碳青霉烯(carbapenem)的無細胞制備方法
【專利摘要】本文提供用于生成碳青霉烯、例如式(I)化合物或其鹽的無細胞系統；其中(II)、R1、R2、R3、R4、R5和R6如本文所定義。還提供包含通過本發明無細胞系統生成的化合物的醫藥組合物，以及這些化合物和組合物用于治療細菌感染的用途。
【專利說明】碳青霉烯（CARBAPENEM)的無細胞制備
[0001] 相關申請案
[0002] 本申請案依據35U.S.C. § 119(e)主張對2011年9月9日申請的美國臨時專利申 請案U. S. S. N. 61/533, 039的優先權，其是以引用方式并入本文中。
【背景技術】
[0003] 在1976年，發現從土壤細菌卡特利鏈霉菌（Streptomyces cattleya)獲得的發酵 液可有效用于篩選肽聚糖生物合成的抑制劑。最初嘗試證實，活性物質的分離因所述組份 的化學不穩定性而難以進行。在多次嘗試和廣泛純化后，最終以>90%純度分離所述材料， 從而使得可對首先分離的天然碳青霉烯（carbapenem)抗生素噻烯霉素（thienamycin)進 行結構闡釋。例如，參見卡漢（Kahan)等人，抗生素雜志（J.Antibiot.) (1979)32:1-12。
[0004]
【權利要求】
1. 一種細胞裂解物，其包含一組能生成式（I-a)化合物，
或其鹽或互變異構體或其組合的酶； 其是從以下物質生成： 葡萄糖和甘氨酸或其鹽；和/或 葡萄糖和式（i)的任選地經取代的谷氨酸：
或其鹽；和/或 葡萄糖和式（iv)脯氨酸化合物： 或其鹽；
其中： 虛線=代表單鍵或雙鍵； R1、R2、R3和R4在每一情況中獨立地選自由以下組成的群組：氫、任選地經取代的烷基、 任選地經取代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯 基、任選地經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、任選地經取代的雜環基、任選地經取 代的芳基和任選地經取代的雜芳基； R5選自由以下組成的群組：氫、-OR8、-SR8和-N(R8) 2 ; R8在每一情況中獨立地選自由以下組成的群組：氫、任選地經取代的烷基、任選地經取 代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任選地 經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、任選地經取代的雜環基、任選地經取代的芳基、 任選地經取代的雜芳基、-C( = 0)R8a、-C( = 0)0R8a、-C( = 0)SR8a、-C( = 0)N(R8b)2、-C(= NR8b)R8a、-C( = NR8b)0R8a、-C( = NR8b)SR8a、-C( = NR8b)N(R8b)2、-C( = S)R8a、-C( = S) 0R8a、-C( = S)SR8a、-C( = S)N(R8b)2、-C( = 0)NR8bS02R8a、-S( = 0)R8a、-S02R8a、_S02N(R 8a)2、-Si (R8a) 3、-P ( = 0) (R8a) 2、-P ( = 0) (0R8a) 2、-P ( = 0) (R8a) (0R8a)、-P ( = 0) (R8a) (N (R8b) 2)、-P ( = 0) (N(R8b)2)2、-P( = 0)2R8a、-P( = 0)20R8a、-P( = 0)2N(R8b)2、-B(R8a)2、-B(0R 8a)jP_BR8a(0R8a)， 其中如果氧保護基團附接到氧原子，且如果硫保護基團附接到硫原子，那么R 8a選自由以下 組成的群組：任選地經取代的烷基、任選地經取代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經 取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任選地經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、 任選地經取代的雜環基、任選地經取代的芳基、任選地經取代的雜芳基，或兩個R8a基團或 R8a與R8b基團接合形成任選地經取代的雜環；且R8b在每一情況中獨立地選自由以下組成的 群組：氫、任選地經取代的烷基、任選地經取代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經取代 的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任選地經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、任選 地經取代的雜環基、任選地經取代的芳基、任選地經取代的雜芳基和氮保護基團，或兩個R 8b 接合形成任選地經取代的雜環；且 R7a為氫。
2. -種生成式（I-a)化合物，
或其鹽或互變異構體或其組合的方法； 所述方法包含： 提供包含一種或一種以上酶的根據權利要求1所述的細胞裂解物，其中所述一種或 一種以上酶選自由以下組成的群組：Y -谷氨酰基激酶、Glu-5-P脫氫酶、糖酵解/乙酰 基-CoA生物合成多酶、乙酰基-CoA乙酰基轉移酶、β -氧化多酶、巴豆酰基-CoA還原酶、乙 酰基-CoA羧化酶、丙二酰基-CoA還原酶、蘇氨酸醛縮酶、β -丙氨酸轉移酶、脯氨酸3-羥化 酶、脯氨酸氧化酶、羧甲基-Pro合酶、碳青霉烷合成酶、β-內酰胺合成酶、碳青霉烯合酶、 轉移酶、加氧酶和甲基轉移酶和其同工酶； 其中使所述一種或一種以上細胞裂解物與以下物質接觸： (1) 葡萄糖和甘氨酸或其鹽；和/或 (2) 葡萄糖和式⑴的任選地經取代的谷氨酸：
或其鹽，和/或 (3) 葡萄糖和式（iv)脯氨酸化合物： 或其鹽；
其中： 虛線=代表單鍵或雙鍵； R1、R2、R3和R4在每一情況中選自由以下組成的群組：氫、任選地經取代的烷基、任選地 經取代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任 選地經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、任選地經取代的雜環基、任選地經取代的芳 基和任選地經取代的雜芳基；且 R5選自由以下組成的群組：氫、-OR8、-SR8和-N(R8) 2 ; R8在每一情況中獨立地選自由以下組成的群組：氫、任選地經取代的烷基、任選地經取 代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任選地 經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、任選地經取代的雜環基、任選地經取代的芳基、 任選地經取代的雜芳基、-C( = 0)R8a、-C( = 0)0R8a、-C( = 0)SR8a、-C( = 0)N(R8b)2、-C(= NR8b)R8a、-C( = NR8b)0R8a、-C( = NR8b)SR8a、-C( = NR8b)N(R8b)2、-C( = S)R8a、-C( = S) 0R8a、-C( = S)SR8a、-C( = S)N(R8b)2、-C( = 0)NR8bS02R8a、-S( = 0)R8a、-S02R8a、_S02N(R 8a)2、-Si (R8a) 3、-P ( = 0) (R8a) 2、-P ( = 0) (0R8a) 2、-P ( = 0) (R8a) (0R8a)、-P ( = 0) (R8a) (N (R8b) 2)、-P ( = 0) (N(R8b)2)2、-P( = 0)2R8a、-P( = 0)20R8a、-P( = 0)2N(R8b)2、-B(R8a)2、-B(0R 8a)jP_BR8a(0R8a)， 其中如果氧保護基團附接到氧原子，且如果硫保護基團附接到硫原子，那么R 8a選自由以下 組成的群組：任選地經取代的烷基、任選地經取代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經 取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任選地經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、 任選地經取代的雜環基、任選地經取代的芳基、任選地經取代的雜芳基，或兩個R 8a基團或 R8a與R8b基團接合形成任選地經取代的雜環；且R8b在每一情況中獨立地選自由以下組成的 群組：氫、任選地經取代的烷基、任選地經取代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經取代 的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任選地經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、任選 地經取代的雜環基、任選地經取代的芳基、任選地經取代的雜芳基和氮保護基團，或兩個R 8b 接合形成任選地經取代的雜環；且 R7a為氫。
3. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中R1為氫。
4. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中R3為氫或-CH3。
5. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中R2為氫、-CH3或-CH2CH 3。
6. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中R4為氫。
7. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中一種或一種以上選自由以下組成 的群組的酶在裂解前存在于細胞質中：Y -谷氨酰基激酶、Glu-5-P脫氫酶、糖酵解/乙酰 基-CoA生物合成多酶、乙酰基-CoA乙酰基轉移酶、β -氧化多酶、巴豆酰基-CoA還原酶、乙 酰基-CoA羧化酶、丙二酰基-CoA還原酶、蘇氨酸醛縮酶、β -丙氨酸轉移酶、脯氨酸3-羥 化酶、脯氨酸氧化酶和其同工酶。
8. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中一種或一種以上選自由以下組成的 群組的酶在裂解前被隔離在所述細胞的壁膜間隙中：羧甲基-Pro合酶、碳青霉烷合成酶、 β-內酰胺合成酶、碳青霉烯合酶、轉移酶、加氧酶和甲基轉移酶和其同工酶。
9. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中所述細胞裂解物是經改造以過表達 所述酶群組的大腸桿菌生物體的裂解物。
10. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中所述式（iv)脯氨酸化合物：
或其鹽在與脯氨酸氧化酶接觸后被酶促轉化為下式的吡咯化合物：
或其鹽；且其中葡萄糖或其鹽被酶促轉化為式（iii)的任選地經取代的CoA化合物：
或其鹽；其中-SCoA是輔酶A單價基團。
11.根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中所述式（iv)脯氨酸化合物：
或其鹽，其中R5為氫，在與脯氨酸-3-羥化酶接觸后被酶促轉化為下式的3-羥化脯氨 酸化合物：
或其鹽；且所述式（iv-a)的3-羥化脯氨酸化合物或其鹽在與脯氨酸氧化酶接觸后被 酶促轉化為下式的3-羥化吡咯化合物：
12. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中所述葡萄糖和甘氨酸或其鹽在與 一種或一種以上選自由糖酵解/乙酰基-CoA生物合成多酶、乙酰基-CoA羧化酶、丙二酰 基-CoA還原酶、蘇氨酸醛縮酶、γ -谷氨酰基激酶和Glu-5-P脫氫酶和其同工酶組成的群 組的酶接觸后被酶促轉化為式（ii)的任選地經取代的谷氨酸半醛： 或其鹽；且
其中葡萄糖或其鹽被酶促轉化為式（iii)的任選地經取代的CoA化合物：
或其鹽；其中-SCoA是輔酶A單價基團。
13. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中所述式（i)的任選地經取代的谷氨 酸或其鹽在與谷氨酰基激酶和Glu-5-P脫氫酶接觸后被轉化為式（ii)的任選地經取 代的谷氨酸半醛化合物：
或其鹽；且 其中葡萄糖或其鹽被酶促轉化為式（iii)的任選地經取代的CoA化合物：
或其鹽；其中-SCoA是輔酶A單價基團。
14. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中所述式（i)的任選地經取代的谷氨 酸：
或其鹽在與谷氨酰基激酶-GP-還原酶多酶復合體接觸后被酶促轉化為式（iv)脯 氨酸化合物：
或其鹽。
15. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中所述細胞將葡萄糖與甘氨酸或其 鹽的所述組合、或葡萄糖與式（i)的任選地經取代的谷氨酸或其鹽的所述組合轉化為式 (iii)的任選地經取代的CoA化合物或其鹽以及式（ii)的任選地經取代的谷氨酸半醛或其 鹽：
其中-SCoA是輔酶A單價基團；且 其中所述式（ii)的任選地經取代的谷氨酸半醛或其鹽和所述式（iii)的任選地經取 代的CoA化合物或其鹽在與羧甲基-Pro合酶或其同工酶接觸后生成式（ΙΙ-a)的吡咯烷基 化合物：
或其鹽。
16. 根據權利要求1或2所述的裂解物或方法，其中所述細胞將葡萄糖或其鹽和所述 式（iv)脯氨酸化合物或其鹽的所述組合轉化為式（iii)的任選地經取代的CoA化合物或 其鹽以及式（v)吡咯化合物或其鹽：
其中-SCoA是輔酶A單價基團；且 其中式（iii)的任選地經取代的CoA化合物或其鹽以及式（v)吡咯化合物或其鹽在與 羧甲基-Pro合酶或其同工酶接觸后生成式（ΙΙ-a)的吡咯烷基化合物： 或其鹽。
17. 根據權利要求15或16所述的裂解物或方法，其中所述吡咯烷基化合物（ΙΙ-a)或 其鹽在與碳青霉烷合成酶、β_內酰胺合成酶或其同工酶接觸后生成式（ΙΙΙ-a)的β-內 酰胺化合物：
或其鹽。
18. 根據權利要求17所述的裂解物或方法，其中所述式（ΙΙΙ-a)的β-內酰胺化合物 或其鹽在與碳青霉烯合酶或其同工酶接觸后生成式（I-a)化合物：
或其鹽，其中=代表雙鍵。
19. 根據權利要求18所述的裂解物或方法，其中R5為氫。
20. 根據權利要求19所述的裂解物或方法，其進一步包含使所述式（I-a)化合物：
或其鹽，其中=代表雙鍵； 與轉移酶和下式的化合物接觸： HSR8 其中R8選自由以下組成的群組：任選地經取代的烷基、任選地經取代的烯基、任選地經 取代的炔基、任選地經取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任選地經取代的雜炔基、任 選地經取代的碳環基、任選地經取代的雜環基、任選地經取代的芳基和任選地經取代的雜 芳基； 以提供式α-c)含硫醇化合物： 或其鹽。
21. 根據權利要求20所述的裂解物或方法，其中R8是任選地經取代的烷基、任選地經 取代的雜烷基或任選地經取代的雜環基。
22. 根據權利要求21所述的裂解物或方法，其中R8選自由以下組成的群組：
其中Γ是抗衡離子。
23. 根據權利要求18所述的裂解物或方法，其中R5是-OH。
24. 根據權利要求23所述的裂解物或方法，其中使所述式（I-a)化合物：
或其鹽或互變異構體或其組合，其中==代表雙鍵； 與下式的化合物接觸： R8' -X 其中： X是離去基團；且 f 選自由以下組成的群組：_C( = 0)R8a、_C( = 0)0R8a、-C( = 0)SR8a、-C( = 0) N(R8b)2、-C( = NR8b)R8a、_C( = NR8b)0R8a、-C( = NR8b)SR8a、-C( = NR8b)N(R8b)2、-C( = S)R8a、-C( = S)0R8a、-C( = S)SR8a、-C( = S)N(R8b)2、-C( = 0)NR8bS02R8a、-S( = 0) R8a、-S02R8a、-S02N(R 8a)2、-Si(R8a)3、-P( = 0)(R8a)2、-P( = 0)(0R8a)2、-P( = 0)(R8a) (0R8a), -P( = 0) (R8a) (N(R8b)2), -P( = 0) (N(R8b)2)2, -P( = 0)2R8\ -P( = 0)20R8\ -P(= 0)2N(R8b) 2、-B (R8a)2、-B (0R8a)2和-BR8a(0R8a)，其中如果氧保護基團附接到氧原子，且如果 硫保護基團附接到硫原子，那么R 8a選自由以下組成的群組：任選地經取代的烷基、任選地 經取代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任 選地經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、任選地經取代的雜環基、任選地經取代的芳 基、任選地經取代的雜芳基，或兩個R 8a基團或R8a與R8b基團接合形成任選地經取代的雜環； 且R 8b在每一情況中獨立地選自由以下組成的群組：氫、任選地經取代的烷基、任選地經取 代的烯基、任選地經取代的炔基、任選地經取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任選地 經取代的雜炔基、任選地經取代的碳環基、任選地經取代的雜環基、任選地經取代的芳基、 任選地經取代的雜芳基和氮保護基團，或兩個R 8b接合形成任選地經取代的雜環； 以提供式（I-e)化合物： 或其鹽。
25. 根據權利要求24所述的裂解物或方法，其中使所述式（I-e)化合物與式HS-R8化 合物接觸， 其中R8選自由以下組成的群組：任選地經取代的烷基、任選地經取代的烯基、任選地經 取代的炔基、任選地經取代的雜烷基、任選地經取代的雜烯基、任選地經取代的雜炔基、任 選地經取代的碳環基、任選地經取代的雜環基、任選地經取代的芳基和任選地經取代的雜 芳基； 以提供式（I-c)含硫醇化合物：
或其鹽。
26. 根據權利要求15到25中任一權利要求所述的裂解物或方法，其中R2是一CH2CH3。
27. 根據權利要求26所述的裂解物或方法，其進一步包含使所述化合物與加氧酶接觸 以提供其中R2是_CH(OH)CH 3的羥化化合物。
28. 根據權利要求15到25中任一權利要求所述的裂解物或方法，其中R1和R2二者都 為氫。
29. 根據權利要求28所述的裂解物或方法，其進一步包含使所述化合物與甲基轉移酶 接觸以提供其中R1是氫且R 2是_CH3或-CH2CH3的化合物。
30. 根據權利要求29所述的裂解物或方法，其進一步包含使其中R2是-CH2CH3的所述 化合物與加氧酶接觸以提供其中R 2是_CH(OH)CH3的羥化化合物。
31. -種醫藥組合物，其包含通過根據權利要求2到30中任一權利要求所述的方法制 備的化合物或其鹽以及醫藥上可接受的賦形劑。
32. -種治療細菌感染的方法，其包含向有需要的個體投與治療有效量的通過根據權 利要求2到30中任一權利要求所述的方法制備的化合物或其鹽或根據權利要求31所述的 醫藥組合物。
【文檔編號】C12N15/52GK104093848SQ201280054408
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年9月7日 優先權日:2011年9月9日
【發明者】威廉·杰瑞米·布雷克, 丹尼爾·克萊恩-馬庫斯查梅爾 申請人:綠光生物科學公司