幾個)位置包含改變，即取代、插入和/或缺失的具有酶活性的多肽。取代意指將占據某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占據某位置的氨基酸；而插入意指在鄰接并緊接著占據某位置的氨基酸之后添加氨基酸。
[0054]木聚糖酶:術語“木聚糖酶”意指1，4- β -D-木聚糖-木糖水解酶(I, 4-β -D-xylan-xylohydrolase) (E.C.3.2.1.8),其催化木聚糖中 I, 4_β -D-木糖苷鍵的內水解。就本發明而言，木聚糖酶活性是使用0.2% AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6在200mM磷酸鈉pH6緩沖液中從作為底物的0.2% AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產生1.0微摩爾天青精。
[0055]發明詳述
[0056]本發明涉及纖維素分解酶組合物；其用于水解乙酰化纖維素材料的用途；和使用本發明的纖維素分解酶組合物產生發酵產物的工藝。
[0057] 本發明發現包含纖維素分解制備物的酶組合物增強乙酰化纖維素材料的轉化。更具體而言，本發明人令人意想不到地發現當在纖維素分解制備物中包含乙酰木聚糖酯酶(AXE)，特別是來源于土生梭孢霉的乙酰木聚糖酯酶時，經預處理的乙酰化纖維素材料的轉化得到增強。例如，實施例1顯示乙酰木聚糖酯酶(AXE)當用于經預處理的乙酰化玉米秸桿漿的纖維素分解水解時，與用纖維素分解組合物但不用乙酰木聚糖酯酶(AXE)時相比，增強了葡萄糖和木糖產量。
[0058]本發明的酶組合物
[0059]在第一個方面，本發明涉及酶組合物，其包含纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
[0060]在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物來源于木霉屬(Trichoderma)的菌株，如里氏木霉(Humicola insolens)的菌株；腐質霉屬(Humicola)的菌株，如特異腐質霉(Humicola insolens)的菌株，和/或金孢子菌屬(Chrysosporium)的菌株，如Chrysosporium Iucknowense的菌株。在一個優選實施方案中，所述纖維素分解制備物來源于里氏木霉的菌株。
[0061]纖維素分解制備物
[0062]所述纖維素分解制備物可包含一種或多種下述多肽，如酶:具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，CBHI，CBHII，或其兩種、三種、四種、五種、或六種的混合物。
[0063]在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽和葡糖苷酶。
[0064]在另一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，和木聚糖酶。 [0065]在另一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶和β-木糖苷酶。
[0066]在另一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，和CBHI。
[0067]在另一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，CBHI和CBHII。
[0068]其它酶，如內切葡聚糖酶，亦可包含于所述纖維素分解制備物。
_9] g -葡糖苷酶
[0070]在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物可包含一種或多種葡糖苷酶。在一個實施方案中，所述β -葡糖苷酶可為來源于曲霉屬(Aspergillus),如米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株的酶，如公開于W02002/095014的酶，或公開于W02008/057637的具有β -葡糖苷酶活性的融合蛋白，或來源于煙曲霉的酶，如公開于TO2005/047499的酶，或煙曲霉β-葡糖苷酶變體。在一個實施方案中，在水解過程中亦可存在或添加葡糖苷酶。所述葡糖苷酶可為煙曲霉葡糖苷酶(例如W02005/047499的SEQ ID NO: 2)或其公開于W02012/044915 (通過提述并入本文)的變體，如具有下述取代的變體:F100D，S283G，N456E, F512Y。
[0071]在另一個實施方案中,所述β_葡糖苷酶來源于青霉屬(Penicillium)的菌株,如公開于W02007/019442的巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)的菌株，或木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株。
[0072]具有纖維素分解增強活性的GH61多肽
[0073]在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物可包含一種或多種具有纖維素分解增強活性的GH61。在一個實施方案中，所述酶組合物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽,如來源于嗜熱子囊菌屬(Thermoascus),如桔橙嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的菌株的多肽，如作為SEQ ID NO:2公開于W02005/074656的多肽；或來源于梭孢殼屬，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作為SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8公開于2005/074647的多肽；或來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的多肽，如作為SEQ ID NO: 2公開于W02010/138754的多肽；或來源于源自青霉屬的菌株，如埃默森青霉(Penicilliumemersonii)的菌株的多肽，如公開于W02011/041397的多肽。
[0074]木聚糖酶
[0075]在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物可包含一種或多種木聚糖酶。在一個方面，所述纖維素分解制備物包含木聚糖酶，優選GHlO木聚糖酶，如來源于曲霉屬的菌株，如來自煙曲霉的菌株的酶，如作為Xyl III公開于W02006/078256的酶，或來自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的酶，如作為 SEQ ID NO: 5 公開于 W094/21785 的酶(Xyl II)。
[0076]β木糖苷酶
[0077]在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物可包含一種或多種木糖苷酶。在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含β_木糖苷酶，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的酶，如公開于共同待決的美國臨時申請號61/526，833或PCT/US12/052163(實施例16和17)的酶，或來源于木霉屬菌株，如里氏木霉的菌株的酶，如W02011/057140 中的 SEQ ID NO:58 的成熟多肽。
[0078]CBH I
[0079]在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物可包含一種或多種CBH I (纖維二糖水解酶I)。在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含纖維二糖水解酶I (CBHI)，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的酶，如公開于W02011/057140中的SEQ ID NO: 2的Cel7ACBHI，或來源于木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的酶。
[0080]CBH II
[0081]在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物可包含一種或多種CBH II (纖維二糖水解酶II)。在一個實施方案中，纖維二糖水解酶II (CBHII)，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的酶；或來源于木霉屬，如里氏木霉的菌株，或來源于梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如來自土生梭孢霉的纖維二糖水解酶II CEL6A。
[0082]乙酰木聚糖酯酶(AXE)
[0083]除了纖維素分解制備物之外，所述酶組合物還包含乙酰木聚糖酯酶(AXE)。在一個實施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作為SEQ ID勵:2公開于冊2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或與W02009/042846中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0084]在另一個實施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于曲霉屬的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作為SEQ 10勵:2公開于冊2010/108918的酶，或與W02010/108918中的SEQID NO: 2具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選95%，如至少96%，如97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0085]在另一個實施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于曲霉屬的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如棘孢曲霉CBS101.43，如作為SEQ ID NO:5公開于W095/02689的酶，或與W095/02689中的SEQ ID NO: 5具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選95%，如至少96%，如97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0086]在一個實施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于腐質霉屬的菌株,如特異腐質霉的菌株，如作為SEQ ID NO: 2公開于W02009/073709或作為本文中的SEQ ID NO: 3的酶，或與W02009/073709的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:3具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選95%，如至少96%，如97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0087]在一個實施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于曲霉屬的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作為SEQ ID N0:2公開于W02010/108918或作為本文中的SEQ ID NO: 2的酶，或與TO2010/108918的SEQ ID N0:2或本文中的SEQ ID N0:2具有至少80%，如至少85%，如至少90 %，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0088]在一個優選實施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶來源于梭孢殼屬的菌株，更優選土生梭孢霉的菌株，甚至更優選作為SEQ IDN0:2公開于W02009/042846或本文中SEQ ID NO:1的酶。
[0089]纖維素分解制備物
[0090]如上所述，所述纖維素分解制備物可包含多種不同的多肽，如酶。 [0091]在一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656)，米曲霉葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中的Xyl
II)。
[0092]在另一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656中的SEQ ID NO: 2)，煙曲霉β -葡糖苷酶(W02005/047499中的SEQ ID NO: 2)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785 中公開的 Xyl II)。
[0093]在另一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656中的SEQ ID NO: 2)，煙曲霉β -葡糖苷酶(W02005/047499中的SEQ ID NO: 2)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中公開的Xyl II)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)為來源于土生梭孢霉、作為 SEQ ID Ν0:2 公開于 W02009/042846 或本文中的 SEQ ID NO:1 的酶，或與 W02009/042846中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0094]在另一個實施方案中，所述纖維素分解制備物包含里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含公開于W02011/041397的具有纖維素分解增強活性的埃默森青霉GH61多肽，煙曲霉β-葡糖苷酶(W02005/047499中的SEQ ID NO: 2)和煙曲霉木聚糖酶(W02006/078256中的Xyl III)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)為來源于土生梭孢霉、作為SEQ ID NO: 2 公開于 W02009/042846 或本文中的 SEQ ID NO:1 的酶，或與 W02009/042846 中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95 %，如至少96 %，如至少97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0095]本發明的酶組合物可為任何適于使用的形式，例如，去除或未去除細胞的粗發酵液，含或不含細胞碎片的細胞裂解物，半純化或純化的酶組合物，或宿主細胞，例如木霉屬宿主細胞，作為酶的來源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無粉塵的顆粒，液體，穩定化液體或穩定化受保護的酶。液體酶組合物可根據確立的工藝，例如通過添加穩定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機酸來穩定化。
[0096]纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶之間的比例
[0097]根據本發明，將乙酰木聚糖酯酶和纖維素分解制備物以使得乙酰化木素纖維素材料的水解得到改善的比例混合。
[0098]乙酰木聚糖酯酶的最適量取決于幾個因素，其包括但不限于，組分纖維素分解和/或半纖維素分解酶的混合物、乙酰化纖維素材料、乙酰化纖維素材料的濃度、纖維素材料的預處理、溫度、時間、PH和包括發酵生物體(例如，用于同步糖化和發酵的酵母)。
[0099]在一個方面，添加至乙酰化纖維素材料的纖維素分解制備物的有效量是約0.01至約50.0mg,例如約I至約25mg,如約2至約1mg,如約4至約8mg蛋白每g/DS的纖維素材料。
[0100]在一個實施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)以例如約0.01至約1mgJn 0.05至約5mg,如0.1至約4mg酶蛋白每DS的纖維素材料的量使用。
[0101]在一個實施方案中，纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之間的比例是500:1至1:1，如50:1至2:1，如約4:1的范圍。
[0102]在一個優選實施方案中，所述纖維素分解制備物來源于里氏木霉，且所述乙酰木聚糖酯酶來源于梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作為SEQ ID NO:2公開于2009/042846 或本文中的 SEQ ID NO:1 的酶，或與 W02009/042846 中的 SEQ ID NO: 2 或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶，兩者比例為500:1至1:1，如50:1至2:1，如約4:1。
[0103]本發明的水解方法
[0104]纖維素材料天然并非乙酰化的。然而，當對纖維素材料進行例如用酸，如乙酸的原材料，則發生乙酰化。此種乙酰化影響在水解過程中纖維素材料的酶促可消化性。在水解(亦稱作糖化)過程中，將乙酰化纖維素材料水解以將纖維素和/或半纖維素降解為可發酵的糖，如葡萄糖，纖維二糖，木糖，木酮糖，阿拉伯糖，甘露糖，半乳糖，和/或可溶性寡糖。根據本發明，水解可使用本發明的酶組合物酶促進行。
[0105]在第二個方面，本發明涉及水解乙酰化纖維素材料的方法，其包括對乙酰化纖維素材料施以纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。在一個實施方案中，所述乙酰化纖維素材料是經預處理的纖維素材料。
[0106]乙酰化纖維素材料
[0107]乙酰化纖維素材料指與天然纖維素材料相比具有較高乙酰化程度的纖維素材料。所述乙酰化纖維素材料可為包含纖維素材料(如上所定義)的植物材料。通常乙酰化纖維素材料亦包含半纖維素材料，如木聚糖酶、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖與多種取代基形成復雜支化的結構。[0108]在一個實施方案中，所述乙酰化纖維素材料是植物材料碎片(chip)，植物莖段(stem segment)和/或整個植物莖。在一個實施方案中，所述纖維素材料選自下組:蘆竹、甘鹿洛、竹、玉米穗軸、玉米纖維、玉米稻桿、芒屬(miscanthus)、橙皮、稻桿、柳枝稷、麥桿。在一個優選實施方案中，纖維素材料的來源是玉米稻桿、玉米穗軸和/或麥桿。在一個優選實施方案中，所述乙酰化纖維素材料是乙酰化玉米秸桿漿。
[0109]預處理。纖維素材料可以在預處理之前使用本領域中已知的方法進行粒度減小、篩分、預浸泡、潤濕、洗漆和/或調節/調理(condit1ning)。
[0110]可已對所述纖維素材料施以常規的預處理。常規的預處理包括但不限于，蒸汽預處理(伴隨或不伴隨爆炸)、酸預處理如稀酸預處理、熱水預處理、堿性預處理、石灰預處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機溶劑預處理和生物預處理。其它預處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界!120、臭氧、離子性液體和Y輻射預處理。優選酸預
處理。
[0111]優選在水解之前預處理纖維素材料。或者，預處理可以與酶水解同時進行以釋放可發酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。
[0112]術語“化學處理“指能促進纖維素、半纖維素和/或木質素分離和/或釋放的任何化學處理。此種預處理可將晶體纖維素轉化為無定形纖維素。合適的化學預處理工藝的實例包括例如酸預處理如稀酸預處理、石灰預處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)、離子性液體和有機溶劑預處理。優選包括酸預處理的預處理。
[0113]經常在蒸汽預處理之前加入催化劑如H2SO4或SO2 (通常0.3至5 % w/w)，其可減少時間，降低溫度，增加回收率，并改進酶水解(Ballesteros等，2006, Appl.Biοchem.Biοtechno1.1 29-1 32:496-508 ; Varga 等，2004，App 1.B1chem.B1technol.113-116:509-523 ;Sassner 等., 2006, Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。在稀酸預處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時間后閃變至大氣壓。可以用很多反應器設計進行稀酸預處理，例如，活塞流反應器、逆流反應器或連續逆流收縮床反應器(Duff和Murray，1996，見上文；Schell 等,2004,B1resource Technol.91:179-188 ；Lee 等,1999,Adv.B1chem.Eng.B1technol.65:93-115)。
[0114]還可以使用堿性條件下的幾種預處理方法。這些堿預處理包括，但不限于，氫氧化鈉、石灰、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。
[0115]用氧化鈣或氫氧化鈣，在85_150°C的溫度進行石灰預處理，停留時間從I小時到幾天(Wyman 等，2005, B1resource Technol.96:1959-1966 ；Mosier 等，2005, B1resourceTechnol.96:673-686)。W02006/11089UW02006/110899,W02006/110900 和 W02006/110901
公開了使用氨的預處理方法。
[0116]濕法氧化是熱預處理，通常在180-20(TC進行5-15分鐘，加入氧化劑如過氧化氫或過壓氧(Schmidt 和 Thomsen, 1998, B1resource Technol.64:139-151 ；Palonen 等，2004，Appl.B1chem.B1technol.117:1-17 ;Varga 等，2004，B1technol.B1eng.88:567-574 ；Martin 等,2006, J.Chem.Technol.B1technol.81:1669-1677)。預處理優選以1-40%干物質，例如2-30%干物質，或5-20%干物質進行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH經常會增加。[0117]濕法氧化預處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達30%的干物質。在濕爆炸中，在預處理過程中，在一定的停留時間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結束預處理(W02006/032282)。
[0118]氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-150 °C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨將纖維素材料處理5-10分鐘，其中干物質含量可以高達60% (Gollapalli等，2002，Appl.B1chem.B1technol.98:23-35 ;Chundawat 等，2007，B1technol.B1eng.96:219-231 ；Alizadeh 等，2005，Appl.B1chem.B1technol.121:1133-1141 ；Teymouri 等,2005, B1resource Technol.96:2014-2018)。在 AFEX 預處理過程中，纖維素和半纖維素保持相對完整。木質素-糖復合物受切割。
[0119]有機溶劑預處理通過用含水乙醇(40-60 %乙醇)在160-200°C提取30-60分鐘而將纖維素材料去木質素化(Pan等,2005, B1technol.B1eng.90:473-481 ；Pan 等，2006，B1technol.B1eng.94:851-861 ;Kurabi 等，2005，Appl.B1chem.B1technol.121:219-230)。經常加入硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理中，去除大部分半纖維素和木質素。
[0120]在一個方面，化學預處理優選作為酸預處理如稀酸處理，如連續稀酸處理進行。
[0121]酸處理優選使用乙酸進行，但也可以使用其它酸，如硫酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。
[0122]弱酸處理在優選1-5，例如1-4，或1-2.5的pH范圍內進行。在一個方面，酸濃度在優選0.01至，例如0.05至5wt%酸或0.1至2wt%酸的范圍內。將酸與纖維素材料接觸，并在例如優選140-200°C，例如165-190°C范圍內的溫度保持I至60分鐘的時間。
[0123]在另一個方面，預處理發生在含水漿料中。在優選的方面，在預處理過程中纖維素材料以優選10-80wt%，例如20-70wt%* 30-60wt%，如約40wt%的量存在。預處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。
[0124]術語“機械預處理”或“物理預處理”指任何促進顆粒大小減少的預處理。舉例而言，此種預處理可涉及各種類型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如,干磨、濕磨或振動球磨)。
[0125]纖維素材料可經物理(機械)和化學預處理。機械或物理預處理可例如與下述結合:汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)、酸預處理如稀酸或弱酸處理、高溫、高壓處理、輻射(例如微波輻射)，或其組合。在一個方面，高壓指優選約100至400psi，例如約150至約250psi的范圍的壓力。在另一個方面，高溫指約100至300°C，例如約140至約200°C范圍的溫度。在一個優選的方面，機械或物理預處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、使用蒸汽槍水解器系統，例如來自Sunds Defibrator AB, Sweden的SundsHydrolyzer中進行。所述物理和化學預處理可視需要順序進行或同時進行。
[0126]術語“生物預處理”指可以促進纖維素、半纖維素和/或木質素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預處理。生物預處理技術可以包括應用溶解木質素的微生物和 / 或酶(參見，例如，Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of b1mass,于 Handbookon B1ethanol!Product1n and Utilizat1n, Wyman, C.E 編,Taylor&Francis, Washington, DC, 179-212 ；Ghosh 和 Singh, 1993, Physicochemical and b1logical treatmentsfor enzymatic/microbial convers1n of lignocellulosic b1mass, Adv.Appl.Microb1l.39:295-333 ；McMillan, J.D., 1994, Pretreating lignocellulosic b1mass:areview,于 Enzymatic Convers1n of B1mass for Fuels Product1n, Himmel, M.E., Baker, J.0.,和 Overend, R.P.,編，ACS Symposium Series566, AmericanChemical Society, Washington, DC,第 15 章；Gong, C.S.，Cao, N.J.，Du, J.，和Tsao,G.T.,1999,Ethanol product1n from renewable resources,于 Advances inB1chemical Engineering/B1technology, Scheper,T.,編,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,Germany,65:207-241 ；01sson 和 Hahn-Hagerdal, 1996，Fermentat1n oflignocellulosic hydrolysates for ethanol product1n, Enz.Microb.Tech.18:312—331 ；和 Vallander 和 Eriksson,1990, Product1n of ethanol from lignocellulosicmaterials: State of the art, Adv.B1chem.Eng./B1technol.42:63-95)。
[0127]優選的預處理包括化學預處理，物理預處理，或化學預處理和物理預處理。在一個實施方案中，對纖維素材料施以熱機械制衆(thermomechanicalIy pulping)。在一個實施方案中，所述乙酰化纖維素材料已經熱機械制漿。
[0128]在一個實施方案中，所述乙酰化纖維素材料通過預處理，包括酸預處理制備。
[0129]在一個實施方案中，所述乙酰化纖維素材料已通過在高溫、高壓和/或酸預處理下預處理纖維素材料來制備。
[0130]在一個實施方案中，所述酸預處理使用乙酸或其它酸實施。
[0131]在一個實施方案中，所述乙酰化纖維素材料已通過使用有機溶劑預處理如Acetosolv和Acetocell工藝預處理纖維素材料來制備。
[0132]在一個實施方案中，在預處理之后，將含有糖、酸和溶解的木質素的可溶性級分從乙酰化纖維素材料移除。
[0133]在一個實施方案中，乙酰化纖維素材料的水解在20至70°C，如30至60°C，優選45至55°C的溫度，在4-6，如4.5-5.5范圍的pH進行。在一個實施方案中，乙酰化纖維素材料以 1-20 (w/w) % 的 TS，如 2-10 (w/w) % TS (總固形物)，如約 5 (w/w) % TS 存在。
[0134]在一個實施方案中，水解進行I至20日，優選5至15日。
[0135]根據本發明，水解使用本發明的酶組合物進行，所述組合物包含纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)，如定義于上文中的“本發明的酶組合物”部分。
[0136]水解在易于由本領域技術人員確定的條件下，在合適的含水環境中進行。在一個方面，水解在適于酶的活性，即對于酶最佳的條件下進行。水解可以以補料批式或連續的過程進行，其中將乙酰化纖維素材料逐漸補入，例如，含酶組合物的水解溶液中。
[0137]水解(即糖化)通常在攪拌釜反應器或發酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進行。溫度優選約25°C至約70°C，例如約30°C至約65°C，約40°C至約60°C，或約50°C至55 V的范圍。pH優選約3至約8，例如約3.5至約7，約4至約6，或約pH5.0至約pH5.5的范圍。干燥固體含量優選約5至約50wt%,例如約10至約40wt%,或約20至約30wt%。
[0138]從乙酰化纖維素材料產生發酵產物的工藝
[0139]在第三個方面，本發明涉及使用本發明的酶組合物的工藝。
[0140]在一個優選實施方案中，本發明涉及從乙酰化纖維素材料產生發酵產物的工藝，其包括:[0141](a)通過對所述乙酰化纖維素材料施以本發明的酶組合物或根據本發明的水解方法水解所述材料；
[0142](b)使用發酵生物進行發酵；和
[0143](C)任選地回收所述發酵產物。
[0144]根據本發明的工藝，水解(即糖化)和發酵可分別或同時進行。在一個實施方案中，本發明的工藝可作為分離的水解和發酵(SHF)、同步糖化和發酵(SSF)、同步糖化和共發酵(SSCF)、混合的水解和發酵(HHF)、分離的水解和共發酵(SHCF)、混合的水解和共發酵(HHCF)，或直接微生物轉化(DMC)(有時也稱為合并的生物加工(consolidatedb1processing, CBP))進行。SHF使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖和戊糖單體，然后將可發酵糖發酵成為乙醇。在SSF中，乙酰化纖維素材料的酶水解和糖變為乙醇的發酵在一個步驟中組合。SSCF包括多種糖的共發酵(Sheehan J.和 Himmel M., 1999, Enzymes, energy and the environment:A strategicperspective on the U.S.Department of Energy’ s research and development activitiesfor b1ethanol, B1technol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨的水解步驟，所述步驟可以在同一個反應器中進行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度，即，高溫酶法水解(糖化)，然后在發酵菌株能夠耐受的較低溫度進行SSF。DMC在一個或多個(例如幾個)步驟中組合了所有三個過程(酶產生、水解和發酵)，其中使用相同的生物體產生用于將纖維素材料轉化成可發酵糖并將可發酵糖轉化成終產物的酶。
[0145]所述乙酰化纖 維素材料可為如“乙酰化纖維素材料”部分描述的材料。水解依照“本發明的水解方法”部分進行。
[0146]遞
[0147]可通過一種或多種(例如幾種)能將糖直接或間接發酵成所需發酵產物的發酵微生物發酵自經水解的乙酰化纖維素材料獲得的可發酵糖。“發酵”或“發酵方法”指任何發酵方法或包含發酵步驟的任何方法。發酵方法還包括用于消費品醇工業(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(例如，發酵乳產品)、皮革業和煙草業的發酵方法。發酵條件依賴于期望的發酵產物和發酵生物體，并且能由本領域的技術人員容易地確定。
[0148]在發酵步驟中，作為預處理和酶水解步驟的結果從纖維素材料釋放的糖，通過發酵生物體(如酵母)發酵成為產物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發酵可以是單獨或同時的。
[0149]發酵微牛物
[0150]術語“發酵微生物”指適用于理想的發酵方法產生發酵產物的任何微生物，包括細菌和真菌生物體。發酵生物體可以是己糖和/或戊糖發酵生物體，或它們的組合。己糖和戊糖發酵生物體均在本領域公知。合適的發酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或間接地發酵(即，轉化)成所需的發酵產品。可產生乙醇的細菌和真菌發酵生物體的實例如Lin等，2006, Appl.Microb1l.B1technol.69:627-642 所述。
[0151]能發酵己糖的發酵微生物的實例包括細菌和真菌生物體，如酵母。優選的酵母包括假絲酵母屬、克魯維酵母屬和酵母屬，例如Candida sonorensis、馬克斯克魯維酵母和釀酒酵母的菌株。[0152]以其天然狀態能發酵戊糖的發酵生物體的實例包括細菌和真菌生物體，如一些酵母。優選的木糖發酵酵母包括假絲酵母屬，優選休哈塔假絲酵母(Candida sheatae)或Candida sonorensis ;和畢赤酵母屬，優選樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS5773的菌株。優選的戍糖發酵酵母包括管囊酵母屬(Pachysolen),優選嗜鞋管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能夠發酵戍糖如木糖和阿拉伯糖的生物體通過本領域已知方法可經遺傳修飾而發酵戊糖。
[0153]能有效地將己糖和戊糖發酵成乙醇的細菌包括，例如，凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)、Clostridium phytofermentans、地芽抱桿菌屬菌種、解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter saccharoIyticum)和運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)(Philippidis, 1996，見上文)。
[0154]其它發酵生物包括芽孢桿菌屬，如凝結芽孢桿菌；假絲酵母屬，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假絲酵母(Candida diddensii)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blanki1、C.entomophilia、蕓薹假絲酵母(C.brassicae)、假熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、產I元假絲酵母(Candidautilis)和休哈塔假絲酵母(C.scehatae);梭菌屬，如丙酮丁醇梭菌、熱纖維梭菌和C.phytofermentans ;大腸桿菌,特別是經遺傳修飾促進乙醇產生的大腸桿菌菌株；地芽孢桿菌屬菌種；漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala);克雷伯氏菌屬(Klebsiella),如產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca);克魯維酵母屬，如馬克斯克魯維酵母、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、K.thermotolerans和脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe);熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter),如解糖熱厭氧桿菌，和發酵單胞菌屬(Zymomonas),如運動發酵單胞菌的菌株。
[0155]在一個優選的 方面，酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在一個更優選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一個更優選的方面,酵母是假絲酵母。在另一個更優選的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一個更優選的方面,酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個更優選的方面，酵母是Candida blankii。在另一個更優選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個更優選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個更優選的方面，酵母是Candida entomophiIiia0在另一個更優選的方面,酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優選的方面，酵母是休哈塔假絲酵母。在另一個更優選的方面，酵母是產朊假絲酵母。在另一個優選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個更優選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora Iusitaniae)。在另一個更優選的方面,酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一個優選的方面,酵母是克魯維酵母屬。在另一個更優選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個更優選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母。在另一個更優選的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一個優選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一個優選的方面，酵母是畢赤酵母。在另一個更優選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個優選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個更優選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個更優選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一個更優選的方面,酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。[0156]在一個優選的方面，細菌是芽孢桿菌屬。在一個更優選的方面，細菌是凝結芽孢桿菌。在另一個更優選的方面，細菌是梭菌屬。在另一個更優選的方面，細菌是丙酮丁醇梭菌。在另一個更優選的方面，細菌是Clostridium phytofermentans在另一個更優選的方面，細菌是熱纖維梭菌。在另一個更優選的方面，細菌是地芽孢桿菌屬菌種。在另一個更優選的方面，細菌是熱厭氧桿菌屬。在另一個更優選的方面，細菌是解糖熱厭氧桿菌。在另一個更優選的方面，細菌是發酵單胞菌屬。在另一個更優選的方面，細菌是運動發酵單胞菌。
[0157]商業上可得到的適合乙醇產生的酵母包括，例如B1FERM? AFT和XR(NABC-NorthAmerican B1products Corporat1n, GA, USA), ETHANOL RED? 酵母(Red Star/Lesaffrej USA)、FALI?(Fleischmann’s Yeast, Burns Philp Food Inc.，USA),FERM1L?(DSMSpecialties)，GERT STRAND? (Gert Strand ABj Sweden)以及 SUPERSTART? 和 THERMOSACC?新鮮酵母(Ethanol Technology, WIj USA)。
[0158]在一個優選的方面，發酵微生物已經經過遺傳修飾，提供發酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0159]通過將異源基因克隆入多種發酵微生物已經構建了能將己糖和戊糖轉化成乙醇(共發酵)的生物體(Chen 和 Ho，1993, Cloning and improving the express1n ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl.B1chem.B1technol.39-40:135-147 ；Ho 等，1998，Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microb1l.64:1852-1859 ；Kotter 和 Ciriacy，1993，Xylose fermentat1n bySaccharomyces cerevisiae,Appl.Microb1l.B1technol.38:776—783 ;Walfridsson等，1995, Xylose-me tabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKLland TALlgenes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolaseand transaldolase, Appl.Environ.Microb1l.61:4184-4190 ；Kuyper 等，2004，Minimalmetabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobicxylose fermentat1n: a proof of principle,FEMS Yeast Research4:655—664 ；Beall 等，1991，Parametric studies of ethanol product1n from xylose and othersugars by recombinant Escherichia coli, B1tech.B1eng.38:296-303 ；Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol product1n, B1technol.B1eng.58:204-214 ；Zhang 等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolismpathway in ethanologenic Zymomonas mobiIis，Science267:240—243 ;Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strainby metabolic pathway engineering, Appl.Environ.Microb1l.62:4465—4470 ；W02003/062430, xylose isomerase)。
[0160]在一個優選的方面，經過遺傳修飾的發酵微生物是Candida sonorensi。在另一個優選的方面，經過遺傳修飾的發酵微生物是大腸桿菌。在另一個優選的方面，經過遺傳修飾的發酵微生物是產酸克雷伯氏菌。在另一個優選的方面，所述經遺傳修飾的發酵微生物是馬克斯克魯維酵母。在另一個優選的方面，所述經遺傳修飾的發酵微生物是釀酒酵母。在另一個優選的方面，經過遺傳修飾的發酵微生物是運動發酵單胞菌。
[0161]本領域中公知的是，上述生物體還能用于產生其它物質，如本文所述。[0162]通常向降解的纖維素材料或水解物加入發酵微生物，并進行約8至約96小時，例如約24至約60小時發酵。溫度通常為約26°C至約60°C，例如約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，例如約pH4-5、6或7。
[0163]在一個方面，對降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進行約12至約96小時，如通常為24-60小時發酵。在另一個方面，溫度優選為約20°C至約60°C，例如約25°C至約50°C，約32°C至約50°C，或約32°C至約50°C，并且pH通常為約pH3至約pH7，例如約PH4至約pH7。然而，一些發酵生物體例如細菌，具有更高的最適發酵溫度。酵母或另一種微生物優選以約15-1O12,優選約17-1Oltl,特別是約2xl08活細胞計數每ml發酵液的量施用。關于使用酵母進行發酵的進一步指導可見于例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques, T.P.Lyons 和 D.R.Kelsall 編,Nottingham University Press, UnitedKingdoml999),其通過提述并入本文。
[0164]對于乙醇產生，在發酵之后，蒸餾經發酵的漿料以提取乙醇。根據本發明的工藝獲得的乙醇可用作，例如燃料乙醇，飲用乙醇，即可飲用的中性含酒精飲料，或工業乙醇。
[0165]發酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進一步改進發酵工藝，而且特定地，改進發酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“發酵刺激劑”指用于發酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優選的用于生長的發酵刺激劑包括維生素和礦物質。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內消旋肌醇(meso-1nositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E。參見，例如，Alfenore等，Improving ethanol product1n and viability of Saccharomyces cerevisiaeby a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002)，其通過提述并入本文。礦物質的實例包括能夠提供營養物的礦物質和礦物質鹽，所述營養物包括 P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn 和 Cu。
[0166]發酵產物
[0167]根據本發明，術語“發酵產物”可以是源自發酵的任何物質。發酵產物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、異丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1，3_丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；燒烴(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；環烷烴(例如環戊烷、環己烷、環庚烷、和環辛烷)；烯烴(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO));異戊二烯；酮(例如，丙酮)；有機酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5- 二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。發酵產物還可以是作為高價值產品的蛋白質。
[0168]在一個優選的方面，發酵產物是醇。可理解的是，術語“醇”包括包含一個或多個(例如幾個)羥基基團的物質。在更優選的方面，所述醇是正丁醇。在另一個更優選的方面，所述醇是異丁醇。在另一個更優選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優選的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個更優選的方面，所述醇是丁二醇。在另一個更優選的方面，所述醇是乙二醇。在另一個更優選的方面，所述醇是丙三醇(glycerin)。在另一個更優選的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一個更優選的方面,所述醇是1，3_丙二醇。在另一個更優選的方面,所述醇是山梨醇。在另一個更優選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong, C.S.，Cao, N.J., Du,J.,和 Tsao, G.T., 1999, Ethanol product1n from renewable resources,于Advances in B1chemical Engineering/B1technology, Scheper, T.編,Springer-VerlagBerl in Heidelberg, Germany, 65: 207-241 ；Si lveira, M.M.,和 Jonas, R.，2002，Theb1technological product1n of sorbitol, Appl.Microb1l.B1technol.59:400-408 ；Nigam 和 Singh, 1995, Processes for fermentative product1n of xylitol - a sugarsubstitute,Process B1chemistry30(2):117-124 ；Ezeji 等，2003，Product1n ofacetone, butanol and ethanol by Clostridium bei jerinckii BAlOland in situ recoveryby gas stripping, World Journal of Microb1logy and B1techno logy 19 (6): 595-603。
[0169]在另一個優選的方面，所述發酵產物是烷烴。所述烷烴是未支化或支化的烷烴。在另一個更優選的方面，所述烷烴是戊烷。在另一個更優選的方面，所述烷烴是己烷。在另一個更優選的方面，所述烷烴是庚烷。在另一個更優選的方面，所述烷烴是辛烷。在另一個更優選的方面，所述烷烴是壬烷。在另一個更優選的方面，所述烷烴是癸烷。在另一個更優選的方面，所述烷烴是十一烷。在另一個更優選的方面，所述烷烴是十二烷。
[0170]在另一個優選的方面，所述發酵產物是環烷烴。在另一個更優選的方面，所述環烷烴是環戊烷。在另一個更優選的方面，所述環烷烴是環己烷。在另一個更優選的方面，所述環烷烴是環庚烷。在另一個更優選的方面，所述環烷烴是環辛烷。
[0171]在另一個優選的方面，所述發酵產物是烯烴。所述烯烴可為未支化或支化的烯烴。在另一個更優選的方面，所述烯烴是戊烯。在另一個更優選的方面，所述烯烴是己烯。在另一個更優選的方面，所述烯烴是庚烯。在另一個更優選的方面，所述烯烴是辛烯。
[0172]在另一個優選的方面，所述發酵產物是氨基酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard 和 Margaritis, 2004, Empirical modeling of batch fermentat1n kinetics forpoly(glutamic acid)product1n and other microbial b1polymers, B1technology andB1engineering87 (4):501-515。
[0173] 在另一個優選的方面，所述物質是氣體。在另一個更優選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優選的方面，所述氣體是C02。在另一個更優選的方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka, Miya,和Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen product1n by continuous culture system ofhydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology36 (6-7):41-47 ；和 Gunaseelan,1997, Anaerobic digest1n of b1mass for methane product1n:Areview, B1mass and B1energy, 13(1-2), 83-114。
[0174]在另一個優選的方面，所述發酵產物是異戊二烯。
[0175]在另一個優選的方面，所述發酵產物是酮。應理解的是，術語“酮”涵蓋了含有一個或多個(例如幾個)酮模塊的酮。在另一個更優選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如Qureshi 和 Blaschek, 2003,見上文。[0176]在另一個優選的方面，所述發酵產物是有機酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是反丁烯二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見，例如，Chen 和 Lee, 1997, Membrane-mediated extractive fermentat1n for lactic acidproduct1n from cellulosic b1mass, Appl.B1chem.B1technol.63-65:435—448。
[0177]
[0178]在發酵之后，任選地使用本領域已知的任何方法回收發酵產物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過常規蒸餾方法從發酵的材料分離并純化醇，如乙醇。可以獲得純度高達約96vol.%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇(即，可飲 用的中性含酒精飲料)，或工業乙醇。
[0179]通過以下實施例進一步對本發明進行描述，但不應將其理解為對本發明范圍的限制。
[0180]本發明通過下述段落進一步定義:
[0181]段1.一種酶組合物，其包含纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
[0182]段2.段I的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物來源于里氏木霉，特異腐質霉或 Chrysosporium Iucknowense0
[0183]段3.段的酶組合物I或2，其中所述纖維素分解制備物包含葡糖苷酶，優選來源于曲霉屬(Aspergillus),如米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株的酶,如公開于W02002/095014的酶，或公開于W02008/057637的具有β -葡糖苷酶活性的融合蛋白，或來源于煙曲霉的酶，如公開于W02005/047499的酶，或公開于共同待決的美國臨時申請號61/388,997或W02012/044915、具有下述取代的煙曲霉β -葡糖苷酶變體:F100D，S283G，N456E，F512Y ;或來源于青霉屬(Penicillium)的菌株，如公開于W02007/019442的巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)的菌株，或木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株。
[0184]段4.段1-3任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽,如來源于嗜熱子囊菌屬(Thermoascus),如桔橙嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株的多妝，如作為 SEQ ID NO: 2 公開于 W02005/074656 的多肽；或來源于梭孢殼屬，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作為SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8描述于2005/074647的多肽；或來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的多肽，如作為SEQID NO:1和SEQ ID NO: 2公開于W02010/138754的多肽；或來源于源自青霉屬的菌株，如埃默森青霉(Penicilliumemersonii)的菌株的多肽，如公開于W02011/041397的多肽。[0185]段5.段1-4任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含木聚糖酶，優選GHlO木聚糖酶，如來源于曲霉屬的菌株，如來自煙曲霉的菌株的酶，如作為Xyl III公開于W02006/078256 的酶，或來自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的酶，如作為 SEQ ID NO: 5公開于 W094/21785 的酶(Xyl II)。
[0186]段6.段1-5任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含木糖苷酶，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的酶，如公開于共同待決的美國臨時申請號61/526，833或PCT/US12/052163 (實施例16和17)的酶，或來源于木霉屬菌株，如里氏木霉的菌株的酶，如W02011/057140中的SEQ ID NO:58的成熟多肽。
[0187]段7.段1-6任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含纖維二糖水解酶
I(CBH I)，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的酶，如公開于W02011/057140中的SEQID NO:2的Cel7Α CBHI，或來源于木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的酶。
[0188]段8.段1-7任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含纖維二糖水解酶IKCBH II)，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的酶；或來源于木霉屬，如里氏木霉的菌株，或來源于梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如來自土生梭孢霉的纖維二糖水解酶 II CEL6A。
[0189]段9.段1-8任一項的酶組合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作為SEQ IDN0:2公開于W02009/042846或本文中的SEQ IDNO:1的酶，或與W02009/042846中的SEQ ID Ν0:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90 %，優選95%，如至少96%，如97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0190]段10.段1-8任一項的酶組合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于曲霉屬的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作為SEQ ID NO:2公開于W02010/108918的酶，或與W02010/108918中的SEQ ID Ν0:2具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選95%，如至少96%，如97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0191]段11.段1-8任一項的酶組合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于曲霉屬的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如棘孢曲霉CBS101.43，如作為SEQ ID NO:5公開于W01995/002689 的酶，或與 W01995/002689 中的 SEQ ID NO: 5 具有至少 80%，如至少 85%，如至少90 %，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0192]段12.段1-8任一項的酶組合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于腐質霉屬的菌株，如特異腐質霉的菌株，如作為SEQ ID Ν0:2公開于W02009/073709或作為本文中的SEQ IDN0:3的酶，或與W02009/073709中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO: 3具有至少80 %，如至少85 %，如至少90 %，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0193]段13.段1-12任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽和β -葡糖苷酶。
[0194]段14.段1-12任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β -葡糖苷酶，和木聚糖酶。
[0195]段15.段1-12任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β -葡糖苷酶，木聚糖酶和β -木糖苷酶。
[0196]段16.段1-12任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β -葡糖苷酶，木聚糖酶，β -木糖苷酶,和CBHI。
[0197]段17.段1-12任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β -葡糖苷酶，木聚糖酶，β -木糖苷酶，CBHI和CBHII。
[0198]段18.段1-17任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(TO2005/074656 中的SEQIDN0:2)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中的Xyl II)。
[0199]段19.段1-17任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656 中的 SEQ ID NO: 2)，煙曲霉 β -葡糖苷酶(W02005/047499 的 SEQ ID NO: 2)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中公開的Xyl II)。
[0200]段20.段1-17任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656 中的 SEQ ID NO: 2)，煙曲霉 β -葡糖苷酶(W02005/047499 的 SEQ ID NO: 2)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中公開的Xyl II)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)為來源于土生梭孢霉、作為SEQ 10勵:2公開于冊2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或與W02009/042846中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90 %，優選至少 95 %，如至少96 %，如至少97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0201]段21.段1-17任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含公開于W02011/041397的具有纖維素分解增強活性的埃默森青霉GH61多肽，煙曲霉β-葡糖苷酶(W02005/047499的SEQ ID NO: 2)和煙曲霉木聚糖酶(W02006/078256中的Xyl III)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)為來源于土生梭孢霉、作為SEQ ID NO: 2 公開于 W02009/042846 或本文中的 SEQ ID NO:1 的酶，或與 W02009/042846 中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95 %，如至少96 %，如至少97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0202]段22.段1-21任一項的酶組合物，其中纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之間的比例是500:1至100:1，如50:1至2:1，如約4:1的范圍。
[0203]段23.—種水解乙酰化纖維素材料的方法，其包括對乙酰化纖維素材料施以纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(ΑΧΕ)。
[0204]段24.段23的方法，其中所述乙酰化纖維素材料是經預處理的纖維素材料。
[0205]段25.段23或24的方法，其中所述乙酰化纖維素材料是植物材料碎片(chip)，植物莖段(stem segment)和/或整個植物莖。
[0206]段26.段25的方法，其中所述纖維素材料選自下組:蘆竹、甘蔗渣、竹、玉米穗軸、玉米纖維、玉米秸桿、芒屬、橙皮、稻桿、柳枝稷、麥桿。
[0207]段27.段26的方法，其中纖維素材料的來源是玉米秸桿、玉米穗軸和/或麥桿。
[0208]段28.段24-27任一項的方法，其中對纖維素材料的預處理是通過化學預處理，物理預處理，或化學預處理和物理預處理的預處理。
[0209]段29.段24-28任一項的方法，其中所述纖維素材料是經熱機械制漿的植物材料。
[0210]段30.段24-29任一項的方法，其中所述乙酰化纖維素材料是經熱機械制漿的植物材料，如乙酰化的玉米秸桿漿。
[0211]段31.段24-30任一項的方法，其中預處理所述纖維素材料包括用酸的預處理。
[0212]段32.段24-31任一項的方法，其中所述乙酰化纖維素材料已通過在高溫、高壓下用酸預處理纖維素材料來制備。
[0213]段33.段31或32的方法，其中所述酸預處理使用乙酸實施。
[0214]段34.段24-33任一項的方法，其中所述乙酰化纖維素材料已通過使用有機溶劑預處理如Acetosolv和Acetocell工藝預處理纖維素材料來制備。
[0215]段35.段24-34任一項的方法，其中在預處理之后，將含有糖、酸和溶解的木質素的可溶性級分從乙酰化纖維素材料移除。
[0216]段36.段24-35任一項的方法，其中水解在20至70°C，如30至60°C，優選45至550C的溫度，在4-6，如4.5-5.5范圍的pH進行。
[0217]段37.段24-36任一項的方法，其中所述乙酰化纖維素材料以1_20 (w/w) %的TS，如2-10 (w/w) % TS (總固形物)，如約5 (w/w) % TS存在。
[0218]段38.段24-37任一項的方法，其中水解進行I至20日，優選5至15日。
[0219]段39.段24-38任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物來源于里氏木霉，特異腐質霉或 Chrysosporium Iucknowense0
[0220]段40.段24-39任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含β -葡糖苷酶，優選來源于曲霉屬(Aspergillus),如米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株的酶,如公開于W02002/095014的酶，或公開于W02008/057637的具有β -葡糖苷酶活性的融合蛋白，或來源于煙曲霉的酶，如公開于W02005/047499的酶，或公開于共同待決的美國臨時申請號61/388,997或W02012/044915、具有下述取代的煙曲霉β -葡糖苷酶變體:F100D，S283G，N456E，F512Y ;或來源于青霉屬(Penicillium)的菌株，如公開于W02007/019442的巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)的菌株，或木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株。
[0221]段41.段24-40任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽,如來源于嗜熱子囊菌屬(Thermoascus),如桔橙嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株的多妝，如作為 SEQ ID NO: 2 公開于 W02005/074656 的多肽；或來源于梭孢殼屬，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作為SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8描述于2005/074647的多肽；或來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的多肽，如作為SEQID NO:1和SEQ ID NO: 2公開于W02010/138754的多肽；或來源于源自青霉屬的菌株，如埃默森青霉的菌株的多肽，如公開于W02011/041397的多肽。
[0222]段42.段24-41任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含木聚糖酶，優選GHlO木聚糖酶，如來源于曲霉屬的菌株，如來自煙曲霉的菌株的酶，如作為Xyl III公開于W02006/078256 的酶，或來自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的酶，如作為 SEQ ID NO: 5公開于 W094/21785 的酶(Xyl II)。
[0223]段43.段24-41任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含β-木糖苷酶，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的酶，如公開于共同待決的美國臨時申請號61/526，833或PCT/US12/052163的酶，或來源于木霉屬菌株，如里氏木霉的菌株的酶，如W02011/057140 中的 SEQ ID NO:58 的成熟多肽。
[0224]段44.段24-42任一項的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作為SEQ ID NO: 2公開于W02009/042846或本文中的SEQID NO:1的酶，或與W02009/042846中的SEQ ID NO: 2具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木
聚糖酯酶。
[0225]段45.段24-43任一項的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于曲霉屬的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作為SEQ ID NO:2公開于W02010/108918或本文中的SEQ IDNO:2的酶，或與W02010/108918中的SEQ ID N0:2或本文中的SEQ ID N0:2具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0226]段46.段24-43任一項的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于曲霉屬的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如棘孢曲霉CBS101.43，如作為SEQ ID NO:5公開于W01995/002689 的酶，或與 W01995/002689 中的 SEQ ID NO: 5 具有至少 80%，如至少 85%，如至少90 %，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚
糖酯酶。 [0227]段47.段24-43任一項的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于腐質霉屬的菌株，如特異腐質霉的菌株，如作為SEQ ID NO: 2公開于W02009/073709或作為本文中的SEQ ID NO: 3的酶，或與W02009/073709中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO: 3具有至少80 %，如至少85 %，如至少90 %，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99 %
同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0228]段48.段24-47任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含纖維二糖水解酶
I(CBHI),如來源于曲霉屬的菌株,如煙曲霉的菌株的酶，或來源于木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的酶。
[0229]段49.段24-48任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含纖維二糖水解酶
II(CBHII),如來源于煙曲霉的酶；或來源于木霉屬，如里氏木霉的菌株，或來源于梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如來自土生梭孢霉的纖維二糖水解酶II CEL6A。
[0230]段50.段24-49任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽和β -葡聚糖酶。
[0231]段51.段24-49任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β -葡聚糖酶，和木聚糖酶。
[0232]段52.段24-49任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β -葡聚糖酶，木聚糖酶和β -木糖苷酶。
[0233]段53.段24-49任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β -葡聚糖酶，木聚糖酶，β -木糖苷酶，和CBHI。
[0234]段54.段24-49任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，β -葡聚糖酶，木聚糖酶，β -木糖苷酶，CBHI和CBHII。
[0235]段55.段24-54任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2)，米曲霉β -葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(TO94/21785中的Xyl II)。
[0236]段56.段24-55任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656 中的 SEQ ID NO: 2)，煙曲霉 β -葡糖苷酶(W02005/047499 的 SEQ ID NO: 2)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中公開的Xyl II)。
[0237]段57.段24-56任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的埃默森青霉GH61A多肽(W0W02011/04139中的SEQ ID NO: 2)，具有下述取代的煙曲霉β -葡糖苷酶變體(公開于美國臨時申請號 N0.61/388，997 或 W02012/044915):F100D, S283G, N456E，F512Y，和煙曲霉木聚糖酶(W02006/078256中公開的Xyl III)和來源于煙曲霉的菌株的木糖苷酶。
[0238]段58.段24-57任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物以約0.0I至約50.0mg,例如約I至約25mg,如約2至1mg,如約4至約8mg蛋白每g/DS的纖維素材料的量添加。
[0239]段59.段24-58任一項的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)以約0.01至約1mg,如0.05至約5mg,如0.1至約4mg酶蛋白每g/DS的纖維素材料的量使用。
[0240]段60.段24-59任一項的方法，其中纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之間的比例是500:1至1:1，如50:1至2:1，如約4:1的范圍。 [0241]段61.段24-60任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656 中的 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2)，煙曲霉 β -葡糖苷酶(W02005/047499 的SEQ ID NO: 2)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中公開的Xyl II)，且進一步包含來源于土生梭孢霉、作為SEQ ID Ν0:2公開于W02009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的乙酰木聚糖酯酶(AXE)，或與W02009/042846中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80 %，如至少85%，如至少90%，優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0242]段62.段24-61任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含公開于W02011/041397的具有纖維素分解增強活性的埃默森青霉GH61多肽，具有下述取代的煙曲霉β_葡糖苷酶變體(公開于美國臨時申請號吣.61/388，997 或冊2012/044915):F100D, S283G, N456E, F512Y，和煙曲霉木聚糖酶(W02006/078256中公開的Xyl III)，且進一步包含來源于土生梭孢霉、作為SEQ ID NO: 2公開于W02009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的乙酰木聚糖酯酶(AXE)，或與W02009/042846中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
[0243]段63.—種從乙酰化纖維素材料產生發酵產物的工藝，其包括:
[0244](a)通過對所述乙酰化纖維素材料施以段1-23任一項的酶組合物或根據段24_62任一項的水解方法水解所述材料；
[0245](b)使用發酵生物進行發酵；和[0246](c)任選地回收所述發酵產物。
[0247]段64.段63的工藝，其中所述發酵產物是乙醇。
[0248]段65.段63或64的工藝，其中所述發酵生物是酵母，如酵母屬的菌株，如釀酒酵母的菌株。
[0249]段66.段63-65任一項的工藝，其中所述纖維素材料是玉米秸桿漿。
[0250]材料和方法
[0251]酶:
[0252]-里氏木霉纖維素分解制備物
[0253]-作為SEQID NO: 2描述于W02005/074656的具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽。
[0254]-公開于W02005/047499的煙曲霉β-葡糖苷酶。
[0255]-公開于W02012/044915的煙曲霉β-葡糖苷酶變體，具有下述取代:F100D，S283G, Ν456Ε, F512Y。 [0256]-作為SEQID NO: 5公開于W094/21785的棘孢曲霉木聚糖酶(Xyl II)。
[0257]-作為SEQID NO: 2公開于W02009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶。(P6GE)
[0258]-作為SEQID NO: 2公開于W02010/108918或本文中SEQ ID NO: 2的棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶。(ΝΡ002824)
[0259]-公開于W02011/057140 中的 SEQ ID NO:2 的煙曲霉 Cel7A CBHl。
[0260]-可從NovozymesA/S獲得的煙曲霉CBH2。
[0261]-在共同待決的美國臨時申請號61/526833或PCT/US12/052163(實施例16和17)中公開的煙曲霉β_木糖苷酶。
[0262]乙酰化纖維素材料:
[0263]含有約75 %纖維素和11 %木聚糖的乙酰化玉米秸桿漿從Archer DanielsMidland(ADM)，USA 獲得。
[0264]方法
[0265]纖維素材料中的乙酰基的確定
[0266]糖和乙酸基團可根據NREL方法測量(參見A.Sluiter等，“Determinat1n ofStructural Carbohydrates 和 Lignin in B1mass, ppl5-18-NREL/TP-510_42618，2011 年 7月重新修訂)和 nrel.gov/b1mass/pdfs/42618.pdf。
實施例
[0267]實施例1
[0268]使用AXE改善的纖維素和木聚糖轉化
[0269]使用含有約75%纖維素和11%木聚糖的乙酰化玉米秸桿漿。基于總糖的乙酰化程度測量為約8% (每12.5糖單元I個乙酰基團)。玉米秸桿漿通過在高溫和高壓使用乙酸預處理玉米秸桿來制備。將所得的漿料通過固/液分離器(壓力過濾)以去除含有糖、乙酸和溶解的木質素的可溶性級分。將不可溶的底物(乙酰化漿)用自來水洗滌至PH高于5.0,并將其在24孔(5mL)聚丙烯細胞生長板(WhatmanUniplate)中進行一式四份酶水解，所述水解在5g水解規模，2.5%固形物，50mM檸檬酸緩沖液，5.1的pH和50°C使用下述進行11日:
[0270]i)里氏木霉纖維素分解制備物，具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽(作為SEQ ID N0:2描述于W02005/074656)，煙曲霉β -葡糖苷酶(W02005/047499)，和棘孢曲霉木聚糖酶(作為SEQ ID NO: 5公開于W094/21785 (稱為XylII)，其劑量為6mg蛋白/g纖維素；
[0271]ii)里氏木霉纖維素分解制備物，具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽(作為SEQ ID N0:2描述于W02005/074656)，煙曲霉β -葡糖苷酶(W02005/047499)，和棘孢曲霉木聚糖酶(作為SEQ ID NO: 5公開于W094/21785 (稱為XylII)，其劑量為4.Smg蛋白/g纖維素；
[0272]iii)如上文ii)中所述的纖維素分解制備物(4.8mg蛋白/g纖維素)，連同1.2mg蛋白/g纖維素的棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶I (作為SEQ ID NO:2公開于W02010/108918(NP000409))；
[0273]-如上文ii)中所述的纖維素分解制備物(4.8mg蛋白/g纖維素)，連同1.2mg蛋白/g纖維素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作為SEQ 10勵:2公開于冊2009/042846 (P6GE))。
[0274]在0.005M H2SO4中稀釋的樣品的糖濃度使用4.6x250mm AMINEX?HPX-87H 柱(B1-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)通過如下測量:在65°C用0.005MH2S04以0.6ml每分鐘的流速洗脫，并通過積分來自折射率檢測(CHEMSTAT1N?, AGILENT? 1100HPLC，Agilent Technologies, Santa Clara,
CA，USA) 并通過純糖樣品校正的葡萄糖、纖維二糖和木糖信號來定量。葡萄糖和木糖產量計算為基于起始纖維素和木聚糖輸入和在酶水解之后獲得的葡萄糖和木糖濃度的理論值的％。
[0275]在11日水解之后獲得的結果示于表1，以及圖1和圖2。所述乙酰木聚糖酯酶顯示趨向改善葡萄糖產量的活性，且具體而言，土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶顯示改善纖維素轉化為葡萄糖方面的顯著益處(圖1)。亦可見幾種乙酰木聚糖酯酶和特別是土生梭孢霉除了改善來自經預處理的玉米秸桿的葡萄糖產量之外還可改善木糖產量。
[0276]
蛋白(mg)平均葡萄糖標準偏差平均木糖標準偏差
___產量(％) (葡萄糖) 產量(％) (木糖)
__纖維素酶(6.0)__56__L6__71__1.2
__纖維素酶(4.8)__45__OJ__66__2.0
加上纖維素酶(4.8)總AXE (1.2)__67__25__80__3.2
__平均AXE (1.2) 50__fLA__70__3.3
[0277]表1:11日水解結果
[0278]實施例2
[0279]使用進一步包含土生梭孢霉AXE的纖維素分解制備物改善乙酰化玉米秸稈漿的纖維素轉化[0280]使用含有約75%纖維素和11%木聚糖的乙酰化玉米秸桿漿。基于總堂的乙酰化程度測量為約8% (每12.5個糖單元I個乙酰基團)。玉米秸桿漿通過在高溫和高壓使用乙酸預處理玉米秸桿來制備。將所得的漿料通過固/液分離器(壓力過濾)以去除含有糖、乙酸和溶解的木質素的可溶性級分。將不可溶的底物(乙酰化漿)用自來水洗滌至PH高于5.0,并將其在旋轉培養箱(rotisserie incubator)中進行一式兩份酶水解,所述水解在20g水解規模，5%固形物，50mM檸檬酸緩沖液，5.0的pH和50°C以相同量的總蛋白每g的纖維素使用下述進行3和6日:
[0281]i)里氏木霉纖維素分解制備物，具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61A 多肽(W02005/074656 中的 SEQ ID NO: 2)，煙曲霉 β -葡糖苷酶(W02005/047499 的SEQ ID NO: 2)，和棘孢曲霉木聚糖酶(公開于W094/21785的Xyl II)，其劑量為6mg蛋白/g纖維素(圖3中的纖維素I)；
[0282]ii)如上文i)中所述的纖維素分解制備物(5.7mg蛋白/g纖維素)，連同0.3mg蛋白/g纖維素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作為SEQ ID N0:2公開于W02009/042846 (P6GE)，其為 5 % 替換水平(!^placement level)(圖 3 中的纖維素酶1+AXE(5% 替換))；
[0283]iii)如上文i)中所述的纖維素分解制備物(5.4mg蛋白/g纖維素)，連同0.6mg蛋白/g纖維素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作為SEQ ID N0:2公開于W02009/042846 (P6GE),其為 10 % 替換水平(!^placement level)(圖 3 中的纖維素酶I+AXE (10% 替換))；
[0284]iv)如上文i)中所述的纖維素分解制備物(5.1mg蛋白/g纖維素)，連同0.9mg蛋白/g纖維素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作為SEQ ID N0:2公開于W02009/042846 (P6GE )，其為 15 % 替換水平(!^placement level)(圖 3 中的纖維素酶I+AXE (15% 替換))；
[0285]V)里氏木霉纖維素分解制備物，其含有煙曲霉Cel7A CBH I (公開于W02011/057140中的SEQ ID NO: 2)和CBH II，具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽(W02005/074656中的SEQ ID NO: 2)，具有下述取代的煙曲霉β -葡糖苷酶變體:F100D, S283G，Ν456Ε，F512Y (W02012/044915)，和煙曲霉木聚糖酶(W02006/078256 中的 XylIII)，其劑量為6mg/蛋白/g纖維素(圖3中的實驗纖維素酶2)；
[0286]vi)里氏木霉纖維素分解制備物，其含有煙曲霉CBH I和CBH II，具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽(W02005/074656中的SEQ ID NO: 2),公開于美國臨時申請號61/388，997的煙曲霉β _葡糖苷酶變體，煙曲霉木聚糖酶(W02006/078256中的Xyl III)，和煙曲霉β-木糖苷酶(公開于共同待決的美國臨時申請號61/526833或PCT/US12/052163(實施例16和17))，其劑量為6mg/蛋白/g纖維素(圖3中的纖維素酶3)；
[0287]vii)如上文vi)中所述的纖維素酶(5.82mg蛋白/g纖維素)，連同0.18mg蛋白/g纖維素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作為SEQ ID N0:2公開于W02009/042846(P6GE)，其為3%替換水平(!^placement level)(圖3中的纖維素酶3+AXE (3%替換))。
[0288]在0.005M H2SO4中稀釋的樣品的糖濃度使用4.6x250mm AMINEX?HPX-87H 柱(B1-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)通過如下測量:在80 °C用MilliQ-H2O以0.6ml每分鐘的流速洗脫，并通過積分來自折射率檢測(CHEMSTAT1N?, AGILENT? 1100HPLC，Agilent Technologies, Santa Clara,
CA，USA)并通過純糖樣品校正的葡萄糖、纖維二糖和木糖信號來定量。纖維素轉化計算為基于起始纖維素和木聚糖輸入和在酶水解之后獲得的葡萄糖和木糖濃度的理論值的％。
[0289]在72小時和144小時水解之后獲得的結果示于表2和圖3。結果顯示纖維素酶2和3在纖維素轉化方面在6mg每g的纖維素的相同蛋白劑量下相對于纖維素酶I性能顯示實質性改善。此外，通過土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶對實驗纖維素酶3蛋白的3 %替代將纖維素轉化從約67.2%進一步增強至76.7%。
[0290]
【權利要求】
1.一種酶組合物，其包含纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(ΑΧΕ)。
2.權利要求1的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物來源于里氏木霉(Trichodermareesei)，特異腐質霉(Humicola insolens)或 Chrysosporium Iucknowense0
3.權利要求1或2的酶組合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于梭孢殼屬(Thielavia)的菌株，如土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的菌株，如作為 SEQ ID NO:1公開于本文中的酶，或與本文中的SEQ ID N0:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
4.權利要求1-3任一項的酶組合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于曲霉屬(Aspergillus)的菌株，如棘孢曲霉(Aspergillusaculaetus)的菌株，如作為 SEQ ID NO:2公開于本文中的酶，或與本文中的SEQ ID NO: 2具有至少80%，如至少85 %，如至少90 %，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
5.權利要求1-4任一項的酶組合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于腐質霉屬(Humicola)的菌株，如特異腐質霉的菌株，如作為SEQ ID NO: 3公開于本文中的酶，或與本文中的SEQ ID NO: 3具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選95%，如至少96%，如97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
6.權利要求1-5任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656 中的 SEQ ID NO: 2)，煙曲霉 β -葡糖苷酶(W02005/047499 的 SEQ ID NO: 2)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中公開的Xyl II)。
7.權利要求1-6任一 項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽，煙曲霉β-葡糖苷酶和棘孢曲霉木聚糖酶，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)為來源于土生梭孢霉、本文中的SEQ ID NO:1的酶，或與本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
8.權利要求1-6任一項的酶組合物，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的埃默森青霉(Penicilliumemersonii)GH61A多肽，煙曲霉β -葡糖苷酶和煙曲霉木聚糖酶(W02006/078256中的XylIII)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)為來源于土生梭孢霉的酶，或與W02009/042846中的SEQ ID NO: 2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95 %，如至少96 %，如至少97 %，如至少98 %，如至少99 %同一性的乙酰木聚糖酯酶。
9.權利要求1-8任一項的酶組合物，其中纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之間的比例是500:1至100:1，如50:1至2:1，如約4:1的范圍。
10.一種水解乙酰化纖維素材料的方法，其包括對乙酰化纖維素材料施以纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(ΑΧΕ)。
11.權利要求10的方法，其中所述乙酰化纖維素材料是經預處理的纖維素材料。
12.權利要求10或11的方法，其中所述乙酰化纖維素材料是經熱機械制漿的植物材料，如乙酰化的玉米秸桿漿。
13.權利要求10-12任一項的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作為SEQ ID NO:1公開于本文中的酶，或與本文中的SEQ IDNO:1具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
14.權利要求10-13任一項的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于曲霉屬的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作為SEQ ID NO:2公開于本文中的酶，或與本文中的SEQ ID NO:2具有至少80 %，如至少85 %，如至少90 %，優選95 %，如至少96 %，如97 %，如至少98 %，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
15.權利要求10-14任一項的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)來源于腐質霉屬的菌株，如特異腐質霉的菌株，如作為SEQ ID NO: 3公開于本文中的酶，或與本文中的SEQID NO: 3具有至少80%，如至少85%，如至少90%，優選95%，如至少96%，如97%，如至少98%，如至少99%同一性的乙酰木聚糖酯酶。
16.權利要求10-15任一項的方法，其中所述纖維素分解制備物為里氏木霉纖維素分解制備物，其進一步包含具有纖維素分解增強活性的埃默森青霉GH61A多肽，煙曲霉β -葡糖苷酶變體，和來源于煙曲霉的菌株的β_木糖苷酶。
17.權利要求10-16任一項的方法，其中纖維素分解制備物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之間的比例是500:1至1:1，如50:1至2:1，如約4:1的范圍。
18.—種從乙酰化纖維素材料產生發酵產物的工藝，其包括: (a)通過對所述乙酰 化纖維素材料施以權利要求1-9任一項的酶組合物來水解所述材料； (b)使用發酵生物進行發酵；和 (C)任選地回收所述發酵產物。
19.權利要求18的工藝，其中所述發酵產物是乙醇。
20.權利要求18或19的工藝，其中所述乙酰化纖維素材料是玉米秸桿漿。
【文檔編號】C12N9/42GK104039958SQ201280057791
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年9月21日 優先權日:2011年9月23日
【發明者】P.伊耶, A.R.加斯珀, J.克魯南伯格斯, T.P.賓德 申請人:諾維信公司