產酶芽孢桿菌菌株的制作方法

產酶芽孢桿菌菌株的制作方法
【專利摘要】本公開涉及為動物提供益處的產酶芽孢桿菌菌株以及使用這些菌株的方法。在一種實施方式中，本公開涉及包括所述產酶芽孢桿菌菌株的組合物。在另一種實施方式中，本公開涉及包括所述產酶芽孢桿菌菌株的動物飼料。
【專利說明】產酶芽孢桿菌菌株
[0001]交叉引用的相關申請
[0002]本申請根據35號美國法典第§ 119 (e)要求于2011年8月24日提交的美國臨時專利申請第61/526881號和2011年8月25日提交的美國臨時專利申請第61/527371號的優先權；上述申請的全部內容通過引用并入到本發明中。
[0003]參考文獻
[0004]在本公開中由括號中的第一作者的姓氏所提到的參考文獻的完整文獻標引可以在權利要求書之前的參考文獻部分中找到。
【技術領域】
[0005]本公開涉及一種產生對動物有益的酶的芽孢桿菌菌株，以及使用這些菌株的方法。在一種實施方式中，本公開涉及改進動物生長性能的方法。在另一種實施方式中，本公開涉及一種直接飼喂微生物，和補充有直接飼喂微生物的動物飼料。在另一種實施方式中，本公開涉及一種改進肥料存儲單元的方法。在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于減輕炎癥應答的方法。
【背景技術】
[0006]全球養豬業已經出現了增加飼喂副產品(含有可溶物的干酒糟(DDGS)、粗麥粉等)從最初的0-10%到當前的 極限30-60%。這些飲食成本節約對于工業上節省飼料投入成本是一個很好的機會，但也帶來了一系列挑戰。從玉米中提取乙醇的發酵過程除去了幾乎所有的淀粉，使所得到的DDGS飼料副產品含有大約40%的纖維。這種相對于玉米的高纖維含量導致干物質的消化率降低，且與玉米相比，DDGS中大多數氨基酸的消化率降低大約10 個百分數單位(Stein 和 Shurson, 2009)。
[0007]因此，在牲畜飼料中包含DDGS可能對動物的生長性能和胴體品質具有負面影響。除了對動物生長及胴體品質的負面影響，作為添加具有高纖維含量的DDGS的結果，營養物消化率的變化對豬糞的處理、儲存和分解都有影響。商業養豬業已經表明，在厭氧深基坑豬糞存儲單元中持肥能力更小，并且來自飼喂高水平DDGS的豬的糞肥具有更多的固體堆積以及氨、甲烷和硫化氫氣體的排放。
[0008]鑒于上述情況，人們希望提供產生對動物有益處的酶的芽孢桿菌菌株，以及使用這些菌株的方法。

【發明內容】

[0009]本公開涉及產酶芽孢桿菌菌株。在一種實施方式中，所述菌株為枯草芽孢桿菌。在另一種實施方式中，所述菌株為短小芽孢桿菌。
[0010]至少在一些實施方式中，枯草芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTP BS442、枯草芽孢桿菌AGTP BS521、枯草芽孢桿菌AGTP BS918、枯草芽孢桿菌AGTP BS1013、枯草芽孢桿菌AGTP BS1069和枯草芽孢桿菌AGTP944，以及具有它們的所有特征的菌株、它們的任意的衍生物或變體以及它們的混合物。在一些實施方式中，短小芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌AGTP BS1068和短小芽孢桿菌KX11-1，以及具有它們的所有特征的菌株、它們的任意的衍生物或變體以及它們的混合物。
[0011]在一種實施方式中，本公開涉及包括給動物施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料的方法，其中，所述施用改進了以下各項中的至少一項:體重、平均日增重、平均日采食量、飼料效率、胴體品質、養分的消化率和糞肥廢物問題。
[0012]在另一種實施方式中，當飼喂高水平的DDGS時，可以給動物施用所述產酶菌株以提高復合膳食成分的分解、糞肥廢物問題、生產效率、胴體品質和性能中的至少一個。
[0013]在一種實施方式中，將一種或多種產酶菌株作為直接飼喂微生物(DFM)施用。直接飼喂微生物包括一種或多種芽孢桿菌菌株。產酶菌株在降解難以消化的飼料(例如DDGS)的方面是有效的。這允許增加養分的有效性，從而改進動物的生長反應。此外，產酶菌株減弱糞肥氣味，從而改進作業環境空氣質量。至少在某些實施方式中，氣味的減弱是通過減少揮發性脂肪酸、氨和/或甲烷和硫化氫氣體的產生實現的。
[0014]在其它的實施方式中，本公開涉及一種方法，包括給豬施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料以改進糞肥存儲單元。在某些實施方式中，豬糞肥存儲單元是一個糞肥坑。至少在一些實施方式中，相對于對照糞肥坑，所述施用改進了以下各項中的至少一項:更低的起泡發生率、更少的固體積累、以及更少的氮、硫、磷、纖維結合氮、總蛋白、脂肪和纖維含量。 [0015]在某些實施方式中，所述產酶菌株直接施加到糞肥的存儲單元，例如糞肥坑。由于將產酶菌株與糞肥存儲單元直接接觸而得到的改進包括以下各項中的至少一種:比對照糞肥坑更低的起泡發生率、更少的固體積累、以及更少的氮、硫、磷、纖維結合氮、總蛋白、脂肪和纖維含量。
[0016]在另一種實施方式中，本公開涉及一種改變糞肥坑中揮發性脂肪酸組成的方法，包括給動物(該動物的糞肥存儲在糞肥坑中)施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料。在另一種實施方式中，所述產酶菌株可以直接與糞肥坑接觸。
[0017]在另一種實施方式中，本公開涉及改變積聚在容納動物的房間內的氣體排放的方法，包括給動物施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料以減少氣體排放。
[0018]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于減輕炎癥應答的方法，包括給動物施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料以減輕炎癥應答。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]本發明的示例性的實施方式在附圖中舉例說明。
[0020]圖1是顯示枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0021]圖2是枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5的部分16S rDNA序列。[0022]圖3是顯示枯草芽孢桿菌AGTP BS442的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0023]圖4是枯草芽孢桿菌AGTP BS442的部分16S rDNA序列。
[0024]圖5是顯示枯草芽孢桿菌AGTP BS521的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0025]圖6是枯草芽孢桿菌AGTP BS521的部分16S rDNA序列。
[0026]圖7是顯示枯草芽孢桿菌AGTP BS918的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0027]圖8是枯草芽孢桿菌AGTP BS918的部分16S rDNA序列。
[0028]圖9是顯示枯草芽孢桿菌AGTP BS1013的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0029]圖10是枯草芽孢桿菌AGTP BS1013的部分16S rDNA序列。
[0030]圖11是顯示短小芽孢桿菌AGTPBS1068的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0031]圖12為短小芽孢桿菌AGTP BS1068的部分16SrDNA序列。
[0032]圖13是顯示枯草芽孢桿菌AGTP BS1069的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0033]圖14是枯草芽孢桿菌AGTP BS1069的部分16SrDNA序列。
[0034]圖15是顯示枯草芽孢桿菌AGTP944的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0035]圖16是枯草芽孢桿菌AGTP944的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0036]圖17是顯示枯草芽孢桿菌AGTP944的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0037]圖18是枯草芽孢桿菌AGTP944的部分16SrDNA序列。
[0038]圖19是顯示短小芽孢桿菌KXl 1-1的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0039]圖20是顯示短小芽孢桿菌KXl 1-1的RAPD PCR圖譜的凝膠照片。
[0040]圖21為短小芽孢桿菌KXll-1的部分16SrDNA序列。
[0041]圖22是設計用于篩選芽孢桿菌菌株抗炎作用的細胞培養板的代表性示意圖。LPS是用來誘發的炎癥應答，但也可以使用能誘發炎癥應答的任何試劑。
[0042]圖23是描繪在典型巨噬細胞系(雞HD11)所顯示的芽孢桿菌菌株的抗炎作用的柱狀圖。用于誘發炎癥應答的是LPS。對IL-1 β基因表達的作用用白色條顯示(Ρ〈0.01)。對IL-8基因表達的作用用黑色條顯示(Ρ〈0.01)。不同字母(a、b、c)顯示統計學意義上均值不同(P〈0.01)。
[0043]圖24是設計用于細胞培養物篩選候選直接飼喂微生物的板的代表性示意圖。LPS用作誘發炎癥應答的試劑。
[0044]圖25是描繪在哺乳動物細胞系(大鼠腸上皮細胞系(IEC-6))中芽孢桿菌菌株的抗炎作用的柱狀圖。LPS用于誘發炎癥應答。測定腫瘤壞死因子-α (TNF-α)的基因表達。不同的字母(a或b)顯示均值統計學差異(P〈0.10)。
[0045]圖26是顯示在170天測試期內經過3次采樣坑內泡沫特征的折線圖。
[0046]圖27是在用“ X ”標示的區域中在每個欄中的生物發光測量的代表性示意圖。
[0047]在詳細說明本發明的實施方式之前，應當理解的是，本發明在其應用方面并不限于在以下的描述中或在附圖中示出的構造的細節和部件的設置。本發明能夠以其它實施方式或者以各種方式實施或實現。此外，應當理解的是，本發明使用的措辭和術語是為了說明的目的，而不應被視為限制。
[0048]本公開中的組織框架不應限于本公開的任何實施方式或元件。其意圖是在一種實施方式中列舉的元素和應用可以應用于本公開范圍內的其他實施方式。【具體實施方式】
[0049]本公開中的數值范圍是近似值，因此可以包括該范圍之外的值，除非另有說明。數值范圍包括來自并包括下限值和上限值的以一個單位遞增的所有值，只要在任意下限值和任意上限值之間存在至少2個單位的間隔。作為一個實例，如果組成的、物理的或其它性質，諸如，例如分子量、粘度等，是從100到1，000時，它意在將所有單獨的值(例如100、101、102等)和子范圍(例如100至144、155至170、197至200等等)都明確地列舉出來。對于包含小于I的值或包含大于I的分數(例如1.1、1.5等)的范圍，一個單位被認為是0.0001、0.001、0.01或0.1是適當的。對于含有小于10 (例如I至5)的單數位數字的范圍，一個單位通常被認為是0.1。這些僅是具體意圖的實例，列舉的最低值和最高值之間數值的所有可能的組合都被認為在本公開中明確述及。本公開中提供的數值范圍用于在混合物中的組分的相對量，以及方法中列舉的各種溫度和其他參數的范圍。
[0050]通過“施用”，是指將至少一種菌株和/或來自本發明中所述的至少一種菌株的培養物的上清液引入到動物的胃腸道中的操作。更具體地說，該施用是一種通過口服途徑的施用。特別地，該施用可以通過用至少一種所述菌株添加到動物飼料中來進行，然后由動物攝入這樣添加的飼料。也可以使用胃管或任何其他方法進行該施用以使其可以將至少一種所述菌株直接弓丨入到動物的胃腸道內。
[0051]通過“至少一種菌株”是指一種單一菌株，但也指包含至少兩種細菌菌株的混合物。通過“至少兩種菌株的混合物”，是指兩種、三種、四種、五種、六種或者甚至更多種菌株的混合物。在菌株混合物的一些實施方式中，比例可以從1%至99%變化。在某些實施方式中，在混合物中使用的菌株的比例為至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或 95%。菌株混合物的其他實施方式是從25%到75%變化。 菌株混合物的另外的實施方式是每種菌株約50%。當混合物包含兩種以上菌株時，菌株可以以基本相等的比例或以不同的比例存在于混合物中。
[0052]通過“接觸”，是指將至少一種菌株和/或來自本發明所述的至少一種菌株的培養物的上清液與包括但不限于糞肥存儲單元的基板、容器或物體緊密接近的操作。在一些實施方式中，糞肥存儲單元是糞肥坑。可以通過直接或間接的方式來接觸。如在本發明中所用，接觸包括施加、噴灑、接種、分散、分配、傾倒以及其他類似的術語。
[0053]通過“有效量”，是指足以允許在以下各項中的至少一項中改進的菌株和/或上清液的量:動物生產的效率、胴體品質、動物生長性能、當給動物喂食高含量DDGS時的生長性能、養分的消化率、復合飼料成分的分解、家禽生長性能、豬生長性能、飼料利用率、平均日增重、平均日采食量、體重增加:飼料或飼料:采食量、以及死亡率。
[0054]在其它實施方式中，“有效量”是指足以允許在以下各項中的至少一項中改進的菌株和/或上清液的量:糞肥廢物問題、糞肥儲存單元中的發泡量、糞肥存儲單元中的微生物生態、糞肥存儲單元中的揮發性脂肪酸的量、在圈養動物的房間中或糞肥儲存單元中產生氣體的量，包括但不限于甲烷和硫化氫。
[0055]在另一實施方式中，“有效量”是指足以允許在以下各項中的至少一項中改進的菌株和/或上清液的量:涉及炎癥應答的基因的表達、涉及炎癥應答的蛋白的表達以及涉及炎癥應答的蛋白質的活性。
[0056]如在本發明中所用，“性能”是指通過下面的一個或多個參數測量的動物(例如豬或家禽)的生長:平均日增重(ADG)、重量、腹瀉、死亡率、飼料轉化率(其包括飼料:增重和增重:飼料)、以及采食量。此處所使用的“性能的改進”或“改進的性能”是指在性能定義中列出的至少一個參數的改進。
[0057]如在本發明中所用，使用隨機擴增多態性DNA聚合酶鏈式反應(RAPD-PCR)分析，“變體”與所公開的菌株的基因序列具有至少80%的同一性。基因序列的同一性程度可以變化。在一些實施方式中，使用RAPD-PCR分析，所述變體與所公開的菌株具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的基因序列的同一性。可以用于RAPD-PCR分析的六種引物包括如下弓丨物:引物 I (5，-GGTGCGGGAA-3’) (SEQIDN0.1);引物 2 (5，-GTTTCGCTCC-3’)(SEQIDN0.2)；引物 3(5，-GTAGACCCGT-3，)(SEQ IDN0.3)；引物 4(5，-AAGAGCCCGT-3，)(SEQIDN0.4);引物 5 (5，-AACGCGCAAC-3’) (SEQIDN0.5);以及引物 6 (5，-CCCGTCAGCA-3’)(SEQIDN0.6)。RAPD分析可以使用Ready-to-Go?RAPD分析珠(安瑪西亞生物科技公司(Amersham Biosciences),瑞典)來進行,其設計為預混合、預分配反應以進行RAPD分析。
[0058]本發明人發現某些芽孢桿菌菌株具有分解纖維、脂質、碳水化合物和蛋白質的酶活性。這些菌株在本發明中稱作“產酶菌株”，“芽孢桿菌菌株”，或“菌株”。在一些實施方式中，所述酶活性是纖維素酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、酪蛋白酶、玉米淀粉酶、β-甘露聚糖酶、脂肪酶和/或蛋白酶，例如玉米蛋白酶和大豆蛋白酶。
[0059]本發明人發現某些微生物可以用來分解含有可溶物的干酒糟(DDGS)中的挑戰性成分。
[0060]本發明人還發現，產酶菌株可以提高以下各項中的至少一項:(1)復合膳食成分的分解；(2)糞肥廢物問題；(3)動物生產的效率；(4)動物胴體品質；(5)動物生長性能；和
(6)炎癥應答的效果。
[0061]產酶菌株
[0062]產酶菌株包括芽孢桿菌菌株，包括但不限于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和遲緩芽孢桿菌菌株，以及具有它們的所有特征的菌株、它們的任何衍生物或變體，和它們的混合物。
[0063]至少在一些實施方式中，所述枯草芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTP BS442、枯草芽孢桿菌AGTP BS521、枯草芽孢桿菌AGTP BS918、枯草芽孢桿菌AGTP BS1013、枯草芽孢桿菌AGTP BS1069和枯草芽孢桿菌AGTP944，以及具有它們的所有特征的菌株、它們的任何衍生物或變體和它們的混合物。在一些實施方式中，所述短小芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌AGTP BS1068和短小芽孢桿菌ΚΧ11-1，以及具有它們的所有特征的菌株、它們的任何衍生物或變體和它們的混合物。
[0064]所述菌株由威斯康星州(Wisconsin)沃基沙(Waukesha)的丹尼斯克美國(Danisco USA)有限公司保藏在美國農業研究菌種保藏中心(NRRL)，伊里諾斯州皮奧里亞市北大學街 1815 號(1815North University Street, Peoria, 111.),61604。原始保藏日期和保藏登記號如下:枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5，2011年5月13日(NRRL B-50510);枯草芽孢桿菌AGTP BS442，2011年8月4日(NRRL B-50542);枯草芽孢桿菌AGTP BS521,2Oll 年 8 月 4 日(NRRL B-50545);枯草芽孢桿菌 AGTP BS9H 2Oll 年 5 月 I3 日(NRRLB-50508);枯草芽孢桿菌AGTP BS1013，2011年5月13日(NRRL B-50509);枯草芽孢桿菌AGTP BS1069，2011 年 8 月 4 日(NRRL B-50544);枯草芽孢桿菌 AGTP944，2011 年 8 月 11 日(NRRL B-50548);短小芽孢桿菌 AGTP BS1068，2011 年 8 月 4 日(NRRL B-50543)以及短小芽孢桿菌KX11-1，2011年8月5日(NRRL Β-50546)。所有這些保藏都是根據國際承認用于專利程序目的的微生物保藏的布達佩斯條約的規定進行。
[0065]在一些實施方式中，所述產酶菌株具有酶活性，包括但不限于纖維素酶、α -淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、酪蛋白酶、玉米淀粉酶、β -甘露聚糖酶、脂肪酶和/或蛋白酶，例如玉米蛋白酶和大豆蛋白酶。
[0066]至少在一些實施方式中，將多于一種的本發明所述菌株相結合。
[0067]任何芽孢桿菌的衍生物或變體也包括在本發明中，并且在本發明所描述和所要求保護的方法中是有用的。在一些實施方式中，具有枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTP BS442、枯草芽孢桿菌AGTP BS521、枯草芽孢桿菌AGTP BS918、枯草芽孢桿菌AGTPBS1013、枯草芽孢桿菌AGTP BS1069、枯草芽孢桿菌AGTP944、短小芽孢桿菌AGTP BS1068和短小芽孢桿菌KXll-1的所有特征的菌株也包括在本發明中，并且在本發明所描述和所要求保護的方法中是有用的。
[0068]在某些實施方式中，枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTP BS442、枯草芽孢桿菌AGTP BS521、枯草芽孢桿菌AGTP BS918、枯草芽孢桿菌AGTP BS1013、枯草芽孢桿菌AGTP BS1069、枯草芽孢桿菌AGTP944、短小芽孢桿菌AGTP BS1068和短小芽孢桿菌KXll-1的任何衍生物或變體也包括在本發明中，并且在本發明所述和所要求保護的方法中是有用的。
[0069]至少在一些實施方式中，所述產酶菌株是組合使用的。在一種實施方式中，所述產酶菌株可以與來自芽孢桿菌屬的細菌菌株和來自不同種屬的其它細菌菌株組合使用。
[0070]至少在一些實施方式中，當飼喂高水平的DDGS時，與對照相比，本發明所述產酶菌株和提供的方法改進了以下各項中的一項或多項:復合飼料成分的分解、糞肥廢物問題、動物生產的效率、動物胴體品質、和性能。
[0071]糞肥廢物問題包括，但不限于，不希望的糞肥養分和微生物的組分，以及來自糞肥儲存單元(例如糞肥坑)的不希望的氣體排放。糞肥廢物問題的改進包括，但不限于，以下各項中的至少一項:(1)糞肥中積累更少營養物，(2)將糞肥的微生物群落改變至對固體分解有利的種群，以及(3)氨、甲烷和硫化氫氣體排放的減少。
[0072]胴體品質的改進可以通過增加的瘦肉率和屠宰率以及減少的油脂碘值中的至少一個來測量。性能可以通過平均日增重、平均日飼料攝取量、每單位增重所需飼料，以及本領域中已知的其他測量方法來測定。
[0073]當攝入時，產酶菌株產生酶。在一些實施方式中，產酶菌株在體內產生酶。在其它實施方式中，所述產酶菌株在施用了該菌株的動物的糞肥中生存，并在排出的糞肥中產生酶。
[0074]培養菌株的方法
[0075]芽孢桿菌菌株由細菌菌株發酵產生。發酵可以通過按比例放大種子培養物開始。這涉及重復地且無菌地將培養物轉移到越來越大的體積，作為用于發酵的接種體，所述發酵在含有蛋白質、碳水化合物和最佳生長必要的礦物質的培養基的大型不銹鋼發酵罐中進行。一種非限制性的示例性培養基是TSB。接種體加入到發酵容器中后，控制溫度和攪拌以允許最大生長。一旦培養物達到最大群落密度，通過從發酵培養基中分離出細胞以收集培養物。這通常是通過離心進行的。
[0076]其后可以確定培養物的總數。CFU或菌落形成單位是從標準微生物平板法得到的樣品的活菌計數。該術語是由當單個細胞在合適的培養基中培養時會生長并成為一個在瓊脂培養基中有活力的菌落而得出。由于多個細胞可以產生一個可見的菌落，術語菌落形成單位是一個比細胞數目更加有用的度量單位。
[0077]在一種實施方式中，每種芽孢桿菌菌株以5X 108CFU/ml的水平到約4X 109CFU/ml的水平發酵。在至少一種實施方式中，使用2X109CFU/ml的水平。細菌通過離心收集，并除去上清液。上清液可以在本發明中描述的方法中使用。至少在一些實施方式中，細菌被造粒。至少在一些實施方式中，細菌被冷凍干燥。至少在一些實施方式中，將細菌與載體混合。然而，在使用它們之前沒有必要冷凍干燥芽孢桿菌。菌株也可以添加或不加防腐劑，以濃縮、非濃縮或稀釋的形式來使用。
[0078]DFM和制各DFM的方法
[0079]提供一種包括本發明所述的一種或多種菌株的組合物。該組合物可以作為直接飼喂微生物(DFM)飼喂動物。一種或多種載體或其它成分可以添加到DFM中。DFM可以以各種物理形式存在，例如作為追肥，作為用于液體灌服藥或添加到代乳料的水溶性濃縮物、明膠膠囊或凝膠。在追肥形式的一種實施方式中，將凍干的細菌發酵產物加入到載體上，例如乳清、麥芽糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石(碳酸鈣)、稻殼、酵母培養物、干淀粉和/或硅鋁酸鈉。在用于液體灌服藥或代乳料補充物的水溶性濃縮物的一種實施方式中，將凍干的細菌發酵產物加入到水溶性載體上，例如乳清、麥芽糊精、蔗糖、右旋糖、干淀粉、硅鋁酸鈉，并添加一種液體以形成所述灌服藥或將所述補充物加入乳料或代乳料中。在明膠膠囊形式的一種實施方式中，將凍干的細菌發酵產物加入到載體上，例如乳清、麥芽糊精、糖、石灰石(碳酸鈣)、稻殼、干燥淀粉酵母培養物和/或硅鋁酸鈉。在一種實施方式中，細菌和載體被封裝在可降解的膠囊中。在凝膠形式的一種實施方式中，將凍干的細菌發酵產物加入到載體中，例如植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨醇酯80、丙二醇、丁羥茴醚、檸檬酸、乙氧喹和/或人造色素，以形成凝膠。
[0080]菌株可以任選地與添加劑的干制劑混合，所述添加劑包括，但不限于，生長基質、酶、糖、碳水化合物、提取物、和生長促進微量成分。所述糖可以包括:乳糖；麥芽糖；右旋糖；麥芽糖糊精；葡萄糖；果糖；甘露糖；塔格糖；山梨糖；棉子糖；以及半乳糖。所述糖的范圍從50至95 %，單獨或組合使用。所述提取物可以包括酵母或干酵母發酵可溶物，其范圍從5至50%。所述生長基質可以包括:胰蛋白胨，其范圍從5至25% ;乳酸鈉，其范圍從5至30% ;以及吐溫80，其范圍從I至5%。所述碳水化合物可以包括甘露糖醇、山梨糖醇、阿東糖醇以及阿糖醇。所述碳水化合物的范圍從5至50%，單獨或組合使用。所述微量成分可以包括:碳酸鈣，其范圍從0.5至5.0% ;氯化鈣，其范圍從0.5至5.0 %，磷酸氫二鉀，其范圍從0.5-5.0% ;磷酸鈣，其范圍從0.5至5.0% ;蛋白錳，其范圍從0.25至1.00%，以及錳，其范圍從0.25至1.0%。
[0081]為了制備本發明所述的DFM，可以將培養物和載體(如果使用)添加到螺帶式混合機或槳式混合機中，混合約15分鐘，盡管時間可以增加或減少。將上述成分混合，以產生培養物和載體的均勻混合物。最終產物優選是干燥的、可流動的粉末。然后可以將菌株添加到動物飼料或飼料預混合物中，添加到動物的飲水中，或者以本領域中已知的其他方式施用。動物飼料可以補充本發明所述的一種或多種菌株或本發明所述的組合物。
[0082]例如，本發明提供的DFM可以作為含有菌株的培養溶液、產生菌株的上清液、或培養溶液的細菌產物來施用。
[0083]給動物施用本發明提供的DFM可以提高動物性能。在一種實施方式中，給動物施用本發明提供的DFM可以增加平均日飼料攝入量(ADFI)、平均日增重(ADG)或飼料效率(增重:飼料；G:F或者飼料:增重；F:G)(統稱為“性能指標”)。一種或多種上述性能指標可以得到改進。
[0084]所述DFM可以以多種方式中的一種施用于動物。例如，所述菌株可以以固體形式作為獸醫藥劑施用，可以分配在賦形劑，優選為水中并直接給動物飼喂，可以與干燥形式的飼料材料物理混合，或所述菌株可以形成溶液然后噴灑到飼料材料上。給動物施用所述菌株的方法被認為是在本領域技術人員的技能范圍內。
[0085]給動物施用的方法
[0086]在一種實施方式中，可以向動物施用有效量的所述菌株。至少在一些實施方式中，本公開涉及一種方法，其包括給動物施用有效量的所述產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料。在一種實施方式中，所述動物是豬。在另一種實施方式中，所述動物是家禽。在另一種實施方式中，所述動物是反 芻動物。
[0087]給動物施用一種或多種產酶菌株通過任何方便的方法來實現，包括將所述菌株添加到動物的飲用水中，添加到飼料中，或添加到墊草中，或者通過直接口腔插入，例如通過氣霧劑或通過注射劑。
[0088]在另一種實施方式中，一種或多種產酶菌株的施用是通過用產酶菌株噴灑動物。動物可以清理或用嘴整理并攝取產酶菌株。
[0089]在一種實施方式中，芽孢桿菌菌株作為芽孢施用。
[0090]如在本發明中所用，術語“動物”包括但不限于人、哺乳動物、兩棲動物、鳥類動物、爬行動物、豬屬動物(swine)、家豬(pigs)、奶牛(cows)、牛(cattle)、山羊、馬、綿羊、家禽和其它在農場或牧場飼養或生長的動物、綿羊、大角羊、野牛(buffalo)、羚羊、公牛(oxen)、驢、驟、鹿(deer)、麋鹿(elk)、馴鹿(caribou)、水牛(waterbuffalo)、駱騎、美洲馬它(llama)、羊駝(alpaca)、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、雪貂、狗、貓和其他寵物、靈長類動物、猴子、猿和大猩猩。
[0091]在一些實施方式中，所述動物是不同齡的鳥類，如起始期鳥(starters)、成長期鳥(growers)和育成期鳥(finishers)。在一些實施方式中，所述動物是家禽和野鳥(exoticfowl),其包括，但不限于，雛雞(chicks)、雛火雞(turkey poults)、雛鵝(goslings)、雛鴨(ducklings)、幾內亞珍珠雞(guinea keets)、小母雞(pullets)、母雞(hens)、雄雞(roosters)(也稱為公雞(cocks))、小公雞(cockereks)和閹雞(capons)。
[0092]在一些實施方式中，動物是豬，其中包括但不限于保育豬(nursery pigs)、種豬(breeding stock)、大母豬(sows)、小母豬(gilts)、公豬(boars)、哺乳期仔豬(lactation-phase piglets)、和育肥豬(finishing pigs)。可以在哺乳期間將菌株飼喂給母豬，雖然可以在不同的時間持續不同的時間來飼喂菌株。在某些實施方式中，菌株是通過給小母豬或大母豬飼喂菌株來施用給仔豬的。人們認為，從母豬轉移到仔豬是通過糞-口途徑和/或通過其它途徑來實現的。
[0093]產酶菌株可以施用于動物以改進以下各項中的至少一項:養分的消化率、豬生長性能、家禽生長性能反應、飼料效率(增重:飼料或飼料:增重)、體重、采食量、平均日增重、平均日飼料攝取量、復合飼料成分分解、家禽生產效率、豬生產效率和死亡率。當飼喂含有高水平DDGS的飼料時，這些優點可以是特別有用的。最初，DDGS為動物飲食的0%至10%。目前，DGGS 為 30%至 60%。
[0094]改進的量可以如本發明所述或通過本領域中已知的其它方法進行測量。所述有效量可以通過提供隨意飼料含有DFM的飼料來施用給動物。所述DFM也可以以一劑或多劑施用。
[0095]在某些實施方式中，與未經處理的對照相比，所述改進為至少1-5^^5-10%.10-15 %,15-20 20-25 25-30 30-35 35-40 40-45 45-50 50-5555-60 60-65 65-70 70-75 %,75-80 %,80-85 85-90 90-95 %,96 %,9798%、99%或大于 99%。
[0096]至少在一些實施例中，與對照動物相比，在對施用所述菌株的動物的所述測量中的改進為至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%,16%,17%,18%,19%,20%,21 %,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31 %,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41 %,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和大于 99%。
[0097]在其它實施方式中，相對于對照動物，在對施用所述菌株的動物的所述測量中的改進為2-8%。在某些其它實施方式中，相比于對照動物，在對施用所述菌株的動物的所述測量中的改進至少為8%。
[0098]在一些實施方式中，對照動物是沒有施用所述產酶菌株的動物。
[0099]這種有效量可以以一劑或多劑施用于動物。在一些實施方式中，所述一種或多種芽孢桿菌菌株以至少I X IO4CFU/動物/天的比例加入到動物的飼料中。
[0100]在一種實施方式中，所述施用改進了以下各項中的至少一項:養分的消化率、生長性能反應，例如，飼料效率、復合飼料成分的分解、生產效率、體重增加、飼料攝取量和死亡率。
[0101]在所述方法的某些實施方式中，所述菌株是以約IXlO5CFU/動物/天至約I X IO11CFU/動物/天施用。在一些實施方式中，所述動物是豬。在另一種實施方式中，所述動物是家禽。
[0102]至少在某些實施方式中，當給動物飼喂高水平的含有可溶物的干酒糟(DDGS)時使用所述方法。高水平的DDGS可以是大于動物飼料的10%以上的比例。高水平的DDGS也可以是大于動物的飼料的30%以上的比例。
[0103]至少在某些實施方式中，至少一種有效量的細菌菌株是通過給預期用于動物的飼料補充至少一種有效量的細菌菌株而施用給動物的。如在本發明中所用，“補充”是指將本發明所提供的有效量的細菌直接混合到預期用于動物的飼料中的操作。因此，當飼養時，動物攝取本發明提供的細菌。
[0104]所述產酶菌株可以以單菌株或多菌株施用。可以給動物施用產酶菌株的一種或多種上清液。當攝入時,產酶菌株產生酶。
[0105]在某些實施方式中,給豬飼喂一種或多種產酶菌株。所述一種或多種產酶菌株分解含有可溶物的干酒糟(DDGS)中的挑戰性成分。
[0106]在一種實施方式中，所述產酶菌株是以每克動物飼料1X103、1X104、1X105、I X 106、I X 107、I X IO8、I X 109、I X 101。、I X IO11U X IO12U X IO13 和大于 I X IO13CFU 的比例加入到動物飼料中的。
[0107]在另一種實施方式中，所述產酶菌株是以每只動物每天I X 103、1X IO4UX 105、I X 106、I X 107、I X IO8、I X 109、I X 101。、I X IO11U X IO12U X IO13 和大于 I X IO13CFU 的比例加入到動物飼料中的。
[0108]在一種實施方式中，所述一種或多種芽孢桿菌菌株是以每克飼料約3.75 X IO5CFU的比例加入到豬飼料中的。它(們)也可以以約I X IO4至約I X IO11CFU/動物/天來飼喂。在一些實施方式中，所述一種或多種芽孢桿菌菌株是以約IX IO8CFU/動物/天來飼喂的。
[0109]對于反芻動物， 所述一種或多種芽孢桿菌菌株是以約5X IO9CFU/頭/天來飼喂的。
[0110]對于家禽，所述一種或多種芽孢桿菌菌株是以約lX104CFU/g飼料至約
IX 1010CFU/g飼料加入飼料的。至少在某些實施例中，所述一種或多種芽孢桿菌菌株以約
IX IO5CFU/只/天至約I X IO8CFU/只/天來飼喂的。
[0111]飼料原料
[0112]在另一種實施方式中，動物飼料包括本發明所述的至少一種細菌菌株。至少在一些實施方式中，用有效量的至少一種細菌菌株補充飼料。如在本發明中所用，“補充”是指將本發明所提供的有效量的細菌直接混合進預期用于動物的飼料中的操作。因此，當飼喂時，動物攝取本發明提供的細菌。
[0113]當與飼料原料組合使用時，對于單胃進食，飼料原料可以包括玉米、豆柏、如含有可溶物的干酒糟(DDGS)的副產物，以及維生素/礦物質補充劑。用于反芻動物的飼料原料可以是谷物或干草或青貯飼料或牧草，或它們的組合。包括在這樣的飼料原料中的是玉米、曬谷(dried grain)、紫花苜猜、任何飼料成分和食品或飼料工業副產品以及生物燃料工業的副產品和玉米柏以及它們的混合物。也可以使用其它飼料原料。
[0114]施用時間可以有所不同，只要顯示出以下各項中的一項或多項改進即可:(I)復合飼料成分的分解，(2)養分的消化率，(3)糞肥廢物的問題，(4)生產效率，(5)胴體品質，
(6)生長性能，(7)當飼喂高水平DDGS時的生長性能，(8)家禽生長性能反應，(9)豬生長性能反應，(10)家禽生產效率，(11)豬生產效率，(12)體重增加，(13)采食量，(14)飼料效率，以及(15)死亡率。可以在任何時候以喂或不喂飼料來施用。然而，優選在飼喂飼料時或緊接飼喂飼料之前施用所述細菌。
[0115]用于改進動物生長性能的方法
[0116]在一種實施方式中，本公開涉及一種用于改進動物生長性能的方法，其包括使用一種或多種產酶菌株或其上清液，以相對于沒有施用產酶菌株的動物提高動物生長性能。在一種實施方式中，所述動物是豬。在另一種實施方式中，所述動物是禽類。在另一種實施方式中，所述動物是反芻動物。
[0117]在一種實施方式中，生長性能包括但不限于養分的消化率、家禽生長性能反應、豬的生長性能反應、飼料效率、復合飼料成分的分解、平均日增重、平均日采食量、體重增量、采食量、胴體品質和死亡率。在另一種實施方式中，本發明所公開的方法可用來改進飼喂了含有DDGS的動物飼料的動物的生長性能。
[0118]在某些實施方式中，相對于未經處理的對照，生長性能的改進至少是1_5%、5-10 %、10-15 %,15-20 20-25 25-30 30-35 35-40 40-45 45-5050-55 55-60 60-65 65-70 70-75 75-80 80-85 85-90 90 % -9596%、97%、98%、99%或大于 99%。
[0119]至少在一些實施方式中，與對照動物相比，施用菌株的動物的生長性能的改進至少是 I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21 %,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,3132%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41 %,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,6162%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9192%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和大于 99%。
[0120]在一種實施方式中，用于改進動物的生長性能的所述產酶菌株包括芽孢桿菌菌株。在一種實施方式中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌。在另一種實施方式中，芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌。
[0121]在另一種實施方式中，所述用于改進生長性能的產酶菌株包括，但不限于，枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTP BS442、枯草芽孢桿菌AGTP BS521、枯草芽孢桿菌AGTP BS918、枯草芽孢桿菌AGTP BS1013，以及枯草芽孢桿菌BS AGTP1069、枯草芽孢桿菌AGTP944、短小芽孢桿菌AGTP BS1068和短小芽孢桿菌KX11-1，以及具有它們所有特征的菌株、它們的任意衍生物或變體以及它們的混合物。
[0122]所述用于改進動物生長性能的產酶菌株可以以單一菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料的形式施用。
[0123]A.養分消化率
[0124]在另一種實施方式中，本公開涉及一種提高動物飼料的消化率的方法，包括給動物施用有效量的產酶菌株，以相對于未施用所述產酶菌株的動物提高動物飼料的消化率。在另一種實施方式中，所述方法進一步包括測量在來自施用了所述產酶菌株的動物的糞肥坑中累積的養分的量，并將該養分的量與在來自未施用所述產酶菌株的動物的糞肥坑中的養分的量相比較。在另一種實施方式中，所述動物飼料含有DDGS。
[0125] 在另一種實施方式中，本公開涉及一種提高動物飼料的消化率的方法，包括給動物施用補充了有效量的產酶菌株的飼料，以相對于未施用所述產酶菌株的動物提高動物飼料的消化率。[0126]在一種實施方式中，用于改進動物生長性能的方法包括給動物施用產酶菌株，并且相對于未施用所述產酶菌株的動物，減少動物未消化的養分的量。
[0127]在另一種實施方式中，用于改進動物生長性能的方法，包括通過給動物施用產酶菌株，相對于未施用所述產酶菌株的動物，減少動物未消化的養分的量。
[0128]在另一種實施方式中，用于改進動物生長性能的方法包括給動物施用產酶菌株，測量在來自施用了所述產酶菌株的動物的糞肥坑中累積的養分的量，并將在來自施用所述產酶菌株的動物的糞肥坑中的養分的量與在來自未施用所述產酶菌株的動物的第二糞肥坑中的養分的量相比較。
[0129]在一種實施方式中，動物飼料的消化率可以通過糞肥坑中的養分的量來測量。可以從糞肥坑測量出任何養分，包括但不限于干物質、灰分、總氮、銨態氮、磷和鈣。
[0130]所述用于改進養分消化率的產酶菌株可以以單一菌株所述菌株的、一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料的形式施用。
[0131]B.家禽生長性能
[0132]在一種實施方式中，本公開涉及一種提高家禽生長性能的方法，包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽提高家禽生長性能。本發明公開的方法可以用于改進生長性能，無論家禽的飼料或飲食。
[0133]在一種實施方式中，本公開涉及一種提高喂食了高纖維副產品飼料的家禽的生長性能的方法，包括對喂食了高纖維副產品飼料的家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽提高家禽生長性能。
[0134]在另一種實施方式中，本公開涉及一種提高家禽平均日增重的方法，包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽提高家禽平均日增重。
[0135]在另一種實施方式中，本公開涉及一種提高家禽平均日飼料攝入量的方法，包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽提高家禽平均日飼料攝入量。
[0136]在另一種實施方式中，本發明涉及一種提高家禽的動物飼料的飼料效率的方法，包括給家禽施用補充了有效量產酶菌株的動物飼料，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽提高家禽的飼料效率。
[0137]在又一種實施方式中，本公開涉及一種改進家禽胴體品質的方法，包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽改進家禽的胴體品質。可以改進的胴體品質包括，但不限于，脂肪厚度、器官重量、胸部特征、胴體重、胴體等級和胴體價值。
[0138]在一種實施方式中，所述胴體品質的測量值可以增加或減少。
[0139]在另一種實施方式中，以下各項中的一種或多種胴體品質的測量值增加:脂肪厚度、器官重量、胸部特征、胴體重、胴體等級和胴體價值。
[0140]在又一種實施方式中，以下各項中的一種或多種胴體品質的測量值減少:脂肪厚度、器官重量、胸部特征、胴體重、胴體等級和胴體價值。
[0141]在又一實施方式中，本公開涉及一種降低家禽死亡率的方法,包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽降低所述家禽的死亡率。
[0142]在另一種實施方式中，本公開涉及一種提高木質素消化率的方法，包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽提高木質素的消化率。
[0143]在另一種實施方式中，本公開涉及提高高纖維飼料中的木質素的消化率的方法，包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽提高高纖維飼料中木質素的消化率。在另一種實施方式中，所述高纖維飼料包括基于副產品的飼料。在另一種實施方式中，所述飼料含有DDGS。
[0144]在另一種實施方式中，本公開涉及提高表觀回腸消化率的方法，包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽提高表觀回腸消化率。
[0145]在又一種實施方式中，本公開涉及提高表觀總腸道消化率的方法，包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽提高表觀總消化道消化率。
[0146]在另一種實施方式中，本公開涉及降低回腸食糜的pH值的方法，包括對家禽施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的家禽降低回腸食糜的PH值。
[0147]在又一實施方式中，以上所述的方法進一步包括施用補充了產酶菌株的飼料。
[0148]所述用于提高家禽生長性能的產酶菌株可以以單一菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養 物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料的方式施用。
[0149]C.豬生長性能
[0150]在一種實施方式中，本公開涉及一種提高豬生長性能的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬提高豬生長性能。本發明公開的方法可以用于改進生長性能，無論豬的飼料或飲食。
[0151]在一種實施方式中，本公開涉及一種提高喂食了高纖維副產品飼料的豬的生長性能的方法，包括對喂食了高纖維副產品飼料的豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用廣酶菌株的豬提聞豬生長性能。
[0152]在另一種實施方式中，本公開涉及一種提高豬平均日增重的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬提高豬平均日增重。
[0153]在另一種實施方式中，本公開涉及一種提高豬平均日飼料攝入量的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬提高豬平均日飼料攝入量。
[0154]在另一種實施方式中，本公開涉及一種提高豬的動物飼料的飼料效率的方法，包括給豬施用補充了有效量產酶菌株的動物飼料，以相對于沒有施用產酶菌株的豬提高豬的飼料效率。
[0155]在又一種實施方式中，本公開涉及一種改進豬胴體品質的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬改進豬的胴體品質。可以改進的胴體品質包括，但不限于，脂肪厚度、腰部厚度、瘦肉率、熱胴體重、器官重量、胴體等級和胴體價值。
[0156]在一種實施方式中，所述胴體品質的測量值可以增加或減少。
[0157]在另一種實施方式中，以下各項中的一種或多種胴體品質的測量值增加:脂肪厚度、腰部厚度、瘦肉率、熱胴體重、器官重量、胴體等級和胴體價值。
[0158]在又一種實施方式中，以下各項中的一種或多種胴體品質的測量值減少:脂肪厚度、腰部厚度、瘦肉率、熱胴體重、器官重量、胴體等級和胴體價值。
[0159]在又一實施方式中，本公開涉及一種降低豬死亡率的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬降低所述豬的死亡率。
[0160]在另一種實施方式中，本公開涉及一種提高木質素消化率的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬提高木質素的消化率。
[0161]在另一種實施方式中，本公開涉及提高高纖維飼料中的木質素的消化率的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬提高高纖維飼料中木質素的消化率。在另一種實施方式中，所述高纖維飼料包括基于副產品的飼料。在另一種實施方式中，所述飼料含有DDGS。
[0162]在另一種實施方式中，本公開涉及提高表觀回腸消化率的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬提高表觀回腸消化率。
[0163]在又一種實施方式中，本公開涉及提高表觀總腸道消化率的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬提高表觀總消化道消化率。
[0164]在另一種實施方式中，本公開涉及降低回腸食糜的pH值的方法，包括對豬施用有效量的產酶菌株，以相對于沒有施用產酶菌株的豬降低回腸食糜的PH值。
[0165]在又一實施方式中，以上所述的方法進一步包括施用補充了產酶菌株的飼料。
[0166]在另一種實施方式中，在上述有關豬的生長性能的方法中的產酶菌株是包括枯草芽孢桿菌菌株 AGTP BS918(NRRL B-50508), AGTP BS1013 (NRRL B-50509)和 AGTPBS3BP5(NRRLB-50510)的組合。 [0167]所述用于提高豬生長性能的產酶菌株可以以單一菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料的形式施用。
[0168]用于改進糞肥存儲單元的方法
[0169]在一種實施方式中，本公開涉及一種用于改進糞肥存儲單元的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料以改進糞肥存儲單元。在一種實施方式中，所述動物是豬。在某些實施方式中，所述糞肥存儲單元是糞肥坑。
[0170]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于改善圈養動物的房間的空氣質量的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料以改善該房間的空氣質量。在一種實施方式中，改善空氣質量包括減弱房間內氣味。在另一種實施方式中，改善空氣質量包括降低下列中的一種或多種的產生:揮發性脂肪酸、氨、甲烷或硫化氫。
[0171]至少在一些實施方式中，相對于對照糞肥坑，該施用在以下各項中的至少一項上得到了改進:更低的起泡發生率、更少的固體積累、以及更少的氮、硫、磷、纖維結合氮、總蛋白、脂肪和纖維含量。
[0172]在一種實施方式中，所述用于改進糞肥儲存單元的產酶菌株包括芽孢桿菌菌株。在一種實施方式中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌。在另一種實施方式中，所述芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌。
[0173]在另一種實施方式中，所述用于改進糞肥儲存單元的產酶菌株包括但不限于枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTP BS442、枯草芽孢桿菌AGTP BS521、枯草芽孢桿菌AGTP BS918、枯草芽孢桿菌AGTP BS1013、枯草芽孢桿菌AGTP BS1069、枯草芽孢桿菌AGTP944、短小芽孢桿菌AGTP BS1068、短小芽孢桿菌KX11 -1以及具有它們所有特征的菌株、它們的任何衍生物或變體和它們的混合物。
[0174]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于改進糞肥儲存單元的方法，其包括將產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的組合物與糞肥存儲單元(例如糞肥坑)直接接觸。將產酶菌株與糞肥存儲單元直接接觸所產生的改進包括以下各項中的至少一種:比對照糞肥坑更低的起泡發生率、更少的固體積累以及更少的氮、硫、磷、纖維結合氮、總蛋白、脂肪和纖維含量。
[0175]在另一種實施方式中，上述方法可用于改進糞肥廢物問題，其包括，但不限于:糞肥坑中的發泡，固體積累，(a)氮、(b)硫、(C)磷、⑷纖維結合氮、(e)總蛋白、(f)脂肪和(g)纖維含量的增加。
[0176]A.用于控制或減少糞肥存儲單元中的泡沫的方法
[0177]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于控制或減少糞肥存儲單元中的泡沫的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料，以相對于未施用產酶菌株的動物的糞肥存儲單元控制或減少糞肥存儲單元中的泡沫。在另一種實施方式中，所述糞肥存儲單元中的泡沫:液體的比例降低。
[0178]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于控制或減少存儲坑中的泡沫的方法，其包括將有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的組合物與糞肥存儲坑直接接觸，以相對于沒有產酶菌株的糞肥存儲坑控制或減少糞肥存儲坑中的泡沫。在另一種實施方式中，所述糞肥存儲單元中的泡沫:液體的比例降低。
[0179]糞肥存儲單元中泡沫的量與糞肥存儲單元中的固體的量相關聯。具有更高的固體百分比的糞肥存儲單元通常具有更大的泡沫:液體比例，因此，有更多泡沫。
[0180]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于控制或減少糞肥存儲單元中的泡沫的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料，以相對于未施用產酶菌株的動物的糞肥存儲單元減少固體的量，從而減少糞肥存儲單元中的泡沫量。在另一種實施方式中，所述糞肥存儲單元的中泡沫:液體的比例降低。
[0181]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于控制或減少糞肥存儲單元中的泡沫的方法，其包括將有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的組合物與糞肥存儲單元直接接觸，以相對于沒有產酶菌株的糞肥存儲單元減少糞肥存儲單元中的固體的量。在另一種實施方式中，所述糞肥存儲單元的中泡沫:液體的比例降低。
[0182]B.用于改變糞肥存儲單元微生物生態的方法
[0183]在一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變糞肥存儲單元中的微生物生態的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料，以相對于未施用產酶菌株的動物的糞肥存儲單元改變糞肥存儲單元的微生物生態。[0184]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變糞肥存儲單元中的微生物生態的方法，其包括將有效量的產酶菌株、所述菌株的一種或多種組合、所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的組合物與糞肥存儲單元直接接觸，以相對于沒有產酶菌株的糞肥存儲單元改變糞肥存儲單元的微生物生態。
[0185]在一種實施方式中，產酶菌株可以直接地或間接地改變糞肥存儲單元的微生物生態，導致某些種類細菌的數量增加而其它種類細菌的數量減少。通過所述產酶菌株可以直接或間接地改變的細菌種類包括，但不限于，產甲烷菌、擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌群1、梭狀芽孢桿菌群IV、梭狀芽孢桿菌群XIVa和硫酸鹽還原菌。
[0186]在一種實施方式中，所述產酶菌株具有通過微生物種群改變養分利用率并隨后改變微生物生態的能力，從而通過減少可被截留在泡沫基質中的氣體產生，改變構成泡沫基質的分子化合物的可利用率，或直接抑制與發泡事件有關的細菌的生長，而緩解了累積的發泡發生率。
[0187]C.改變揮發性脂肪酸組成的方法
[0188]在一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變糞肥中揮發性脂肪酸組成的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株，以相對于來自未施用產酶菌株的第二動物的糞肥改變來自所述動物糞肥中的脂肪酸的組成。在一種實施方式中，改變脂肪酸組合物可能會導致某些脂肪酸增加而其它脂肪酸減少。在另一種實施方式中，改變的脂肪酸組成可以以直接或間接的方式進行。
[0189]在一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變糞肥存儲單元中的揮發性脂肪酸組成的方法，其包括給動 物施用有效量的產酶菌株，以相對于來自未施用產酶菌株的第二動物的糞肥改變存儲在糞肥存儲單元中的來自所述動物糞肥中的脂肪酸的組成。在一種實施方式中，所述動物是豬。在另一種實施方式中，所述糞肥儲存單元是糞肥坑。
[0190]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變糞肥存儲單元中的揮發性脂肪酸組成的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株，測量來自飼喂了產酶菌株的動物的糞肥中的揮發性脂肪酸的量；和調節飼喂動物的產酶菌株的濃度以達到存儲在糞肥坑中的糞肥的揮發性脂肪酸的所需濃度。
[0191]在又一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變糞肥存儲單元中的揮發性脂肪酸組成的方法，其包括將有效量的產酶菌株直接與糞肥存儲單元接觸，以相對于沒有產酶菌株的糞肥存儲單元改變糞肥存儲單元中的脂肪酸的組成。
[0192]在另一種實施方式中，可以通過本發明公開的方法改變的揮發性脂肪酸包括，但不限于，乙酸、丙酸、丁酸、1-丁酸、4-甲基戊酸。在另一種實施方式中，本發明所公開的方法增加糞肥中的脂肪酸丁酸。在又一實施例中，本發明所公開的方法降低糞肥中的脂肪酸4-甲基戊酸。
[0193]在另一種實施方式中，可以改變總揮發性脂肪酸。在另一種實施方式中，本發明所公開的方法降低糞肥中的總揮發性脂肪酸。
_4] 改變氣體排放的方法
[0195]在一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變氣體排放的方法，包括給動物施用有效量產酶菌株，以相對于來自未施用產酶菌株的動物改變氣體的排放。在一種實施方式中，改變氣體排放可以導致某些氣體排放增加而其他氣體排放減少。在另一種實施方式中，改變氣體排放可以以直接或間接的方式發生。
[0196]在一種實施方式中，所述用于改變氣體排放的產酶菌株包括芽孢桿菌菌株。在一種實施方式中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌。在另一種實施方式中，所說芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌。
[0197]在另一種實施方式中，所述用于改變氣體排放的產酶菌株包括，但不限于，枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTP BS442、枯草芽孢桿菌AGTP BS521、枯草芽孢桿菌AGTP BS918、枯草芽孢桿菌AGTP BS1013、以及枯草芽孢桿菌AGTP BS1069、枯草芽孢桿菌AGTP944、短小芽孢桿菌AGTP BS1068和短小芽孢桿菌KX11-1，以及具有它們所有特性的菌株、它們的任何衍生物或變體以及它們的混合物。
[0198]所述改變氣體排放的產酶菌株可以以單一菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料的方式施用。
[0199]可以通過產酶菌株改變的氣體包括，但不限于，氨、二氧化碳、甲烷和硫化氫。
[0200]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變飼養動物的房間內的氣體排放的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株，以相對于飼養未施用產酶菌株的動物的房間改變氣體的排放。在一種實施方式中，所述動物是豬。在另一種實施方式中，該房間位于豬棚內。在一種實施方式中，飼養施用了產酶菌株的動物的房間內甲燒和硫化氫氣體的排放減少。
[0201]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變飼養動物的房間內的氣體排放的方法，其包括:給動物施用有效量的產酶菌株以改變飼養動物的房間內的氣體排放；并測量該房間內氣體的量。
[0202]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變糞肥儲存單元中的氣體排放的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株，以相對于具有來自未施用產酶菌株的動物的糞肥的糞肥儲存單元改變糞肥儲存單元中的氣體排放。在一種實施方式中，所述動物是豬。在另一種實施例中，所述糞肥儲存單元是糞肥坑。
[0203]在另一種實施方式中，本公開涉及一種用于改變糞肥儲存單元中的氣體排放的方法，其包括將有效量的產酶菌株與糞肥儲存單元直接接觸，以相對于沒有產酶菌株的糞肥儲存單元改變氣體排放。在一種實施方式中，所述動物是豬。在另一種實施方式中，所述糞肥儲存單元是糞肥坑。
[0204]在一種實施方式中，甲烷和硫化氫氣體的排放減少。
[0205]減輕炎癥應答的方法
[0206]在另一種實施方式中，本公開涉及一種減輕動物炎癥效應的方法，其包括給動物施用有效量的產酶菌株，以減輕或抑制炎癥應答。在一種實施方式中，所述動物是哺乳動物。在另一種實施方式中，所述動物是家禽。在另一種實施方式中，所述動物是雞。在另一種實施方式中，所述動物是豬。
[0207]相對于參考對照(例如無抗炎性質的試劑，例如緩沖鹽水或無抗炎性質的菌株)，所述的產酶菌株可以減輕或抑制炎癥應答2-5%、5-10%、10-15%、15-20%、20-25 %、25-30 30-35 35-40 40-45 45-50 50-55 55-60 60-65 65-7070-75 %、75-80 %、80-85 %、85-90 %、90-95 %和大于 95 %。[0208]在一種實施方式中，所述用于減輕動物炎癥效應的產酶菌株包括芽孢桿菌菌株。在一種實施方式中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌。在另一種實施方式中，所述芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌。
[0209]在另一種實施方式中，所述用于減輕動物炎癥效應的產酶菌株包括枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTP BS442、枯草芽孢桿菌AGTP BS521、枯草芽孢桿菌AGTP BS918、枯草芽孢桿菌AGTP BS1013、以及枯草芽孢桿菌AGTP BS1069、枯草芽孢桿菌AGTP944、短小芽孢桿菌AGTP BS1068和短小芽孢桿菌KX11-1，以及具有它們的所有特性的菌株、它們的任何衍生物或變體以及它們的混合物。
[0210]在另一種實施方式中，所述用于減輕動物炎癥效應的產酶菌株是包括枯草芽孢桿菌AGTP BS1013、枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5和枯草芽孢桿菌AGTP944的組合物。
[0211]所述產酶菌株可以通過減少涉及炎癥應答的基因的表達以減輕或抑制炎癥應答。在一種實施方式中，相對于參考對照(例如無抗炎性質的試劑，例如緩沖鹽水或無抗炎性質的菌株)，所述產酶菌株可以降低該基因的表達2-5%,5-10%、10-15%、15-20%、20-25 25-30 30-35 35-40 40-45 45-50 50-55 55-60 60-6565-70 %、70-75 %、75-80 %、80-85 %、85-90 %、90-95 %和大于 95 %。
[0212]在另一種實施方式中，所述產酶菌株可以通過減少涉及炎癥應答的蛋白質的表達以減輕或抑制炎癥應答。
[0213]在另一種實施方式中，所述產酶菌株可以通過降低涉及炎癥應答的蛋白的活性以減輕或抑制炎癥應答。 [0214]在另一種實施方式中，相對于參考對照(例如無抗炎性質的試劑，例如緩沖鹽水或無抗炎性質的菌株)，所述產酶菌株可以減少蛋白質的表達或活性2-5%、5-10%、10-15 %,15-20 20-25 25-30 30-35 35-40 40-45 45-50 50-5555-60%,60-65%,65-70%,70-75%,75-80%,80-85%,85-90%,90% -95%和大于 95%。
[0215]在另一種實施方式中，產酶菌株可以減少涉及參與炎癥應答的任何通道的基因的表達或降低涉及參與炎癥應答的任何通道的蛋白質的活性，所述通道包括，但不限于，黏附滲出遷移(adhesion-extravasation-migration);凋亡信號轉導；1丐信號轉導；補體級聯(complement cascade);細胞因子和細胞因子信號轉導；類花生酸的合成和信號轉導；糖皮質激素/PPAR信號轉導；G-蛋白偶聯受體信號轉導；先天性病原體檢測；白細胞信號轉導；MAPK信號轉導；自然殺傷細胞信號轉導；NK - K B信號轉導；抗原遞呈；PI3K/AKT信號轉導；R0S/谷胱甘肽/細胞毒素顆粒；以及TNF超家族和信號轉導。
[0216]在一種實施方式中，所述產酶菌株可以降低細胞因子的活性或表達，所述細胞因子包括，但不限于，白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、促紅細胞生成素、促血小板生成素(Tpo)、Fit-3L、SCF、M-CSF 和 MSP。
[0217]在一種實施方式中，白細胞介素包括，但不限于，白細胞介素(IL)-1、IL-La、IL_1類似物、IL-β、IL-1RA、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL_6 類似物、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1O 類似物、IL-1U IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、GM-CSF 和 OSM。
[0218]在另一種實施方式中，干擾素包括，但不限于，IFN-a、IFN-β和IFN-Y。
[0219]在另一種實施方式中，腫瘤壞死因子包括，但不限于，⑶154、LT- β、TNF- a、TNF-β、TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、4_1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、0X40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK 和 TRANCE。
[0220]在另一種實施方式中，所述產酶菌株可以用于降低趨化因子的活性或減少趨化因子的表達，該趨化因子包括，但不限于，C趨化因子、CC趨化因子、CXC趨化因子和CXC3趨化因子。
[0221]在一種實施方式中，C趨化因子包括，但不限于，XCLl和XCL2。
[0222]在另一種實施方式中，CC趨化因子包括，但不限于，CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCLl1、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27 和 CCL28。
[0223]在另一種實施方式中，CXC趨化因子包括，但不限于，CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO、CXCLl1、CXCLl2、CXCL13 和 CXCL14。
[0224]所述用于減輕動物炎癥應答的產酶菌株可以以單一菌株、所述菌株的一種或多種組合或者所述菌株的培養物的一種或多種上清液、包含一種或多種菌株或者它們的混合物的飼料的方式施用。
[0225]本發明所公開 的菌株、方法和組合物可以通過編號的段落來進一步描述。
[0226]1、一種具有酶活性的分離的芽孢桿菌菌株。
[0227]2、第I段所述的菌株，其中，所述酶活性選自纖維素酶活性、α -淀粉酶活性、木聚糖酶活性、酯酶、β -甘露聚糖酶、脂肪酶活性、蛋白酶活性及其組合。
[0228]3、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述酶活性選自玉米蛋白酶活性和大豆蛋白酶活性以及它們的組合。
[0229]4、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，當喂食高水平的DDGS時，相對于對照動物，當給動物施用所述菌株時，所述菌株在復合飼料成分的分解、糞肥廢物問題、豬生產效率、胴體品質和豬性能中的至少一個方面提供了改進。
[0230]5、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，與對照動物相比，當飼喂高水平DDGS時，當給動物施用所述菌株時，該菌株在復合飼料成分的分解、糞肥廢物問題、豬生產效率、胴體品質中至少一個方面的提供了至少2%的改進。
[0231]6、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，與對照動物相比，當給動物施用所述菌株時，該菌株在以下各項中的至少一項上提供改進:體重、平均日增重、平均日飼料攝入量、飼料效率、胴體品質、養分消化率和糞肥廢物問題。
[0232]7、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，與對照動物相比，當給動物施用所述菌株時，該菌株在以下各項中的至少一項上提供至少2 %的改進:體重、平均日增重、平均日飼料攝入量、飼料效率、胴體品質、養分消化率和糞肥廢物問題。
[0233]8、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述菌株選自枯草芽孢桿菌種和短小芽孢桿菌種、具有它們所有特征的菌株、它們的任何衍生物或變體以及它們的混合物。
[0234]9、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述菌株選自枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5 (NRRL Β-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS442 (NRRL Β-50542)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS52KNRRL Β-50545)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS1013(NRRL B-50509)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS1069 (NRRLB-50544)、枯草芽孢桿菌 AGTP944 (NRRL B-50548)、短小芽孢桿菌 AGTP BS1068 (NRRL B-50543)、短小芽孢桿菌KXll-1 (NRRL B-50546)、具有它們所有特征的菌株、它們的任何衍生物或變體以及它們的混合物。
[0235]10、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述菌株選自枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS442 (NRR L B-50542)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS52KNRRL B-50545)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS1013(NRRL B-50509)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS1069(NRRL B-50544)、枯草芽孢桿菌 AGTP944 (NRRL B-50548)、短小芽孢桿菌 AGTP BS1068(NRRL B-50543)和短小芽孢桿菌KXll-1 (NRRL B-50546)、它們的任何衍生物或變體以及它們的混合物。
[0236]11、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510)。
[0237]12、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP BS442(NRRL B-50542)。
[0238]13、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP BS52 KNRRL B-50545)。
[0239]14、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP BS918(NRRL B-50508)?
[0240]15、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)。
[0241]16、前述段落 中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌AGTP BS1068(NRRL B-50543)?
[0242]17、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)。
[0243]18、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP944(NRRL B-50548)。
[0244]19、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌KXll-1(NRRL B-50546)。
[0245]20、一種組合物，其包括來自根據段落1-19中任一段所述的一種或多種菌株的一種或多種培養物的上清液以及它們的混合物。
[0246]21、一種組合物，其包括根據段落1-19中任一段所述的一種或多種菌株以及它們的混合物。
[0247]22、根據段落20或21所述的組合物，其中，所述菌株是枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5 (NRRL B-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS918(NRRL B-50508)和枯草芽孢桿菌 AGTPBS1013(NRRL B-50509)?
[0248]23、根據段落20或21所述的組合物，其中，所述菌株是枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5 (NRRL B-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS944 (NRRL B-50509)、和枯草芽孢桿菌 AGTPBS1013(NRRL B-50509)?
[0249]24、一種動物飼料，其中，所述飼料補充有根據段落1-19中任一段所述的分離菌株或根據段落20-23中任一段的組合物或它們的混合物。
[0250]25、一種方法，其包括給動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24的飼料或它們的混合物的步驟，其中，當給動物飼喂高含量的DDGS時，所述施用酶分解了飼喂給動物的飼料中的纖維、蛋白質、碳水化合物和脂質的至少一種。
[0251]26、一種方法，其包括給動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物的步驟，其中，所述施用改進了復合飼料成分的分解、肥料廢物問題、豬生產效率、胴體品質和豬性能中的至少一項。
[0252]27、一種方法，其包括給動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物的步驟，其中，相對于對照動物，所述施用改進了以下各項中的至少一項:體重、平均日增重、平均日飼料攝入量、飼料效率、胴體品質、養分消化率和糞肥廢物問題。
[0253]28、一種方法，其包括給家禽施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物的步驟，其中，相對于對照動物，所述施用改進了以下各項中的至少一項:體重、平均日增重、平均日飼料攝入量、飼料效率、胴體品質、養分消化率和糞肥廢物問題。
[0254]29、一種方法，其包括給豬施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物的步驟，其中，相對于對照動物，所述施用改進了以下各項中的至少一項:體重、平均日增重、平均日飼料攝入量、飼料效率、胴體品質、養分消化率和糞肥廢物問題。
[0255]30、段落25-29所述的方法，其中，所述組合物是段落22或23所述的組合物。
[0256]31、段落25-30中任一段所述的方法，其中，所述菌株是以約I X IO5至約I X IO11CFU/動物/天施用。
[0257]32、段落25-27和29_31中任一段所述的方法，其中，所述動物是豬屬動物。
[0258]33、段落25-32中任一段所述的方法，其中，所述動物飼喂高水平的含有可溶物的干酒糟(DDGS)。
[0259]34、段落25-33中任一段所述的方法，其中，所述動物以動物飲食10%以上的比例施用含有可溶物的干酒糟(DDGS)。
[0260]35、段落25-34中任一段所述的方法，其中，所述動物以動物飲食30%以上的比例施用含有可溶物的干酒糟(DDGS)。
[0261]36、一種方法，其包括給豬糞肥存儲單元施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株或根據段落20-23中任一段所述的組合物的步驟。
[0262]37、段落36所述的方法，其中，所述豬糞肥存儲單元是糞肥坑。
[0263]38、段落36或37所述的方法，相比于對照糞肥坑，其進一步包括改進以下各項中的至少一項:更少的起泡發生率、更少的固體積累、更少的氮、硫、磷、纖維結合氮、總蛋白、脂肪和纖維含量。
[0264]39、一種形成組合物的方法，所述方法包括:(a)在液體肉湯培養基中培養培養物，所述培養物包括根據段落1-19中任意一段所述的分離菌株中的一種，以及(b)從液體肉湯培養基中分離菌株。
[0265]40、段落39所述的方法，進一步包括冷凍干燥所述分離的菌株，并將凍干的菌株加入載體。
[0266]41、段落39或40所述的方法，進一步包括在所述菌株分離后保留液體肉湯培養基以生成上清液。
[0267]42、一種用于相對于對照動物改進動物生長性能的方法，包括給動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物。
[0268]43、段落42的方法，其中，所述施用改進了以下各項中的至少一項:體重、平均日增重、平均日采食量、飼料效率、胴體品質、養分消化率和糞肥廢物問題。
[0269]44、一種用于改進糞肥存儲單元的方法，其包括給動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物，以相對于儲存于第二糞肥存儲單元的來自對照動物的糞肥改進糞肥存儲單元。
[0270]45、一種用于改進糞肥存儲單元的方法，其包括將有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物與糞肥存儲單元直接接觸。
[0271 ] 46、段落44或45所述的方法，其中，相對于對照糞肥坑，改進包括下列各項中的至少一項:更低的起泡的發生率、更少的固體積累、更少的氮、硫、磷、纖維結合的氮、總蛋白、脂肪和纖維含量。 [0272]47、一種控制或減少糞肥坑中泡沫的方法，其包括給糞肥存儲在糞肥坑中的動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物。
[0273]48、一種控制或減少糞肥坑中泡沫的方法，其包括將有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物與糞肥坑直接接觸。
[0274]49、一種改變糞肥坑中的微生物生態的方法，其包括給糞肥存儲在糞肥坑的動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物。
[0275]50、一種改變糞肥坑中的微生物生態的方法，其包括將有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物與糞肥坑直接接觸。
[0276]51、一種改變糞肥坑中的揮發性脂肪酸組成的方法，其包括給糞肥存儲在糞肥坑的動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物。
[0277]52、一種改變糞肥坑中揮發性脂肪酸組成的方法，其包括將有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物與糞肥坑直接接觸。
[0278]53、一種改變圈養動物的房間內的氣體排放的方法，其包括給動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物以減少氣體排放。[0279]54、一種改變糞肥存儲單元中的氣體排放的方法，其包括給動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物以減少氣體排放。
[0280]55、一種改變糞肥存儲單元中的氣體排放的方法，其包括將有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物與糞肥存儲單元直接接觸以減少氣體排放。
[0281]56、一種減輕炎癥應答的方法，其包括給動物施用有效量的根據段落1-19中任一段所述的菌株、根據段落20-23中任一段所述的組合物、根據段落24所述的飼料或它們的混合物以減輕炎癥應答。
[0282]57、段落1-19所述的分離的菌株、根據段落20_23所述的組合物、根據段落24所述的飼料，當飼喂高含量的DDGS時，其用作藥物以改進復合飼料成分的分解、肥料廢物問題、豬生產效率、胴體品質和豬性能中的至少一項。
[0283]58、段落1-19所述的分離的菌株或根據段落20_23所述的組合物或根據段落24所述的飼料在制備提供一種或多種酶的藥物中的應用。
[0284]60、段落1-19中所述的芽孢桿菌的分離菌株，當飼喂高含量的DDGS時，其用于改進復合飼料成分的分解、肥料廢物問題、豬生產效率、胴體品質和豬性能。
[0285]61、段落1-19中所述的芽孢桿菌的分離菌株在制備提供酶活性的藥物中的應用。
[0286]62、段落1-19 中所述的芽孢桿菌的分離菌株，當飼喂高含量的DDGS時，在制備用于改進復合飼料成分的分解、肥料廢物問題、豬生產效率、胴體品質和豬性能的藥物中的應用。
[0287]實施例
[0288]提供下面的實施例僅用于說明的目的。在本發明中包括實施例僅用于幫助更完整地理解此處所描述的本發明。實施例不以任何方式限制本發明所描述的或要求的范圍。
[0289]實施例1
[0290]環境細菌的分離和酶活性的鑒定。
[0291]在幾年的時期內，從不同的來源地點收集農業和環境廢物樣品。達到目的后，將所有樣品在1%蛋白胨溶液中稀釋，在65°C下芽孢處理35分鐘，并連續稀釋到胰蛋白酶大豆瓊脂平板(BD Difco，Franklin Lakes, NJ)上。在32°C下溫育48小時后，將不同的未知環境菌落生長從所述平板轉移到胰蛋白大豆肉湯液體培養基(TSB)中進行培養，類似地進行再培養并于_85°C冷凍保存用于后續分析。
[0292]收集環境來源的大約4000個可能的芽孢桿菌分離菌株，并篩選其降解各種目標底物的能力。環境培養物挑選自冷凍庫材料，并在32°C下在0.5ml TSB中在軌道搖床培養箱中培養24小時，速度設置為130 (Gyromax737R)。通過將2微升液體培養物平行點滴到100X 100X 15mm柵格板中的15.0ml各種目標底物培養基類型上進行這些試驗菌株的高通量篩選。用各個菌株基于特定底物利用測定纖維素酶、α-淀粉酶、玉米蛋白酶、大豆蛋白酶、酯酶、脂肪酶和木聚糖酶活性。用于分析由環境衍生菌株的酶活性導致的底物利用性能的培養基成分描述于表1中。在施加培養物后，將測定板放置干燥30分鐘,然后在32°C下孵育24小時。通過以毫米為單位測量底物降解的區域以測定每種菌株的酶活性，如由菌落生長的透明周圍邊緣所指示的。記錄由平行平板得到的平均值。[0293]作為顯示出所有篩選菌株中的代表酶活性最高的10%和最高的2%的底物活性的范圍的直接飼喂的候選微生物菌株，從約4000株篩選菌株中挑選出九種菌株(表2)。基于它們利用或降解一系列與在飼料中包含DDGs相聯系的相關底物的能力，選出九種分離菌株作為一種或多種直接飼喂微生物(DFM(s))的候選物。測定了 RAPDPCR圖譜和各菌株的部分16SrDNA序列。通過使用8F和1541R引物組擴增16SrDNA進行每個菌株的屬和推定種的測定。從正向和反向端對純化的PCR產物測序，并用CAP3裝配程序生成連續序列。九個所選的菌株有:枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5(圖1和2)、枯草芽孢桿菌AGTP BS442 (圖3和4)、枯草芽孢桿菌AGTP BS521(圖5和6)、枯草芽孢桿菌AGTP BS918 (圖7和8)、枯草芽孢桿菌AGTP BS1013(圖9和10)、短小芽孢桿菌AGTP BS1068(圖11和12)、枯草芽孢桿菌AGTP BS1069(圖13和14)、枯草芽孢桿菌AGTP944 (圖15-18)和短小芽孢桿菌KXll-1 (圖19-21)。
[0294]表1-用于分析通過環境衍生芽孢桿菌的底物利用性能說明的酶活性的培養基成分。
[0295]
【權利要求】
1.一種分離的具有酶活性的芽孢桿菌菌株，選自:枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5 (NRRLB-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS442 (NRRL B-50542)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS521(NRRLB-50545)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS1013(NRRLB-50509)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS1069 (NRRL B-50544)、枯草芽孢桿菌 AGTP944 (NRRLB-50548)、短小芽孢桿菌 AGTP BS1068(NRRL B-50543)和短小芽孢桿菌 KXll-1 (NRRLB-50546)、以及具有它們所有特征的菌株、它們的任何衍生物或變體和它們的混合物。
2.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述的酶活性選自纖維素酶活性、α-淀粉酶活性、木聚糖酶活性、酯酶、β -甘露聚糖酶、脂肪酶活性、蛋白酶活性以及它們的組合。
3.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述的酶活性選自玉米蛋白酶活性和大豆蛋白酶活性，以及它們的組合。
4.根據權利要求1所述的菌株，其中，當給動物施用所述菌株時，該菌株在以下各項的至少一項上提供改進:體重、平均日增重、平均日飼料攝入量、飼料效率、胴體品質、養分消化率和糞肥廢物問題。
5.根據權利要求1所述的菌株，其中，當給動物施用所述菌株時，與對照相比，該菌株在以下各項的至少一項上提供至少2%的改進:體重、平均日增重、平均日飼料攝入量、飼料效率、胴體品質、養分消化率和糞肥廢物問題。
6.根據權利要求4所述的菌株，其中，所述動物是家禽或豬。
7.根據權利要 求1所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5 (NRRL Β-50510)。
8.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTPBS442(NRRL Β-50542)。
9.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTPBS52 KNRRL Β-50545)。
10.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTPBS918(NRRL B-50508)。
11.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTPBS1013(NRRL B-50509)?
12.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌AGTPBS1068(NRRL B-50543)?
13.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTPBS1069(NRRL B-50544)?
14.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌AGTP944(NRRL B-50548)。
15.根據權利要求1所述的菌株，其中，所述芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌KXll-1(NRRL B-50546)。
16.一種組合物，其包括來自權利要求1所述的一種或多種菌株的一種或多種培養物的上清液。
17.—種組合物，其包含權利要求1所述的兩種或多種菌株。
18.根據權利要求16所述的組合物，其包括枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5 (NRRLB-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS944 (NRRL B-50509)和枯草芽孢桿菌 AGTP BS1013(NRRLB-50509)。
19.一種組合物，其包含枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510)、枯草芽孢桿菌AGTP BS918(NRRL B-50508)和枯草芽孢桿菌 AGTP BS1013(NRRL B-50509) ?
20.一種動物飼料，其中，所述 飼料補充有枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS918(NRRL B-50508)和枯草芽孢桿菌 AGTP BS1013(NRRL B-50509)。
【文檔編號】C12N1/20GK103930540SQ201280052430
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年8月24日 優先權日:2011年8月24日
【發明者】馬里·埃倫·戴維斯, 賈斯汀·薩瓦爾, 安東尼·諾依曼, 格雷格·西拉古薩, 路易斯·羅梅羅 申請人:杜邦營養生物科學有限公司