來自紅花煙草的異丙基蘋果酸合酶及其方法和用途

來自紅花煙草的異丙基蘋果酸合酶及其方法和用途
【專利摘要】本發明涉及突變、非天然存在的或轉基因植物細胞，包含：(i)至少一種多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼異丙基蘋果酸合酶并且與SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:10或SEQ?ID?NO:12或SEQ?ID?NO:14具有至少60％序列同一性的序列所組成；或者(ii)由所述多核苷酸編碼的多肽；或者(iii)與SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:11或SEQ?ID?NO:13或SEQ?ID?NO:15具有至少60％序列同一性的多肽；或者(iv)含有所述多核苷酸序列的構建體、載體或表達載體，任選地，其中所述構建體、載體或表達載體額外含有啟動子，所述啟動子包含、由或基本上由如SEQ?ID?NO:8所示的序列、或與其具有至少約60％同一性的其變體、或毛狀體啟動子所組成。
【專利說明】來自紅花煙草的異丙基蘋果酸合酶及其方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明公開來自紅花煙草(Nicotiana tabacum)的異丙基蘋果酸合酶基因以及其變體、同系物和片段。特別地，描述了為變更植物如煙草植物的蔗糖酯組合物而改變這種基因表達或由其編碼的蛋白的活性。
【背景技術】
[0002]蔗糖酯因在植物中具有殺蟲性質而廣為人知，其顯示出針對軟體昆蟲的毒性以及抗生活性，所述軟體昆蟲包括蚜蟲、螨、梨木虱、和粉虱。蔗糖酯也視作風味前體，在植物的生命期中積累在葉子表面上。其是可以在烤制材料和吸煙材料中鑒定出的穩定化合物。通過加熱從蔗糖酯中釋放出酯化的小羧酸。這些小羧酸是非常強效的風味分子，其被視為與煙草的東方風味部分地有關。蔗糖酯產生在植物的腺毛狀體細胞中。所述腺毛狀體細胞也是合成其它葉滲出物如蛋白質(phylloplanin(無對應中譯文))和雙職(cembrenoid(無對應中譯文)和IabdenoicK無對應中譯文))的地方。通過兩種截然不同的代謝阻斷產生所述蔗糖和小羧酸，其被酯化至蔗糖以生成蔗糖酯。
[0003]煙草品種在其葉表面上存 在的蔗糖酯的數量和質量上不同。作為一般規則，烤煙、白肋和馬里蘭品種積累低量的具有達5碳鏈長酰基的蔗糖酯，然而大多數東方品種和許多雪茄煙草型積累高量的具有達6碳鏈長酰基的蔗糖酯，以及在較小程度上可觀察到具有7碳鏈長酰基的酯。在煙草品種中生產的蔗糖酯中觀察到的二分(dichotomy)與單顯性基因座相關，所述單顯性基因座對其功能等位基因稱為BMVSE (含有蔗糖酯的β -甲基戊酰基)、以及對其非功能等位基因稱為bmvse。BMVSE基因組基因座定位在煙草的染色體A上。
[0004]Kroumova 和 Wagner(2009)General and Applied PlantPhysiology35, 3-4, p95_110描述了嘗試使用雙鏈干擾RNA通過反向遺傳學方法來敲低異丙基蘋果酸合酶的表達從而改變在各種植物中的蔗糖酯酰基含量。在這一研究中，所述來自潘那利番爺(Solanum pennellii)的異丙基蘋果酸合酶基因用于從cDNA中擴增部分基因。繼而將其以正義和反義方向引入至雙鏈干擾RNA構建體中，再通過農桿菌(Agrobacterium)轉化至紅花煙草 T.1.1068、粘性煙草(Nicotiana glutinosa cv.) 24a以及潘那利番茄。與未轉化的對照相比，使用紅花煙草植物獲得的結果顯示出通過減少的β -甲基戊酰基和增加的2-甲基丁酰-酰化作用而在蔗糖酯的酰基豐度上的改變。然而，獲得的紅花煙草植物患有萎黃病并且一些具有卷曲葉所以其表型受損。同樣地，轉化的粘性煙草和潘那利番茄表型受損。作者推斷異丙基蘋果酸合酶是重要的酶以及其受損可能導致不健康的植物。
[0005]在本領域中需要這樣的植物，其中蔗糖酯組合物得到調節同時將對植物的不期望影響降至最低。本發明的一個目的是滿足這種需要。

【發明內容】

[0006]本發明至少在部分上基于出人意料的發現:調節來自紅花煙草的異丙基蘋果酸合酶基因的活性或表達導致在蔗糖酯組合物中的改變，其對所述植物的整體代謝具有更少的不期望作用。所述作用的大多數集中在植物的毛狀體和次級代謝上。因此，調節來自紅花煙草的異丙基蘋果酸合酶基因的活性或表達基本上不導致相對于對照植物的植物視覺外觀改變。這是有利的，因為植物可用于各種產品的商業化生產，其中視覺外觀上的改變將是產業上不可接受的、或者可導致產量不可接受的減少。有利地，從煙草中生成的煙霧的風味譜可被改變，因此可建立新的風味譜。此外，其中蔗糖酯譜已被改變的植物的抗蟲性也可被改變。蔗糖酯的組合物可以從所述植物中提取以用于各種用途，例如在藥物、食品添加劑、吸煙風味劑中、以及作為有機殺蟲劑的組分等。
[0007] 本發明的方面和實施方案
[0008]本發明的方面和實施方案如所附權利要求所示。
[0009]在第一方面中，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼異丙基蘋果酸合酶、并且與 SEQ ID NO: 1、或 SEQ ID NO: 10、或 SEQ ID NO: 12、或 SEQ ID NO: 14 具有至少
60%序列同一性的序列所組成。
[0010]在另一方面，提供由所述多核苷酸編碼的分離多肽。
[0011]在又一方面，提供與SEQ ID NO:2、或 SEQ ID NO: 11、或 SEQ ID NO: 13、或 SEQ IDNO: 15具有至少60%序列同一性的分離多肽。
[0012]含有分離多核苷酸序列的構建體、載體或表達載體，任選地其中所述構建體、載體或表達載體另外包括啟動子，所述啟動子包含、由或基本上由如SEQ ID N0:8所示的序列、或者與所示的序列具有至少約60%同一1丨生的其變體、或者毛狀體啟動子、或者天然異丙基蘋果酸合酶啟動子所組成。
[0013]在另一方面，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由SEQ ID N0:8、或與其具有至少約60%同一性的其變體所組成。
[0014]在另一方面，提供突變、非天然存在的或轉基因的植物細胞，其含有本發明的多核苷酸的至少一種、多肽或者構建體、載體或表達載體中的至少一種。合適地，調節異丙基蘋果酸合酶的表達或由其編碼的蛋白的活性，至少植物的一部分相較于對照植物具有蔗糖酯組合物的改變，對照植物中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性未經調節。合適地，植物的視覺外觀基本上和對照植物相同。
[0015]在另一方面，提供突變、非天然存在的或轉基因的植物，其含有本發明的植物細胞。
[0016]在另一方面，提供在植物的部分中用于調節蔗糖酯量的方法，其包括下列步驟:(i)調節在植物中的異丙基蘋果酸合酶的表達或活性，優選地，其中所述異丙基蘋果酸合酶含有本文所述的多核苷酸序列或多肽序列；(ii)測量在獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉基因植物的至少部分中的蔗糖酯的量；以及(iii)鑒定突變、非天然存在的或轉基因植物，其中其蔗糖酯的量與對照植物相比已經改變，所述對照植物中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性沒有被調節；以及優選地，其中所述突變、非天然存在的或轉基因植物的視覺外觀與對照植物基本相同。
[0017]在另一方面，提供通過這種方法獲得的或可獲得的突變、非天然存在的或轉基因植物。
[0018]在另一方面，提供突變、非天然存在的或轉基因植物，其中異丙基蘋果酸合酶的表達、或由其編碼的蛋白的活性是得到調節的，以及至少植物的部分與其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性沒有得到調節的對照植物相比在蔗糖酯的組合物上具有改變，并且其中所述植物的視覺外觀與對照植物基本相同。
[0019]在另一方面，提供植物材料，包括含有來自所述植物的細胞或組織的生物質、種子或葉。
[0020]在另一方面，提供含有根據本發明的植物的部分或植物材料的煙草制品。
[0021]在另一方面，提供用于產生蔗糖酯的組合物的方法，包括下列步驟:(i)提供根據本發明的突變、非天然存在的或轉基因植物、植物材料或煙草制品的至少部分；(ii)從其中提取(例如，一種或多種)蔗糖酯；以及(iii)任選地，純化提取出的蔗糖酯。
[0022]也提供通過所述方法獲得的或可獲得的蔗糖酯的組合物。
[0023]適宜地，所述一種或多種蔗糖酯具有如圖5所示的結構，其中R3是乙酰基或氫，優選乙酰基；R1、R2和R4中的一個或多個含有至少一種6碳的酰基鏈，優選β -甲基戊酰基；以及R5是乙酰基或氫，優選地是氫。
[0024]適宜地，所述一種或多種蔗糖酯選自:如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl=丙酰基或其同分異構體、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =戍酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4=己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C14:0);如圖5所示的蔗糖酯，其中R3=乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl =戍酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =己酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C15:0);蔗糖酯具有如圖5所示的通用結構，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是戊酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0);或者蔗糖酯具有如圖5所示的通用結構，其中R3是乙酰基、Rl是丙酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0)；蔗糖酯具有如圖5所示的通用結構，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是己酰基、R4是己酰基、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C17:0);或鹿糖酯具有如圖5所示的通用結構，其中R3是乙酰基、Rl是己酰基、R2是己酰基、R4是己酰基、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C18:0)或其組合。
[0025]適宜地，所述一種或多種蔗糖酯選自:如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl=丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl =戍酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =己酰基或其同分異構體、R4=己酰基或其同分異構體、以及R 5是氫或乙酰基(C2C15:0);蔗糖酯具有如圖5所示的通用結構，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是戊酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0);或者蔗糖酯具有如圖5所示的通用結構，其中R3是乙酰基、Rl是丙酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0);蔗糖酯具有如圖5所示的通用結構，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是己酰基、R4是己酰基、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C17:0);或者蔗糖酯具有如圖5所示的通用結構，其中R3是乙酰基、Rl是己酰基、R2是己酰基、R4是己酰基、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C18:0)或其組合。
[0026]在另一方面，提供調節煙草或煙草制品風味的方法，包括:(i)加入來自本文所述的突變、非天然存在的或轉基因植物、或者植物材料的煙草或煙草制品、植物部分，優選葉，優選地其中所述突變、非天然存在的或轉基因植物、或者植物材料屬于煙草(Nicotinia)屬；或者(ii)將通過本文所述的方法獲得的或可獲得的包括含蔗糖酯的β_甲基戊酰基的組合物加入到煙草或煙草制品。
[0027]在另一方面，提供用于產生β_甲基戊酸的方法，包括以下步驟:(i)提供突變、非天然存在的或轉基因植物、植物材料或煙草制品的至少部分；(ii)水解步驟(i)提供的材料或其提取物；以及(iii)任選地分離或純化甲基戊酸。適宜地，所述植物是煙草植物，例如煙草屬的植物或紅花煙草種的植物。[0028]適宜地，所述植物的視覺外觀與對照植物基本相同。適宜地，在田間移植后三個月、或者在去稍之后36天，所述植物的視覺外觀與對照植物基本相同；優選其中，田間移植后三個月或者在去稍之后36天，突變、非天然存在的或轉基因植物的桿高與對照植物的桿高基本相同；和/或在田間移植后三個月或者在去稍之后36天，所述突變、非天然存在的或轉基因植物的葉綠素含量與對照植物的葉綠素含量基本相同。在其它實施方案中，在田間移植后三個月或者在去稍之后36天，突變、非天然存在的或轉基因植物的下列特征的任何一個或多個:成熟度、每株葉片數、桿高、葉插入角度、葉尺寸(寬度和長度)、節間距離、葉片-中脈比、以及葉片著色與對照植物基本相同。
[0029]再一方面涉及含有來自本文所述植物的細胞或組織的生物質、種子或葉，其是含有所述植物的部分或生物質、種子或葉的煙草制品。
[0030]在本公開的另一方面中也提供通過這種方法鑒定的或可鑒定的煙草材料。
[0031]所述植物的抗蟲性可以被調節。
[0032]本發明的其它方面如下所示。
[0033]含有所述分離多核苷酸的嵌合基因可操作地連接到一個或多個調控序列。
[0034]異丙基蘋果酸合酶多核苷酸構建體包含、由或基本上由至少15-30個核苷酸、30-50個核苷酸、50-100個核苷酸、100-150個核苷酸、150-200個核苷酸、200-300個核苷酸、300-400個核苷酸、400-500個核苷酸、500-600個核苷酸、600-700個核苷酸、700-1000個核苷酸、1000-1300個核苷酸、1300-1500個核苷酸或1500-1900個核苷酸所組成。可消費的產物，其整合或利用根據本發明的植物材料、生物質、種子或葉。
[0035]細胞或細胞系，其含有根據本發明的分離多核苷酸、嵌合基因、多核苷酸構建體、雙鏈RNA、綴合物或表達載體等。
[0036]用于在細胞中調節異丙基蘋果酸合酶的表達、或由其編碼的蛋白的活性的方法，所述方法包括施用本文所述的嵌合基因、多核苷酸構建體、雙鏈RNA、綴合物或表達載體。[0037]用于檢測、分離、擴增或分析異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟:提供含有多核苷酸的樣本，使所述多核苷酸雜交至另一多核苷酸分子，所述另一多核苷酸分子含有來自根據本發明的分離核苷酸序列的至少10個連續核苷酸的核苷酸序列。
[0038]調節異丙基蘋果酸合酶的表達、或由其編碼的蛋白的活性的試劑，用于調節在植物的至少部分如葉中的蔗糖酯含量的用途。
[0039]在一個實施方案中，所述試劑是或源自異丙基蘋果酸合酶核酸、嵌合異丙基蘋果酸合酶基因、含有異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的多核苷酸構建體、反義RNA、雙鏈RNA、cDNA、含有異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的綴合物以及與其共價附著的至少一種非核苷酸或非多核苷酸半體、核酶、誘變劑(mutagen)、鋅指、小分子或大范圍核酸酶。
[0040]在另一個實施方案中，所述多核苷酸片段編碼反義核酸、核酶、影響剪接體介導的反式剪接的RNA、干擾RNA (RNAi)、向導RNA、或其它非翻譯RNA等等。在另一實施方案中，所述多核苷酸片段編碼RNAi。
[0041]另一方面涉及產生煙草制品的方法，包括以下步驟:(a)從本文所述的轉基因、突變或非天然存在的 植物中獲得種子；(b)種植種子并使之生長成植物；(c)收獲植物；以及(d)從收犾的植物中制備煙早制品。
[0042]上述實施方案作為上述各方面的實施方案而公開。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1說明在葉滲出物上測量的蔗糖酯同分異構體的估計量。在來自bmvse煙草品種希克斯闊葉(HBL)以及來自BMVSE煙草品種紅色俄羅斯(RR)的綠葉盤的丙酮/甲醇洗滌中進行測量。從作為外標添加的蔗糖八乙酸酯中估計所述量。對每個品種而言，η = 4。C2C12:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =乙酰基、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基。C2C13:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯其中R3=乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 = 丁酰基、R4 =戍酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基。C2C14:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基。C2C15:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl =戍酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或者如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =己酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；C2C16:0包括具有如圖5所示的通用結構的(飽和)蔗糖酯，以及其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是戊酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體；或者其中所述蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，其中R3是乙酰基、Rl是丙酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體。C2C17:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是己酰基、R4是己酰基、以及R5是氫原子或乙酰基半體。C2C18:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是己酰基、R2是己酰基、R4是己酰基、以及R5是氫原子或乙酰基半體。
[0044]圖2顯示主要的蔗糖酯同分異構體，其按照分子量以及其在生產或不產含β -甲基戊酯的蔗糖酯的煙草品種中的存在進行分類。在分別列為C5和C6的2和3甲基丁酰基或3和4甲基戊酰酯之間沒有區別。下列術語用于定義酰基組合物。例如，提到C2C4C4C5這指分別在R3、R1、R2和R4上酰基中碳的數目。C2可以是乙酰基；C3是可以是丁酰基；C4可以是丙酰基或其同分異構體、或異丁酰基；C5可以是戊酰基(戊酰基(pentanoyl))或其同分異構體、或2-甲基-丁酰基(butyry)、或異戊酰基、或異戊酰基、或戊酰基；C6可以是己酰基或其同分異構體、或2-甲基戊酰基、或β -甲基戊酰基、或4-甲基戊酰基。乙酰基或氫可存在于R5(未顯不)，氫也是適宜的。
[0045]圖3說明支鏈氨基酸合成途徑、以及在蔗糖上酯化的酰基鏈的生成。框起的步驟代表核心支鏈氨基酸 合成途徑，其中通過每輪的縮合同分異構化作用(condensationisomerization)和脫羧作用將所述碳鏈延伸一個碳。1:乙酰乳酸合酶[2.2.1.6] ；2 --乙酰羥酸還原異構酶[1.1.1.86] ；3:3，4- 二羥酸脫水酶[4.2.1.9] ；4:支鏈氨基酸轉氨酶[2.6.1.42] ；5:支鏈酮酸脫氫酶復合物(BCKD) ([1.2.4.4] [2.3.1.168] [1.8.1.4]) ；6 --異丙基蘋果酸合酶[2.3.3.13] ；7:異丙基蘋果酸異構酶[4.2.1.33] ；8:異丙基蘋果酸脫氫酶[1.1.1.85] ；9:蘇氨酸脫氨酶[4.3.1.19]。C4:異丁酰基酯(isobutanoyl ester) ；iC5:
3-甲基-丁酰基酯(異戊酰基酯);aiC5:2-甲基-丁酰基酯(反異-戊酰基酯);iC6:
4-甲基-戊酰基酯(異-己酰基酯)；aiC6:3-甲基-戊酰基酯(反異-己酰基酯)、β -甲基戊酰基酯，BMV)。羧酸以中性形式存在，雖然名字反映出可溶的形式。建議的IPMS2催化步驟是圈中的。
[0046]圖4:顯示轉化植物的表面葉滲出物中的蔗糖四酯豐度的估計。從獨立轉化事件中所得的一月齡再生植物中收集葉。以2.5ng/mg鮮重的比添加內標(蔗糖八乙酸酯)。針對每種蔗糖酯特異的離子所記錄的信號面積加以測量，并作為內標面積的比加以繪制。與內標信號面積的比允許將葉鮮重上的信號正態化。圖2描述了此處所示的蔗糖酯的命名。八:親本品種1(326(烤煙，11 = 3)的葉滲出物的組合物和在毛狀體特異啟動子下表達SEQ IDNO:1的轉化體；B:親本品種K326的葉滲出物的組合物和在病毒啟動子控制下表達SEQ IDNO:1的轉化體；C:親本品種巴斯瑪(Basma)(東方,η = 4)的葉滲出物的組合物和在毛狀體特異啟動子下表達SEQ ID NO: 9的RNAi構建體的轉化體；以及D:親本品種巴斯瑪的葉滲出物的組合物和在病毒啟動子下表達SEQ ID Ν0:9的RNAi構建體的轉化體。C2C14:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4=戍酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基。C2C15:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl =戍酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =己酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；C2C16:0包括具有如圖5所示的通用結構的(飽和)蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是戊酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體；或者其中蔗糖酯具有如圖5所示的通用結構以及其中R3是乙酰基、Rl是丙酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體。C2C17:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是己酰基、R4是己酰基、以及R5是氫原子或乙酰基半體。C2C18:0包括如圖5所示的(飽和)蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是己酰基、R2是己酰基、R4是己酰基以及R5是氫原子或乙酰基半體。 [0047]圖5說明蔗糖酯支架的結構。Rl至R5是氫原子或通過酯鍵連接的酰基半體。
[0048]圖6說明在蔗糖酯上酯化的酰基鏈。R’代表蔗糖分子。1.乙酰基、2.丁酰基、
3.丙酰基、4.異丁酰基、5.戊酰基(戊酰基)、6.2-甲基-丁酰基、7.異戊酰基、8.異戊酰基、9.戊酰基、10.己酰基或其同分異構體、11.2-甲基戊酰基、12、β-甲基戊酰基、13.4-甲基戊酰基。也考慮同分異構體及其衍生物。因此，例如，所述同分異構體可以是丙酰基的同分異構體，例如異丁酰基。再例如，所述同分異構體可以是戊酰基(戊酰基)的同分異構體，如2-甲基-丁酰基、或異戊酰基；或者具有雙鍵的戊酰基(戊酰基)的同分異構體，例如異戊酰基或戊酰基。又例如，所述同分異構體可以是己酰基的同分異構體，例如2-甲基戊酰基、甲基戊酰基、或4-甲基戊酰基。所述同分異構體可包含或者可不包含一個或更多雙鍵。
具體實施方案
[0049]定義
[0050]在本申請的范圍內，所用的技術術語和表達通常被給予普遍適用于植物和分子生物學相關領域中的含義。所有下列術語定義適用于本申請中的全部內容。詞“包括”不排除其它元素或步驟，并且不定冠詞“一”或“一個”不排除復數。單個步驟可能實現權利要求中記載的幾個特征的功能。一個給定計算值或范圍的上下文中，術語“約”、“基本上”和“近似地”指給定值或范圍的20%內、10%內、或5%、4%、3%、2%或1%內的值或范圍。
[0051]術語“分離的”是指取自其天然環境的任何實體，但是所述術語并不意味著任何程度的純化。
[0052]術語“載體”是指核酸載體，其包括能夠轉運核酸、核酸構建體和核酸綴合物等等的核酸組分的組合。合適的載體包括能夠進行染色體外復制的附加體，如環形、雙鏈核酸質粒；線性化的雙鏈核酸質粒；以及任何來源的其它載體。
[0053] “表達載體”是指核酸載體，其包括能夠表達核酸、核酸構建體和核酸綴合物等等的核酸組分的組合。合適的表達載體包括能夠進行染色體外復制的附加體，如環形、雙鏈核酸質粒；線性化的雙鏈核酸質粒；以及任何來源的其它功能等同的表達載體。表達載體包括至少一個位于上游的并且可操作地連接至如下所限定的核酸、核酸構建體或核酸綴合物的啟動子。
[0054]術語“構建體”是指雙鏈、重組核酸片段，其包括一個或多個多核苷酸。構建體包括與互補的“有義或編碼鏈”堿基配對的“模板鏈”。給定的構建體可以按兩個可能的方向插入到載體中，相對于位于載體(如表達載體)中啟動子的方向相同(或有義)方向或相反(或反義)方向。示例構建體如SEQ ID N0:9所示。
[0055]“啟動子”是指通常位于上游并且可操作地連接至雙鏈核酸片段的核酸元件/序列。啟動子可完全源自靠近目標天然基因的區域，或可由源自不同天然啟動子或合成核酸節段的不同元件所組成。示例啟動子如SEQ ID N0:8所示。
[0056]術語“同源性、同一性或相似性”是指通過序列比對比較的兩個多肽之間或兩個核酸分子之間序列相似性的程度。待比較兩個離散核酸序列之間的同源性程度是在可比較的位置上相同的、或匹配的核苷酸數目的函數。百分比同一性可通過目測和數學計算來確定。或者，可以通過使用計算機程序如ClustalW、ClustalX、BLAST、FASTA或Smith-Waterman比較序列信息來確定兩個核酸序列的百分比同一性。
[0057]術語“植物”是指在其生命周期或發育的任何階段的任何植物及其后代。在一個實施方案中，植物是煙草植物，其是指屬于煙草屬的植物。本文描述了煙草植物的優選物種、栽培品種、雜種和品種。
[0058]“植物細胞”指植物的結構和生理單元。植物細胞可以是沒有細胞壁的原生質體的形式、分離的單細胞或培養細胞、或作為更高組織單元的部分，例如而不限于植物組織、植物器官或整個植物。
[0059]術語“植物材料”是指可獲自植物的任何固體、液體或氣體組合物、或其組合，其包括生物質、葉、葉片、中脈、莖、根、花或花部分、果實、花粉、卵細胞、受精卵、種子、插條、分泌物、提取物、細胞或組織培養物、或植物的任何其它部分或產品。在一個實施方案中，植物材料包括或由生物質、種子或葉組成。在另一個實施方案中，植物材料包括或由葉組成。
[0060]術語“品種”是指共享恒定特性的植物群體，所述特性將其從相同物種的其它植物中分離出來。當具有一個或多個獨特性狀時，品種還特征在于所述品種內個體間非常小的整體差異。品種往往是市售的。
[0061]本文所用術語“系”或“育種系”表示植物育種期間所使用的一組植物。系不同于品種，因為系表現個體間一個或多個目標性狀的小差異，盡管對于其它性狀可能有一些個體間差異。
[0062]術語“調節”可指減少、抑制、增加或其它影響多肽活性。所述術語也可指減少、抑制、增加或其它影響編碼多肽的基因活性，其可包括而非限制于調節轉錄活性。
[0063]此處所用術語“減少”或“減少的”是指從約10%至約99%的減少，或至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %、至少99 %、或至少100 %、或更多的量或活性的減少，例如但不限于多肽活性、轉錄活性、和/或蛋白表達。
[0064]如本文所用，術語“抑制”或“抑制的”是指從約98%至約100%的減少，或至少98%、至少99%、但尤其是100%的量或活性的減少，例如但不限于多肽活性、轉錄活性和/或蛋白表達。
[0065]本文所用術語“增加”或“增加的”是指從約10%至約99%的增加，或至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或至少100%、至少150%、或至少200%或更多的量或活性的增加，例如但不限于多肽活性、轉錄活性、和/或蛋白表達。
[0066]術語“對照”在對照植物或對照植物細胞的背景中，是其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性未經改變(例如增加或減少的)植物或植物細胞，因此其可以提供與異丙基蘋果酸合酶的表達或活性已經過改變的植物作比較。對照植物可包括空載體。對照植物可與野生型植物相對應。
[0067]發明詳述
[0068]在一方面，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由多核苷酸序列所組成，并且與本文所述的任何序列具有至少60%序列同一性，包括在序列表中顯示的任何多核苷酸。適宜地，所述分離多核苷酸包含、由或基本上由下列序列所組成:與其具有至少60%、
6162%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性的序列。
[0069]在一方面中，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼異丙基蘋果酸合酶且與SEQ ID NO:1具有至少60%序列同一'丨生的多核苷酸序列所組成。合適地,所述分離多核苷酸由或基本上由與 SEQ ID N0:1 具有至少 60%、61%、62%、63%、66%,67%,68%,69%,70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、95%、96%、97%、98%、99% 或100 %序列同一性的序列所組成。
[0070]在另一方面，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由下列多核苷酸序列所組成，所述多核苷酸序列編碼異丙基蘋果酸合酶且與SEQ ID N0:10具有至少62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,87%,88%,89%,90%,9192%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一性。
[0071]在又一方面，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由下列多核苷酸序列所組成，所述多核苷酸序列編碼異丙基蘋果酸合酶且與SEQ具有至少60 %、61 %、62 %、63 %、64%,65%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%、99%或100%的序列同一性。
[0072]在還一方面，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由下列多核苷酸序列所組成，所述多核苷酸序列編碼異丙基蘋果酸合酶且與SEQ ID N0:14具有至少62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,87%,88%,89%,90%,9192%,93%,94%,95%,96%,9 7%,98%,99%^； 100% 的同一性。
[0073]在再一方面，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由下列多核苷酸序列所組成，所述多核苷酸序列與SEQ ID N0:8具有至少60%、61%、62%、65%、70%、75%、80%、85%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,98%,99%^； 100% 的序列同一
性。SEQ ID NO:8編碼啟動子。[0074]術語“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物，其可以是未修飾的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。因此，多核苷酸可以是，但不限于基因組DNA、互補DNA(cDNA)、mRNA、或RNA或其片段。此外，多核苷酸可以是單鏈、單鏈和雙鏈區的混合物的核酸、cDNA的克隆片段、基因組DNA、寡核苷酸、或單個核苷酸、或上述的組合。雖然本文所述的多核苷酸序列以DNA序列顯示，所述序列包括其對應的RNA序列、及其互補(例如完全互補)的DNA或RNA序列、包括其反向互補。
[0075]術語“異丙基蘋果酸合酶多核苷酸”包括編碼來自紅花煙草的異丙基蘋果酸合酶(IMPS)的多核苷酸，以及包括多核苷酸，多核苷酸含有、由或者基本由與SEQ ID NO: 1、SEQID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14基本上同源(即序列相似)或基本同一的多核苷酸所組成；多核苷酸變體，其與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ IDNO: 14 的序列具有至少約 60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性；多核苷酸的片段，其含有SEQ ID N0:USEQ ID NO: 10,SEQ ID N0:12或SEQ ID NO: 14 的片段；以及 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12 或 SEQ ID NO: 14的片段，其與如下的序列具有基本同源性(即序列相似)或基本同一性:所述序列與SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12 或 SEQ ID NO: 14 的相應片段具有至少約 60%、61 %、62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性。所述異丙基蘋果酸合酶多核苷酸還包括這樣的序列，序列含有與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 10,SEQID NO: 12或SEQ ID NO: 14具有足夠或充分的同一性或相似性的程度以編碼發揮異丙基蘋果酸合酶功能的多肽。在一個實施方案中，術語“異丙基蘋果酸合酶多核苷酸”指包含、由或者基本由在本文中指定為 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12 或 SEQ ID NO: 14的多核苷酸所組成的核苷酸的聚合物。[0076]本文所述的多核苷酸將普遍含有磷酸二酯鍵，然而在某些情況下包括多核苷酸類似物，類似物可具有包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯鏈接的替換主鏈；以及肽多核苷酸主鏈和鏈接。其它多核苷酸類似物包括具有陽性主鏈、非離子型主鏈和非核糖主鏈的那些。核糖-磷酸主鏈的修飾可以出于各種原因進行，例如為了增加這樣的分子在生理環境中或在生物芯片上作為探針的穩定性和半衰期。可以制備天然存在的多核苷酸和類似物的混合物；或者，可以制備不同多核苷酸類似物的混合物，以及天然存在的多核苷酸和類似物的混合物。
[0077]已知各種多核苷酸類似物，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基氨基磷酸酯鏈接以及肽多核苷酸主鏈和鏈接。其它多核苷酸類似物包括具有陽性主鏈、非離子型主鏈和非核糖主鏈的那些。也包括含有一個或更多個碳環糖的多核苷酸。
[0078]其它類似物包括肽核酸，其是肽的多核苷酸類似物。與天然存在的多核苷酸的高電荷磷酸二酯主鏈不同，這些主鏈在中性條件下大體上是非離子型的。這可能會帶來優勢。首先，肽多核苷酸主鏈可能會表現出改善的雜交動力學。相對于完全匹配的堿基對，肽核酸對于錯配的堿基對在解鏈溫度上具有更大的變化。DNA和RNA對于內部錯配在解鏈溫度上通常表現出2-4°C的下降。對于非離子型的肽多核苷酸主鏈，下降接近7-9°C。相似地，由于其非離子性質，堿基附著至這些主鏈的雜交對鹽濃度相對不敏感。此外，肽核酸可能不會被細胞酶降解或降解程度較小，因此可能會更穩定。
[0079]在公開的多核苷酸、及其片段的組合的用途當中，是片段在核酸雜交分析中作為探針、或者在核酸擴增分析中用作引物的用途。這樣的片段通常包括DNA序列的至少約10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多個連續核苷酸。在其它實施方案中，DNA片段包括DNA序列的至少約10、15、20、30、40、50或60或更多個連續核苷酸。因為功能異丙基蘋果酸合酶基因在本文所示是形成蔗糖酯所必須的，所以這些技術也可用于鑒定BMVSE和bmvse植物。鄰近的遺傳標志物與異丙基蘋果酸合酶基因的等位基因可用作植物蔗糖酯產量的預測物。這種測試可用于追蹤植物品種或預測煙熏質量(smoking quality)或分批類型的同質性(homogeneity)。因此在一方面，也提供用于檢測如本文所述的異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的方法，包括使用能夠特異性檢測或特異性擴增所述多核苷酸的探針或引物、或者特異性檢測且特異性擴增所述多核苷酸的探針或引物。在另一方面，提供用于鑒定能夠產生蔗糖酯的植物的方法，所述方法包括步驟:(a)提供含有來自目標植物核酸的樣本；以及(b)確定如本文所述的異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的存在，在其中所述植物中所述多核苷酸的存在指示所述植物能夠產生蔗糖酯。還提供用于檢測至少一部分的異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的試劑盒，所述試劑盒包括用于特異性檢測至少一部分異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的一種或更多種(one of more)引物或探針。所述試劑盒可包括用于多核苷酸擴增如聚合酶鏈式反應(PCR)的試劑，或用于核酸探針雜交檢測技術如Southern印跡、Northern印跡、原位雜交或微陣列的試劑。所述試劑盒可包括用于抗體結合檢測技術比如Western印跡、ELISA、SELDI質譜或測試條的試劑。所述試劑盒可包括用于DNA測序的試劑。所述試劑盒可包括用于確定蔗糖酯含量的試劑和/或說明書。在某些實施方案中，試劑盒可包括所述一種或更多種方法的說明書。所述試劑盒可用于遺傳同一性確定、系統發育研究、基因分型、單 體型分析、譜系分析、或特別具有共顯性評分(co-dominant scoring)的植物育種。所述方法和試劑盒可用于依賴BMVSE和bmvse品種之間雜交的育種方法、以及在后代中基于序列的植物選擇。一般來說，將選擇顯示有功能的異丙基蘋果酸合酶遺傳區的植物，或者選擇顯示功能障礙的異丙基蘋果酸合酶遺傳區的植物，所述有功能的異丙基蘋果酸合酶遺傳區存在于產生BMVSE的品種，所述功能障礙的異丙基蘋果酸合酶遺傳區存在于不產生bmvse的品種。
[0080]影響雜交條件選擇的基本參數和制定合適條件的指南描述于Sambrook, J.，E.F.Fritsch 和 T.Maniatis(1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。使用遺傳密碼子結合本文所述氨基酸序列的知識，可以制備簡并寡核苷酸的集合。如在PCR中，這樣的寡核苷酸用作引物，由此分離并擴增DNA片段。在某些實施方案中，可以用簡并引物作為遺傳文庫的探針。這種文庫包括但不限于cDNA文庫、基因組文庫、以及甚至電子表達序列標簽或DNA文庫。然后將通過此方法鑒定的同源序列用作探針，來鑒定本文所鑒定序列的同系物。
[0081]潛在用途還有多核苷酸和寡核苷酸(例如引物或探針)，其在降低的嚴謹條件下、通常中等嚴謹條件下、以及通常高度嚴謹條件下雜交至本文所述的多核苷酸。影響雜交條件選擇的基本參數和制定合適條件的指南描述于Sambrook, J.，E.F.Fritsch和 T.Maniatis(1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.),并且可以由本領域的普通技術人員基于如多核苷酸的長度或堿基組成很容易地確定。
[0082]實現中等嚴謹條件的一種方法涉及使用含有5X標準檸檬酸鈉、0.5%十二烷基硫酸鈉、1.0mM乙二胺四乙酸(pH8.0)的預洗溶液，約50%甲酰胺、6X標準檸檬酸鈉的雜交緩沖液，以及約55°C的雜交溫度(或其它相似的雜交溶液，如含有約50%甲酰胺的一種，雜交溫度約42°C )，以及0.5X標準檸檬酸鈉、0.1 %十二烷基硫酸鈉中約60°C的洗滌條件。一般來說，高度嚴謹條件定義為如上雜交條件，但在約68°C，0.2X標準檸檬酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉中洗滌。SSPE (I X SSPE是0.15M氯化鈉、IOmM磷酸鈉和1.25mM乙二胺四乙酸，pH值7.4)在雜交以及洗滌緩沖液中可替換為標準檸檬酸鈉(IX標準檸檬酸鈉是0.15M氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)；雜交完成后，進行15分鐘的洗滌。應當理解，洗滌溫度和洗滌鹽濃度，通過應用控制雜交反應和雙鏈體穩定性的基本原則，可以根據需要進行調整以實現所需的嚴謹程度，如本領域技術人員所知的并在下面進一步描述(見，例如 Sambrook, J.，E.F.Fritsch 和 T.Maniatis (1989，Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。當多核苷酸雜交至未知序列的靶多核苷酸時，雜交長度假定為雜交多核苷酸的長度。當已知序列的多核苷酸雜交時，雜交長度可通過比對多核苷酸的序列以及鑒定最佳序列互補性的區域或多個區域來確定。雜交期望小于50堿基對長度的雜交溫度應該是低于雜交的解鏈溫度5至10°C，其中根據下列等式確定解鏈溫度。對于小于18堿基對長的雜交，解鏈溫度(°C )=2 (A+T堿基數目 )+4 (G+C堿基數目)。對于18堿基對長以上的雜交，解鏈溫度(°C )=81.5+16.6 (1glO [Na+]) +0.41 (% G+C) - (600/N)，其中 N 是雜交堿基數目，以及[Na+]是鈉離子在雜交緩沖液中的鈉離子的濃度(對于IX標準檸檬酸鈉，[Na+] = 0.165M)。一般來說，每個這種雜交多核苷酸具有這樣的長度，是其所雜交的多核苷酸的長度的至少25%(通常至少50%、60%、或70%，并最常用為至少80% )，并且與其所雜交的多核苷酸具有至少 60%的序列同一性(例如，至少 65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%、99%或 100% )。
[0083]本領域技術人員將理解，線性DNA具有兩個可能的方向:5’至3’方向和3’至5’方向。例如，如果參考序列處于5’至3’方向，并且如果第二序列在相同多核苷酸分子/鏈內處于5’至3’方向，那么參考序列和第二序列取向相同的方向，或具有相同的取向。一般來說，在給定啟動子的調控下，啟動子的序列和目標基因處于相同的取向。然而，相對于處于5’至3’方向的參考序列,如果第二序列在相同多核苷酸分子/鏈內處于3’至5’方向，那么參考序列和第二序列取向反義方向，或具有反義的取向。如果參考序列(5’至3’方向)和參考序列的反向互補序列(參考序列處于5’至3’)處于相同多核苷酸分子/鏈內，相對于彼此具有反義取向的兩條序列可以可選擇地描述為具有相同的取向。本文所示序列以5’至3’方向顯示。
[0084]本文提供的重組構建體可用于轉化植物或植物細胞以調節異丙基蘋果酸合酶蛋白表達水平。重組多核苷酸構建體可包括編碼如本文所述的異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的多核苷酸，其可操作地連接于適于在植物或細胞中表達異丙基蘋果酸合酶多肽的調控區。因此，多核苷酸可包括編碼本文所述的異丙基蘋果酸合酶多肽的編碼序列。由重組多核苷酸編碼的異丙基蘋果酸合酶多肽可以是天然的、也可以是對細胞異源的異丙基蘋果酸合酶多肽。在某些情況下，重組構建體含有減少或抑制異丙基蘋果酸合酶-調節多肽表達的多核苷酸，其可操作地連接于調控區。合適調控區的實例是本文所述的。
[0085]還提供了如本文所述的那些含有重組多核苷酸構建體的載體。合適的載體骨架包括例如本領域常規使用的那些，比如質粒、病毒、人工染色體、BAC、YAC或PAC。合適的表達載體包括，但不限于，源自例如噬菌體、桿狀病毒和逆轉錄病毒的質粒和病毒載體。許多載體和表達系統是商業上可獲得的。
[0086]載體還可以包括例如復制起點、支架附著區或標志物。標志物基因可以為植物細胞賦予可選擇的表型。例如，標志物可以賦予殺生物劑抗性，比如對抗生素(例如卡那霉素、G418、博來霉素或潮霉素)或除草劑(例如草甘膦、氯磺隆或草銨膦)的抗性。此外，表達載體可以包括設計用來促進操作或檢測(例如，純化或定位)所表達多肽的標簽序列。標簽序列，如熒光素酶、β葡糖醛酸酶(GUS)、綠色熒光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、多聚組氨酸、c-myc或血凝素序列，通常作為與所編碼的多肽的融合體來表達。這樣的標簽可以插入多肽內 的任何地方，包括在羧基末端或氨基末端。
[0087]植物或植物細胞可以通過將重組多核苷酸整合至基因組進行轉化來實現穩定的轉化。穩定轉化的細胞通常在各細胞分裂中保留所引入的多核苷酸。也可以瞬時轉化植物或植物細胞，從而重組多核苷酸沒有整合至其基因組中。瞬時轉化的細胞通常在各細胞分裂中丟失引入的重組多核苷酸的所有或一些部分，從而引入的重組多核苷酸在足夠次數的細胞分裂之后不能在子細胞中檢測到。
[0088]用于轉化植物細胞一些方法在本領域中是可用的，這些方法全部包括在本文中，包括生物彈技術、基因槍技術、農桿菌介導的轉化、病毒載體介導的轉化和電穿孔法。用于向植物染色體中整合外源核酸的農桿菌系統已經針對植物遺傳工程進行了廣泛的研究、改進和探索。包括核酸序列的裸重組核酸分子通過常規方法被連接到適當的T-DNA序列上，其中核酸序列對應著目標純化煙草蛋白，并按有義或反義方向可操作地連接至調控序列。通過聚乙二醇技術或通過電穿孔技術將這些引入煙草原生質體，兩者都是標準的。或者，將這種含有編碼目標純化蛋白的重組核酸分子的載體引入活的農桿菌細胞，隨后所述農桿菌細胞將核酸轉移到植物細胞中。可以通過煙草原生質體與含有核酸的脂質體進行融合或者通過電穿孔可以實現不伴有T-DNA載體序列的裸DNA的轉化。不伴有T-DNA載體序列的裸DNA也可通過惰性、高速微彈(microprojectile)用于轉化煙草細胞。
[0089]如果細胞或培養的組織用作轉化受體組織，如果需要的話通過本領域技術人員已知的技術，植物可以從轉化的培養物中再生。
[0090]待納入重組構建體的調控區選擇取決于若干因素，包括但不限于效率、可選擇性、可誘導性、所需的表達水平和細胞的或組織的優先表達。對于本領域技術人員而言，通過適當選擇和定位相對于編碼序列的調控區來調節編碼序列的表達是一個常規的事情。多核苷酸的轉錄可以以類似方式調節。一些合適的調控區僅僅或主要在某些細胞類型中起始轉錄。用于鑒定和表征植物基因組DNA中調控區的方法是本領域已知的。
[0091]合適的啟動子包括組織特異性因子所識別的組織特異性啟動子，其存在于不同組織或細胞類型中(例如，根特異性啟動子、莖特異性啟動子、木質部特異性啟動子)、或不同發育階段出現的、或者響應不同環境條件而出現的。合適的啟動子包括組成型啟動子，其可以在大多數細胞類型中被激活而無需特定的誘導物。用于控制異丙基蘋果酸合酶RNAi多肽生產的合適啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒35S(CaMV/35S)、SSU、OCS、lib4、usp、STLSl、B33、nos或泛素啟動子或菜豆素啟動子。本領域技術人員能夠產生重組啟動子的多種變體。
[0092]組織特異性啟動子是轉錄控制元件，其僅在植物發育期間的特定時間中在特定細胞或組織中有活性，如在營養組織或繁殖組織中。例如，當優選在某些組織中表達多核苷酸時，組織特異性表達可以是有利的。發育控制下的組織特異性啟動子實例包括可以僅在(或主要僅在)某些組織(如營養組織例如根或葉，或生殖組織如果實、胚珠、種子、花粉、pistols (無對應中譯文)、花或任何胚組織)中起始轉錄的啟動子。生殖組織特異性啟動子可以是例如花藥特異性、胚珠特異性、胚特異性、胚乳特異性、珠被特異性、種子和種皮特異性、花粉特異性、花瓣特異性、萼片特異性的或其組合。
[0093]合適的葉特異性啟動子包括來自C4植物(玉米)的丙酮酸、正磷酸二激酶(ProK)啟動子、來自玉米的cab-mlCa+2啟動子、擬南芥(Arabidopsis thaliana)myb相關基因的啟動子(Atmyb5)、核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)啟動子(例如，在葉和光照生長的幼苗中表達的番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因、在發育中的番茄果實中表達的RBCSl和RBCS2、或者幾乎只在葉片和葉鞘的葉肉細胞中高水平表達的核酮糖二磷酸羧化酶啟動子)。
[0094]合適的衰老特異性啟動子包括在果實成熟、衰老和葉脫落期間有活性的番茄啟動子，編碼半胱氨酸蛋白酶的基因的玉米啟動子。可使用合適的花藥特異性啟動子。可選擇本領域技術人員已知合適的根優選啟動子。合適的種子優選啟動子包括種子特異性啟動子(種子發育期間有活性的那些啟動子，比如種子貯藏蛋白的啟動子)和種子萌發啟動子(種子萌發期間有活性的那些啟動子)。這樣的種子優選啟動子包括但不限于Ciml (細胞分裂素誘導的信息)；cZ19Bl (玉米19kDa的玉米醇溶蛋白)；milps (肌-肌醇-1-磷酸合酶)；mZE40-2也稱為Zm-40 ；nuclc ；以及celA (纖維素合酶)。y-玉米醇溶蛋白是胚乳特異性啟動子。Glob-1是胚特異性啟動子。對于雙子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限于豆β菜豆素(bean, beta-phaseolin)、油菜籽蛋白、β -伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。對于單子葉植物,種子特異性啟動子包括但不限于玉米15kDa的玉米醇溶蛋白啟動子、22kDa的玉米醇溶蛋白啟動子、27kDa的玉米醇溶蛋白啟動子、Y -玉米醇溶蛋白啟動子、27kDa的Y-玉米醇溶蛋白啟動子(如gzw64A啟動子,參閱GenBank登錄號S78780)、糯質基因(waxy)啟動子、超甜基因(shrunken) I啟動子、超甜基因2啟動子、球蛋白I啟動子(見GenBank登錄號L22344)、Itp2啟動子、ciml啟動子、玉米endl和end2啟動子、nucl啟動子、Zm40啟動子、eepl和eep2 ;lecl、硫氧還蛋白H啟動子；mlipl5啟動子、PCNA2啟動子；以及超甜基因2啟動子。
[0095]可誘導啟動子的實例包括響應病原體攻擊、條件、溫度升高、光、干旱、低溫或高鹽濃度的啟動子。病原體可誘導的啟動子包括來自病理相關蛋白(PR)的那些，病理相關蛋白是病原體感染之后誘導的(例如PR蛋白、SAR、β-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶)。
[0096]除了植物啟動子 ，其它合適的啟動子可源自細菌，例如，章魚堿合酶啟動子、胭月旨堿合酶啟動子和源于Ti質粒的其它)，或可以源自病毒啟動子(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)的35SRNA啟動子、煙草病毒的組成型啟動子、花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S和35S啟動子、或玄參花葉啟動子)。
[0097]術語“異丙基蘋果酸合酶多肽”指來自紅花煙草的異丙基蘋果酸合酶(IPMS)的多肽并包括多肽，所述多肽包含、由或基本上由多核苷酸變體編碼的氨基酸序列所組成，所述多核苷酸變體與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13或S: 15具有至少約60%、
61 62%,63%,64%,65%,66%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91%、92%、93%、94%、95%、98%或99%的序列同一性；異丙基蘋果酸合酶多肽的片段；以及 SEQ、SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15 的片段，其與 SEQ ID NO: 2,SEQ IDNO、ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15 的相應片段具有至少約 60%、75%、80%、85%、87%、88%、89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98 或 100%的序列同一性。所述異丙基蘋果酸合酶多肽也包括與SEQ、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15含有足夠或很大程度的同一性或相似性以發揮異丙基蘋果酸作用的序列。所述異丙基蘋果酸合酶多肽的片段通常保留合酶活性。只要異丙基蘋果酸合酶多肽仍作為異丙基蘋果酸起作用，其也包括通過引入任何類型的改變(例如，酸的插入、刪除或取代；糖基化狀態的變化；影響重新折疊或異構化、三維結構或自我結合狀態的變化)的突變體，其可以有意地經過工程化改造天然分離的。異丙基蘋果酸合酶多肽可以處于線性形式或使用已知的。術語“異丙基蘋果酸合酶多肽”也可指多肽。
[0098]在另一方面，提供含有、由或基本上由與本文所述的任何序列具有至少60%序列同一性的多肽序列所組成的分離多肽，其包括在序列表中顯示的任何多肽。適宜地，所述分離多肽含有、由或基本上由與其具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96 %、97 %、98 %、99 %或100 %序列同一性的序列所組成。
[0099]多肽包括通過引入任何類型的改變所產生的變體(例如，氨基酸的插入、刪除或取代；糖基化狀態的變化；影響重新折疊或異構化、三維結構或自我結合狀態的變化)，其可以有意地經過工程化改造或是天然分離的。所述變體可具有產生沉默改變并導致功能等同蛋白的改變。只要保留底物的二級結合活性，基于在殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和兩親性上的相似性可進行有意的氨基酸取代。例如，帶負電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；以及具有相似親水性值的具有不帶電極性頭部基團的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可進行保守取代，例如根據下表。在第二列相同方框中的氨基酸以及優選在第三列相同行中的氨基酸可互相取代:
[0100]
?肪族 IH極性GIy Ala Pro ==



He Leu Vai

極性-不:電荷 CysSerThrMet

Asn GIy_
極性-帶電荷^ Asp Giu
___Lys Arg_
力香族 Ij His Ph^TrpTyr
[0101]所述多肽可以是成熟蛋白、或不成熟蛋白、或源自不成熟蛋白的蛋白。多肽可以處于線性形式或者使用已知方法環化。多肽通常包含至少10、至少20、至少30、或至少40個連續的氨基酸。
[0102]在另一方面，提供分離的異丙基蘋果酸合酶多肽，其包含、由或者基本由編碼異丙基蘋果酸合酶的并且與SEQ ID N0:2具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性的序列所組成。
[0103]在再一方面，提供分離的異丙基蘋果酸合酶多肽，其包含、由或者基本由編碼異丙基蘋果酸合酶的并且與SEQ ID吣:11具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性的序列所組成。
[0104]在又一方面，提供分離的異丙基蘋果酸合酶多肽，其包含、由或者基本由編碼異丙基蘋果酸合酶的并且與SEQ ID吣:13具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%、99%或 100%序列同一性的序列所組成。
[0105]在還一方面，提供分離的異丙基蘋果酸合酶多肽，其包含、由或者基本由編碼異丙基蘋果酸合酶的并且與SEQ ID吣:15具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性的序列所組成。
[0106]所述多肽序 列的片段也在本文中公開，適宜地，這樣的片段保留了全長序列的活性。
[0107]突變多肽可用于建立含有突變多肽的突變植物、非天然存在的植物或轉基因植物。適宜地，所述突變多肽保留未突變多肽的活性。突變多肽的活性可以比未突變多肽更高、更低或與之大約相同。
[0108]通過在適合表達多肽的培養條件下培養轉化的或重組的宿主細胞可以制備多肽。然后可使用已知的純化方法從這種培養物中純化出所產生的表達的多肽。多肽純化可包括含有將與多肽結合的試劑的親和柱；一個或多個穿過這種親和樹脂的柱步驟；一個或多個涉及疏水性相互作用色譜的步驟；或免疫親和色譜。或者，所述多肽也可以表達為將促進純化的形式。例如，其可以作為融合多肽表達，如麥芽糖結合多肽、谷胱甘肽-5-轉移酶、或硫氧還蛋白中的那些。用于表達和純化融合多肽的試劑盒是商業上可獲得的。多肽也可以用表位標記，并隨后通過使用針對這種表位的特異性抗體進行純化。可以采用一個或多個液相色譜步驟，例如反相高效液相色譜法進一步純化多肽。以不同的組合可采用部分或全部上述純化步驟來提供基本上同質的重組多肽。因此，純化的多肽可基本上不含其它多肽，在本文定義為“基本上純化的多肽”;這樣純化的多肽包括多肽、片段、變體等。可以通過任何合適的技術包括但不限于本文所述的方法實現多肽和片段的表達、分離和純化。
[0109]也可能利用親和柱，如產生的抗多肽的單克隆抗體來親和純化表達的多肽。可以用常規技術從親和柱中除去這些多肽，例如在高鹽洗脫緩沖液中，然后對較低鹽的緩沖液進行透析備用、或取決于所用的親和基質通過改變PH值或其它成分，或者使用天然存在的親和半體的底物競爭性地除去。
[0110]也可以通過已知的常規化學合成來產生多肽。通過合成方式來構建多肽或其片段的方法是本領域技術人員已知的。合成構建的多肽序列通過與天然多肽分享一級、二級或三級結構或構象特征，可擁有與其共同的生物學性質，包括生物活性。
[0111]本文所用術語“非天然存在的”描述不由自然形成或者不存在于自然當中的實體(例如，多核苷酸、遺傳突變、多肽、植物、植物細胞和植物材料)。可以通過本文所述或本領域中已知的方法制造、合成、起始、修飾、干預或操縱這樣的非天然存在的實體或人工實體。因此，例如可以使用傳統植物育種技術(如回交)或通過遺傳操作技術(如反義RNA、干擾RNA、大范圍核酸酶等)制成非天然存在的植物、非天然存在的植物細胞或非天然存在的植物材料。再例如，可以通過將來自第一植物或植物細胞一個或多個遺傳突變(例如一個或多個多態性)基因滲入或通過轉移至第二植物或植物細胞(其本身可以是天然存在的)來制備非天然存在的植物、非天然存在的植物細胞或非天然存在的植物材料，從而得到的植物、植物細胞或植物材料或其后代含有非天然形成或者非天然存在的遺傳結構(例如基因組、染色體或其節段)。因此，所得植物、植物細胞或植物材料是人工或者非天然存在的。因此，如果第二植物或植物細胞含有不同于第一植物或植物細胞的遺傳背景，可以通過在第一人工或天然存在的植物或植物細胞中修飾遺傳序列來制成人工的或非天然存在的植物或植物細胞，導致(i)人工的修飾的遺傳序列、或(ii)天然存在于第二植物或植物細胞的修飾的遺傳序列。可以通過表型差異或通過本領域已知的分子生物學技術如核酸測序、遺傳標志物(例如微衛星RNA標志物)的存在或缺失，檢測植物或植物細胞在遺傳背景上的差異。
[0112]一些基于多核苷酸的方法可用于增加基因在植物中的表達。例如，可制備和待轉化的植物兼容的構建體、載體或表達載體，其包括目標基因連同能夠在植物中過表達所述基因的上游啟動子。在本文描述示例性啟動子。轉化后當生長在合適條件下，所述啟動子可驅動表達以調節(例如，增加)這種酶在植物或在其特定組織中的水平。在一個示例性實施方案中，生成攜帶異丙基蘋果酸合酶的載體以在植物中過表達所述基因。所述載體攜帶位于異丙基蘋果酸合酶基因上游的合適啟動子，所述啟動子驅動所述基因在植物的所有組織中表達。為轉化的愈傷組織和細胞系賦予選擇性，所述載體還可攜帶抗生素抗性基因。在一個實施方案中，所述啟動子促進在植物毛狀體中的轉錄活性。在一個實施方案中，所述啟動子在植物毛狀體 中具有轉錄活性。在另一個實施方案中，所述啟動子在植物毛狀體中具有特異性轉錄活性、而在植物的任何其它部分沒有或基本沒有活性。適宜地，所述啟動子包含、由或基本上由SEQ ID N0:8所示的序列、或毛狀體啟動子或天然異丙基蘋果酸合酶啟動子所組成。天然異丙基蘋果酸合酶啟動子將位于異丙基蘋果酸合酶基因的5’端。例如在SEQ ID N0:6中，內源異丙基蘋果酸合酶啟動子將定位在核苷酸2826之前。因此，所述異丙基蘋果酸合酶基因可在植物的毛狀體中過表達。令人驚訝地，本發明人已發現，組成型表達并不導致與使用毛狀體特異表達所達到的水平一樣高的蔗糖酯積累(參見圖4和其描述)。
[0113]根據一個實施方案，在已能夠產生含甲基戊酰基的蔗糖酯的植物中，異丙基蘋果酸合酶的表達或活性提高，從而導致其中異丙基蘋果酸合酶的積累提高，并因此提高含甲基戊酰基的蔗糖酯的生產。根據另一個實施方案，在不能夠產生含甲基戊酰基的蔗糖酯的植物中，異丙基蘋果酸合酶的表達或活性提高，從而導致其中異丙基蘋果酸合酶的積累以及因此含甲基戊酰基的蔗糖酯的生產。
[0114]一些基于多核苷酸的方法，包括反義RNA、核酶指導的RNA切割、轉錄后基因沉默如RNA干擾、以及轉錄基因沉默，可用于調節在植物中基因表達。雖然這樣的方法典型地用于減少或抑制基因表達，其也可通過增加細胞生產力和表達出的蛋白的質量用于增加基因表達。這樣的方法可包括細胞凋亡相關基因表達、蛋白的糖基化相關基因表達、參與細胞代謝的乳酸脫氫酶、以及用于基因擴增的二氫葉酸還原酶的沉默。其它方法可以擴展到減少或抑制涉及用于改變植物細胞中基因調節的不同細胞通路中的多個靶標。
[0115]在一些實施方案中，可以使用全長多核苷酸或其片段的互補物。通常，片段是至少 10 個連續核苷酸，例如至少 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、35、40、50、80、100、200、500個或更多連續核苷酸。在一個實施方案中，所述多核苷酸片段能夠減少表達或活性，并可編碼例如本文所述的反義核酸、核酶、影響剪接體介導的反式剪接的RNA、干擾RNA、向導RNA或其它非翻譯RNA等。在另一個實施方案中，所述多核苷酸片段編碼干擾RNA。
[0116]可減少異丙基蘋果酸合酶表達或活性的組合物包括，但不限于可干擾一個或更多內源異丙基蘋果酸合酶基因轉錄的序列特異性多核苷酸；可干擾異丙基蘋果酸合酶RNA轉錄物(例如，雙鏈RNA、siRNA、核酶)翻譯的序列特異性多核苷酸；可干擾異丙基蘋果酸合酶蛋白穩定性的序列特異性多肽；可干擾異丙基蘋果酸合酶蛋白的酶活性、或異丙基蘋果酸合酶蛋白對于底物或調節蛋白結合活性的序列特異性多核苷酸；顯示對異丙基蘋果酸合酶蛋白特異性的抗體；可干擾異丙基蘋果酸合酶蛋白的穩定性、或異丙基蘋果酸合酶蛋白的酶活性、或者異丙基蘋果酸合酶蛋白的結合活性的小分子化合物；結合異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的鋅指蛋白；以及具有針對異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的活性的大范圍核酸酶。[0117]反義技術是一種公知的方法，其可以用來調節(例如，減少或抑制)多肽的表達。待抑制的多核苷酸被克隆并被可操作地連接到調節區和轉錄終止序列，從而轉錄RNA的反義鏈。然后，將重組構建體轉化到植物中并產生RNA的反義鏈。多核苷酸不需是待抑制基因的整個序列，但通常將基本上互補于待抑制基因的正義鏈至少部分。
[0118]多核苷酸可被轉錄成核酶、或催化性RNA,其影響mRNA的表達。核酶可被設計成特異性地與幾乎任何靶RNA配對，并在特定位置上切割磷酸二酯骨架，從而在功能上使靶RNA失活。異源多核苷酸可以編碼設計用于切割特定mRNA轉錄物的核酶，從而阻止多肽表達。盡管可以使用在位點特異性識別序列上切割mRNA的各種核酶，錘頭核酶用于破壞特定的mRNA。錘頭核酶在側翼區所規定的位置切割mRNA，側翼區與靶mRNA形成互補堿基對。唯一要求是靶RNA包含5’-UG-3’核苷酸序列。錘頭核酶的構建和生產是本領域已知的。錘頭核酶序列可以被嵌入至穩定的RNA(如轉移RNA)中來增加體內切割效率。
[0119]在一個實施方案中，可干擾RNA轉錄物翻譯的序列特異性多核苷酸是干擾RNA。RNA干擾或RNA沉默是進化上保守的過程，通過它特異性mRNA可以被靶向酶促降解。必須引入或由細胞產生雙鏈RNA (例如，雙鏈RNA病毒、或干擾RNA多核苷酸)來啟動干擾RNA途徑。雙鏈RNA可以被RNA酶III轉換成多個21_23bp長的小干擾RNA雙鏈體，RNA酶III是雙鏈RNA特異性內切酶。小干擾RNA可以隨后被RNA誘導的沉默復合物所識別，其通過ATP-依賴的過程促進小干擾RNA解旋。解旋的小干擾RNA的反義鏈將激活的RNA誘導的沉默復合物引導至含有互補于小干擾RNA反義鏈的序列的靶mRNA。靶mRNA和反義鏈可形成A-型螺旋，以及A-型螺旋的大溝可以被激活的RNA誘導的沉默復合物所識別。在小干擾RNA鏈的5’端結合位點所定義的單一位點處，靶mRNA可以被激活的RNA誘導的沉默復合物所切割。激活的RNA誘導的沉默復合物可以被回收以催化另一個切割事件。[0120]干擾RNA表達載體可包括編碼干擾RNA多核苷酸的干擾RNA構建體，其通過降低mRNA.pre-mRNA或相關RNA變體的表達水平顯示出RNA干擾活性。表達載體可包括位于上游并可操作地連接到干擾RNA構建體的啟動子，如本文進一步描述的。干擾RNA表達載體可包括合適的最小核心啟動子、目標干擾RNA構建體、上游(5’)調控區、下游(3’)調控區，包括轉錄終止和多腺苷酸化信號，以及本領域技術人員已知的其它序列，如各種選擇標志物。
[0121]多核苷酸可以以各種形式生產，包括雙鏈結構(即，含有反義鏈和互補正義鏈的雙鏈RNA分子)、雙鏈發夾樣結構、或單鏈結構(即，只含有反義鏈的單鏈RNA分子)。結構可以包括雙鏈體、不對稱雙鏈體、發夾或不對稱發夾二級結構、具有自身互補性的正義和反義鏈。雙鏈干擾RNA可以被酶轉化為雙鏈小干擾RNA。小干擾RNA雙鏈體的其中一條鏈可以退火至靶mRNA和相關RNA變體內的互補序列。小干擾RNA/mRNA雙鏈體由RNA誘導的沉默復合物識別，其可以在多位點上以序列依賴性方式切割RM,導致靶mRNA和相關RNA變體的降解。 [0122]雙鏈RNA分子可包括由單個寡核苷酸組裝成莖環結構的小干擾RNA分子，其中小干擾RNA分子自身互補的正義和反義區通過基于多核苷酸或基于非多核苷酸接頭的方式相連接，以及環狀單鏈RNA具有兩個或多個環結構、以及含有自身互補的正義和反義鏈的莖，其中環狀RNA可以在體內或在體外進行加工來產生能夠介導干擾RNA的活性小干擾RNA分子。
[0123]本文還關注了小發夾RNA分子的用途，包括除反向互補(正義)序列以外的特異性反義序列，其通常由間隔或環序列分開。間隔或環的切割提供單鏈RNA分子及其反向互補物，使得它們可以退火形成雙鏈RNA分子(任選地具有附加的處理步驟，其可導致從一條或兩條鏈的3’端或5’端添加或除去一個、兩個、三個或更多個核苷酸)。間隔可以足夠長以在切割間隔之前(和任選地隨后的處理步驟，其可導致從一條或兩條鏈的3’端或5’端添加或除去一個、兩個、三個、四個或更多個核苷酸)，允許反義和正義序列退火以形成雙鏈結構(或莖)。間隔序列通常是無關的核苷酸序列，其位于退火成雙鏈多核苷酸時的兩個互補核苷酸序列區之間，包括小發夾RNA。間隔序列通常包括在約3至約100個核苷酸之間。
[0124]通過選擇適合產生發夾雙鏈體的序列組合物、環尺寸和莖長度，可產生任何目標RNA多核苷酸。適合設計發夾雙鏈體的莖長的范圍，包括至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸，如約14-30個核苷酸、約30-50個核苷酸、約50-100個核苷酸、約100-150個核苷酸、約150-200個核苷酸、約200-300個核苷酸、約300-400個核苷酸、約400-500個核苷酸、約500-600個核苷酸以及約600-700個核苷酸的莖長。設計發夾雙鏈體的環長的合適范圍，包括約4-25個核苷酸、約25-50個核苷酸的環長、或當發雙鏈體的莖長相當長時則更長的環長。雙鏈RNA或單鏈RNA分子是在約15和約40個核苷酸長之間。小干擾RNA分子可以是在約15和約35個核苷酸長之間的雙鏈RNA或單鏈RNA分子。小干擾RNA分子可以是在約17和約30個核苷酸長之間的雙鏈RNA或單鏈RNA分子。小干擾RNA分子可以是在約19和約25個核苷酸長之間的雙鏈RNA或單鏈RNA分子。小干擾RNA分子是在約21至約23個核苷酸長之間的雙鏈RNA或單鏈RNA分子。具有長于21個核苷酸的雙鏈體區的發夾結構可促進有效的小干擾RNA指導的沉默，無論環序列和長度如何。
[0125]靶mRNA序列可以是在約14至約50個核苷酸長之間。因此，可以掃描靶mRNA在約14和約50個核苷酸長之間的區域，其對于靶序列優選地滿足以下標準的一個或多個:在約2:1和約1:2之間的A+T/G+C比；靶序列的5’端的AA 二核苷酸或CA 二核苷酸；靶mRNA獨有的至少10個連續核苷酸的序列(即，在相同植物的其它mRNA序列上不存在的序列)；以及沒有三個以上連續鳥嘌呤(G)核苷酸或三個以上連續胞嘧啶(C)核苷酸的“串”。使用本領域已知的各種技術可以評估這些標準，例如，計算機程序如BLAST可用于搜索公共可用數據庫以確定是否所選靶序列是靶mRNA獨有的。或者，使用商業上可獲得的計算機軟件(例如，01igoEngine、Target Finder以及商業上可獲得的小干擾RNA Design Tool可以選擇靶序列(和設計小干擾RNA序列)。
[0126]可選擇靶mRNA序列，其滿足上述標準中的一個或多個且在約14和約30個核苷酸長之間，或者可選擇靶序列，其滿足上述標準中的一個或多個且在約16和約30個核苷酸長之間。可選擇靶序列，其滿足上述標準中的一個或多個且在約19和約30個核苷酸長之間。選擇靶序列，其滿足上述標準中的一個或多個且在約19和約25個核苷酸長之間。
[0127]小干擾RNA分子可包括特異性反義序列，其互補于本文所述的多核苷酸序列中任一個的至少 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多個連續核苷酸。
[0128]小干擾RNA分子所含有的特異性反義序列可以與靶序列的互補物一致或基本一致。小干擾RNA分子所含有的特異性反義序列可與靶mRNA序列的互補物至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%—致。確定序列同一性的方法是本領域已知的，并且能夠通過，例如使用威斯康星大學計算機組(GCG)軟件或NCBI網站上提供的BLASTN程序來確定。
[0129]通過與靶mRNA序列在一個、兩個、三個、四個或更多個核苷酸上有差別(例如，通過核苷酸取代，包括轉換或顛換)，小干擾RNA分子的特異性反義序列可以表現出變異性。當這樣的核苷酸取代存在于雙鏈RNA分子的反義鏈中時，與取代核苷酸通常形成氫鍵堿基配對的正義鏈中的互補核苷酸可能或可能不會被相應地取代。也可以考慮雙鏈RNA分子，其中一個或多個核苷酸取代發生在正義序列中，但不在反義鏈中。當小干擾RNA分子的反義序列包括在小干擾RNA的核苷酸序列和靶核苷酸序列之間的一個或多個錯配時，如上所述，所述錯配可能會發現在反義序列的3’末端、5’末端或中央部分。
[0130]小干擾RNA分子可包括特異性反義序列，其能夠在嚴謹條件下選擇性地雜交至天然存在的靶基因或靶mRNA的部分。如本領域普通技術人員所知，可以通過改變雜交和洗滌步驟中所用時間、溫度或溶液濃度來實現雜交條件的嚴謹程度的變化。適當的條件也可以部分依賴于所用的特定核苷酸序列，例如靶mRNA或基因的序列。
[0131]一種用于在植物中誘導雙鏈RNA沉默的方法是用產生發夾RNA的基因構建體進行轉化(參見Smith等，(2000)Nature, 407，319-320)。這樣的構建體包含由合適間隔所分開的靶基因序列的反轉區。由于生成內含子剪接的發夾RNA，插入作為間隔片段的功能植物內含子區，額外地增加基因沉默誘導的效率(Wesley等，(2001) Plant J.，27，581-590)。適宜地，莖長是約50核苷酸至約 I千堿基長。用于產生內含子剪接發夾RNA的方法在本領域詳述(參見例如，Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617)。
[0132]具有雙鏈體或雙鏈結構的干擾RNA分子，例如雙鏈RNA或小發夾RNA，可具有平端，或者可具有3’或5’突出。如本文所用，“突出”是指未配對的核苷酸，或者當一條RNA鏈的3’ -末端延伸超出另一條鏈的5’ -末端時突出于雙鏈體結構的核苷酸(3’突出)，或反之亦然(5’突出)。含有突出的核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或其修飾的版本。在一個實施方案中，干擾RNA分子的至少一條鏈具有3’突出，其從約I至約6個核苷酸長。在其它實施方案中，所述3’突出是從約I至約5個核苷酸，從約I至約3個核苷酸以及從約2至約4個核苷酸長。
[0133]當干擾RNA分子在分子的一端包括3’突出時，另一端可以是平端或也具有突出(5’或3’)。當干擾RNA分子在分子的兩端包括突出時，突出的長度可以相同或不同。在一個實施方案中，干擾RNA分子在分子兩端包括約I至約3個核苷酸的3’突出。在另一個實施方案中，干擾RNA分子是在分子兩端具有2個核苷酸的3’突出的雙鏈RNA。在又一個實施方案中，含有干擾RNA突出的核苷酸是TT 二核苷酸或UU 二核苷酸。
[0134]當確定含有一個或多個突出的干擾RNA分子與靶mRNA序列的百分比同一性時，可以考慮或不用考慮突出。例如，來自3’突出的核苷酸以及來自雙鏈的5’-或3’-末端的至多2個核苷酸可以經過修飾而沒有顯著損失小干擾RNA分子的活性。
[0135]干擾RNA分子可以包括一個或多個5’或3’ -帽結構。干擾RNA分子可以包括帽結構，所述帽結構在正義鏈、反義鏈、或正義和反義鏈兩者的3’-端；或在干擾RNA分子的正義鏈、反義鏈、或正義和反義鏈兩者的5’ -端。或者，干擾RNA分子可以在干擾RNA分子的3’-端和5’-端兩者含有帽結構。術語“帽結構”指在寡核苷酸的任一末端并入的化學修飾，其保護分子免于外切核酸酶降解，并且還可有助于細胞內的遞送或定位。
[0136]適于干擾RNA分子的另一種修飾是將一個或多個半體或綴合物化學鏈接至干擾RNA分子，所述半體或綴合物增強干擾RNA分子的活性、細胞分布、細胞吸收、生物利用度或穩定性。所述多核 苷酸可以通過本領域公認的方法進行合成或修飾。化學修飾可包括但不限于2’修飾、引入非天然堿基、與配體的共價附著、以及用硫代磷酯鍵替換磷酯鍵。在本實施方案中，雙鏈體結構的完整性通過至少一個、以及典型地兩個化學鍵得到加強。化學鏈接可以通過各種公知技術的任意者來實現，例如通過引入共價、離子或氫鍵；疏水相互作用、范德華力或堆積相互作用；通過金屬離子配位的方式、或通過使用嘌呤類似物。
[0137]在又一個實施方案中，在兩條單鏈的一個或兩個上的核苷酸可被修飾以減少或抑制細胞酶的激活，如例如但不限于某些核酸酶。用于減少或抑制細胞酶激活的技術是本領域已知的，包括但不限于2’ -氨基修飾、2’ -氟修飾、2’ -烷基修飾、不帶電荷的骨架修飾、嗎啉基修飾、2’ -O-甲基修飾和氨基磷酸酯。因此，在雙鏈RNA上的核苷酸的至少一個2’ -羥基基團被化學基團所取代。此外，至少一個核苷酸可被修飾以形成鎖核苷酸。這種鎖核苷酸包含連接核糖的2’ -氧與核糖的4’ -碳的亞甲基或亞乙基橋。將鎖核苷酸引入到寡核苷酸改善了對互補序列的親和性并將解鏈溫度提高若干度。
[0138]配體可綴合至干擾RNA分子，例如，以便增強其細胞吸收。在某些實施方案中，疏水性配體綴合至分子以利于細胞膜的直接滲透。使用這些方法以促進反義寡核苷酸的細胞滲透。在某些情況下，陽離子配體和寡核苷酸的綴合通常導致改善的對核酸酶的抗性。陽離子配體的代表性實例包括丙基銨和二甲基丙基銨。當陽離子配體分散在寡核苷酸時，反義寡核苷酸可以保留其對mRNA的高結合親和性。
[0139]根據一個實施方案，在已經能夠產生含甲基戊酰基的蔗糖酯的植物中，異丙基蘋果酸合酶的表達或活性是減少的，因此導致其內異丙基蘋果酸合酶的積累減少，以及因此減少含β-甲基戊酰基的蔗糖酯的生產。
[0140]本文所述的分子和核苷酸可使用公知的固相合成技術來制備。本領域已知用于這樣合成的任何其它方法可以附加地或可選擇地采用。
[0141]各種實施方案針對含有一個或多個本文所述多核苷酸的表達載體、或含有一個或多個多核苷酸的干擾RNA構建體。
[0142]各種實施方案針對含有一個或多個多核苷酸的表達載體、或一個或多個干擾RNA構建體。
[0143]各種實施方案針對含有一個或多個多核苷酸的表達載體、或一個或多個干擾RNA構建體，所述構建體編碼一個或多個能夠自退火以形成發夾結構的干擾RNA多核苷酸，其中所述構建體包括:(a) —個或多個本文所述的多核苷酸；(b)編碼間隔元件的第二序列，其包括剪接時形成發夾結構環的內含子；以及(C)含有第一序列的反向互補序列的第三序列，其定位在與第一序列相同的方向，其中第二序列定位在第一序列和第三序列之間，并且第二序列可操作地連接于第一序列和第三序列。
[0144]可利用所述公開的序列來構建各種不形成發夾結構的多核苷酸。例如，通過(I)通過可操作地連接到第一啟動子來轉錄所述DNA的第一鏈、和(2)通過可操作地連接到第二啟動子來轉錄所述DNA片段的第一鏈的反向互補序列，可形成雙鏈RNA。可以從同一表達載體，或從不同表達 載體轉錄出所述多核苷酸的每條鏈。具有RNA干擾活性的RNA雙鏈體可以通過酶轉化為小干擾RNA來降低RNA水平。
[0145]因此，各種實施方案針對包含多核苷酸的表達載體、或編碼能夠自退火的干擾RNA多核苷酸的干擾RNA構建體，其中所述構建體包括(a) —個或多個本文所述的多核苷酸；和(b)含有第一序列的互補(例如，反向互補)序列的第二序列，其定位在與第一序列相同的方向。
[0146]通過促進基因表達的共抑制來提供各種組合物和方法用于降低異丙基蘋果酸合酶的內源表達水平。作為向植物細胞宿主中引入多拷貝轉基因的結果而發生共抑制現象。多拷貝轉基因的整合可導致轉基因和靶向內源性基因的表達減少。共抑制程度依賴于轉基因和靶向內源性基因之間序列同一性程度。內源性基因和轉基因兩者的沉默可以通過沉默的基因座(即，目標內源性啟動子和內源性基因)的廣泛甲基化而發生，其可以阻止轉錄。或者在某些情況下，內源性基因和轉基因的共抑制可以通過轉錄后基因沉默發生，其中可以產生轉錄物，但增強的降解速度阻止轉錄物的積累。轉錄后基因沉默的共抑制機制被認為類似于RNA干擾，其中RNA似乎是這些過程中的重要的起始子(initiator)和靶，并且可以通過相同的分子機制、可能通過RNA引導的mRNA降解至少部分地被介導。
[0147]可以通過將多個拷貝的核酸或其片段作為轉基因整合到目標植物的基因組中來實現核酸的共抑制。使用含有可操作地連接到核酸或其片段的啟動子的表達載體可轉化宿主植物。各種實施方案針對用于促進內源性基因共抑制的表達載體，其包括可操作地連接到多核苷酸的啟動子。
[0148]也描述了用于獲得保守突變多核苷酸和多肽的方法。任何目標植物包括植物細胞或植物材料，可以通過各種已知用于誘導誘變的方法進行遺傳修飾，包括位點定向誘變、寡核苷酸定向誘變、化學誘導的誘變、輻射誘導的誘變、利用修飾堿基的誘變、利用缺口雙鏈體DNA的誘變、雙鏈斷裂誘變、利用修復缺陷的宿主株的誘變、通過全基因合成的誘變、DNA改組和其它等同的方法。
[0149]或者，可以通過向目標植物基因組中引入轉座子(例如，IS元件)使基因靶向失活。可以通過有性雜交受精引入這些可移動的遺傳元件，通過蛋白活性丟失篩選插入突變體。通過將親本植物與未經轉座子誘導誘變的植物進行雜交，例如通過有性雜交受精，可以將親本植物中破壞的基因引入到其它植物中。可以利用本領域技術人員已知的任何標準育種技術。在一個實施方案中，可以通過插入一個或多個轉座子使一個或多個基因失活。突變可導致一個或多個基因的純合子破壞，導致一個或多個基因的雜合子破壞，或者如果破壞一個以上基因則導致純合子破壞和雜合子破壞的組合。合適的可轉座的元件包括反轉錄轉座子、反轉錄子(retroposon)和SINE樣元件。這樣的方法是本領域的技術人員已知的。
[0150]或者，可以通過引入源自一些能夠自我切割并在植物中復制的小環狀RNA的核酶靶向基因進行失活。這些RNA可以單獨復制(類病毒RNA)或與輔助病毒(衛星RNA) —起復制。合適的RNA實例包括源自鱷梨日斑類病毒(avocado sunblotch viroid)的那些、以及源自煙草環斑病毒(tobacco ringspot virus)、紫花苜猜短暫條紋病毒(lucernetransient streak virus)、絨毛煙斑駁病毒(velvet tobacco mottle virus)、爺屬植物斑駁病毒(solanum nodiflorum mottle virus)和地三葉草斑駁病毒(subterranean clovermottle virus)的衛星RNA。各種祀RNA特異性核酶是本領域技術人員已知的。
[0151]在一些實施方案中，通過非轉基因方式(例如在基因中建立突變)來調節異丙基蘋果酸合酶多肽的表達。在基因序列中隨機引入突變的方法可以包括化學誘變、EMS誘變和輻射誘變。向細胞 中引入一個或多個靶向突變的方法包括但不限于基因組編輯技術，特別是鋅指核酸酶介導的誘變、tilling(靶向誘導的基因組局部損傷)、同源重組、寡核苷酸定向誘變以及大范圍核酸酶介導的誘變。
[0152]突變的一些非限制性實例是至少一個核苷酸的刪除、插入和錯義突變、單核苷酸多態性和簡單序列重復。突變后，可以進行篩選以鑒定產生早期終止密碼子或者其它非功能基因的突變。突變后，可以進行篩選以鑒定產生能夠以升高的水平表達的功能基因的突變。通過測序、或通過使用對基因或蛋白特異的探針或引物可以進行突變體的篩選。也可以產生多核苷酸中的特異性突變，其導致減少的或增加的基因表達、減少或增加的mRNA穩定性、或者減少或增加的蛋白穩定性。這樣的植物本文稱為突變的植物。
[0153]突變的植物可具有一個或多個突變的任意組合，突變導致調節的多肽水平。例如，突變植物可以具有在單基因中的單突變；在單基因中的多突變；在兩個或更多或者三個或更多基因中的單突變；在兩個或更多或者三個或更多基因中的多突變。因此，公開了含有突變多肽變體的突變植物。
[0154]在一個實施方案中，來自植物的種子被誘變，然后生長成第一代突變植物。然后，允許第一代植物自花傳粉，來自第一代植物的種子生長成第二代植物，然后篩選第二代植物基因座中的突變。雖然可以篩選誘變植物材料的突變，篩選第二代植物的優點是所有的體細胞突變對應于種系突變。本領域技術人員理解，為產生突變植物可誘變各種植物材料，包括但不限于種子、花粉、植物組織或植物細胞。然而，當篩選植物核酸的突變時，誘變的植物材料類型可能產生影響。例如，當在非誘變植物授粉前對花粉進行誘變時，所述授粉所產生的種子生長成第一代植物。第一代植物的每一個細胞將包含花粉中產生的突變；因此，隨后可以篩選這些第一代植物的突變，而不是等到第二代。[0155]產生點突變、短的刪除、插入、顛換和或轉換的誘變劑，包括化學誘變劑或輻射，可用于產生突變。誘變劑包括但不限于甲磺酸乙酯、甲磺酸甲酯、N-乙基-N-亞硝基脲、三乙基三聚氰胺、N-甲基-N-亞硝基脲、甲基芐肼、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺單體、美法侖、氮芥、長春新堿、二甲基亞硝胺、N-甲基-N’ -硝基-亞硝基胍、亞硝基胍、2-氨基嘌呤、7，12二甲基-苯并蒽、環氧乙烷、六甲基磷酰胺、白消安(bisulfan)、二環氧烷烴(二環氧辛燒、二環氧丁燒等)、2_甲氧基-6-氯_9[3_(乙基-2-氯-乙基)氨丙基氨基]吖啶二鹽酸鹽和甲醛。只要它們產生期望的表型，也可以考慮不是由誘變劑直接造成的基因座中的自發突變。合適的誘變試劑還包括，例如電離輻射，如X-射線、Y射線、快中子輻射和UV輻射。
[0156] 本領域技術人員已知的植物核酸制備的任何方法可用來制備用于突變篩選的植物核酸。
[0157]來自個體植物、植物細胞、或植物材料的制備核酸可以任選地進行合并，以便加快篩選源自誘變的植物組織、細胞或材料的植物群體的異丙基蘋果酸合酶基因中的突變。可以篩選植物、植物細胞或植物材料的一代或隨后更多代。任選合并組的尺寸取決于所用篩選方法的靈敏度。
[0158]任選地合并核酸樣本之后，可對其進行多核苷酸特異性擴增技術，如聚合酶鏈式反應(PCR)。對異丙基蘋果酸合酶基因特異的、或對異丙基蘋果酸合酶基因緊鄰的序列特異的任何一個或多個引物或探針，可用于擴增任選合并的核酸樣本中的序列。優選地，設計一個或多個引物用于擴增最有可能產生有用突變的異丙基蘋果酸合酶基因座區域。最優選的是，設計引物用于檢測異丙基蘋果酸合酶多核苷酸區域內的突變。此外，優選引物以避免已知多態性位點以便于點突變的篩選。為方便擴增產物的檢測，可以使用任何常規標記方法來標記一個或多個引物或探針。可以基于本文所述序列使用本領域公知的方法設計引物或探針。通過本領域已知的方法可鑒定多態性。在其它方面，提供制備突變植物的方法。方法涉及提供含有編碼功能性異丙基蘋果酸合酶多肽基因的植物的至少一個細胞。接著，在有效調節異丙基蘋果酸合酶基因活性的條件下，處理所述植物的至少一個細胞。然后，將所述至少一個突變植物細胞繁殖成突變植物，與對照植物相比突變植物具有調節的異丙基蘋果酸合酶多肽水平。在制成突變植物的這種方法的一個實施方案中，處理步驟涉及在有效產生至少一個突變植物細胞的條件下，讓至少一個細胞經受如上所述的化學誘變試劑。在本方法的另一個實施方案中，處理步驟涉及在有效產生至少一個突變植物細胞的條件下，讓至少一個細胞經受輻射源。術語“突變植物”包括突變植物，其中與對照植物相比，適當地通過遺傳工程或遺傳修飾以外的方式修飾突變植物的基因型。
[0159]在某些實施方案中，突變植物、突變植物細胞或突變植物材料可包括一個或多個突變并賦予期望的性狀，所述突變天然存在于另一植物、植物細胞或植物材料中。這種突變可以并入(例如，基因滲入)另一植物、植物細胞或植物材料(例如，具有與突變所源自植物的遺傳背景不同的植物、植物細胞或植物材料)來賦予其性狀。因此，舉例來說，天然存在于第一植物中的突變可被引入第二植物，如具有與第一植物遺傳背景不同的第二植物。因此，技術人員能夠搜索和鑒定在其基因組中天然攜帶異丙基蘋果酸合酶基因的一個或多個賦予期望性狀的突變等位基因的植物。可以通過各種方法(包括育種、回交和基因滲入)將天然存在的突變等位基因轉移到第二植物，以產生在異丙基蘋果酸合酶基因中具有一個或多個突變的系、品種或雜種。可從突變植物的庫中篩選出顯示期望性狀的植物。合適地，利用如本文所述的異丙基蘋果酸合酶核苷酸序列的知識進行選擇。因而，可能篩選指示蔗糖酯組合物與對照相比的改變的遺傳性狀。這種篩選方法可涉及如本文所述的常規核酸擴增和/或雜交技術的應用。因此，本發明的其它方面涉及用于鑒定突變植物的方法，所述方法包括步驟:(a)提供含有來自植物的異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的樣本；以及(b)確定異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的核酸序列，其中所述異丙基蘋果酸合酶多核苷酸與對照植物的異丙基蘋果酸合酶多核苷酸相比在序列上的差異，指示所述植物是異丙基蘋果酸合酶突變植物。另一個方面，提供鑒定突變植物的方法，所述突變植物與對照植物相比在蔗糖酯的組合物上有改變，所述方法包括步驟:(a)提供來自待篩選植物的樣本；(b)確定所述樣本是否含有在異丙基蘋果酸合酶多核苷酸中的一個或多個突變；以及(C)確定在所述植物中的蔗糖酯的組合物；其中如果所述樣本在異丙基蘋果酸合酶多核苷酸上含有一個或多個突變(與對照植物相比，其調節編碼蛋白的表達或活性)，那么與對照植物(在其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性并未減少)相比所述植物的部分在鹿糖酯的組合物上有改變則指示著在蔗糖酯組合物上有改變的突變植物。在另一方面中，提供用于制備突變植物的方法，所述突變植物和對照植物相比在蔗糖酯的組合物上有改變，所述方法包括步驟:(a)提供來自第一植物的樣本；(b)確定所述樣本是否在異丙基蘋果酸合酶多核苷酸中含有一個或多個突變，所述突變導致樣本中蔗糖酯的組合物的改變；以及(C)將一個或多個突變轉移到第二植物內。可以使用本領域已知的各種方法(如通過遺傳工程、遺傳操作、基因滲入、植物育種、回交等)將突變轉移到第二植物中。在一個實施方案中，第一植物是天然存在的植物。在一個實施方案中，第二植物具有不同于第一植物的遺傳背景。在另一方面，提供制備突變植物的方法，所述突變植物與對照植物相比在蔗糖酯的組合物上有改變，所述方法包括步驟:(a)提供來自第一植物的樣本；(b)確定所述樣本是否包含異丙基蘋果酸合酶多核苷酸中的一個或多個突變，所述突變導致樣本中蔗糖酯的組合物的改變；以及(c)將一個或多個突變從第一植物中基因滲入到第二植物。在一個實施方案中，基因滲入的步驟包括植物育種，任選地包 括回交等。在一個實施方案中，第一植物是天然存在的植物。在一個實施方案中，第二植物具有不同于第一植物的遺傳背景。在一個實施方案中，第一植物不是栽培品種或優良栽培品種。在一個實施方案中，第二植物是栽培品種或優良栽培品種。再一方面涉及通過本文所述方法獲得或可獲得的突變植物(包括栽培品種或優良栽培品種突變植物)。在某些實施方案中，突變植物可具有僅位于植物特定區域的一個或多個突變，如在異丙基蘋果酸合酶多核苷酸序列內。根據本實施方案，突變植物的其余基因組序列和誘變之前的植物相同或基本上相同。
[0160]在某些實施方案中，突變植物可以具有位于植物一個以上的區域(如異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的序列內)以及基因組的一個或多個其它區域中的一個或多個突變。根據本實施方案，突變植物的其余基因組序列和誘變之前的植物不相同或基本上不相同。在某些實施方案中，突變植物可以不在異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的一個或多個、兩個或多個、三個或多個、四個或多個或五個或多個外顯子中具有一個或多個突變；或者可以不在異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的一個或多個、兩個或多個、三個或多個、四個或多個或五個或多個內含子中具有一個或多個突變；或者可以不在異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的啟動子中具有一個或多個突變；或者可以不在異丙基蘋果酸合酶3’非翻譯區具有一個或多個突變；可以不在異丙基蘋果酸合酶5’非翻譯區具有一個或多個突變；可以不在異丙基蘋果酸合酶編碼區具有一個或多個突變；或可以不在異丙基蘋果酸合酶非編碼區具有一個或多個突變；或兩個或多個、三個或多個、四個或多個、五個或多個；或六個或多個其部分的任意組合。在另一方面中，提供了鑒定在編碼異丙基蘋果酸合酶基因中含有突變的植物、植物細胞或植物材料的方法，包括:(a)使植物、植物細胞或植物材料經誘變；(b)從所述植物、植物細胞或植物材料或其后代獲得核酸樣本；以及(c)確定編碼異丙基蘋果酸合酶、或其變體或片段的基因的核酸序列，其中所述序列中的差異指示著其中一個或多個突變。
[0161]鋅指蛋白可用于調節異丙基蘋果酸合酶的表達或活性。在各種實施方案中，通過鋅指核酸酶介導的誘變來修飾含有部分或全部多核苷酸編碼序列的基因組DNA序列。搜索基因組DNA序列以找尋鋅指蛋白結合的獨特位點。或者，搜索基因組DNA序列以找尋鋅指蛋白結合的兩個獨特位點，其中兩個位點在相對的鏈上并彼此靠近，例如，相隔1、2、3、4、5、6或更多個堿基對。因此，提供結合本文所述多核苷酸的鋅指蛋白。
[0162]可將鋅指蛋白工程化以識別在異丙基蘋果酸合酶基因上的選擇的靶向位點。通過截短、或擴展、或定點誘變的方法結合選擇方法(例如而非限制于噬菌體展示選擇、細菌雙雜交選擇或細菌單雜交選擇)，鋅指蛋白可含有源自天然鋅指DNA結合結構域和非天然鋅指DNA結合結構域的基序的任何組合。術語“非天然鋅指DNA結合結構域”是指鋅指DNA結合結構域，其結合靶DNA中的3堿基對序列并且不存在于含有待修飾DNA的細胞或生物中。鋅指蛋白的設計方法是本領域已知的，所述鋅指蛋白結合對靶基因獨特的特異核苷酸序列。
[0163]可以通過制備第一多核苷酸和第二多核苷酸的融合體來構建鋅指核酸酶，所述第一多核苷酸編碼結合多核苷酸的鋅指蛋白，以及第二多核苷酸編碼非特異性核酸內切酶，例如但不限于IIS型核酸內切酶的那些。在鋅指蛋白和所述核酸酶之間的融合蛋白可包括由兩個堿基對組成的間隔區(spacer)、或者可替代地，所述間隔區可由3、4、5、6或7或更多堿基對所組成。在各種實施方案中，鋅指核酸酶在多核苷酸的基因組DNA序列的調控區、編碼區或非編碼區引入一個雙鏈斷裂、并導致多核苷酸表達水平的降低、或者多核苷酸編碼的蛋白活性的降低。鋅指核酸酶的切割頻繁導致在切割位點上的DNA刪除，隨后是通過非同源端連接的DNA修復。
[0164]在其它實施方案中，可選擇鋅指蛋白來結合異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的調控序列。更具體地，所述調控序列可包含轉錄起始位點、起始密碼子、外顯子區、外顯子-內含子邊界、終止子或終止密碼子。因此，本公開提供在異丙基蘋果酸合酶基因附近或內部通過鋅指核酸酶介導的誘變所產生的突變的、非天然存在的或轉基因的植物或植物細胞，以及通過鋅指核酸酶介導的誘變制成這種植物或植物細胞的方法。用于將鋅指蛋白和鋅指核酸酶遞送至植物的方法與下述用于遞送大范圍核酸酶的那些相似。
[0165]在另一方面，提供了使用大范圍核酸酶(比如大范圍核酸酶1-CreI)產生重組的、突變的、非天然存在的或轉基因的或者其它遺傳修飾的植物的方法。天然存在的大范圍核酸酶以及重組大范圍核酸酶可用于在植物基因組DNA中的單個位點或在相對較少位點上特異性造成雙鏈斷裂，從而允許異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的破壞。大范圍核酸酶可以是具有改變的DNA識別性能的工程化 的大范圍核酸酶。可以通過本領域已知的各種不同機制將大范圍核酸酶蛋白遞送到植物細胞中。[0166]本公開包括大范圍核酸酶在植物細胞或植物中失活一個或多個本文所述的多核苷酸的用途。方面還涉及使用大范圍核酸酶失活植物中多核苷酸的方法，包括:(a)提供含有一個或多個本文所述多核苷酸的植物細胞；(b)將大范圍核酸酶或編碼大范圍核酸酶的構建體引入所述植物細胞中；以及(C)允許大范圍核酸酶使所述多核苷酸基本上失活。
[0167]大范圍核酸酶可用于切割多核苷酸編碼區內的大范圍核酸酶識別位點。這種切割頻繁導致大范圍核酸酶識別位點的DNA刪除，隨后是通過非同源端連接的致突變的DNA修復。這種在基因編碼序列中的突變通常足以使所述基因失活。首先，這種改變植物細胞的方法涉及使用合適的 轉化方法將大范圍核酸酶表達盒遞送至植物細胞。為獲得最高效率，需要將大范圍核酸酶表達盒連接至可選擇的標志物，并在選擇試劑存在下選擇成功轉化的細胞。這種方法將導致大范圍核酸酶表達盒整合到基因組中，然而如果植物有可能需要監管批準，這種過方法則是不可取的。在這種情況下，可以使用常規育種技術將大范圍核酸酶表達盒(以及相連的選擇性標志物基因)在后代植物中分離(segregate)出來。或者，可以最初用缺乏選擇性標志物的大范圍核酸酶表達盒轉化植物細胞，所述植物細胞可在缺乏選擇試劑的介質中生長。在這種條件下，部分處理后的細胞將獲得大范圍核酸酶表達盒并瞬時表達工程化的大范圍核酸酶而沒有將大范圍核酸酶表達盒整合到基因組中。因為沒有考慮轉化效率，所述后者轉化過程需要篩選更多處理的細胞以獲得所需的基因組修飾。當使用鋅指蛋白或鋅指核酸酶時，上述方法也可用于修飾植物細胞。
[0168]遞送大范圍核酸酶表達盒之后，植物細胞最初在對于所用特定轉化過程典型的條件下生長。這可能意味著，通常在黑暗中在低于26度C的溫度下的介質上，使轉化細胞生長。這樣的標準條件可使用一段時間，優選1-4天以允許植物細胞從轉化過程中恢復。此初始恢復期后的任何點上，可提高生長溫度以刺激工程化的大范圍核酸酶的活性來切割并突變大范圍核酸酶識別位點。
[0169]對于某些應用，可能需要從植物基因組中精確除去多核苷酸。通過使用一對工程化的大范圍核酸酶這種應用是可行的，其中每種大范圍核酸酶切割位于所預期的刪除各側的大范圍核酸酶識別位點。
[0170]大范圍核酸酶和其它DNA修復策略可用于觸發在植物細胞所含的DNA和靶DNA之間的異源重組。靶DNA通常含有與植物細胞所含的DNA同源的至少一個、優選兩個區。細胞修復DNA之后，同源端結合導致靶DNA被引入細胞內。
[0171]在其它實施方案中，因為異丙基蘋果酸合酶是在植物細胞核中編碼的葉綠體蛋白，所以通過將所述基因直接插入到葉綠體基因組中可增加植物中的異丙基蘋果酸合酶的表達水平。同樣，提高異丙基蘋果酸合酶蛋白轉運或輸入至葉綠體也可調節活性模式。
[0172]一個目的是提供突變、轉基因或非天然存在的植物，其顯示出調節的蔗糖酯水平同時基本保持了與對照植物相同的視覺外觀。因此，本文描述了突變、轉基因或非天然存在的植物或細胞，其與對照細胞或對照植物相比具有調節的蔗糖酯水平。通過調節編碼本文所述多核苷酸序列一個或多個多肽的表達，所述突變、轉基因或非天然存在的植物或細胞已經被改變來調節本文所述的異丙基蘋果酸合酶的合成或活性。
[0173]另一方面，涉及突變、非天然存在的或轉基因的植物或細胞，其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性被調節，并且所述植物的部分與對照植物相比在蔗糖酯水平上具有至少5%的增加或減少，所述對照植物中所述酶的表達或活性未被調節。在又一方面，涉及突變、非天然存在的或轉基因的植物或細胞，其中異丙基蘋果酸合酶的表達或其所編碼的蛋白的活性被調節，以及在其中煙霧(aerosol)中的蔗糖酯水平與對照植物的煙霧相比增加或減少了至少5% ο
[0174]與對照植物相比，在蔗糖酯含量上的改變可以是至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%或更多。
[0175]可加熱植物至100°C或以上，如至少125°C、至少150°C、至少175°C或至少20(TC，來釋放煙霧。
[0176]適用于遺傳修飾的植物包括單子葉和雙子葉植物以及植物細胞系統，包括來自下列科之一的種:爵床科(Acanthaceae)、蔥科(Alliaceae)、六出花科(Alstroemeriaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、夾竹桃科(Apocynaceae)、模柳科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、小梁科(Berberidaceae)、紅木科(Bixaceae)、十字花科(Brassicaceae)、鳳梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、三尖杉科(Cephalotaxaceae)、黎科(Chenopodiaceae)、秋水仙科(Colchicaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、薯截科(Dioscoreaceae)、麻黃科(Ephedraceae)、古柯科(Erythroxylaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)、亞麻科(Linaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、錦奏科(Malvaceae)、黑藥花科(Melanth iaceae)、色蕉科(Musaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、藍果樹科(Nyssaceae)、S粟科(Papaveraceae)、松科(Pinaceae)、車前草科(Plantaginaceae)、禾本科(Poaceae)、蓄薇科(Rosaceae)、菌草科(Rubiaceae)、楊柳科(Salicaceae)、無患子科(Sapindaceae)、煎科(Solanaceae)、紫杉科(Taxaceae)、山茶科(Theaceae)或葡萄科(Vitaceae)。
[0177]合適的種可包括黃秋葵(Abelmoschus)、冷杉(Abies)、槭(Acer)、翦股穎(Agrostis)、蔥(Allium)、六出花(Alstroemeria)、鳳梨(Ananas)、穿心蓮(Andrographis)、須芒草(Andropogon)、蒿(Artemisia)、蘆竹(Arundo)、真頁煎(Atropa)、小檗(Berberis)、舌甘菜(Beta)、紅木(Bixa)、蕓苔(Brassica)、金蓋菊(Calendula)、山荼花(Camellia)、喜樹(Camptotheca)、大麻(Cannabis)、辣椒(Capsicum)、紅花(Carthamus)、長春花(Catharanthus)、三尖杉(Cephalotaxus)、菊花(Chrysanthemum)、金雞納(Cinchona)、西瓜(Citrullus)、咖啡(Coffea)、秋水仙(Colchicum)、彩葉草(Coleus)、黃瓜(Cucumis)、南瓜(Cucurbita)、狗牙根(Cynodon)、曼陀羅(Datura)、石竹(Dianthus)、洋地黃(Digitalis)、薯截(Dioscorea)、油掠(Elaeis)、麻黃草(Ephedra)、斑茅(Erianthus)、古柯(Erythroxylum)、按樹(Eucalyptus)、羊茅(Festuca)、草莓(Fragaria)、雪花蓮(Galanthus)、大豆(Glycine)、棉花(Gossypium)、向日葵(Helianthus)、橡膠樹(Hevea)、大麥(Hordeum)、天仙子(Hyoscyamus)、麻瘋樹(Jatropha)、萬苣(Lactuca)、亞麻(Linum)、黑麥草(Lolium)、羽扇豆(Lupinus)、番煎(Lycopersicon)、石松(Lycopodium)、木薯(Manihot)、苜猜(Medicago)、薄荷(Mentha)、芒草(Miscanthus)、香蕉(Musa)、煙草(Nicotiana)、水稻(Oryza)、黍(Panicum)、S 粟(Papaver)、銀膠菊(Parthenium)、狼尾草(Pennisetum)、矮牽牛(Petunia)、減^_離sedicago Sativa) (^輯_離(巴 f^f^rl^(Arundo donax) ((giantreed)) Λ_?(secale cereal e) (_?(rye)r^(salix spp.) (?(willow)) )--(Eucalyptus spp.x^^(eucalyptus)) λ?(TritiCOSeCale) (bamboo) Λ^Η織(Helianthus annuus) (^B 織(sunf lower)) λ ?Η^(carthamus tinctorius) ( ?Η^(saff lower)) ysM (Jatropha Ourcas) (SM (jatropha)) yMs(Ricinus communis) (Μ0 (castor)) )-- (Elaeis guineensis) (-- (palm))yM0 (Linum usitatissimum)(^?(f lax)) λ^μ(Brassica juncea) Λ--Μ(Beta vulgaris)(肆蝴(SUgarbeet))m(Manihot esculenta) ( 7K_ (CaSSaya)) λ 蝴^(Lycopersicon esculentum) (Μ?Η#(tomato)) λ _m(Lactuca sativa)(_m(lettuce)) Λ^?(Musa paradisiaca)(蝴?(banana)) Λ^ι*(solanum tuberosum) (Jp^*(potato)) ΛΠΦΚ(Brassica oleracea)(011^? (broccoli)) Λ^^Μ(caulif lower) Λ^坤K(Bsssels sprouts)) Λ^(camelliasinensis)(辦(蚪68))>?挪(Fragaria ananassa) (?挪(strawberry)) λnJnJ (Theobromacacao) (?!?! (cocoa)) λ 營蓋(coffea arabica)(營蓋(coffee)) ΛΛΛ(vitis vinifera)(# (grape)) > _^(Ananas c〇moss)(_^(pineapple)) Λ^^(capsicum annum)(輿肆楚(hot&sweet pepper)) Λ^_ (Allium cepa)c4Hi_ (onion))^o±/R (cucumismelo) (肆/R (melon)) > 攤 /R (cucumis sativus) (?/^ (cucumber)) Λ*/β.(cucurbitamaxima) (潘/R (squash)) Λ*/β.(cucurbita moschata) (潘/R (squash)) λ _M(spinaceaoleracea) (_M(spinacea)) λM/R (citrullus lanatus) (M/R (watermelon)) λ棠 M (Abelmoschus esculentus)(棠觸(okra)r^ (solanum melongena) (?^(eggplant)) λ #鐵(Rosa spp.x#^(rose)) ΛΜ75?(Dianthus caryophyllus) (?75?(carnation)) λ 鄕嫌+ (petunia spp.)(鄕嫌+ (petunia)) λ 丨sn^H(poinsettiapulcherrima)(丨sn*H(poinsettia)) Λ^(Lupinus albus) SMM (lupin)) Λ^?(uniola paniculata)(凝?(〇ats)) λ?*雜煙(bentgrass) (?雜^(Agrostis spp.)rlil?(populus tremuloides) ( 111?(aspen)r^(pinus spp.)(謬(pine)) λ^效(Abiesspp.) (^讀(fir)) λ?(Acer spp.)(貧(maple)) λH?(Hordeum vulgare) ( H?(barley)) λ _響^(p〇a pratensis) ( _響^(bluegrass)) Λ_--(Lolium spp.)(義--(ryegrass))菩簾^?(phleum pratense)(簾細?(timothy) Λ§(panicum virgatum)




32(柳(switchgrass))、高梁(Sorghum bicolor)(高梁(sorghum)、蘇丹草(sudangrass))、芒草(Miscanthus giganteus)(芒草(miscanthus))、甘鹿(Saccharum sp.)(甘鹿(energycane))、白楊(Populus balsamifera)(白楊(poplar))、玉米(Zea mays)(玉米(corn))、大豆(Glycine max)(大豆(soybean))、油菜(Brassica napus)(油菜(canola))、小麥(Triticum aestivum)(小麥(wheat))、棉花(Gossypium hirsutum)(棉花(cotton))、水稻(Oryza sativa)(水稻(rice))、向日葵(Helianthus annuus)(向日葵(sunflower))、紫花苜猜(Medicago sativa)(紫花苜猜(alfalfa))、甜菜(Beta vulgaris)(甜菜(sugarbeet))或者珍珠粟(Pennisetum glaucum)(珍珠粟(pearl millet))。
[0179]各種實施方案針對突變植物、非天然存在植物或轉基因植物，其經過修飾以減少異丙基蘋果酸合酶基因表達水平，從而產生這樣的植物如煙草植物，在其中目標植物組織內的異丙基蘋果酸合酶表達水平和對照植物相比是減少的。公開的組合物和方法可應用于煙草屬的任何種，包括黃花煙草(N.rustica)和紅花煙草(N.tabacum)(例如，LA B21、LN KY171、TI1406、巴斯瑪(Basma)、Galpao(無對應譯文)、珀里克(Perique)、Beinhart 1000-1、K326，希克斯闊葉(Hicks Broadleaf)和 Petico (無對應譯文))。其它物種包括N.acaulis (無對應譯文)、智利尖葉煙草(N.acuminata)、N.acuminata var.multiflora (無對應譯文)、非洲煙草(N.africana)、花煙草(N.alata)、抱莖煙草(N.amplexicaulis)、N.arentsii (無對應譯文)、N.attenuata(無對應譯文)、N.benavidesii (無對應譯文)、本塞姆氏煙草(N.benthamiana)、N.bigelovii (無對應譯文)、N.bonariensis (無對應譯文)、N.cavicola (無對應譯文)、克氏煙草(N.clevelandii)、心葉煙草(N.cordifolia)、N.corymbosa(無對應譯文)、N.debneyi (無對應譯文)、N.excelsior (無對應譯文)、福氏煙草(N.forgetiana)、N.fragrans (無對應譯文)、粉藍煙草(N.glauca)、粘性煙草(N.glutinosa)、N.goodspeedii (無對應譯文)、野生煙草(N.gossei) λ N.hybrid (無對應譯文)、N.1ngulba(無對應譯文)、N.kawakamii (無對應譯文)、N.knightiana(無對應譯文)、郎氏煙草(N.1angsdorffii)、N.linearis (無對應譯文)、長花煙草(N. 1ongiflora)、海濱煙草(N.maritima)、麥格隆熄豐煙草(N.megalosiphon)、N.miersii (無對應譯文)、夜花煙草(N.noctif1ra)、N.nudicaulis(無對應譯文)、N.0btusifolia(無對應譯文)、西方煙草(N.0ccidentalis)、N.0ccidentalis subsp.hesperis (無對應譯文)、耳狀煙草(N.0tophora)、圓維煙草(N.paniculata)、N.pauciflora(無對應譯文)、矮牽牛狀煙草(N.petunioides)、藍茉莉葉煙草(N.plumbaginifolia)、N.quadrivalvis (無對應譯文)、N.raimondii (無對應譯文)、波緣煙草(N.repanda)、蓮座葉煙草(N.rosulata)、N.rosulata subsp.1ngulba(無對應譯文)、N.rotundifolia(無對應譯文)、N.setchellii (無對應譯文)、N.simulans (無對應譯文)、N.solanifolia(無對應譯文)、N.spegazzinii (無對應譯文)、斯托克通氏煙草(N.stocktonii)、N.suaveolens (無對應譯文)、種林煙草(N.sylvestris)、N.thyrsiflora(無對應譯文)、域毛煙草(N.tomentosa)、擬鸞毛煙草(N.tomentosiformis)、N.trigonophylla(無對應譯文)、N.umbratica(無對應譯文)、波緣煙草(N.undulata)、N.velutina(無對應譯文)、N.wigandioides (無對應譯文)和N.Xsanderae (無對應譯文)。在高度優選的實施方案中，所述植物是煙草植物，例如煙草屬的植物或紅花煙草種。[0180]本文也考慮使用煙草栽培品種和優良煙草栽培品種。因此轉基因、非天然存在的或突變的植物可以是煙草品種或優良煙草栽培品種，其包括一個或多個轉基因或一個或多個遺傳突變或其組合。遺傳突變(例如，一個或多個多態性)可以是不天然存在于個體煙草品種或煙草栽培品種(例如，優良煙草栽培品種)的突變，或只要突變不天然存在于個體煙草品種或煙草栽培品種(例如，優良煙草栽培品種)中，所述遺傳突變可以是天然存在的遺傳突變。特別有用的紅花煙草品種包括白肋煙型、深型、烤煙型和東方型煙草。品種或栽培品種的非限制性實例是:BD64、CClOl、CC200、CC27、CC301、CC400、CC500、CC600、CC700,CC800,CC900,Coker176 (無對應譯文)、Coker319 (無對應譯文)、Coker371Gold (無對應譯文)、Coker48 (無對應譯文)、CD263、DF911、DT538LC Galpao 煙草、GL26H、GL350、GL600、GL737、GL939、GL973、HB04P、HB04P LC、HB3307PLC、雜交 403LC、雜交 404LC、雜交501LC、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、KDH959、KT200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY17、KY171、KY907、KY907LC、KTY14xL8LC、Little Crittenden(無對應譯文)、McNair373、McNair944、msKY14xL8、窄葉 Madole (無對應譯文)、窄葉 Madole LC、NBH98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC100、NC102、NC2000、NC291、NC297、NC299、NC3、NC4、NC5、NC6、NC7、NC606、NC71、NC72、NC810、NC BH129、NC2002、Neal Smith Madole (無對應譯文)、0XF0RD207、PD7302LC、PD7309LC、PD7312LC、“珀里克”煙草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R630、R7-11、R7-12、RG17、RG81、RG H51、RGH4、RGH51、RS1410、Speightl68 (無對應譯文)、Speightl72 (無對應譯文)、Speightl79 (無對應譯文)、Speight210 (無對應譯文)、Speight220(無對應譯文)、Speight225(無對應譯文)、Speight227 (無對應譯文)、Speight234 (無對應譯文)、Speight G-28 (無對應譯文)、Speight G-70 (無對應譯文)、Speight H-6 (無對應譯文)、Speight H20 (無對應譯文)、Speight NF3 (無對應譯文)、TI1406、TI1269、TN86、TN86LC、TN90、TN97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson) Madole(無對應譯文)、VA309、VA359、AA37-1、B13P、Xanthi (Mitchel1-Mor (無對應譯文))、Bel-W3、79-615、沙姆遜福爾摩斯 NN、KTRDC2 號雜交 49、白肋 21、KY8959、KY9、MD609、PG01、PG04、P01、P02、P03、RGll、RG8、VA509、AS44、Banket Al (無對應譯文)、巴斯瑪 DramaB84/31 (無對應譯文)、巴斯瑪I Zichna ZP4/B (無對應譯文)、巴斯瑪Xanthi BX2A (無對應譯文)、Batek(無對應譯文)、Besuki Jember (無對應譯文)、C104、Coker347、CriolloMisionero (無對應譯文)、Delcrest (無對應譯文)、Djebel81 (無對應譯文)、DVH405、Galpao Comum(無對應譯文)、HB04P、希克斯闊葉、Kabakulak Elassona(無對應譯文)、Kutsage El (無對應譯文)、LA BU21、NC2326、NC297、PVH2110、紅色俄羅斯(Red Russian)、Samsun (無對應譯文)、Saplak (無對應譯文)、Si_aba (無對應譯文)、Talgar28 (無對應譯文)、Wislica (無對應譯文)、Yayaldag (無對應譯文),Prilep HC-72 (無對應譯文)、PrilepP23(無對應譯文),Prilep PB156/1 (無對應譯文)>Prilep P12-2/1 (無對應譯文)、YakaJK-48 (無對應譯文)、Yaka JB125/3 (無對應譯文)、T1-1068、KDH-960、T1-1070、TW136、巴斯瑪、TKF4028、L8、TKF2002、GR141、巴斯瑪 xanthi (無對應譯文)、GR149、GR153、PetitHavana(無對應譯文)。即使本文未特別指明，也考慮上述低轉化亞變種(low convertersubvariety) 0在某些實施方案中，栽培品種和優良栽培品種是優選的。所述紅花煙草種可用在某些其它實施方案中。可使用紅花煙草白肋型。
[0181]實施方案還針對用于產生突變、非天然存在的、或轉基因植物的組合物和方法，其中植物已被修飾以調節異丙基蘋果酸合酶表達或活性，從而導致植物或植物成分與對照相比具有蔗糖酯的調節水平。在植物中調節蔗糖酯水平可用于生成從其中生成的煙霧風味譜被改變的植物。因此，本發明可提供新的混合機會以生成期望的煙草風味。因此，例如通過增加異丙基蘋果酸合酶的表達或活性可增加植物的蔗糖酯含量，其可導致植物能夠釋放升高水平的與東方煙草更相似的風味分子。因此，再例如，通過降低異丙基蘋果酸合酶的表達或活性可降低植物的蔗糖酯含量，其可導致植物能夠釋放較低水平的與烤煙更相似的風味分子。
[0182] 在再一方面，提供調配煙草的方法，包括步驟:在煙草調配中替換或添加一種或更多類型的煙草，所述煙草(例如，煙葉、或者源自或可源自煙葉的組合物)源自轉基因、突變或非天然存在的植物，所述植物中的植物蔗糖酯含量如本文所述通過調節(優選，增加)異丙基蘋果酸合酶的表達或活性已經得到調節(例如增加或減少)。在另一方面，提供調配煙草的方法，包括步驟:在煙草調配中替換、減少或省略東方類型的煙草；而添加源自轉基因、突變或非天然存在植物的煙草(例如，煙葉、或者源自或可源自煙葉的組合物)，所述植物中的植物蔗糖酯含量如本文所述通過調節(優選，增加)異丙基蘋果酸合酶的表達或活性已經得到調節(優選，增加)。煙草如東方煙草的替換、減少或添加可對應于被替換、減少或添加的煙草的約 10%,20%,30%,40%, 50%,60%,70%,80%,90%^； 100%。
[0183]在又一方面涉及調節煙草或煙草制品風味的方法，包括:加入煙草(例如，煙葉、或者源自或可源自煙葉的組合物)或煙草制品，所述煙草源自或可源自轉基因、突變或非天然存在的植物，如本文所述植物中的植物蔗糖酯含量已經得到調節。
[0184]在還一方面涉及使用調節異丙基蘋果酸合酶的表達或活性的試劑來調節煙草或煙草制品的風味。
[0185]調節在植物中的蔗糖酯水平還可用于生成其中植物抗蟲性被改變的植物。通過如本文所述地增加蔗糖酯生產水平可增加植物的抗蟲性。通過如本文所述地減少蔗糖酯生產水平可減少植物的抗蟲性。
[0186]如本文所述的在植物中產生的蔗糖酯的組合物可從其中提取和可選地純化以用于各種其它用途，例如在藥物、食品添加劑、吸煙風味劑(smoking flavourant)以及作為有機殺蟲劑的成分等等。在一個實施方案中，從葉或葉表面提取蔗糖酯。因此，本公開的另一方面是產品，例如含有蔗糖酯的藥物、食品添加劑、吸煙風味劑以及有機殺蟲劑。
[0187]根據本公開的蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，其中Rl、R2、R3、R4和R5是氫原子或酰基鏈。在蔗糖酯上可被酯化的酰基鏈如圖6所示。一些具體蔗糖酯的實例如表1和圖2所示。
[0188]在一個或多個蔗糖酯中每一個的R1、R2和R4上的酰基鏈中的碳總數可以是，例如12、13、14、15、16、17 或 18 ;適宜地，14、15、16、17 或 18 ;適宜地，16、17 或 18 ;或適宜地，14或15。如果這個總數的碳存在于每個蔗糖酯上，那么組成的酰基鏈可選自如圖6所示那些中的任意者。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。適宜地，所述酰基鏈的一個或更多、兩個或更多、或者三個或更多將是甲基戊酰基，特別是當6碳酰基鏈存在時。
[0189]在一個實施方案中，所述蔗糖酯是這樣的蔗糖酯，其在R3和R5上具有乙酰基或氫、以及在R1、R2和R4位的任意者上具有3、4、5或6碳的酰基鏈。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。在另一個實施方案中，所述蔗糖酯在R3和R5上具有乙酰基或氫、以及在Rl、R2和R4位的任意者上具有4、5或6碳的酰基鏈。適宜地，所述蔗糖酯具有在R3上的乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。在又一個實施方案中，所述蔗糖酯在R3和R5上具有乙酰基或氫、以及在R1、R2和R4位的任意者上具有5或6碳的酰基鏈。適宜地，所述蔗糖酯在R3上的乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。在還一個實施方案中，所述蔗糖酯在R3和R5上具有乙酰基或氫、以及在Rl、R2和R4位上具有6碳的酰基鏈。適 宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。
[0190]在一個實施方案中，所述蔗糖酯在R3和R5上具有乙酰基或氫、以及在Rl位上具有3、4、5或6碳的酰基鏈、在R2位上具有3、4、5或6碳的酰基鏈和在R4位上具有3、4、5或6碳的酰基鏈。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。在另一個實施方案中，所述蔗糖酯在R3和R5上具有乙酰基或氫、以及在Rl位上具有4、5或6碳的酰基鏈、在R2位上具有4、5或6碳的酰基鏈和在R4位上具有4、5或6碳的酰基鏈。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。在又一個實施方案中，所述蔗糖酯在R3和R5上具有乙酰基或氫、以及在Rl位上具有5或6碳的酰基鏈、在R2位上具有5或6碳的酰基鏈和在R4位上具有5或6碳的酰基鏈。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。
[0191]在一個實施方案中，所述蔗糖酯在R3和R5上具有乙酰基或氫、以及至少在R1、R2和R4位之一上具有6碳的酰基鏈。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。
[0192]在一個實施方案中，所述蔗糖酯在R3和R5上具有乙酰基或氫、以及在Rl位上具有6碳的酰基鏈、在R2位上具有6碳的酰基鏈和在R4位上具有6碳的酰基鏈。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及R5上具有乙酰基或氫。適宜地，所述蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。在一個實施方案中，所述蔗糖酯是含有(支鏈)β-甲基戊酰基的蔗糖酯。
[0193]在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，其中Rl至R5的每一個是這樣的酰基鏈中的任一個，所述酰基鏈選自乙酰基、丁酰基、丙酰基或其同分同分異構體、異丁酰基、戊酰基(戊酰基)、2_甲基-丁酰基、異戊酰基、異戊烯酸酰基、戊烯酸酰基、己酰基或其同分異構體、2-甲基戊酰基、β-甲基戊酰基和4-甲基戊酰基。在另一個實施方案中，蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基以及Rl、R2、R4和R5中的每一個是這樣的酰基鏈中的任一個，所述酰基鏈選自乙酰基、丁酰基、丙酰基或其同分異構體、異丁酰基、戊酰基(戊酰基)、2_甲基-丁酰基、異戊酰基、異戊烯酸酰基、戊烯酸酰基、己酰基或其同分異構體、2-甲基戊酰基、β-甲基戊酰基和4-甲基戊酰基。在一個實施方案中，優選6碳的酰基鏈是支鏈。在另一個實施方案中，優選6碳的酰基鏈是β-甲基戊酰基。[0194]在另一個實施方案中，蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是氫或乙酰基、R5是氫或乙酰基、以及Rl、R2和R4中的每一個是這樣的酰基鏈中的任一個，所述酰基鏈選自乙酰基、丁酰基、丙酰基或其同分異構體、異丁酰基、戊酰基(戊酰基)或其同分異構體、2-甲基-丁酰基、異戊酰基、異戊烯酸酰基、戊烯酸酰基、己酰基或其同分異構體、2-甲基戊酰基、β -甲基戊酰基和4-甲基戊酰基。個體蔗糖酯公開在表1和圖2中。
[0195]在另一個實施方案中，蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、R5是氫或乙酰基、以及R1、R2和R4中的每一個是這樣的酰基鏈中的任一個，所述酰基鏈選自乙酰基、丁酰基、丙酰基或其同分異構體、異丁酰基、戊酰基(戊酰基)或其同分異構體、2-甲基-丁酰基、異戊酰基、異戊烯酸酰基、戊烯酸酰基、己酰基或其同分異構體、2-甲基戊酰基、β -甲基戊酰基和4-甲基戊酰基。
[0196]在另一個實施方案中，蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、R5是氫或乙酰基；R1是丁酰基、丙酰基或其同分異構體、戊酰基(戊酰基)或其同分異構體、或者己酰基或其同分異構體；R2是丙酰基或其同分異構體、戊酰基(戊酰基)或其同分異構體、或者己酰基或其同分異構體；以及R4是戊酰基(戊酰基)或其同分異構體、或者己酰基或其同分異構體。
[0197]在另一個實施方案中，蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、R5是氫或乙酰基；Rl是丙酰基或其同分異構體、戊酰基(戊酰基)或其同分異構體、或者己酰基或其同分異構體；R2是戊酰基(戊酰基)或其同分異構體、或者己酰基或其同分異構體；以及R4是己酰基或其同分異構體。
[0198]在一個實施方案中，得到調節的蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體以及R5是氫或乙酰基；或者蔗糖酯如圖5所示，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體以及R5是氫或乙酰基；或者鹿糖酯如圖5所示,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4=己酰基或其同分異構體以及R5是氫或乙酰基(C2C14:0)。
[0199]在一個實施方案中,鹿糖酯具有圖5所示的通用結構,其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體以及R5是氫或乙酰基；或者鹿糖酯如圖5所示,其中R3 =乙酰基、Rl =戍酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體以及R5是氫或乙酰基；或者蔗糖酯如圖5所示,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =己酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體以及R5是氫或乙酰基(C12C15:0)。
[0200]在一個實施方案中，蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是戊酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0)。
[0201]在一個實施方案中，被調節的蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是丙酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0)。
[0202]在一個實施方 案中，蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C17:0)。
[0203]在一個實施方案中，被調節的蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是己酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C18:0)。
[0204]在另一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約594道爾頓至692道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約608道爾頓至692道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約622道爾頓至692道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約636道爾頓至692道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約650道爾頓至692道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約650道爾頓至678道爾頓的分子量。在另一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約594道爾頓至678道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約608道爾頓至678道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約622道爾頓至678道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約636道爾頓至678道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約650道爾頓至678道爾頓的分子量。在一個實施方案中，所述蔗糖酯具有從約664道爾頓至678道爾頓的分子量。
[0205]另一方面涉及調節煙草或煙草制品風味的方法，包括向其中添加此處所述的蔗糖酯組合物。
[0206]在另一個實施方案中，在植物中所述蔗糖酯的濃度、水平、或產量增加了。在另一個實施方案中，在植物中所述蔗糖酯的濃度、水平、或產量減少了。
[0207]在一個具體實施方案中，提供用于產生突變、非天然存在的或轉基因植物的組合物和方法，其中所述 植物已被修飾以增加異丙基蘋果酸合酶表達或活性，這可導致其中蔗糖酯的濃度、水平、或產量增加了的植物或植物材料。具體地，本文所述的蔗糖酯的水平或產量是增加的或誘導的。
[0208]在另一個具體實施方案中，提供用于產生突變、非天然存在的或轉基因植物的組合物和方法，其中所述植物已被修飾以減少或抑制異丙基蘋果酸合酶表達或活性，這可導致其中蔗糖酯的濃度、水平、或產量減少了的植物或植物材料。具體地，本文所述的蔗糖酯的水平是減少的或廢除的。
[0209]有利地，根據本文所述方法獲得的突變、非天然存在的或轉基因植物與對照植物在視覺外觀上相似或基本相同。在一個實施方案中，突變、非天然存在的或轉基因植物的桿高(stalk height)與對照植物基本相同，例如在田間移植后一、二、或三或更多個月、或者在去稍后10、20、30或36或更多天。例如，突變、非天然存在的或轉基因植物的桿高與不低于對照植物基本的桿高。在另一個實施方案中，突變、非天然存在的或轉基因植物的葉綠素含量與對照植物基本相同。在另一個實施方案中，突變、非天然存在的或轉基因植物的桿高與對照植物基本相同、并且突變、非天然存在的或轉基因植物的葉綠素含量與對照植物基本相同。在其它實施方案中，突變、非天然存在的或轉基因植物的葉子的尺寸、或形狀、或數目、或顏色與對照植物基本相同。適宜地，所述植物是煙草植物。
[0210]在另一方面，提供至少在植物的部分中用于調節蔗糖酯含量(如甲基戊酰基蔗糖酯含量)的方法，其包括下列步驟:(i)調節在植物中的異丙基蘋果酸合酶的表達或活性，優選地，其中所述異丙基蘋果酸合酶含有本文所述的多核苷酸序列或多肽序列；(ii)任選地測量在獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉基因植物的至少部分中的蔗糖酯含量；以及(iii)識別其中蔗糖酯含量與對照植物相比已得到調節的突變、非天然存在的或轉基因植物。適宜地，所述突變、非天然存在的或轉基因植物的視覺外觀與對照植物基本相同。適宜地，所述植物是煙草植物。
[0211]在另一方面，提供至少在植物的部分(例如，葉子)中用于增加蔗糖酯含量(如β -甲基戊酰基蔗糖酯含量)的方法，其包括下列步驟:(i)增加在植物中的異丙基蘋果酸合酶的表達或活性，優選地，其中所述異丙基蘋果酸合酶含有本文所述的多核苷酸序列或多肽序列；(ii)任選地測量在獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉基因植物的至少部分中的蔗糖酯含量；以及(iii)鑒定其中蔗糖酯含量與對照植物相比已增加的突變、非天然存在的或轉基因植物。
[0212]在另一方面，提供至少在植物的部分中用于減少蔗糖酯含量(如甲基戊酰基蔗糖酯含量)的方法，其包括下列步驟:(i)減少在植物中的異丙基蘋果酸合酶的表達或活性，優選地，其中所述異丙基蘋果酸合酶含有本文所述的多核苷酸序列或多肽序列；(ii)任選地測量在獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉基因植物的至少部分中的蔗糖酯含量；以及(iii)鑒定其中蔗糖酯含量與對照植物相比已減少的突變、非天然存在的或轉基因植物。
[0213]有利地，本文所述的方法也可用于通過增加異丙基蘋果酸合酶的表達或活性而生成東方性狀的植物。根據這種實施方案，非東方植物品種，例如烤煙品種植物可被工程化以使得其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性增加。這可賦予植物東方性狀，因為其可改變(例如，增加或提高)其東方所以是有利地，從而產生新的芳香植物系、品種或雜種。 [0214]本文所述的方法也可用于生成植物，通過減少異丙基蘋果酸合酶的表達和活性減少、抑制或廢除所述植物 中的東方。因此，根據這種實施方案，東方植物品種可以從而異丙基蘋果酸合酶的表達或活性減少。植物內東方性狀的減少或廢除可以是有利的，因為改變或減少了其東方風味，從而產生新的芳香品種或雜種。
[0215]異丙基蘋果酸合酶表達與對照相比的增加從約5%至約100%或更多、或至少10%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、％、至少80%、至少90 %、至少95 %、至少98 %、100 %、150 %、或200的增加，其包括在轉錄活性或蛋白表達或兩者上的增加。
[0216]異丙基蘋果酸合酶活性與對照植物相比的增加從約5%至約100%或更多、或至少10%、至少20、25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、100%、150%、或200%或更多的增加。
[0217]異丙基蘋果酸合酶表達與對照相比的減少從約5%至約100%、或至少10%、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少75、80 %、至少90 %、至少95%、至少98%、或100%的減少,其包括轉錄活性或蛋白表達或兩者。
[0218]異丙基蘋果酸合酶活性與對照植物相比的減少從約5%至約100%、或至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、％、至少90%、至少95%、至少98%、或100%或更多的減少。
[0219]蔗糖酯含量與對照植物相比的減少可從約5%至約100 %、或至少10 %、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、或多達100%的減少。
[0220]本文所述的多核苷酸和重組構建體可用于在目標植物種(適宜地煙草)中調節本文所述的異丙基蘋果酸合酶的表達。
[0221]一方面是本公開的突變植物、非天然存在植物、雜交植物、轉基因植物的種子。優選地，所述種子是煙草種子。另一方面是本公開的突變植物、非天然存在植物、雜交植物、轉基因植物的花粉或胚珠。此外，本發明提供所述的突變植物、非天然存在植物、雜交植物、轉基因植物，其進一步包括賦予雄性不育的核酸。
[0222]本公開還提供本發明突變植物、非天然存在植物、雜交植物、或轉基因植物或其部分的可再生細胞的組織培養，其培養能夠表達親代的所有形態和生理特征的可再生植物。可再生細胞包括，但不限于來自葉、花粉、胚、子葉、下胚軸、根、根尖、花藥、花和其部分、胚珠、芽、莖(stem)、桿(stalk)、髓和莢膜、或源自其的愈傷組織或原生質體的細胞。
[0223]根據本公開，攜帶突變異丙基蘋果酸合酶等位基因的植物可用于植物育種程序中以建立有用的系、品種和雜種。特別地，可使所述突變異丙基蘋果酸合酶等位基因進行基因滲入至以上所述的商業上重要的品種。因此，提供植物育種的方法，其包括將本文所述的突變植物、非天然存在植物或轉基因植物與另一種植物進行雜交、育種或基因滲入，所述另一種植物例如具有不同遺傳同一性、不同遺傳背景、不同品種、不同系或者不同雜種。一種方法包括將本文所述的突變植物、非天然存在植物或轉基因植物與栽培品種、或優良栽培品種或煙草屬植物如紅花煙草(例如，白肋型)進行雜交、育種或基因滲入。方法可以進一步包括后代植物與另一植物雜交，和任選地重復雜交直到獲得具有期望的遺傳性狀或遺傳背景的后代。所述方法可進一步包括鑒定其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性被調節的植物的步驟。所述方 法可進一步包括選擇其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性與對照植物相比被調節的植物的步驟。這樣的育種方法的一個目的是向其它品種、育種系、雜種或栽培品種，尤其是具有商業利益的那些，引入期望的遺傳性狀。另一個目的是便于在單一植物品種、系、雜種或栽培品種中疊加不同基因的遺傳修飾。考慮種內和種間交配。這樣的雜交所產生的后代植物也稱為育種系，是本公開的非天然存在植物的實例。
[0224]在一個實施方案中，提供用于生產非天然存在植物的方法，包括:(a)突變或轉基因植物與第二植物雜交以產生后代煙草種子；(b)在植物生長條件下使后代煙草種子生長以產生非天然存在植物。所述方法可進一步包括鑒定其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性被調節的植物的任選步驟。所述方法可進一步包括選擇其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性與對照植物相比被調節的植物的任選步驟。所述方法可進一步包括:(C)非天然存在植物的上一代與自身或另一植物雜交以產生后代煙草種子；(d)在植物生長條件下使步驟(C)的后代煙草種子生長，以產生額外的非天然存在植物；以及(e)重復多次(C)和(d)的雜交和生長步驟，以產生非天然存在植物的其它世代。方法在步驟(a)之前可任選地包括提供親本植物的步驟，親本植物包括表征的遺傳同一性且不同于突變或轉基因植物。在一些實施方案中，根據育種程序，雜交和生長步驟重復從O到2次、從O到3次、從O到4次、從O到5次、從O到6次、從O到7次、從O到8次，從O到9次或從O到10次，以產生非天然存在植物的世代。回交是這種方法的實例，其中后代與其親本之一或與其親本遺傳相似的另一植物雜交，以便獲得具有接近親本之一的遺傳同一性的下一代中的后代植物。用于植物育種，尤其是煙草植物育種的技術，是公知的并可以用于所述的方法。本公開還提供了通過這些方法產生的、獲得的或可獲得的非天然存在的植物。
[0225]在本文所述方法的一些實施方案中，使用標準田間程序在田間評價獲自育種和篩選的系的變體異丙基蘋果酸合酶基因。包括原始未誘變親本的對照基因型包括在內，并且按隨機的完全區組設計或其它適當的田間設計將入選者(entries)排布于田間。對于煙草，使用標準的農學操作，例如在焙烘(curing)之前和期間，收割、稱量和取樣煙草用于化學和其它常見測試。進行數據的統計分析以確認所選擇系與親本系的相似性。任選進行所選植物的細胞遺傳學分析來確認染色體互補性和染色體配對關系。
[0226]在一個實施方案中，通過上述育種、雜交或基因滲入方法所獲得的或可獲得的植物將不產生順式冷杉醇、將基本上不產生順式冷杉醇、或將不產生可檢測水平的順式冷杉醇。在另一個實施方案中，蔗糖酯組合物和通過本文所述方法所獲得或可獲得的蔗糖酯組合物將不包含或含有順式冷杉醇、將不包含或含有實質水平的順式冷杉醇、或者將不包含或含有可檢測水平的順式冷杉醇。因此，順式冷杉醇性狀可以存在或者其不存在。[0227]DNA指紋、單核苷酸多態性、微衛星標志物或類似技術可用在標志物輔助的選擇(MAS)育種程序中，以便向其它如本文所述的煙草轉移或培育異丙基蘋果酸合酶基因的突變等位基因。例如，育種人員可以采用含有突變等位基因的基因型與農學期望的基因型進行雜交而建立分離的群體。可使用本文所列出的技術之一，使用從異丙基蘋果酸合酶基因組序列或其片段所開發的標志物來篩選F2中的植物或回交世代。鑒定為具有突變等位基因的植物可以回交或自花傳粉以建立待篩選的第二群體。取決于預期遺傳樣式或所用MAS技術，有必要在每輪回交之前對所選擇的植物進行自花授粉，以幫助鑒定期望的個體植物。可以重復進行回交或其它育種過程直到恢復輪回親本的所需表型。
[0228]根據本公開，在育種程序中，成功的雜交產生可育的Fl植物。所選擇的Fl植物可以與親本之一雜交，并且第一回交世代植物進行自花傳粉以產生再次篩選變體異丙基蘋果酸合酶基因表達的群體(例如，異丙基蘋果酸合酶基因的無效版本)。重復回交、自花授粉和篩選的過程，例如至少4次，直到最終篩選產生可育并且與輪回親本相當相似的植物。如果需要的話，這種植物自花授粉，并且隨后再次篩選后代以確認植物顯示出變體異丙基蘋果酸合酶基因表達。在一些實施方案中，篩選F2代中植物群體的變體異丙基蘋果酸合酶基因表達，例如，根據標準方法，例如通過使用PCR方法采用基于本文所述異丙基蘋果酸合酶的核苷酸序列信息的引物，鑒定由于缺失異丙基蘋果酸合酶基因而沒有表達異丙基蘋果酸合酶的植物。
[0229]雜交煙草品種可通過以下產生:阻止第一品種的雌性親本植物(即，種子親本)的自花傳粉、允許來自第二品種的雄性親本植物的花粉使雌性親本植物受精、并允許在雌性植物上形成Fl雜種種子。可以通過在花發育早期將花朵去雄防止雌性植物的自花授粉。或者，可以使用雄性不育的形式防止雌性親本植物上的花粉形成。例如，通過細胞質雄性不育(CMS)或轉基因雄性不育可以產生雄性不育，在轉基因雄性不育中轉基因抑制孢子和/或花粉形成或自交不兼容。含有CMS的雌性親本植物特別有用。在實施方案中，其中雌性親本植物是CMS，從雄性可育植物收獲花粉并人工施加到CMS雌性親本植物的柱頭，從而收獲得到的Fl種子。
[0230]本文所述品種和系可用于形成單雜交煙草Fl雜種。在這樣的實施方案中，親本品種的植物可以生長為基本均勻的相鄰種群，以便雄性親本植物對雌性親本植物的天然交叉授粉。通過常規方式選擇性收獲雌性親本植物上形成的Fl種子。還可以大批培養兩個親本植物品種，并收獲作為自花授粉結果的雌性親本上形成的Fl雜種種子和雄性親本上形成的種子的混合。或者，可以進行三元雜交，其中單雜交Fl雜種用作雌性親本，并與不同的雄性親本雜交。作為另一種選擇，可以建立雙雜交雜種，其中兩個不同單雜交的Fl后代進行自交。
[0231]可以篩選或選擇突變的、非天然存在的或轉基因的植物群體中具有期望性狀或表型的那些群體成員。例如，可以篩選單一轉化事件的后代群體中具有期望多肽或多核苷酸表達水平的那些植物。物理和生物化學的方法可用于鑒定表達水平。這些包括用于檢測多核苷酸的Southern分析或PCR擴增；用于檢測RNA轉錄物的Northern印跡、SlRNA酶保護、引物延伸或RT-PCR擴增；用于檢測多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶法分析；以及檢測多肽的蛋白凝膠電泳、Western印跡、免疫沉淀和酶聯免疫分析。其它技術如原位雜交、酶染色和免疫染色也可用于檢測多肽或多核苷酸的存在或表達。
[0232]如本文所述的突變的、非天然存在的或轉基因植物細胞和植物包括一個或多個重組多核苷酸，例如本文所述的一個或多個分離多核苷酸、一個或多個多核苷酸構建體、一個或多個雙鏈RNA、一個或多個綴合物或者一個或多個載體/表達載體。
[0233]可以使用包括例如RT-PCR、Northern印跡、RNA酶保護、引物延伸、Western印跡、蛋白凝膠電泳、免疫沉淀、酶聯免疫分析、芯片分析和質譜法的方法評價基因表達。應當注意，如果多肽在組織優選的或廣泛表達啟動子的控制下表達，可以在整個植物或在選定的組織中來評價表達。同樣，如果多肽在特定時間例如在特定的發育時間或經誘導表達，可在期望的時間段內選擇性地評價表達。
[0234]沒有限制，本文所述的植物出于其它目的在表達或活性被調節之前或之后可經過修飾。一個或多個如下遺傳修飾可以存在于本公開的突變的、非天然存在的或轉基因植物中。在一個實施方案中，修飾參與重金屬吸收或重金屬轉運的一個或多個基因，產生比未經修飾的對照植物或其部分具有更低重金屬含量的植物或植物部分(如葉)。非限制性實例包括助陽離子擴散蛋白(CDF)家族、Zrt-，Irt樣蛋白(ZIP)家族、陽離子交換蛋白(CAX)家族、銅轉運蛋白(COPT)家族、重金屬P型ATP酶家族(HMA，如W02009074325中所述)、天然抗性相關的巨噬細胞蛋白(NRAMP)同系物家族以及參與重金屬(如鎘)轉運的ATP結合盒(ABC)轉運蛋白家族中的基因。如本文所用，術語重金屬包括過渡金屬。在另一個實施方案中，參與含氮代謝中間體轉化的一個或多個基因被修飾，產生這樣的植物或植物部分(如葉)，當加熱時產生和對照植物或其部分相比更低水平的至少一種煙草特異性亞硝胺(例如4-(甲基亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-1_ 丁酮、N-亞硝基去甲基煙堿、N-亞硝基新煙草堿和N-亞硝基假木賊堿)。可以被修飾的基因的非限制性實例包括編碼煙堿去甲基化酶的基因，如CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10，其參與煙堿向去甲基煙堿的轉化，并在TO2006091194、W02008070274、W02009064771 和 PCT/US2011/021088 中描述。
[0235]其它修飾的實例包括除草劑耐受性，例如，草甘膦是許多廣譜除草劑的活性成分。已經通過轉移aroA基因(來自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和大腸桿菌(E.coli)的草甘膦 EPSP合成酶)開發了草甘膦抗性轉基因植物。已經通過轉化來自擬南芥的突變ALS(乙酰乳酸合成酶)基因制備了磺脲抗性植物。來自突變綠穗莧(Amaranthus hybridus)的光系統II的OB蛋白已經轉移至植物中產生阿特拉津抗性轉基因植物；以及通過并入來自細菌肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的bxn基因產生溴苯腈抗性轉基因植物。另一示例性的修飾產生昆蟲抗性植物。蘇云金芽孢桿菌(Baci I Iusthuringiensis) (Bt)毒素可以提供延遲Bt抗性害蟲出現的有效途徑，如最近在西蘭花中所示，其中漸增的(pyramided) cryIAc和crylC Bt基因控制小菜蛾對單一蛋白的抗性,并顯著延遲抗性昆蟲的進化。另一個示例性修飾產生抵抗病原體(如病毒、細菌、真菌)引起的疾病的植物。工程改造了表達Xa21基因的植物(細菌性葉斑病抗性)以及表達Bt融合基因和幾丁質酶基因的植物(三化螟抗性和鞘耐受)。另一個示例性的修飾產生改變的生殖能力，如雄性不育。另一個示例性的修飾產生耐受非生物脅迫(例如，干旱、溫度、鹽度)的植物，通過轉移來自擬南芥的酰基甘油磷酸酶產生耐受轉基因植物；編碼參與甘露糖醇和山梨糖醇合成的甘露糖醇脫氫酶和山梨醇脫氫酶的基因改善抗旱性。另一個示例性的修飾產生這樣的植物，其產生具有人體使用中良好的免疫原性特性的蛋白質。例如，能夠產生在其N-聚糖中基本上缺失α _1，3_連接的巖操糖殘基、β _1，2_連接的木糖殘基、或兩者的蛋白質的植物可以是有用的。其它示例性修飾可以產生具有改善的貯藏蛋白和油的植物、具有增強的光合效率的植物、具有延長的貨架期的植物、具有增強的碳水化合物含量的植物以及抗真菌的植物；編碼參與生物堿生物合成的酶的植物。也可考慮這樣的轉基因植物，其中S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和/或胱硫醚Y -合酶(CGS)的表達已被調節。
[0236]一個或更多這樣的性狀可基因滲入到來自另一個植物或煙草栽培品種的突變的、非天然存在的或轉基因的植物，或可以直接轉化至其中。可以通過本領域已知的任何植物育種方法實現將性狀基因滲入到突變的、非天然存在的或轉基因植物中，所述植物育種方法例如譜系育種、回交、雙單倍體育種等(參見，Wernsman，E.A，和Rufty，R.C.1987.第 17 章 Tobacc0.669-698 頁，在 Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr (編)，MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y761 頁中)。如上所述的基于分子生物學的技術，尤其是RFLP和微衛星標志物，可用于這樣的回交中，來鑒定與輪回親本具有最高遺傳同一性程度的后代。這允許加快生產與輪回親本具有至少90%、優選至少95%、更優選至少99%遺傳同一性的煙草品種，以及更優選地與輪回親本遺傳上一致的煙草品種，并還包括來自供體親本的基因滲入性狀。這種遺傳同一性的確定可以基于本領域已知的分子標志物。
[0237]最后的回交世代可進行自交以便為所轉移的核酸提供純的育種后代。除了轉移的性狀(例如，一個或多個單基因性狀)以外，所得植物一般還具有基本上本公開的所有突變的、非天然存在的或轉基因的植物的形態和生理特性。精確的回交操作規程將取決于待改變的性狀來確定合適的測試操作規程。雖然當被轉移的性狀是顯性等位基因時回交方法簡化了，也可以轉移隱性等位基因。在這種情況下，可能有必要引入對后代的測試以確定是否已成功轉移期望性狀。
[0238]可以通過使重組多核苷酸整合至其基因組中方式轉化植物或植物細胞而使其成為穩定轉化的。穩定轉化的細胞一般在每次細胞分裂時保留所引入的多核苷酸。也可以瞬時轉化植物或植物細胞，使得重組多核苷酸沒有整合到其基因組中。瞬時轉化的細胞通常在每次細胞分裂時失去所引入的重組多核苷酸的所有或某些部分，從而在足夠次數的細胞分裂之后所引入的重組多核苷酸在子細胞中檢測不到。
[0239]公開了綴合半體，其包括大分子化合物，例如蛋白質(例如抗體)、脂肪酸鏈、糖殘基、糖蛋白、聚合物(例如，聚乙二醇)，或其組合。寡核苷酸可以綴合至增加寡核苷酸細胞吸收的半體上。半體的非限制性實例包括但不限于抗體、多肽、脂質半體如膽固醇半體、膽酸、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇、巰基膽固醇、脂肪族鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂、聚胺或聚乙二醇鏈、金剛烷乙酸、棕櫚基半體、十八烷基胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇半體。半體可以是帶正電荷的聚合物，如帶正電荷的肽，例如其長度是約I至50個氨基酸殘基，或聚亞烷基氧化物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇。適當地，帶正電荷的聚合物，如聚亞烷基氧化物可以通過接頭例如可釋放的接頭附著至低聚物。
[0240]當多肽表達被測量時，對編碼多肽的mRNA在細胞中量的檢測可以通過例如PCR或Northern印跡來進行定量。當測量到樣本中多肽量的變化時，通過使用抗體檢測它，可用于使用已知技術來定量多肽在細胞中的量。或者，使用本領域公知的方法來測量酶的生物活性。
[0241]在另一個實施方案中，本文提供了對多肽具有免疫反應性的抗體。如本文所示的多肽、片段、變體、融合多肽等可以在生產對其具有免疫反應性的抗體中用作“免疫原”。這樣的抗體可通過抗體的抗原結合位點特異性結合多肽。特異性結合的抗體是特異性識別并結合多肽、同系物和變體、而不識別和結合其它分子的那些。在一個實施方案中，所述抗體特異于具有本文所示氨基酸序列的多肽，并且不與其它多肽交叉反應。
[0242]更具體而言，所述多肽、片段、變體、融合多肽等含有激發抗體形成的抗原決定簇或表位。這些抗原決定簇或表位可以是線性的或構象的(不連續的)。線性表位的組成有單一部分的多肽氨基酸，而構象的或不連續表位的組成有來自多肽鏈不同區域的氨基酸部分，其通過多肽折疊而極為靠近。可以通過本領域已知的任何方法鑒定表位。此外，來自多肽的表位可以用作分析 中的研究試劑，以便用于從物質(如多克隆血清或來自培養雜交瘤的上清)中純化特異性結合的抗體。可以使用本領域已知的技術如固相合成、多肽的化學或酶切割、或使用重組DNA技術來生產這樣的表位或其變體。
[0243]可以通過常規技術制備多肽的多克隆抗體和單克隆抗體兩者。本文也考慮產生對多肽特異的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。可以通過常規技術生產并鑒定這樣的雜交瘤。對于抗體的生產而言，可以通過注射多肽、片段、變體或其突變體來免疫各種宿主動物。舉幾個來說，這樣的宿主動物可以包括，但不限于，兔、小鼠和大鼠。可以使用各種佐劑來增加免疫應答。根據宿主種類，這樣的佐劑包括，但不限于，弗氏(完全和不完全)、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、復合多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、鑰孔血藍蛋白、二硝基苯酹和潛在有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。可以通過常規技術回收單克隆抗體。這樣的單克隆抗體可以是任何免疫球蛋白類，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亞類。
[0244]抗體也可用在分析中來檢測多肽或片段在體內或體外的存在。抗體也可以用于通過免疫親和層析來純化多肽或片段。
[0245]各種實施方案提供了突變的植物、非天然存在的植物或轉基因的植物、以及生物質，其中異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的表達水平是調節的。
[0246]這樣的植物，特別是煙草植物的部分，以及更特別的是煙草植物的葉片和中脈，可以并入或用于制造各種消費品，包括但不限于煙霧形成材料、煙霧形成裝置、吸煙物品、可抽吸物品、無煙制品和煙草制品。煙霧形成材料的實例包括但不限于煙草組合物、煙草、煙草提取物、煙絲、切絲填料、烤煙、膨脹煙草、均質煙草、再造煙草和煙斗煙草。吸煙物品和可抽吸物品是煙霧形成裝置的類型。吸煙物品或可抽吸物品的實例包括但不限于香煙、小雪茄和雪茄。無煙制品的實例包括咀嚼煙草和鼻煙。在某些煙霧形成裝置而不是燃燒裝置中，煙草組合物或其它煙霧形成材料被一個或多個電加熱組件進行加熱而產生煙霧。在加熱煙霧形成裝置的另一種類型中，通過將熱從可燃性燃料組件或熱源傳遞至物理上分開的可位于熱源之內、周圍或下游的煙霧形成材料來產生煙霧。無煙煙草制品和各種含煙草的煙霧形成材料可包含任何形式的煙草，包括干燥的顆粒、片、小粒、粉或勻漿，沉積在、混合于、包圍有或組合有任何形式比如片、膜、卡(tab)、泡沫、或珠的其它成分。如本文所用，術語“煙”用來描述一種類型的煙霧，其由吸煙物品如香煙、或通過煙霧形成材料的燃燒而產生。
[0247] 在一個實施方案中，還提供了來自本文所述突變的、轉基因的和非天然存在的植物的干燥(cured)材料。干燥新鮮煙葉的工藝是本領域技術人員已知的，并包括而不限于空氣干燥、火干燥、烤干和太陽干燥。干燥新鮮煙葉的工藝取決于收獲的煙草的類型。例如，弗吉尼亞烤煙(輕型(bright))煙草通常是烤干的，白肋煙和某些深色株通常是空氣干燥的，而煙斗煙草、咀嚼煙草和鼻煙通常是火干燥的。
[0248]在另一個實施方案中，描述了包括含煙草的煙霧形成材料的煙草制品，所述煙霧形成材料包括來自本文所述的突變煙草植物、轉基因煙草植物或者非天然存在的煙草植物的葉子，優選干燥的葉。本文所述的煙草制品可以是混合的煙草制品，其中還可以包括未修飾的煙草。
[0249]當與源自非突變、非天然存在的或非轉基因的對應植物的煙霧形成材料或煙草組合物相比時，在這些煙霧形成材料或煙草組合物中的％蔗糖酯可以是至少約5 %、10 %、15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、96%、97%、98%、99%、和 100%、150%、或 200%或更高。
[0250]當與源自非突變、非天然存在的或非轉基因的對應植物的煙霧形成材料或煙草組合物相比時，在這些煙霧形成材料或煙草組合物中的％蔗糖酯可以是至少約5 %、10 %、15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、96%、97%、98%、99%、以及 100%更低。
[0251]突變的、非天然存在的或轉基因的植物可以具有其它用途，例如在農業中。例如，本文所述的突變的、非天然存在的或轉基因的植物可用于制造動物飼料和人類食品。
[0252]本公開還提供了用于生產種子的方法，所述方法包括:培養本文所述的突變植物、非天然存在的植物或轉基因植物，并從培養的植物收集種子。來自本文所述植物的種子可以通過本領域中已知的方式進行調整處理并包裝在包裝材料中而形成制品。包裝材料如紙和布是本領域眾所周知的。種子的包裝可以帶有描述其中種子性質的標記，例如固定到包裝材料的標簽或標記、印刷在包裝材料上的標記或插入到包裝內的標記。
[0253]另一方面涉及產生含有蔗糖酯的組合物的方法，包括以下步驟:(a)提供本文所述的突變、非天然存在的或轉基因植物的部分；生物質、種子或葉；或煙草制品；和(b)從其中提取蔗糖酯；以及(C)任選地純化蔗糖酯。
[0254]再一方面涉及產生甲基戊酸的方法，包括以下步驟:(a)提供本文所述的突變、非天然存在的或轉基因植物的部分；生物質、或葉；或煙霧形成材料；(b)水解獲自步驟(a)的材料或其提取物；以及(C)任選地收集β -甲基戊酸。β -甲基戊酸可用于生產聚羥基脂肪酸酯等，其可賦予包括塑料在內的材料以有益的性能。可以生產的塑料可以是可生物降解的，并因此可用于生產生物塑料。細菌，如大腸桿菌或假單胞菌屬(Pseudomonas)，可以工程化以表達本文所述的異丙基蘋果酸合酶。適宜的，所用的細菌也可被工程化用來產生聚羥基脂肪酸酯。使用微生物系統的用于生產聚羥基脂肪酸酯的方法描述在，例如US5, 750，848和US6，492，134中。因此，一方面涉及含有異丙基蘋果酸合酶的細菌以及任選的一種或多種用于生產聚羥基脂肪酸酯的基因。另一方面涉及用于生產聚羥基脂肪酸酯的方法，其包括使用所述細菌。
[0255]在一個實施方案中，提供來自本文所述的突變、轉基因以及非天然存在植物的干燥材料。例如，干燥新鮮煙葉的工藝是本領域技術人員已知的，并包括而不限于空氣干燥、火干燥、烤干和太陽干燥。干燥新鮮煙葉的工藝取決于收獲的煙草的類型。例如，弗吉尼亞烤煙(輕型(bright))煙草通常是烤干的，白肋煙和某些深色株通常是空氣干燥的，而煙斗煙草、咀嚼煙草和鼻煙通常是火干燥的。
[0256]在另一實施方案中，描述了煙草制品，其包括含有來自本文所述的突變、轉基因以及非天然存在植物的葉(如干燥葉)的煙草制品、或者通過本文所述的方法生產的煙草制品。本文所述的煙草制品還可以包括未修飾的煙草。
[0257]在又一實施方案中，描述了煙草制品，其含有來自本文所述的突變、轉基因以及非天然存在植物的植物材料，優選葉如干燥葉。例如，可添加植物材料到該煙草制品的內部或外部，因此在燃燒時所期望的芳香得以釋放。根據這種實施方案的煙草制品甚至可以是未修飾的煙草或改良的煙草。根據這種實施方案的煙草制品甚至可以源自突變、轉基因或非天然存在的植物，其除了本文所公開的基因還具有在一個或多個基因上的修飾。
[0258]另一方面涉及(分離的)蔗糖酯組合物，其包含、由或基本上由本文所述的蔗糖酯的一種或多種組成。所述蔗 糖酯可以是在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是14的蔗糖酯；在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是15的蔗糖酯；在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是16的蔗糖酯；在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是17的蔗糖酯；以及在其中Rl、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是18的蔗糖酯。如果碳的這個總數存在，則組成的酰基鏈可選自圖6所示那些中的任意者。適宜地，蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，蔗糖酯在R3上具有乙酰基以及在R5上具有氫。適宜地，所述酰基鏈的一個或更多、兩個或更多、或者三個或更多將是β-甲基戊酰基。因此，例如，蔗糖酯可以是如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基，Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戍酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C14:0);如圖5所示的蔗糖酯，其中R3=乙酰基、Rl=丙酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl =戍酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =己酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C15:0);蔗糖酯具有圖5中所示的通用結構，并且其中R3為乙酰基、Rl為戊酰基或其同分異構體、R2是戊酰基或其同分異構體、R4為己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0);或者其中所述蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3為乙酰基、Rl為丙酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0);如圖5所示的蔗糖酯，其中R3為乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C17:0);并且，如圖5所示的蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是己酰基或其同分異構體，R2是己酰基或其同分異構體，R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C18:0)。
[0259]或者，所述蔗糖酯可以是在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是14的蔗糖酯；在其中Rl、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是15的蔗糖酯；在其中Rl、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是16的蔗糖酯；在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是17的蔗糖酯；以及在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是18的蔗糖酯不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在(C2C18:0)。如果存在碳的這個總數，則組成的酰基鏈可選自圖6所示那些中的任意者。適宜地，蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。適宜地，所述酰基鏈的一個或更多、兩個或更多、或者三個或更多將是β-甲基戊酰基。因此，例如，蔗糖酯可以是如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4=己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C14:0);如圖5所示的鹿糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl =戍酰基 或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =戍酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2=己酰基或其同分異構體、R4=己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C15:0)；蔗糖酯具有圖5中所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是戊酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0);或其中所述蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是丙酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0);如圖5所示的蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C17:0);并且其中如圖5所示的蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是己酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體，不存在、基本不存在或者在可檢測水平不存在(C2C18:0)。
[0260]或者，所述蔗糖酯可以是在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是14的蔗糖酯；在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是15的蔗糖酯；在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是16的蔗糖酯；在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是17的蔗糖酯不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在；以及在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是18的蔗糖酯不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在。如果碳的這個總數存在，則組成的酰基鏈可選自圖6所示那些中的任意者。適宜地，蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。適宜地，所述酰基鏈的一個或更多、兩個或更多、或者三個或更多將是β-甲基戊酰基。因此，例如，蔗糖酯可以是如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =戍酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C14:0);如圖5所示的蔗糖酯，其中R3=乙酰基、Rl=丙酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl =戍酰基或其同分異構體、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的蔗糖酯其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =己酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C15:0);蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是戊酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0);或其中所述蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是丙酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體(C2C16:0);如圖5所示的蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體，不存在、基本不存在或者在可檢測的水平不存在(C2C17:0);并且其中如圖5所示的蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是己酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體，不存在、基本 上不存在或者在可檢測的水平不存在(C2C18:0)。
[0261]或者，所述蔗糖酯可以是在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是14的蔗糖酯；在其中Rl、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是15的蔗糖酯；在其中Rl、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是16的蔗糖酯不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在；在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是17的蔗糖酯不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在；以及在其中R1、R2和R4上酰基鏈中碳的總數是18的蔗糖酯不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在。如果碳的這個總數存在，則組成的酰基鏈可選自圖6所示那些中的任意者。適宜地，蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有乙酰基或氫。適宜地，蔗糖酯在R3上具有乙酰基、以及在R5上具有氫。適宜地，所述酰基鏈的一個或更多、兩個或更多、或者三個或更多將是β-甲基戊酰基。因此，例如，蔗糖酯可以是如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =丙酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的蔗糖酯，其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =戍酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C14:0);如圖5所示的蔗糖酯其中R3 =乙酰基、Rl =丙酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4=己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl =戊酰基或其同分異構體、R2 =戊酰基或其同分異構體、R4 =戊酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基；或如圖5所示的鹿糖酯,其中R3 =乙酰基、Rl = 丁酰基、R2 =己酰基或其同分異構體、R4 =己酰基或其同分異構體、以及R5是氫或乙酰基(C2C15:0);鹿糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是戊酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體，不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在(C2C16:0);或其中所述蔗糖酯具有圖5所示的通用結構，并且其中R3是乙酰基、Rl是丙酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是一個氫原子或乙酰基團，不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在(C2C16:0);如圖5所示的蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是戊酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體，不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在(C2C17:0)；并且其中如圖5所示的蔗糖酯，其中R3是乙酰基、Rl是己酰基或其同分異構體、R2是己酰基或其同分異構體、R4是己酰基或其同分異構體、以及R5是氫原子或乙酰基半體，不存在、基本不存在、或者在可檢測的水平不存在(C2C18:0)。
[0262]另一方面涉及突變、非天然存在的或轉基因植物(適宜地，煙草植物)，其中本文所述的異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性與(其中異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性沒有增加的)對照植物相比是增加的，并且其中所述植物與所述對照植物相比以更高水平生產在其中含甲基戊酰基的蔗糖酯。再一方面涉及突變、非天然存在的或轉基因植物(適宜地，煙草植物)，其中本文所述的異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性與(其中異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性沒有減少的)對照植物相比是減少的，并且其中含β_甲基戊酰基的蔗糖酯的生產比所述對照植物更低。
[0263]還一方面涉及突變、非天然存在的或轉基因烤煙煙草植物，其中本文所述的異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性與(其中異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性沒有增加的)對照植物相比是增加的，并且其中含β_甲基戊酰基的蔗糖酯的生產比所述對照植物更高。
[0264]又一方面涉及突變、非天然存在的或轉基因東方煙草植物，其中本文所述的異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性與(其中異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性沒有減少的)對照植物相比是減少的，并且其中含β_甲基戊酰基的蔗糖酯的生產比所述對照植物更低。
[0265]可收獲本文所述突變、非天然存在的或轉基因煙草植物，源自其的煙草通過使用對所選煙草類型已知的操作進行處理或干燥。使用例如水或有機溶劑洗滌以及隨后的干燥，可以收集葉表面化合物。然后，所得到的粉末可以用來提高吸煙材料的風味性能。然后，在洗滌后殘留的煙草材料可用作例如膨脹煙草的材料。
[0266]在另一方面，提供用于至少在植物的部分中調節抗蟲性的方法，包括以下步驟:(i)調節在植物中的異丙基蘋果酸合酶的表達或活性，優選地，其中所述異丙基蘋果酸合酶含有本文所述的多核苷 酸序列或多肽序列；(ii)任選地測量在獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉基因植物的至少部分中的甲基戊酰基蔗糖酯的量；(iii)鑒定突變、非天然存在的或轉基因植物，其中其含β-甲基戊酰基的蔗糖酯的量與(其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性沒有被調節的)對照植物相比已改變，以及優選地，其中所述突變、非天然存在的或轉基因植物的視覺外觀與對照植物基本相同；以及(iv)獲得其中抗蟲性已經得到調節的植物。
[0267]合適地，提供用于至少在植物的部分中增加抗蟲性的方法，包括以下步驟:(i)增加在植物中的異丙基蘋果酸合酶的表達或活性，優選地，其中所述異丙基蘋果酸合酶含有本文所述的多核苷酸序列或多肽序列；(ii)任選地測量在獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉基因植物的至少部分中的含β -甲基戊酰基的蔗糖酯的量；(iii)識別突變、非天然存在的或轉基因植物，其中其含β_甲基戊酰基的蔗糖酯的量與(其中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性沒有增加的)對照植物相比已增力卩，以及優選地，其中所述突變、非天然存在的或轉基因植物的視覺外觀與對照植物基本相同；以及(iv)獲得其中抗蟲性已經增加的植物。
[0268]還提供通過所述方法獲得的或可獲得的植物或植物材料。
[0269]另一方面涉及突變、非天然存在的或轉基因植物，其中異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性是得到調節的；以及與(其中異丙基蘋果酸合酶的表達或性沒有得到調節)對照植物相比，至少所述植物的部分在含甲基戊酰基的蔗糖酯的組合物上具有改變，以及其中所述植物的視覺外觀與對照植物基本相同，并且其中其抗蟲性也是得到調節的。
[0270]合適地，提供突變、非天然存在的或轉基因植物，其中異丙基蘋果酸合酶的表達、或者由其所編碼的蛋白的活性是增加的以及與(其中異丙基蘋果酸合酶的表達或性沒有增加的)對照植物相比，至少所述植物的部分在含甲基戊酰基的蔗糖酯的組合物上具有改變，以及其中所述植物的視覺外觀與對照植物基本相同，并且其中其抗蟲性也是增加的。
[0271]包括用于對植物基因分型以鑒定、選擇或育種的組合物、方法和試劑盒，并可包括檢測樣本中異丙基蘋果酸合酶多核苷酸存在的方法。因此，描述了組合物，其包括一個或多個用于特異性擴增異丙基蘋果酸合酶多核苷酸至少一部分的引物，以及用于進行擴增或檢測的任選的一個或多個探針和任選的一種或多種試劑。公開了基因特異性寡核苷酸引物或探針，其包括對應于異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的約10個或更多的連續多核苷酸。所述引物或探針可包括或由約15、20、25、30、40、45或50或更多連續多核苷酸組成，其雜交(例如，在例如嚴謹的雜交條件下特異性地雜交)至異丙基蘋果酸合酶多核苷酸。在一些實施方案中，引物或探針可包括或由約10至50個連續核苷酸、約10至40個連續核苷酸、約10至30個連續核苷酸、或約15至30個連續核苷酸組成，其可用于基因鑒定的序列依賴性方法(例如，Southern雜交)或分離(例如，細菌克隆或噬菌體噬菌斑的原位雜交)或基因檢測(例如，作為核酸擴增或檢測中的一個或多個擴增引物)。可設計一個或多個特異性引物或探針并用于擴增或檢測異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的部分或全部。通過具體的實例，兩個引物可用于聚合酶鏈式反應規程中來擴增編碼異丙基蘋果酸合酶核酸的核酸片段，如DNA或RNA。也可以使用源自異丙基蘋果酸合酶核酸序列的一個引物和雜交至異丙基蘋果酸合酶核酸序列(如異丙基蘋果酸合酶啟動子序列、mRNA前體3’端或源自載體的序列等)的上游或下游序列的第二引物進行聚合酶鏈式反應。可用于多核苷酸體外擴增的熱和等溫技術的實例是本領域中公知的。樣本可以是或可源自植物、植物細胞或植物材料、或者從本文所述的植物、植物細胞或植物材料所制得的或來源的煙草制品。
[0272]因此，在另一方面中，還提供了檢測樣本中異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的方法，包括步驟:(a)提供包括、或疑似包括多核苷酸的樣本；(b)使所述樣本接觸多個引物之一、或一個或多個探針以便特異性檢測異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的至少部分；以及(C)檢測擴增產物的存在，其中擴增產物的存在指示著樣本中存在異丙基蘋果酸合酶多核苷酸。在另一方面中，還提供用于特異性檢測異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的至少部分的一個或多個引物或探針的用途。還提供了用于檢測異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的至少部分的試劑盒，其包括用于特異性檢測異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的至少部分的一個或多個引物或探針。試劑盒可以包括用于多核苷酸擴增如聚合酶鏈反應(PCR)的試劑，或用于核酸探針雜交檢測技術如Southern印跡、Northern印跡、原位雜交或微陣列的試劑。試劑盒可以包括用于抗體結合檢測技術，如Western印跡、ELISA、SELDI質譜法或測試條的試劑。試劑盒可以包括用于核酸測序的試劑。試劑盒可以包括用于確定蔗糖酯含量的試劑和/或說明書。在一些實施方案中，試劑盒可以包括一個或多個所述方法的說明書。所述試劑盒可用于遺傳同一性確定、系統發育研究、基因分型、單倍體分型、譜系分析或植物育種，特別是共顯性評分。
[0273]本公開還提供了對含有異丙基蘋果酸合酶多核苷酸的植物、植物細胞或植物材料進行基因分型方法。基因分型提供了區分染色體對的同系物的方式，并可以用來區分植物群體中的分離子(segregant)。分子標志物方法可用于系統發育研究、表征作物品種之間的遺傳關系、鑒定雜交或體細胞雜種、定位影響單基因性狀的染色體片段、圖位克隆(mapbased cloning)和定量遺傳研究。基因分型的具體方法可以采用任意數目的分子標志物分析技術，包括擴增片 段長度多態性(AFLP)。AFLP是由核苷酸序列變異性引起的擴增片段之間等位基因差異的產物。因此，本發明還提供了使用像AFLP分析這樣的技術來跟蹤異丙基蘋果酸合酶基因或核酸的分離、以及遺傳連鎖至這些基因或核酸的染色體序列的方式。
[0274]將于如下實施例中進一步描述本公開，提供所述實施例以更詳細地描述本公開。這些實施例，其闡述用于實施本發明的當前設想的優選方式，是意欲闡明而非限制本公開。
[0275]實施例
[0276]實施例1:在紅花煙草品種烤煙希克斯闊葉(HBL)和原始的紅色俄羅斯(RedRussian, RR)上的鹿糖酯分析。
[0277]為研究在煙草中的蔗糖酯合成，選擇兩種模式品種:烤煙希克斯闊葉(HBL)和原始的紅色俄羅斯(RR)。從國家遺傳資源計劃(National Genetic Resources Program)(種質資源信息網(Germplasm Resources Information Network) - (GRIN),國家種質資源實驗室(National Germplasm Resources Laboratory),貝茨維爾，馬里蘭)可獲得的初始數據的目錄顯示在這兩種品系之間含甲基戊酰基的蔗糖酯的不同含量。
[0278]分析HBL和RR葉滲出物在蔗糖酯上的組合物，結果顯示在圖1中。RR蔗糖酯組合物與HBL蔗糖酯組合物不同。在HBL中，蔗糖酯主要由C2C15:0組成，然而在RR中，觀察到存在更高分子量的種，如C2C16:0、C2C17:0和C2C18:0。如圖2所示，RR和HBL之間的差異是因為在分子中甲基戊酰基酯的存在或缺失。因此，結論是RR是BMVSE品種而HBL是bmvse品種。[0279]實施例2:數量性狀基因座分析
[0280]在分別源自136個自交的F2基因型植物的8F3植物的136個群體中分析葉滲出物中蔗糖酯的組合物，所述F2基因型植物由HBL和RR親本雜交所得。進行數量性狀基因座研究，以使微衛星標志物和含β_甲基戊酰基的蔗糖酯表型相關聯。使用數量性狀基因座制圖法分析數據。含β_甲基戊酰基的蔗糖酯的性狀與在煙草基因組上的一個單一基因座相關聯。這個基因座定位在煙草的連鎖群15 (染色體Α)上。
[0281]實施例3:含β -甲基戊酰基的蔗糖酯的相關基因的鑒定
[0282]研究煙草外顯子在毛狀體中的轉錄水平，以在編碼圖3所述函數(function)的全部可能基因中選擇優選的基因靶標。為研究含甲基戊酰基的蔗糖酯的生產曲線，使用微陣列在幾種選擇的品種中研究表達。
[0283]所述結果鑒定出異丙基蘋果酸合酶相關外顯子探針，因為其表達與每個品種的每個提取物中測量的含β_甲基戊酰基的蔗糖酯的估計量相關(R>0.95)。
[0284]鑒定出四種煙草序列，其編碼番茄異丙基蘋果酸合酶IPMSA和IPMSB的同系物。其命名為 NtIPMSlA(SEQ ID NO: 10) ,NtIPMSlBvl (SEQ ID NO: 12)、NtIPMSlBv2 (SEQ ID NO: 14)和NtIPMS2(SEQ ID NO:1)。根據EST數據庫，因為大多SEQ ID NO:1的表達可以在毛狀體中觀察到，所以其是選擇的候選者。
[0285]用NtIPMS2cDNA作為PCR誘餌篩選從紅花煙草品種HBL構建的BAC文庫，鑒定出命名為PISOGE的BAC。 用鳥槍測序這個BAC。組裝產生幾個重疊群，其中pisogel和pisoge2含有與NtIPMS2相關的序列。
[0286]內含子-外顯子結構在煙草和番茄的異丙基蘋果酸合酶中是保守的。對NtIPMSlBvl、NtIPMSlBv2、SlIPMSB和S1IPMSA而言，觀察到所述基因分離在12個外顯子中。還預期NtIPMS2由12個外顯子組成，但由于S1IPMSA第一外顯子對應于pisogel上的2個外顯子，所以假定NtIPMS2含有13個外顯子。
[0287]通過PCR來測試基因組序列預測的可靠性。普遍地，使用純化的PISOGE BAC或從希克斯闊葉或紅色俄羅斯植物中分離出的基因組DNA，來驗證來自pisoge組裝的預測序列。鑒定出一個與NtIPMS2對應的全長基因組結構。此外，觀察到兩個其它基因樣結構，并有可能代表假基因重復。由PISOGE BAC提出的結構部分得到驗證，但觀察到所述BAC結構和HBL基因組DNA之間的一些差異。
[0288]用PCR作遺傳標志物來區分NtIPMS2的RR和HBL等位基因。在數量性狀基因座作圖中所用的全部F2植物的基因組DNA的PCR擴增上，使用所述IPMS2標志物。使用這個額外的標志物重新計算蔗糖酯數量性狀基因座。數量性狀基因座峰鑒定出性狀和標志物之間關聯的概率最大的位置。所述IPMS2標志物與簡單序列重復標志物PT30172 —起，是對含β-甲基戊酰基的蔗糖酯的性狀的影響概率最高的標志物。
[0289]實施例4:證明NtIPMS2的活性作為在含β -甲基戊酰基的蔗糖酯的合成中的關鍵因素
[0290]從毛狀體EST文庫中分離出與NtIPMS2對應的表達序列標簽，所述毛狀體EST文庫以如下形式:GT09L09(來源=Galpao (無對應中譯文)[TI 1068]毛狀體)和0T05C20 (來源=Orinocco (無對應中譯文)[TI81]毛狀體)。兩個分子在核苷酸序列上一致，因此只有0T05C20cDNA用于表達實驗。使用基于共有序列的NtIPMS2的第一外顯子和第一內含子來生成RNAi構建體。將兩個構建體轉移至雙元載體內，所述雙元載體含有對毛狀體特異的CPS2p啟動子(CPS2指copalyl合酶2，其參與僅在毛狀體中發生的順式冷杉醇合成)、或MMVp病毒啟動子(MMV指紫茉莉花葉病毒)。在東方煙草品種巴斯瑪xanthi (無對應中譯文)和烤煙品種K326中進行使用分別攜帶雙元載體的根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGLl 的穩定轉化。
[0291]從獨立轉化事件所得的一月齡再生植物中收集葉子。以2.5ng/mg鮮重的比添加內標(蔗糖八乙酸酯)。測量針對特異于每種蔗糖酯的離子所記錄的信號面積，并作為內標面積的比進行繪制。從分子到分子的信號反應不相同，所以僅在每兩個分子之間進行的比較是無效的。與內標信號面積的比允許將葉鮮重上的信號正態化。圖2描述了此處所示的蔗糖酯的命名。參見圖4: (A)親本品種K326(烤煙，η = 3)的葉滲出物的組合物和在毛狀體特異啟動子下表達NtIPMS2的轉化體；(B)親本品種K326的葉滲出物的組合物和在病毒啟動子下表達NtIPMS2的轉化體；(C)親本品種巴斯瑪(東方，η = 4)的葉滲出物的組合物和在毛狀體特異啟動子下表達NtIPMS2-RNAi構建體的轉化體；(D):親本品種巴斯瑪的葉滲出物的組合物和在病毒啟動子下表達NtIPMS2-RNAi構建體的轉化體。
[0292]呈現的數據足以證明NtIPMS2是在含β -甲基戊酸的蔗糖酯的生產中的關鍵基因。在含甲基戊酸的蔗糖酯的品種(東方)中抑制IPMS2，減少或廢除了含β-甲基戊酸的蔗糖酯的生產(參見C和D)，從而證明了 IPMS2是生物合成途徑的關鍵成分。RNA干擾構建體的組成型和毛狀體特異性表達導致蔗糖酯C2C16:0、C2C17:0和C2C18:0積累的損失，所述蔗糖酯是可含甲基戊酸的酯。 [0293]在bmvse品種(烤煙)引入NtIPMS2可以誘導產生蔗糖酯(參見A和B)。這證明，僅NtIPMS2cDNA表達足以恢復蔗糖酯的生產。這里的NtIPMS2cDNA的組成型和毛狀體特異性表達導致蔗糖酯C2C16:0、C2C17:0和C2C18:0的重新積累，蔗糖酯是可以含β甲基戊酸的酯。有趣的是，所述cDNA的組成型表達(B)并未導致蔗糖酯的高度積累，然而毛狀體特異性表達導致蔗糖酯積累到這樣的水平，所述水平比得上例如在含甲基戊酸的蔗糖酯的品種中可觀察到的。
[0294]實施例5:用于選擇鋅指核酸酶靶位點的搜索規程
[0295]本實施例說明如何搜索異丙基蘋果酸合酶基因來篩選相較于給定基因組數據庫在給定基因序列內獨特靶位點的存在，以便開發用于改變基因表達的工具。在本公開內包括:通過本公開的方法所鑒定的靶位點、序列基序、以及任何位點或基序在改變植物(如煙草)中對應的基因序列中的用途。
[0296]搜索算法.開發了計算機程序，其允許在DNA數據庫中使用后綴陣列篩選輸入查詢(目標)核苷酸序列中被給定間隔尺寸所隔開的兩個固定長度子字符串DNA基序的存在。后綴陣列的構建和搜索使用開放資源Iibdivsufsort文庫2.0.0 (http://code,google, com/p/libdivsufsort/)，其將任何輸入的字符串直接轉換成Burrows-Wheeler轉化字符串。程序掃描整個輸入(目標)核苷酸序列并返回在選定DNA數據庫中發生次數少于所選次數的所有子字符串組合。
[0297]選擇查詢序列的鋅指核酸酶介導的誘變的靶位點。鋅指DNA結合結構域識別3堿基對的核苷酸序列。鋅指核酸酶包括含有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個鋅指DNA結合結構域的鋅指蛋白，以及IIS型限制性酶的非特異性核酸酶。鋅指核酸酶可用于向靶序列中引入雙鏈斷裂。為引入雙鏈斷裂，需要一對鋅指核酸酶，其中一個結合靶序列的正(上)鏈，另一個結合同一靶序列的相隔0、1、2、3、4、5、6或更多個核苷酸的負(下)鏈。通過對兩個固定長度子字符串DNA基序的每一個使用3的復數，程序可用來鑒定相隔給定間隔長度的兩個鋅指蛋白靶位點。
[0298]程序輸入:
[0299]1、靶查詢DNA序列
[0300]2、待搜索的DNA數據庫
[0301]3、第一子字符串DNA基序的固定尺寸
[0302]4、間隔序列的固定尺寸
[0303]5、第二子字符串DNA基序的固定尺寸
[0304]6、在程序輸入2的所選DNA數據庫中，由程序輸入4隔開的程序輸入3和5的組合發生數目的閾值。
[0305]程序輸出:核苷酸序列列表，其中對于各序列，序列在DNA數據庫中發生的次數具有程序輸入6閾值的最大值。[0306]本文引用或描述的任何出版物提供本申請申請日之前公開的有關信息。本文的陳述不能被解釋為承認本發明人無權早于這種公開。在以上說明書中提到的所有出版物通過參考并入本文。本公開的各種改變和變化，在不脫離本公開的范圍和精神時，對于本領域技術人員是顯而易見的。雖然本公開已結合具體的優選實施方案進行了描述，應當理解，所要求的本發明不應該被不適當地限制于這種具體的實施方案。實際上，用于實施本發明的所述形式的各種改變，其對于細胞、分子和植物生物學或相關領域的技術人員是顯而易見的，其意欲在如下權利要求的范圍內。
[0307]序列
[0308]SEQ ID NO:l(NtIPMS2 核苷酸序列)
[0309]ATGGCTTCTCTCTCTGTAAATTCTATAATTTCCCTGAGCACTTCCCTTTCATTACATTCTAAAAACCCACTTATTCACAGTGTCTTCAGTTTCACGCCTTCAACCACAAGGCATTCAGCTATATGCTGCTCAAATATTCGTCGGCGGCCGGAGTATAAACATGGAAAATTCTCTGACCCTGATTATGTTGGTATTTTTGACACCAGTCTTCGCGATGGCGAACAGGCCGCTGGTGCTACCATGACTAGTAAAGAAAAACTGGACATTGCACGTCAGTTGGCTAAGCTTGGTGTTGATGTTATTGAGGCCGGTTTTCCTTTTGCCTCTGAAGCTGAGTTCGAGCTTGTAAAGTTGATAGCACAGGAAATTGGTAATAACGTAGACAAAGAAGGATACGTGCCGATGATATGTGCCTTAGCTAGGTCTAGTAAGAAGGATATTGAAAGAGCTTGGGATGCTTTAAAGTATGCAAAGAAACCAATGCTTCATATGTTTATTGCGACGAGTGATATACATATGAAGTACAAGTTAAAGATGAGTAGAGAAGAAATTGTGGAGACAGCTAGGAGTACGGTGGCTTATGCAAAAACCCTATTTGAGGATGTTCGGTTTAGCGCTGAAGATGCTGCAAGATCTGATAGGGAGTTCCTTTATCATATTATTGGAGAAGTTATCAAAGCTGGTGCAACAGTGATTGGCCTCCCTGATACAGTTGGATGCAATTTGCCCAGTGAATATGCACAACTGATTTCTGATATAAAAGCCAATACCCCAGGAATACAAGATGCAAACATTTCAACACACTGTCACAACGATCTTGGGCTTGCTACTGCCAACTCCTTAGCTGGAATTTGCGCAGGCGCAAGACTAGTAGATGTTACCATCAATGGAATTGGTGAAAGAGCTGGAAATGCTTCTCTGGAGGAGATTGTAATGGCCTTAAAATATCGTGGAGAGCAAGTACTAGGTGGTATCTATACTGGGATTAATACAAAGCATATATTCATGACGAGCAAAATGGTAGAAGAGTACAGTGGGCTTAAGCTGCAGCCACATAAGGCCATTGTTGGAGCTAATGCATTTTCTCATGAGAGTGGCATCCATCAGGATGGAGTGTTAAAGAACAGAGATACATATGAGTTTGTATCTCATGAAGATGTTGGGTATCGTCGTGCTAATGAAAACGGTATTAGTCTGGGAAAGCTCAGTGGCCGCCATGCATTGAAAGCCAAAATGGCTGAGCTTGGATATGACTTTGATGGAAAAGAACTTGATGACCTCTTTCGTCGATTCAAGTCACT
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CCTGGCAACTTGGAGATGTACAGATTACTTGTGGAAATGTTGGCCGCTCTACAGCAAATGTTAAGCTTATTGACAGC
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ACAGGAGCGCATATGGACATTGTCGTTTCAAGTGTCCAAGCCTATGTTGAGGCGTTGAACAAAATATTCAGTTACAA
AAAAACAGGTCTCGTGAACAAATTTGAAGGCAGTGCGCAATCGTAA
[0310]SEQ ID NO:2(NtIPMS2 氨基酸序列)
[0311 ] MASLSVNSIISLSTSLSLHSKNPLIHSVFSFTPSTTRHSAICCSNIRRRPEYKHGKFSDPDYVGIFDTS
LRDGEQAAGATMTSKEKLDIARQLAKLGVDVIEAGFPFASEAEFELVKLIAQEIGNNVDKEGYVPMICALARSSKKD
IERAWDALKYAKKPMLHMFIATSDIHMKYKLKMSREEIVETARSTVAYAKTLFEDVRFSAEDAARSDREFLYHIIGE
VIKAGATVIGLPDTVGCNLPSEYAQLISDIKANTPGIQDANISTHCHNDLGLATANSLAGICAGARLVDVTINGIGE RAGNASLEEIVMALKYRGEQVLGGIYTGINTKHIFMTSKMVEEYSGLKLQPHKAIVGANAFSHESGIHQDGVLKNRD
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TASTRVLVRGNDDYASFNTSNGQTVNRTVSGTGAHMDIVVSSVQAYVEALNKIFSYKKTGLVNKFEGSAQS
[0312]SEQ ID NO:3 (用于互補的 NtIPMS2cDNA序列)ctcttttcttagggaaaagaataatggct
tctctctctgtaaattctataatttccctgagcacttccctttcattacattctaaaaacccacttattcacagtgt
cttcagtttcacgccttcaaccacaaggcattcagctatatgctgctcaaatattcgtcggcggccggagtataaac
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[0313]SEQ ID NO:4 (覆蓋外顯子X1、XII和XIII的NtIPMS2區的基因組DNA序列，如在紅色俄羅斯中觀察到的。下劃線表示cDNA匹配區。粗體顯示紅色俄羅斯和希克斯闊葉DNA序列之間的保守DNA區)
[0314]
【權利要求】
1.一種突變、非天然存在的或轉基因植物細胞，其包含: (i)至少一種多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼異丙基蘋果酸合酶并且與SEQIDNO: 1、或 SEQ ID NO: 10、或 SEQ ID NO: 12、或 SEQ ID NO: 14 具有至少 60%序列同一性的序列所組成；或者 (ii)由所述多核苷酸編碼的多肽；或者
(iii)與SEQ ID NO: 2、或 SEQ ID NO: 11、或 SEQ ID NO: 13、或 SEQ ID NO: 15 具有至少60%序列同一性的多肽；或者 (iv)含有所述多核苷酸序列的構建體、載體或表達載體，任選地，其中所述構建體、載體或表達載體額外含有啟動子，所述啟動子包含、由或基本上由SEQ ID NO:8所示的序列、或與其具有至少約60%同一性的其變體、或毛狀體啟動子、或天然存在的異丙基蘋果酸合酶啟動子所組成。
2.含有根據權利要求1所述的植物細胞的突變、非天然存在的或轉基因植物。
3.一種用于在植物的至少部分中調節蔗糖酯的量或類型的方法，所述方法包括以下步驟: (i)調節異丙基蘋果酸合酶在植物中的表達或活性，優選地，其中所述異丙基蘋果酸合酶含有多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼異丙基蘋果酸合酶并且與SEQ ID NO: 1、或SEQID N0:10、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO: 14具有至少60%序列同一性的序列所組成；或者由所述多核苷酸編碼的多肽所編碼；或者其中異丙基蘋果酸合酶由與SEQ ID NO:2、或SEQID NO: 11、或SEQ ID NO: 13、或SEQ ID NO: 15具有至少60%序列同一性的多肽所編碼； (ii)任選地測量在獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉基因植物的至少部分中的一種或更多種蔗糖酯的量、或確定其類型；以及 (iii)鑒定突變、非天然存在的或轉基因植物，其中所述植物中的一種或更多種蔗糖酯的量或類型與對照植物相比已經改變，所述對照植物中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性未得到調節，以及優選地，其中所述突變、非天然存在的或轉基因植物的視覺外觀與對照植物基本相同。
4.通過根據權利要求3所述的方法獲得的或可獲得的突變、非天然存在的或轉基因植物。
5.一種突變、非天然存在的或轉基因植物，其中異丙基蘋果酸合酶的表達或者由其所編碼的蛋白的活性是得到調節的，以及所述植物的至少部分在一種或更多種蔗糖酯的組合物上與對照植物相比具有改變，所述對照植物中異丙基蘋果酸合酶的表達或活性未得到調節，以及其中所述植物的視覺外觀與對照植物基本相同。
6.一種植物材料，其包含含有來自根據權利要求4或權利要求5所述植物的細胞或組織的生物質、種子或葉。
7.一種煙草制品，其包含根據權利要求4、或權利要求5所述植物的部分、或者根據權利要求6所述的植物材料。
8.一種用于產生含有一種或更多種蔗糖酯的組合物的方法，所述方法包括以下步驟: (i)提供根據權利要求4、或權利要求5所述的突變、非天然存在的或轉基因植物、根據權利要求6所述的植物材料、或者根據權利要求7所述的煙草制品的至少部分； (ii)從其中提取蔗糖酯；以及(iii)任選地，分離或純化提取出的鹿糖酯。
9.根據權利要求3或權利要求8所述的方法、或者根據權利要求4或5所述的突變、非天然存在的或轉基因植物，其中蔗糖酯的一種或更多種具有如圖5所示的結構、并且其中R3是乙酰基或氫，優選地乙酰基；R1、R2和R4中的一個或更多含有6碳的酰基鏈，優選地β -甲基戊酰基；以及R5是乙酰基或氫，優選地氫。
10.一種用于調節煙草或煙草制品風味的方法，所述方法包括:(i)將來自根據權利要求2、4或5中任一項所述的突變、非天然存在的或轉基因植物的植物的部分，優選葉，或者根據權利要求6所述的植物材料加入至煙草或煙草制品中；或者(ii)將含有通過權利要求8或9所述的方法所獲得的或可獲得的蔗糖酯的組合物加入至煙草或煙草制品中。
11.一種用于產生β_甲基戊酸的方法，所述方法包括以下步驟: (i)提供根據權利要求2、4或5中任一項所述的突變、非天然存在的或轉基因植物的至少部分、或者根據權利要求6所述的植物材料、或者根據權利要求7所述的煙草制品； (ii)水解在步驟(i)中提供的材料或其提取物；以及 (iii)任選地分離或純化甲基戊酸。
12.—種分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼異丙基蘋果酸合酶并且與SEQ IDNO: 1、或 SEQ ID NO: 10、或 SEQ ID NO: 12、或 SEQ ID NO: 14 具有至少 60%序列同一性的序列所組成。
13.一種由如權利要求12所示的多核苷酸所編碼的分離多肽。
14.一種與 SEQ ID NO:2、或 SEQ ID NO: 11、或 SEQ ID NO: 13、或 SEQ IDNO:15 具有至少60%序列同一性的分離多肽。
15.—種含有如權利要求12所述的分離多核苷酸序列的構建體、載體或表達載體,任選地其中所述構建體、載體或表達載體額外含有啟動子，所述啟動子包含、由或基本上由SEQ ID NO:9所示的序列、或與其具有至少約60%同一1丨生的其變體、或毛狀體啟動子、或天然異丙基蘋果酸合酶啟動子所組成。
【文檔編號】C12N15/82GK103958673SQ201280053787
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年8月31日 優先權日:2011年9月2日
【發明者】N·巴卡爾, G·N·拜德勒, M·P·布朗克, S·格普費特, F·馬丁 申請人:菲利普莫里斯產品有限公司