從絲狀菌生產有用代謝產物的方法

從絲狀菌生產有用代謝產物的方法
【專利摘要】本發明涉及從絲狀菌生產莽草酸等有用代謝產物的方法。通過包括以下工序的生產方法，能夠得到有用代謝產物，該工序為通過抑制絲狀菌的生長，特別是通過賦予比570nm短的中心波長的光刺激，使菌絲中的有用代謝產物的含量增加。
【專利說明】從絲狀菌生產有用代謝產物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及從絲狀菌生產有用代謝產物的方法。更詳細地涉及通過在絲狀菌培養時施加特定波長的光刺激等，使菌絲中的莽草酸等代謝產物含量增加的方法。
【背景技術】
[0002]莽草酸是植物、微生物中包含的各種芳香族化合物共同的生物合成中間體，對植物、微生物而言是極其重要的物質。另外，該莽草酸是作為新型流行性感冒治療藥的奧司他韋(Oseltamivir) (TAMIFLU/達菲)(注冊商標)的制造原料使用之外，還可以作為多種醫藥品、農藥制造原料使用的極其有用的化合物。
[0003]莽草酸現在主要通過從八角茴香(八角)中提取、精制而制造。但是，從天然物的提取法的情況下，其成分含量有不固定等的問題，因此研究著能夠穩定地進行制造的方法。例如，作為合成的制造方法，報告了從奎尼酸使用維爾斯梅爾試劑(Vilsmeier reagent) >選擇性地脫水制造莽草酸衍生物的方法(專利文獻I)，從間苯二甲酸制造二氨基莽草酸的方法(專利文獻2)，從呋喃制造二氨基莽草酸的方法(專利文獻3)等。這些方法都是莽草酸衍生物的制造方法，為了制造目標莽草酸還需要進一步的工序。
[0004]另外，作為從奎尼酸的制造方法，報告了使用來自醋酸菌的莽草酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，以2階段制造莽草酸的方法(專利文獻4)，使奎尼酸成為奎尼酸酯的縮醛體后，再開始制造莽草酸的方法(專利文獻5)等。作為利用微生物的制造方法，報告了使用檸檬酸桿菌屬微生物的制造方法(專利文獻6和7)等，還報告了以在咖啡渣中包含的綠原酸為原料，使具有綠原酸分解酶的微生物作為微生物催化劑使其反應而制造莽草酸的方法(專利文獻8)等。另外，作為利用發酵法的制造方法，還已知使用大腸桿菌由發酵使其生成的方法(非專利文獻I)。
[0005]另一方面，目前為止，本發明的發明人報告了作為擔子菌的一種的平菇的菌體生長被藍色光抑制、以及對藍色光顯示基因表達應答(非專利文獻2和3)。但是，完全不知道平菇通過受到藍色光刺激，生長被抑制，由此會產生怎樣的代謝產物。
[0006]現有技術文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:日本特許第3641384號公報
[0009]專利文獻2:日本特開2001-354635號公報
[0010]專利文獻3:日本特開2001-288152號公報
[0011]專利文獻4:日本特開2007-300809號公報
[0012]專利文獻5:日本特開平11-349583號公報
[0013]專利文獻6:日本特開2000-78967號公報
[0014]專利文獻7:日本特開2002-281993號公報
[0015]專利文獻8:日本特開2009-201473號公報
[0016] 非專利文獻[0017]非專利文獻I:B.A.Bohm, Chemical Reviews, 65，435-466 (1965)
[0018]非專利文獻2:Nakano et al., Biosci Biotechnol Biochem.2010 ；74 (10):2160-5
[0019]非專利文獻3 =Nakano et al.，J.Light&Vis.Env.，35(1):90-942011
【發明內容】

[0020]發明所要解決的課題
[0021]以往的莽草酸的制造方法，因為在制造中都需要幾個階段的工序，所以，在制造中必需要長時間和高成本，存在不適合大量生產的問題。本發明的發明人在為了解決該問題而進行的研究中，獲得了通過對絲狀菌進行光刺激可以生產有用代謝產物的發現，即，通過用藍色光刺激平菇等絲狀菌，菌絲體中的莽草酸量飛躍性地增加，除此以外，來自用藍色光刺激后的菌體中的有機層的提取物顯示抗腫瘤作用等，進一步進行深入研究，結果完成了本發明。[0022]用于解決課題的方法
[0023]即，本發明涉及以下的絲狀菌的有用代謝產物及其生產方法。
[0024][I] 一種有用代謝產物的生產方法，其包括通過抑制絲狀菌的生長，使菌絲中的有用代謝產物的含量增加的生長抑制工序。
[0025][2]在[I]中記載的有用代謝產物的生產方法，其中，生長抑制工序通過對絲狀菌賦予比570nm短的中心波長的光刺激，抑制該絲狀菌的生長。
[0026][3]在[I]或[2]中記載的方法，其包括從絲狀菌中提取有用代謝產物的工序。
[0027][4]在[I]~[3]的任意一項中記載的方法，其中，絲狀菌為擔子菌。
[0028][5]在[4]中記載的方法，其中，擔子菌為平菇屬。
[0029][6]在[2]~[5]的任意一項中記載的方法，其中，光刺激為藍色光的光刺激。
[0030][7]在[2]~[6]的任意一項中記載的方法,其中，以IOymolnT2S4以上照射光刺激。
[0031][8]在[2]~[7]的任意一項中記載的方法，其中，以斷續的照射給予光刺激。
[0032][9]在[I]~[8]的任意一項中記載的方法，其中，有用代謝產物為莽草酸。
[0033][10]在[I]~[8]的任意一項中記載的方法，其中，有用代謝產物為抗腫瘤性物質。
[0034][11]由[I]~[10]的任意一項中記載的方法生產得到的有用代謝產物。
[0035]發明的效果
[0036]本發明的有用代謝產物的生產方法，能夠從絲狀菌有效地生產在醫藥等中所使用的生理活性物質和成為醫藥品原料的前體等。通過本發明，例如，能夠從絲狀菌有效地生產
莽草酸。
[0037]本發明的莽草酸的制造方法，只通過一階段的工序，就能夠使絲狀菌的菌絲中的莽草酸含量飛躍性地增加、積累。本發明的方法因為使用市售的廉價材料，能夠高效率地得到莽草酸，所以，能夠以低成本且短時間制造莽草酸，可以穩定地供給莽草酸。
[0038]本發明的莽草酸的制造方法是利用由光產生的菌類的生長抑制機理的方法，推斷通過對暗處培養的絲狀菌給予光刺激，在菌絲中生物合成莽草酸后，阻斷芳香族氨基酸生物合成路徑，使莽草酸在菌絲中積累，由此能夠使莽草酸含量飛躍性地增加。
[0039]另外，也能夠以得到的莽草酸為起始物質，得到新的產物。即，本發明的芳香族氨基酸生物合成路徑的阻斷機理不僅得到莽草酸，而且通過加上再使其進一步反應的工序，能夠提供用于得到以莽草酸為前體所合成的其它物質的手段。通過在藥劑等中應用這些被合成的物質，能夠貢獻于醫療領域。
[0040]此外，本發明的有用代謝產物的生產方法，還能夠生產抗腫瘤性物質等生理活性物質。由本發明生產的抗腫瘤性物質，能夠有效地抑制參與癌轉移的FABP5基因的表達，即使微量，抗腫瘤效果也高，能夠提供安全的抗腫瘤劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1是表示照射的光的波長與平菇菌絲生長的關系的圖。
[0042]圖2是表示照射的藍色光的強度與平菇菌絲生長的關系的圖。
[0043]圖3是表示斷續地進行藍色光照射時的平菇菌絲生長變化的圖。
[0044]圖4是表示通過有機成分添加的細胞數的觀察結果的照片圖。
[0045]圖5是表示利用半定量PCR法的β -actin基因的表達解析結果的圖。
[0046]圖6是表示利用半定量PCR法的c-myc基因的表達解析結果的圖。
[0047]圖7是表示利用半定量PCR法的Smad4基因的表達解析結果的圖。
[0048]圖8是表示利用定量PCR法的FABP5基因的表達解析結果的圖。
【具體實施方式】
[0049]在本發明的有用代謝產物的生產方法中使用的絲狀菌，可以使用擔子菌類、子囊菌類、接合菌類、變形菌類等，但特別優選擔子菌類。在擔子菌中包含平菇屬和香菇屬等，具體地包含糖皮側耳菌(Pleurotus ostreatus)、刺芳:側耳菌(Pleurotus eryngii)、埃杜香恭(Lentinula edodes)等。在本發明中使用的擔子菌優選平燕屬,特別優選平燕。
[0050]本發明的有用代謝產物的生產方法，可以包括通過抑制絲狀菌的生長而使菌絲中的有用代謝產物的含量增加的生長抑制工序。這樣的生長抑制工序，優選通過賦予光刺激，抑制絲狀菌的生長。
[0051]光刺激優選為單色可見光，包含紫色、藍紫色、藍色、藍綠色、綠色和黃綠色的可見光，優選為藍色光，但也可以為近紫外線(例如UVA等)。另外，也可以包括在光照射前進行絲狀菌培養的培養工序。賦予光刺激時的絲狀菌的狀態沒有特別限定，菌絲體、子實體的任意一種都能夠適用，在使用菌絲體時能夠縮短培養時間。
[0052]光的波長希望是比570nm短的中心波長，優選為400~545nm，更優選為450~495nm,更加優選為460~480nm。另外，也可以為315~400nm。
[0053]光量子束密度希望為10μ molm-2 s-1以上，沒有特別限定，可以設為10~1000 μ moIm 2S \優選為30~500 μ moIm 2S \更優選為50~200 μ moIm 2S \更加優選為90 ~120 μ mo Im 2S、
[0054]照射時間沒有特別限定，但希望一次照射3小時以上，優選為12~120小時，更優選為24~60小時。另外，照射優選連續進行，但也可以反復暗處培養和明處培養(照射)。例如，可以每1、2、3、4或5天反復暗處培養和明處培養(照射)。[0055]作為光照射裝置，沒有特別限定，可以使用產生單色可見光和近紫外線等光刺激的裝置。例如，可以使用LED光照射裝置。
[0056]本發明的有用代謝產物的生產方法，可以包括從絲狀菌提取有用代謝產物的工序。提取物可以使用利用有機溶劑分離為有機層和水層的方法，代謝產物的提取溶劑沒有特別限定，可以使用甲醇、水、氯仿和二氯甲烷等。其它的也可以組合使用醋酸甲酯、醋酸乙酯等酯、丙酮等酮、二乙醚等醚、二甲苯、甲苯、苯等芳香族烴、己烷等脂肪族烴等有機溶劑以及甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等醇等。典型地，在有機層中含有較多的抗腫瘤性物質，在水層中含有較多的莽草酸。
[0057]本發明的有用代謝產物的提取方法，例如，作為溶劑，可以使用甲醇、氯仿和水。具體而言，在菌體中加入甲醇，破碎菌體后，相對甲醇，添加等量的氯仿和2/5量的水，進行離心分離等，能夠分離為水層和有機層。對于得到的水層和有機層，可以進一步進行離心分離和超濾等。典型地，從水層能夠回收莽草酸等的有用代謝產物，從有機層能夠回收本發明的抗腫瘤性物質。
[0058]因此，本發明的有用代謝產物的生產方法包括有用代謝產物的提取工序，其包括菌體的破碎工序、離心分離工序、使用有機溶劑等的提取工序以及分離和干燥等的精制工序。
[0059]本發明的有用代謝產物包含一次代謝產物和二次代謝產物，包含莽草酸等芳香族化合物的中間體和抗腫瘤物質等生理活性物質等。
[0060]本發明的一個方面涉及莽草酸的制造方法。
[0061]在本發明的一個方式中，本發明的莽草酸的制造方法，其特征在于，包括通過抑制絲狀菌的生長，使菌絲中莽草酸含量增加的生長抑制工序。
[0062]另外，其特征在于，上述絲狀菌為菌絲體。
[0063]另外，其特征在于，上述生長抑制工序為通過對上述絲狀菌賦予光刺激來抑制該絲狀菌生長的工序。
[0064]另外，其特征在于，上述光刺激中所使用的光為波長比570nm短的光。
[0065]另外，其特征在于，上述光刺激中所使用的光為藍色光。
[0066]另外，其特征在于，作為上述生長抑制工序的前工序，具備進行絲狀菌培養的培養工序。
[0067]本發明的莽草酸的制造方法，基于如下發現:在植物、菌類的生長速度與形態形成的控制以及在含有功能性營養成分量的增加中，光的刺激扮演著重要角色，其中，如果對營養生長期的平菇菌絲照射特定波長以下的光，則菌絲生長就被顯著抑制。另外還基于如下發現:該抑制在被照射的光是比綠色光波長短的光時、特別是為藍色光時顯著出現，其抑制程度依賴于被照射的光的光量子束密度。
[0068]本發明的莽草酸的制造方法，如上所述，是利用由光產生的菌類生長抑制機理的制造方法，推斷通過對暗處培養的絲狀菌給予光刺激，在菌絲中莽草酸被生物合成后，阻斷芳香族氨基酸生物合成路徑，使莽草酸在菌絲中積累，由此能夠使莽草酸含量飛躍性地增加。
[0069]作為植物的藍色光受體，發現有隱花色素和向光素。關于菌類的藍色光受體，充分研究了子囊菌的粗糙鏈孢霉具有的WCl和WC2，可以認為參與類胡蘿卜素的合成和生物鐘的光控制。另外，作為WCl和WC2的同源基因，在被分類為與平菇相同的擔子菌的灰蓋鬼傘菌(Coprinopsis cinerea)中報告了 dstl,在接合菌中報告了須霉的madA。這樣,編碼藍色光受體的基因，廣泛保存于植物和菌類，因此可以認為藍色光是在生物體控制系統中扮演著非常重要角色的光。關于菌類的光受體或由光受體的作用產生的芳香族氨基酸生物合成路徑的阻斷、由此產生的生長抑制作用，能夠作為發明的新構成或作為新的發明，在本發明的內部或外部適用。
[0070]在本發明的莽草酸的制造方法中，對于使莽草酸含量增加的菌類沒有特別限制，只要是具有光受體和莽草酸路徑的菌類，則任意一種都能夠適用。具體而言，可以在平菇、香菇、其它的子囊菌類、擔子菌類、接合菌類、變形菌類等中適用，但特別優選擔子菌類。另外，賦予光刺激時的絲狀菌的狀態沒有特別限制，菌絲體、子實體的任意一種都能夠適用。其中，使用菌絲體時，因為可以縮短培養時間而優選。
[0071]在本發明的莽草酸的制造方法中，關于照射的光的光源沒有特別限制，只要是可以得到特定波長的光的光源，任意一種都能夠適用。其中，LED消耗電能低而優選。另外，關于光的波長，沒有特別限制，只要能夠得到菌類的生長抑制作用的波長的光，則任意一種都能夠適用。具體而言，可以適用可見光、紅外線、紫外線、其它的電磁波，優選為單色可見光和近紫外線。此外，由溫度、聲音等光以外的刺激，也具有能夠得到菌類的生長抑制作用的可能性。其中，生長抑制作用由光的波長為495nm至570nm范圍的綠色光確認，當從380nm至495nm范圍的藍色光時，因為效果顯著而優選。
[0072]本發明的一個方面涉及抗腫瘤性物質的制造方法。
[0073]本發明的抗腫瘤性物質的制造方法可以包括從絲狀菌中提取有用代謝產物的工序。提取物可以使用利用有機溶劑分離為有機層和水層的方法，代謝產物的提取溶劑沒有特別限定，可以使用甲醇、水、氯仿和二氯甲烷等。此外，可以組合使用醋酸甲酯、醋酸乙酯等酯，丙酮等酮，二乙醚等醚，二甲苯、甲苯、苯等芳香族烴，己烷等脂肪族烴等的有機溶劑及甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等醇。本發明的抗腫瘤性物質典型地可以從有機層較多提取。
[0074]本發明的抗腫瘤性物質具有癌細胞的增殖抑制活性或細胞凋亡誘導活性。另外，可以有效地抑制FABP5基因的表達，即使微量也具有優異的抗腫瘤活性。
實施例
[0075]通過以下的實施例詳細說明本發明的有用代謝產物的生產方法，但本發明不受各實施例限定。
[0076]〈實施例1>
[0077](使用設備)
[0078]在本實施例中作為植物培養裝置使用的設備是CCS公司生產的ELUX-1096LED植物培養裝置。在本實施例中，將其設定在設定溫度20°C，進行平菇中的莽草酸的制造實驗。作為對平菇菌絲進行照射的光的光源，使用CCS公司生產的LED光源面板ISL系列305X302。另外，在發光強度的測定中，在L1-COR公司生產的L1-205Light-Meter上安裝該公司生產的LI_190QuantumSensor或PPSystem International公司生產的660/730nmSKRl IOSensor 來使用。
[0079] (接種源菌絲體的制備)[0080]在Pyrex (注冊商標)玻璃培養皿(內徑90mm)內配制的2.5%瓊脂濃度改良MA培養基(組成:2%麥芽提取物、2%葡萄糖、0.1%蛋白胨)的中央，接種作為供試菌準備的市售菌種的平菇KH-3株(株式會社千曲化成生產)，將其在溫度設定為20°C的暗處放置，進行培養。由該操作，在培養皿內，菌絲體菌落呈同心圓狀地生長，因此，從其外周部分，使用穿孔器(Cork borer)切出直徑約6mm的圓盤狀,將其作為本實施例的接種源使用。
[0081 ](進行光照射的樣品的制備)
[0082]在Pyrex (注冊商標)玻璃培養皿(內徑90_)內配制的2.5%瓊脂濃度GPY培養基(組成:5%葡萄糖、2.5%多聚蛋白胨、2.5%酵母提取物)的中央，接種如上所述準備的接種源，將其在溫度設定為20°C的暗處放置，進行培養。在本實施例中的實驗中，將直徑生長到6mm的菌落和直徑生長到20mm的菌落作為樣品使用。
[0083](光的波長的變化實驗)
[0084]改變對菌絲體照射的光的波長，進行確認光波長對菌絲生長施加的影響的實驗。對如上所述準備的樣品，照射將發光強度設定為95 μ Hi0InT2iT1的藍色、綠色、紅色、遠紅色的各波長的單色光，觀察、比較各菌絲體菌落的生長。生長變化的追蹤為如下評價方法:約每24小時測定菌絲體菌落的直徑最大值和最小值，求出其平均值，將該值作為菌絲體菌落生長量變化。另外，各單色可見光的中心波長，藍色光為470nm，綠色光為525nm，紅色光為660nm,遠紅色光為735nm。
[0085]圖1表示對樣品照射各波長的光并評價其生長得到的結果的圖。從圖中可以確認，在照射了紅色光和遠紅色光的樣品中，菌絲體菌落以與沒有照射光而在暗處培養時相同的速度生長。另外，可以確認在照射了綠色光的樣品中，菌絲的生長顯著變慢，通過藍色光的照射，菌絲的生長完全停止。由此可以確認，平菇菌絲的生長抑制在比綠色光波長短的情況下得到確認，在藍色光時是特別顯著的現象。
[0086](藍色光的發光強度的變化實驗)
[0087]改變對菌絲體照射的藍色光的發光強度，進行確認光強度對菌絲生長的影響的實驗。對如上所述準備的樣品，照射將發光強度設定為6 μ mollies'll μ moln^s'26 μ molm_2s_1>51 μ molm_2s_1和105 μ mo I IrTiV1的藍色光并且培養I周，觀察、比較各菌絲體菌落的生長。評價方法與上述實驗相同。
[0088]圖2表示使照射的藍色光的發光強度變化，評價菌絲體菌落的生長得到的結果的圖。從圖中可以確認，照射的藍色光的發光強度越大，則菌絲體菌落的生長越被抑制。另外，可以確認照射光的發光強度為105 μ Hi0InT2s-1的樣品中，生長完全停止。另外，可以確認在任意樣品中，從實驗開始經過3天以后，生長速度達到一定，穩定。由此，可以確認由藍色光照射產生的菌絲的生長抑制效果依賴于照射的光的發光強度，而且其抑制效果持續地穩定。
[0089](藍色光的斷續照射實驗)
[0090]進行評價交替反復藍色光照射和暗處保存的斷續照射，對于菌絲體菌落生長施加的影響的實驗。對如上所述準備的樣品，照射3天設定為ΙΟδμ molπ-2^1的藍色光，此后3天進行暗處培養，將其交替反復21天。評價方法與上述實驗相同。
[0091]圖3表示交替反復藍色光照射和暗處培養、評價菌絲體菌落生長得到的結果。從圖中可以確認，每3天反復藍色光照射和暗處培養時，由光照射產生的菌絲體生長被抑制的狀態和由中斷光照射產生的菌絲體菌落生長的恢復就交替出現。可以認為這是由于藍色光的信號被傳遞，從而參與平菇的菌絲生長的基因的表達和抑制被反復誘導的緣故。
[0092](莽草酸的提取方法)
[0093]為了評價通過上述實驗生長的平菇菌絲中的莽草酸的含量，進行菌絲體含有代謝產物的提取。提取方法如下。
[0094]1.從通過對菌絲體的藍色光照射產生的生長抑制實驗而生長到規定大小的菌絲體菌落的培養皿中，使用刮器(Sumitomo Bakelite C0., Ltd.生產，Sumilon MS-93100)(注冊商標)采集培養基表面的菌絲體。在本實施例中，使菌落的直徑生長到60mm。
[0095]I1.在上述I工序采集的試樣50mg中，冰冷下加入500 μ L包含50 μ M內部標準物質的甲醇溶液，使用臺式破碎機(BMS公司生產，BMS-M10N21)將其以1500rpm、120秒X3次的條件破碎。
[0096]In.在上述II工序中破碎的破碎溶液中添加500 μ L氯仿和200 μ LMill1-Q水，攪拌混合，將其以2300Xg、4°C、120分鐘的條件進行離心分離。
[0097]IV.在上述III工序中離心分離的溶液中，將水層在超濾管(MILLP0RE公司生產，UltraFree MC UFC3LCC離心式過濾單元5kD)中只移取400 μ LX I支。
[0098]V.將在上述IV工 序中移取的溶液再以9100 X g、4°C、120分鐘的條件進行離心分離，進行超濾。
[0099]V1.使上述V工序的濾液干燥固化，再將其溶解于25 μ L Mill1-Q水，將其作為在生長實驗中得到的菌絲體的評價用試樣。
[0100](莽草酸的定量)
[0101]對于由上述方法準備的各試樣，定量解析含有的莽草酸。解析中使用的設備使用毛細管電泳_飛行時間型質譜(AgilentTechnologies公司生產,Agilent CE-TOFMSSystem)，將其設定為陰離子模式，進行各試樣的陰離子性代謝物質分析。就解析中使用的試樣而言，對于將平燕在暗處培養的0M-1、對與OM-1同樣的起始試樣照射12小時藍色光的0M-2、同樣地照射36小時藍色光的0M-3這3種試樣進行解析。
[0102][表1]
[0103]

檢體名稱~1m-1 1m-2|om-3
含量 μ g/g 2.3 Π6 ￥0
[0104]表1表示由上述方法進行莽草酸的定量解析的結果。含量的計算通過在使用CE-TOFMS測得的濃度(nmol/g)上乘以莽草酸的分子量174.15而進行。從表中可以確認，隨著對試樣照射的藍色光的照射時間變長,試樣中的莽草酸的含量增加。由此可以確認本發明的菌絲體中的莽草酸的增加量與藍色光照射的照射時間有較強的相關性。
[0105]另外，可以確認本發明的方法對于使菌絲體中的莽草酸含量增加有效。
[0106]<實施例2 >
[0107](培養條件和有機層成分的提取方法)
[0108]使用與實施例1中記載的莽草酸的提取方法同樣的方法，從有機層中提取有機層成分。[0109](提取物對癌細胞增殖的影響)
[0110]對于得到的有機層成分研究對癌細胞增殖的效果。
[0111]用添加有10% FBS (MP Biomedicals公司生產)的RPMI培養基(SIGMA公司生產)培養人前列腺癌細胞PC-3 (從Japan Health Sciences Foundation (財團法人日本健康科學振興財團)獲得)。使用如上所述制備的有機層成分，由細胞數的顯微鏡觀察解析對PC-3細胞的細胞增殖的影響(圖4)。
[0112]以最終濃度為0.2% (v/v)和2% (v/v)的方式在培養基中添加以乙醇(EtOH)溶解的從在暗處(Oh)和藍色光(48小時)照射條件下培養的菌絲體中提取的有機層成分，在培養48小時后，用顯微鏡觀察細胞數。
[0113]如圖4所示，相比于對照(圖4A)，通過添加來自暗處的樣品，可見依賴于濃度的細胞數的減少(圖4B、C)。另外，即使在添加藍色光照射樣品中也同樣地可見細胞數的減少，但是相比于來自暗處的樣品，藍色光照射樣品的細胞增殖抑制效果更加顯著(圖4D、E)。
[0114](被提取物處理過的癌細胞的利用半定量RT-PCR的基因表達解析)[0115](I)試樣的制備
[0116]將培養的PC-3細胞在6孔板(NUNC(注冊商標MULTIDISH))中培養到各孔達到50%。對其使用上述制備的有機層成分，進行利用半定量RT-PCR的基因表達解析。以最終濃度為0.2% (v/v)和2% (v/v)的方式在培養基中添加以乙醇(EtOH)溶解的有機層成分，培養48小時后進行半定量RT-PCR解析。
[0117]培養后，除去培養基，以PBS清洗后，添加500 μ L TRIzol，進行吹打，回收RNA。
[0118]在回收的RNA中添加100 μ L氯仿進行混合，室溫放置2~3分鐘后，進行離心分離(13000rpm、15分鐘、4°C )，回收上清液。在該上清液中添加等量異丙醇,顛倒混合,室溫放置10分鐘后，尚心分尚(13000rpm> 10分鐘、4°C )，將上清液傾析。
[0119]在其中添加70%乙醇，清洗團塊(pellet)后，離心分離(13000rpm、5分鐘、4°C )，將上清液傾析，室溫干燥團塊后,添加DEPC水20 μ L,將溶解物作為試樣。
[0120](2) RT-PCR
[0121 ] 使用ReverTra Ace (注冊商標)試劑盒(Τ0Υ0Β0公司生產)和2 X GoTaq (注冊商標)Green Master Mix (Promega 公司生產)，進行 RT-PCR。
[0122]首先，用DEPC水將在上述⑴中制備的試樣稀釋成為250ng/l.! L。將使用其設為表2的組成的液體，用熱循環儀以如下的工序I~3處理(工序1:30°C、10分鐘，工序2:42°C>60 分鐘、工序 3:95°C、5 分鐘),合成 cDNA(互補 DNA, complementary DNA)。
[0123][表2]
【權利要求】
1.一種有用代謝產物的生產方法，其特征在于: 包括通過抑制絲狀菌的生長，使菌絲中的有用代謝產物的含量增加的生長抑制工序。
2.如權利要求1所述的有用代謝產物的生產方法，其特征在于: 生長抑制工序通過對絲狀菌賦予比570nm短的中心波長的光刺激，抑制該絲狀菌的生長。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于: 包括從絲狀菌中提取有用代謝產物的工序。
4.如權利要求1~3中任一項所述的方法，其特征在于: 絲狀菌為擔子菌。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于: 擔子菌為平菇屬。
6.如權利要求2~5中任一項所述的方法,其特征在于: 光刺激為藍色光的光刺激。
7.如權利要求2~6中任一項所述的方法,其特征在于: 光刺激以IOymolnriV1以上照射。
8.如權利要求2~7中任一項所述的方法，其特征在于: 光刺激以斷續的照射給予。
9.如權利要求1~8中任一項所述的方法，其特征在于: 有用代謝產物為莽草酸。
10.如權利要求1~8中任一項所述的方法，其特征在于: 有用代謝產物為抗腫瘤性物質。
11.一種有用代謝產物，其特征在于: 其是由權利要求1~1 0中任一項所述的方法生產的。
【文檔編號】C12P7/42GK103930556SQ201280054117
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年8月6日 優先權日:2011年9月7日
【發明者】小嶋政信, 藤井博 申請人:國立大學法人信州大學