核酸擴增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析裝置制造方法

核酸擴增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析裝置制造方法
【專利摘要】本發明涉及一種核酸擴增方法，其通過以高簇密度制作成為利用測序儀進行序列解析的對象的擴增核酸片段束(簇)，且使簇內核酸片段數達到10,000分子以上，提高核酸序列解析的通量且提高讀取精度；通過預先使引物DNA在基體上形成圖案狀，在其上固定由試樣DNA合成得到的大體積模板DNA進行擴增反應，實現高簇密度和提高簇內擴增片段數。
【專利說明】核酸擴增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析裝置
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種核酸的堿基序列解析中使用的核酸擴增方法、核酸基板及核酸分析裝置。
【背景技術】
[0002]正在陸續開發確定DNA、RNA的堿基序列的新技術。以前，堿基序列的確定采用利用了電泳的方法，預先調制序列確定用DNA片段或根據RNA試樣進行反轉錄反應合成的cDNA片段試樣,采用周知的桑格法(Sanger method)實施雙脫氧反應后,進行電泳,測定分子量遷移展開譜圖(pattern)并進行解析。
[0003]對此，近年來開發出將大量作為試樣的DNA片段固定在基板上，并行確定大量片段的序列信息的方法，使堿基解析速度得到了飛躍性提高。這些技術中，將擴增作為解析對象的核酸序列得到的束(簇)配置在平面上，使用二維圖像傳感器進行測定，從而平行解析多個樣品。例如，非專利文獻I中，通過使用固定在基板上的引物在基板上進行PCR反應，從而在基板上形成擴增基因片段的簇。此外，非專利文獻2中，進行乳液PCR，在微粒表面對核酸序列進行擴增和固定，并將該微粒固定在基板上，使多個樣品配置在平面上。
[0004]在這些超并聯型測序儀中，簇的形成是重要步驟，以高密度形成簇增加可以通過圖像傳感器一次獲取的序列信息，提高每簇的擴增基因片段數可以提高序列信息的信號強度，提高序列信息的可靠性，同時實現檢測裝置的簡化。
[0005]現有技術文獻
[0006]專利文獻
[0007]專利文獻1:日本特表2002-525125號公報
[0008]專利文獻2:日本特表2011-520420號公報
[0009]非專利文獻
[0010]非專利文獻1:Nucleic Acids Research, 2000, vol.28, N0.20, e87.[0011]非專利文獻2:Science2005, vol.309，pp.1728-1732.[0012]非專利文獻3:Nano Letter2010, vol.10，pp.788-792.[0013]非專利文獻4:P.N.A.S.2006，vol.103，pp.19635-19640.
【發明內容】

[0014]發明要解決的問題
[0015]超并聯型測序儀中，通過二維圖像傳感器獲取由配置在平面上的擴增基因簇產生的熒光或者發光反應，得到各基因片段的序列信息。因此，隨著擴增基因簇的密度的提高，則從一張圖像得到的序列信息量增加，有望實現高通量。
[0016]關于在基板上通過擴增反應制作多個簇的現有方法，例如專利文獻I中公開的那樣，將作為模板的試樣DNA隨機地散布在基板上，以預先固定在基板上的引物作為反應起點進行擴增反應。這種隨機散布模板DNA的方法中，如果想提高簇密度，則供給至一定面積的區劃內的模板DNA相對于分子數的頻率分布為泊松分布，所以僅供給一分子模板DNA的區劃的極限是最大約37%。因此，例如，以向基板上平均500nm見方的區劃供給各一分子為目標，理想狀態下應該能夠獲得400萬個/mm2的簇密度，但即使對模板DNA濃度進行最適化，也僅能獲得為其約1/3的130萬個/mm2的簇密度這樣的極限。也就是說，殘留的問題是，如果將作為模板的試樣DNA以高濃度固定，則模板DNA會緊挨著被固定在基板上，因此多種DNA會在同一區劃內被擴增，無法進行正確的堿基序列解析；另一方面，如果將試樣DNA以低濃度固定，則簇密度會下降，通量會下降。
[0017]專利文獻2中還公開了一種方法，其在進行擴增反應后，將其擴增產物固定在預先形成于基板上的固定用墊上。但是，在該方法中，擴增反應為滾環擴增(rolling circleamplification, RCA)反應，難以實現超過10，000倍那樣的高擴增倍率。為了以高通量進行解析，不得不高速檢測熒光亮點，并優選每簇的DNA片段數也多，但從DNA合成反應速度方面考慮，僅憑實用的數小時的反應時間的RCA反應，難以實現超過10，000倍的高擴增倍率。
[0018]本發明提供一種擴增方法，其與根據泊松分布的比例而設定的簇密度相比，實現了更高的簇密度，同時將各簇內的DNA片段數擴增至可以容易檢測的10，000分子以上。
[0019]用于解決問題的手段
[0020]本發明的發明人等進行深入研究的結果，開發出一種擴增方法，其兼顧了與根據泊松分布求得的簇密度相比更高的簇密度、以及使簇內的DNA片段數為10，000分子以上的
高擴增率。
[0021]特別是開發出了一種核酸擴增方法，當把500nm見方作為簇的一個區劃時，其簇密度與根據泊松分布求得的簇密度130萬個/mm2相比更高，且將簇內的DNA片段數擴增至10，000分子以上。
[0022]本方法中，將高密度固定引物的區域孤立且高密度地設在基體上，對該區域供給各一分子擴增對象模板DNA。作為供給各一分子的方法，通過供給模板DNA作為以物理尺寸計大于或等于固定區域的分子，能夠向各固定區域供給各一分子模板DNA。更具體而言，例如通過RCA反應，合成各模板DNA的巨大分子，將它們供給到固定有引物DNA的各固定區域，從而實現一分子供給。一分子供給后，通過PCR反應等擴增反應，在引物固定區域內以引物為起點的擴增產物被固定在基體上。RCA反應產物為巨大分子，但是按堿基序列計，只含一種模板DNA，因此各個引物固定區域中只合成出一種擴增產物。從而能夠制作出可以充分適用于后續測序反應的擴增產物基板。
[0023]發明的效果
[0024]本發明中，與根據泊松分布的比例而設定的簇密度相比，實現了更高的簇密度，這是現有的將試樣DNA隨機固定在基板上的方法所無法實現的；同時實現可以將各簇內的DNA片段數擴增至10，000分子以上，增加了每一視野中的序列解析DNA片段數，并縮短檢測所需曝光時間，從而可以實現高通量的序列解析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是用于說明本發明的基因擴增方式的構成的一例的圖。
[0026]圖2是本發明的基因擴增方式中使用的基板的制作方法的一例。[0027]圖3是本發明的基因擴增方式中使用的大體積的模板DNA的制作方法的一例。
[0028]圖4是使用本發明中制作的擴增基因片段簇進行測序反應時的裝置構成的一例。
[0029]圖5是表示本發明的核酸分析方法的一例的圖。
【具體實施方式】
[0030]實施例中公開一種核酸擴增方法，其特征在于，包含如下工序:在基體的表面配置固定有第一核酸的區域和未固定前述第一核酸的區域的工序；將同一鏈上具有至少兩個以上作為解析對象的堿基序列的第二核酸固定在固定有前述第一核酸的區域上的工序；以及供給第三核酸并以前述第一核酸及第三核酸為引物進行前述第二核酸的擴增反應的工序。
[0031]此外，實施例中公開一種核酸擴增方法，其特征在于，前述核酸擴增方法中，第二核酸的直徑的平均值大于固定有第一核酸的區域的直徑的平均值的1/2。
[0032]此外，實施例中公開一種核酸擴增方法，其特征在于，前述核酸擴增方法中，第二核酸為單鏈，且具有自退火結構。
[0033]此外，實施例中公開一種核酸擴增方法，其特征在于，前述核酸擴增方法中，包含在擴增反應后去除第一核酸的延伸反應產物的互補鏈的工序。
[0034]此外，實施例中公開一種核酸擴增方法，其特征在于，前述核酸擴增方法中，第二核酸是以具有解析對象堿基序列的環狀核酸為模板，在具有鏈置換活性的聚合酶作用下獲得的鏈置換延伸反應產物。
[0035]此外，實施例中公開一種核酸擴增方法，其特征在于，前述核酸擴增方法中，擴增反應為恒溫反應。
[0036]此外，實施例中公開一種`核酸基板，其特征在于，在基體上固定有包含作為解析對象的堿基序列的核酸的核酸基板上，固定有前述核酸的區域的直徑的平均值為500nm以下，且前述核酸的固定區域中核酸的分子數的平均值為10，000分子以上。
[0037]此外，實施例中公開一種核酸基板，其具有至少一個以上的流路，用于進行前述核酸擴增方法。
[0038]此外，實施例中公開一種核酸分析裝置，其具有至少一個溫度調節裝置和送液機構，用于進行前述核酸擴增方法。
[0039]以下參照附圖對本發明的上述以及其它新穎特征和效果進行說明。這里，為了完全理解本發明而對特定的實施方式進行了詳細說明，但本發明不限定于這里所記載的內容。
[0040]實施例1
[0041]本實施例中，使用圖1對本發明的核酸擴增方法進行說明。以試樣DNAlOl為基礎合成大體積DNA分子102(1)。需要在每個大體積DNA分子102中不混淆那些作為基礎的試樣DNAlOl的堿基序列信息地被保持。為此，作為合成方法可以采用滾環擴增(RCA)反應。其詳細內容在實施例3中公開。另一方面，預先將作為引物的DNA104呈圖案狀固定在基體103的表面上。關于將引物DNA104呈圖案狀固定的方法，其例子在實施例2中公開。通過雜交將大體積DNA分子102固定在固定有引物DNA104的區域(2)。為此，預先使引物DNA104中具有大體積DNA分子102的部分堿基序列的互補序列。引物DNA104可以在各固定區域中具有相同的堿基序列，也可以使大體積DNA分子102具有共通的堿基序列以使其具有與之互補的序列。
[0042]呈圖案狀固定的引物DNA104的各固定區域中需要供給各一種試樣DNA101。當假設固定區域的直徑為D，大體積DNA102的直徑為d時，發現如果滿足d > D/2，則各固定區域中不會固定2個以上的大體積DNA，即可以對各固定區域只供給一種試樣DNA101，從而完成了本發明。如果滿足d > D/2，固定有大體積DNA102的區域不會物理性地固定另一個大體積DNA，因此不滿足獨立事件的重復所產生的泊松分布條件，從而可以達到大于或等于根據泊松分布所設定的一分子固定比率約37%的較高的一分子固定比率。即使將大體積DNA102的濃度提高，使其與基體103進行反應，固定區域I處也不能固定2個以上的大體積DNA102，因此可以達到例如泊松分布極限值的2倍左右的、約70%以上的較高一分子固定比率。
[0043]然后，將基體浸入含有DNA合成酶、4種堿基底物的水溶液中，進行以大體積DNA分子102為模板的引物DNA104的延伸反應，進行雙鏈合成(3)。以該大體積DNA分子102為模板的互補鏈合成反應(3)根據所用聚合酶的種類會有所差別，但可以通過在37°C左右的恒定溫度下反應10分鐘左右完成。然后，給予與引物DNA104方向相反的引物DNA105，進行PCR反應(4)。這里，PCR反應時，如果在通常的整個溫度周期范圍內，于通常的95°C左右條件下進行變性，則模板的大體積DNA分子102將從基板上剝離，因此無法獲得所期望的擴增。因此，優選在恒定溫度下進行PCR反應，當雙鏈部分解離時引物DNA104退火，發生互補鏈合成反應。對反應條件進行積極研究的結果，判斷反應溫度和引物濃度是影響擴增效率的決定因素。當反應溫度達到70°C以上時，大體積DNA分子102會發生剝離，擴增率下降。另一方面，當反應溫度達到50°C以下時，擴增率降低，即使反應約3個小時，則擴增率也達不到10，000倍。從而得知，反應溫度優選為50°C到70°C之間，更優選為60°C左右。然后，對引物DNA104的密度與擴增率的關系進行了積極研究。其結果是，得知如果固定密度達不到50，000分子/ μ m2 (~I分子/4.5nm見方)左右，則即使反應約3個小時，擴增率也達不到10，000倍。從而明確，引物DNA104的固定密度優選為10，000分子/μ m2以上，更優選為100，000分子/μ m2以上。關于引物DNA105的濃度，在與通常溶液中的PCR反應相同水平即0.1~0.5 μ M左右的條件下能夠得到充分的擴增。聚合酶優選為具有鏈置換活性的酶，可以使用Phi29、Bst聚合酶、C`sa聚合酶、96-7聚合酶等。PCR反應后，基體103上會制作出預先固定在基體103上的引物DNA104的延伸反應產物與引物DNA105的延伸反應產物的雙鏈。對于這些延伸反應產物，雖然會進行為了堿基序列解析的測序反應，但為了使該測序反應高效地進行，優選將引物DNA105的延伸反應產物去除，以單鏈形式留存。去除方法選用最簡便的利用高溫處理的變性，優選于70°C以上，更優選90°C以上處理2分鐘左右，從而可以在測序反應中實施充分的單鏈化。
[0044]如本實施例所示，根據本發明，簇密度即固定區域密度取決于引物DNA104的固定區域密度，不受泊松分布限制，能夠以較高的固定密度向各固定區域供給各一種試樣DNAlOl0例如，如果在直徑500nm范圍制作固定區域，則可以達到200萬個/mm2以上的高簇密度。另一方面，簇內的DNA密度取決于擴增率和每簇的面積來確定。例如，如果直徑500nm的固定區域(簇形成區域)內，引物DNA密度為50，000分子/ μ m2以上，則在約3個小時的反應時間內擴增率將達到約10，000倍，因此可以達到10，000分子/簇。
[0045]實施例2[0046]本實施例中，參考圖2對將引物DNA呈圖案狀固定在基體上的方法的一個優選例子進行說明，該方法用于本發明的核酸擴增方法中。
[0047]在平滑的支撐基體201上利用旋轉涂布法涂布電子束用正型抗蝕劑202。作為平滑的支撐基體，可以使用玻璃基板、藍寶石基板、硅片等。在作為核酸基板時，需要從與固定核酸的面相反側的背面照射激發光時，使用光透過性優異的石英基板、藍寶石基板即可。作為電子束用正型抗蝕劑，可以列舉例如聚甲基丙烯酸甲酯、ZEP-520A(日本瑞翁公司制)。利用基板上的標記的位置進行位置對齊后進行電子束直寫曝光，在抗蝕劑中形成通孔。例如，形成直徑200nm的通孔。通孔雖然取決于平行處理所能夠解析的核酸的分子數，但考慮到制造上的簡便性、成品率的高低以及平行處理所能夠解析的核酸的分子數，通孔以0.5μπι左右的間距形成是適宜的。通孔形成區域也取決于平行處理所能夠解析的核酸的分子數，但也大幅依賴于檢測裝置側的位置精度、位置分辨率。通孔形成區域也取決于平行處理所能夠解析的核酸的分子數，但也大幅依賴于檢測裝置側的位置精度、位置分辨率。例如，以0.5 μ m間距構成引物DNA固定區域時,每Imm見方可以形成400萬簇。形成通孔后，通過濺射使構成粘接用墊203的材料例如金制膜。在使用玻璃基板、藍寶石基板作為平滑的支撐基體、使用金作為粘接用墊材料時，就強化前述基板材料和前述粘接用墊材料間的粘接而言，優選引入鈦、鉻的薄膜。將抗蝕劑剝離后，對于形成了粘接用墊203以外的平滑基板表面實施防止非特異吸附的處理。為了實現防止對帶熒光色素的核苷酸的吸附，用具有帶負電荷官能團的分子進行涂布。例如，通過旋轉涂布在表面涂布環氧硅烷并加熱處理后，用弱酸性溶液(PH5~pH6左右)進行處理，從而使環氧基開環，在表面導入OH基，從而可以帶來防止非特異吸附的效果。
[0048]優選預先用官能團204修飾引物DNA205。使用金作為粘接用墊材料時，可以使用巰基作為官能團204。將設有粘接用墊203的基體在具有官能團204的引物DNA205的水溶液中進行浸潰處理，經規定反應時間后取出，將多余的水溶液洗滌后，干燥，從而可以制作呈圖案狀地固定有引物DNA的核酸基板。本實施例中已示出使用電子束曝光裝置的例子，可以采用完全相同的步驟使用光線曝光裝置同樣地制作核酸基板。
[0049]此外，除如上所述的光刻技術之外，也可以采用納米壓印、接觸印刷(contactprint)等技術將粘接墊呈圖案狀設置。而且，還可以利用相容性不同的高分子彼此連接而成的嵌段共聚物形成微相分離結構，通過溶解一方的高分子相，制作凹型圖案，并將其作為模板制作金屬墊圖案。
[0050]實施例3
[0051]本實施例中，參考圖3對由試樣DNA制作大體積DNA分子的方法的一個優選例子進行說明，該方法用于本發明的核酸擴增方法中。
[0052]采用酶解、剪切、或者超聲處理等常規方法將試樣DNA301進行片段化(I)。片段302的堿基長度優選為50個堿基到2000個堿基之間，更優選為100個堿基到500個堿基之間。因為后續工序中將與接頭(Iinker)DNA接合形成環狀DNA后，進行DNA的合成反應，所以片段如果過長，則有可能導致大體積DNA的結構與所期望的形狀有所偏離。另一方面，如果過短，則會產生在基體上進行擴增反應時擴增率無法達到期望值的危險性。優選考慮上述情況來決定片段長度，并優選選擇進行片段化(I)的方法，以獲得該長度的片段。
[0053]優選將片段302的兩個末端平滑化處理后，在兩個末端連接(ligation)接頭303(2)。平滑化處理可以采用以聚合酶和dNTP類將突出部分(overhang)的5’單鏈全部補齊的方法、使用具有3’外切酶活性的聚合酶將3’突出部分去除的方法。以防止片段彼此連接，進行平滑化處理時，優選預先利用例如T4激酶的3’磷酸酶活性將3’磷酸基轉化為羥基。可以通過連接預先將接頭303添加到所有的片段302上，使其與用于成環狀的接頭304接合，從而可以容易地合成環狀DNA305(3)。用于成環狀的接頭304可以使用質粒DNA。例如，使用適當的限制酶將質粒DNA的多克隆位點切斷，引入帶有接頭303的片段302。還可以通過大腸桿菌的轉化對引入的質粒進行擴增。然后，將引物DNA306雜交于環狀DNA305上(4)，利用具有鏈置換活性的聚合酶進行RCA反應(5)。作為可用于RCA反應的聚合酶，可以舉出phi29聚合酶、Bst聚合酶、Csa聚合酶、96_7聚合酶。這些聚合酶的最適反應溫度、條件各有不同，可以根據被雜交的引物序列的Tm值適當選擇。為了控制RCA產物307的大小，需要控制反應時間及反應溫度，選擇聚合酶。而且，例如非專利文獻3所公開那樣，通過預先將形成自環結構的堿基序列導入用于成環狀的接頭304中，則可以控制RCA產物307使其形成球形形狀。而且，作為形成自環結構的堿基序列，采用被稱為回文結構的回文狀堿基序列也是有效的。此外，還可以使用被稱為適體(aptamer)的自環結構。如果將如上所述基于自雜交形成高級結構的堿基序列導入接頭304，則長單鏈的RCA產物307將通過形成周期性縮短的結構而形成球形結構。與RCA產物的形狀成為不定形的情況相比，通過使其形狀呈球形，則容易根據固定區域的面積控制作為模板的DNA(RCA產物)的大小。非專利文獻3中公開了直徑為50~150nm的球形DNA的合成。
[0054]發明人等通過將10個到20個堿基長度的適體結構導入到500個堿基長度的質粒DNA中，并使用Csa聚合酶使其反應3個小時，得到了直徑為100~200nm的RCA產物。采用實施例2中所述 電子束光刻技術法，將經巰基末端修飾的寡DNA作為引物固定在形成于石英基板上的直徑為lOOnm、墊間間距為0.5 μ m的金墊基板上。將前述金墊基板放入含有規定量前述RCA產物、Csa聚合酶、反向引物、dNTP類的反應液中，首先于37 °C孵化10分鐘，進行以引物為起點的互補鏈合成后，將溫度上升到60°C進行3個小時擴增反應。通過洗滌去除未反應物后，將具有所合成DNA的互補鏈序列并以Cy3標記末端的熒光探針DNA雜交，通過熒光顯微鏡觀察后，確認金墊上已合成有擴增產物。確認到擴增產物的金墊比率為約70%。從而確認，能夠實現大約2.8百萬簇/mm2的簇密度。此外，根據實施例4中所述，所含熒光分子數與已知熒光珠的熒光強度比較來判斷，每墊的DNA分子數為每墊(每簇)至少合成約10，000分子的DNA。從而確認，能夠達到約10，000DNA分子/簇的DNA片段密度。
[0055]由上述實施例表明，通過RCA反應等合成大體積DNA作為模板DNA，并將大體積模板DNA固定在將引物固定于孤立區域的基體上進行擴增，能夠實現較高的簇密度和較高的每簇DNA片段密度。
[0056]實施例4
[0057]本實施例中，參考圖4對使用了本發明的核酸基板的核酸分析裝置的優選構成的一個例子進行說明。
[0058]本實施例的核酸分析裝置具備:向表面形成有多個孤立的核酸固定用微小區域的核酸基板供給大體積模板DNA的水溶液、洗滌液、核酸合成酶溶液、帶熒光標記的底物(dNTP)溶液的單元；用于控制大體積模板DNA的擴增反應的溫度調節單元；對核酸基板照射光的單元；對帶熒光標記的底物的熒光進行測定的發光檢測單元。更具體而言，將核酸基板401置于溫度調節板403上，在其上貼合設有流路404的流路形成部件402，從而形成反應室。流路形成部件402可以使用例如PDMS(Polydimethylsiloxane,聚二甲基硅氧烷)。注入口 714連接送液單元405,送液單元405中保管著反應和洗漆所需的全部藥液。
[0059]大體積模板DNA的水溶液、核酸合成用底物(dNTP)溶液、反向引物溶液、核酸合成酶溶液依次從送液單元405經由注入口 714、流路404被供給至固定有引物的核酸基板401。將溫度調節板403的溫度升至37°C后，在規定的時間內保持溫度恒定，進行以固定在基體上的引物為起點的互補鏈合成，保持時間優選為3分鐘到10分鐘左右。然后，將溫度調節板403的溫度升至60°C后，進行DNA的擴增反應。反應時間優選為2~7小時左右。DNA的擴增反應后，從送液單元405經由注入口 714、流路404供給洗滌液，所述洗滌液用于洗滌并除去未反應物、以引物為起點的延伸反應產物的互補鏈。
[0060]然后，進行測序反應，反復進行一堿基延伸反應和熒光檢測。作為測序反應，采取例如逐次反應方式時，作為帶熒光色素的核苷酸，可以使用非專利文獻4中公開的、在核糖的3’ OH位置上導入3’ -O-烯丙基作為保護基，并在嘧啶的5位位置或嘌呤的7位位置上介由烯丙基與熒光色素相結合的核苷酸。烯丙基通過光照射(例如波長355nm)或者與鈀接觸來切斷，因此能夠同時實現色素的淬滅與延伸反應的控制。
[0061]熒光測定如下實施。從激發多種熒光體的必要性和經濟性角度出發，優選使用氙燈作為光源407。通過準直透鏡408調整至平行光線后，通過濾光器713濾除激發中不需要且對熒光色素有損傷的那樣的近紫外光，通過分色鏡409引導至物鏡406，照射在核酸基板401上。標記在各堿基上的熒光色素分子發出的熒光與激發光沿著同軸光路逆向前進，通過物鏡406聚光后通過分色鏡409，通過成像透鏡711在二維CXD相機712的感光面上成像。激發光的散射光通過濾光器710而被濾除。為了識別4種堿基，需要識別并觀測4種熒光色素的熒光，但作為其方法之一，可以通過將分色鏡409設為具有適于各熒光色素的波長特性的4種鏡子，使它們保持在旋轉式鏡架上，以適合的角度進行旋轉，從而切換測定波長(熒光色素)。
[0062]如上所述，通過由 送液單元、溫度調節板、激發光源和熒光檢測單元組成核酸分析裝置，可以自動進行從試樣DNA在基體上的擴增反應到測序反應、測定，可以實現對現有技術的通量(through-put)的大幅改善。
[0063]關于本發明檢測裝置的性能所要求的每簇DNA分子數，采用所含熒光分子數已知的突光珠(Invitrogen公司制fIuospheres珠、直徑200nm、含1.1X IO5突光分子)，求算了信號噪聲比達10以上的條件下檢測所需要的熒光分子數。其結果表明，需要IXlO4分子以上。從而可知，為了在信號噪聲比達10以上的條件下檢測測序反應，需要每簇至少存在10，000分子，換算為擴增倍率，優選10，000倍以上的擴增率。
[0064]如實施例1中所述，采用本發明的擴增法能夠使每簇DNA片段數達到10，000分子，從而確認在信號噪聲比達10以上的條件下能夠檢測出測序反應。
[0065]實施例5
[0066]本實施例中，參考圖5對使用了本發明的核酸擴增方法的核酸分析方法的一個例子進行說明。特別是公開了正確求算特定位點具有變異的異常序列片段與不具有變異的正常序列片段的豐度的方法。本發明的核酸擴增方法中，可以在基板上的不同位置各固定一分子已片段化的試樣DNA并進 行擴增，因此能夠容易地檢測到其中包含的特定位點的突變，解析其豐度。
[0067]采用實施例1所記載的方法，在平滑基板501上形成解析對象核酸試樣的片段束(簇)502。然后，向核酸試樣片段束502供給具有截止到欲檢測變異位置的相鄰位置的堿基序列的引物503進行雜交。引物503末端修飾有熒光色素505。然后，供給具有各堿基所固有的熒光色素的雙脫氧核苷酸溶液后，添加DNA合成酶進行延伸反應。圖5中，正常序列導入雙脫氧鳥嘌呤(ddG)停止延伸反應，變異序列導入雙脫氧腺嘌呤(ddA)停止延伸反應。例如，雙脫氧鳥嘌呤上標記有Cy3，雙脫氧腺嘌呤上標記有Cy5。然后，使用普通的熒光顯微鏡向平滑基板501照射激發光，觀察熒光。可以根據熒光色素505的有無來判斷是否為含有變異解析對象堿基序列的片段。求出為熒光色素505的發光亮點且發出Cy3熒光的亮點數和為熒光色素505的發光亮點且發出Cy5熒光的亮點數，計算其比值，從而可以正確求算出試樣DNA中所含的正常序列與異常序列的比率。
[0068]附圖標記說明
[0069]101、301 試樣 DNA
[0070]102大體積DNA分子
[0071]103 基體
[0072]104,205 引物 DNA
[0073]105反向引物DNA
[0074]106延伸反應產物
[0075]201支撐基體
`[0076]202電子束用正型抗蝕劑
[0077]203粘接用墊
[0078]204官能團
[0079]206防止非特異吸附膜
[0080]302 片段
[0081]303 接頭
[0082]304用于成環狀的接頭
[0083]305 環狀 DNA
[0084]306 引物 DNA
[0085]307 RCA 產物
[0086]401核酸基板
[0087]402流路形成部件
[0088]403溫度調節板
[0089]404 流路
[0090]405送液單元
[0091]406 物鏡
[0092]407 光源
[0093]408準直透鏡
[0094]409分色鏡
[0095]410、413 濾光器[0096]411成像透鏡[0097]412 二維 CCD 相機
【權利要求】
1.一種核酸擴增方法,其特征在于，包含如下工序:在基體的表面配置固定有第一核酸的區域和未固定所述第一核酸的區域的工序；將同一鏈上具有至少兩個以上作為解析對象的堿基序列的第二核酸固定在固定有所述第一核酸的區域上的工序；以及進行所述第二核酸的擴增反應的工序。
2.—種核酸擴增方法,其特征在于,包含如下工序:在基體的表面配置固定有第一核酸的區域和未固定所述第一核酸的區域的工序；將同一鏈上具有至少兩個以上作為解析對象的堿基序列的第二核酸固定在固定有所述第一核酸的區域上的工序；以及供給第三核酸并以所述第一核酸及第三核酸為引物進行所述第二核酸的擴增反應的工序。
3.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，其特征在于，第二核酸的直徑的平均值大于固定有第一核酸的區域的直徑的平均值的1/2。
4.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，其特征在于，第二核酸為單鏈，且具有自退火結構。
5.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，其特征在于，包含在擴增反應后去除第一核酸的延伸反應產物的互補鏈的工序。
6.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，其特征在于，第二核酸是以具有解析對象堿基序列的環狀核酸為模板，在具有鏈置換活性的聚合酶作用下獲得的鏈置換延伸反應產物。
7.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，其特征在于，所述擴增反應為恒溫反應。
8.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，其特征在于，固定有所述第一核酸的區域的直徑的平均值為500nm以下，且各固定區域中所述第一核酸的分子數的平均值為10，000分子以上。
9.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，其特征在于，固定有所述第一核酸的各個區域中，所述第一核酸的固定密度為10，000分子/μπι2以上。
10.根據權利要求9所述的核酸擴增方法，其特征在于，所述固定密度為100，000分子/μ m2以上。
11.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，其特征在于，所述擴增反應的反應溫度為50°C~70°C之間的溫度。
12.根據權利要求1所述的核酸擴增方法，其特征在于，所述第二核酸是采用滾環擴增(RCA)反應合成的大體積核酸。
13.—種核酸分析方法,其特征在于,具有在進行權利要求1~12中任一項所述的核酸擴增方法之后，進行導入帶熒光標記堿基的延伸反應的單元和對所述熒光標記進行熒光檢測的單元。
14.一種核酸基板，在基體上固定有包含作為解析對象的堿基序列的核酸，其特征在于，固定有所述核酸的區域的直徑的平均值為500nm以下，且所述核酸的固定區域中的核酸的分子數的平均值為10，000分子以上。
15.一種核酸基板，其具有至少一個以上的流路，用于進行權利要求1所述的核酸擴增方法。
16.一種核酸分析裝置，其具有至少一個溫度調節裝置和送液機構，用于進行權利要求1所述的核酸擴增方法。
【文檔編號】C12N15/09GK103890161SQ201280052238
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年10月19日 優先權日:2011年10月31日
【發明者】齋藤俊郎, 杉村禎昭 申請人:株式會社日立高新技術