高濃度顆粒淀粉的液化和糖化的制作方法

高濃度顆粒淀粉的液化和糖化的制作方法
【專利摘要】本發明的教導內容提供加工包含高干固體含量的漿料中的顆粒淀粉的方法。使用酶在等于或低于糊化溫度下將所述漿料初始溫育。以特定劑量使用支鏈淀粉酶和葡糖淀粉酶，這允許在低能耗下提高葡萄糖產率。
【專利說明】高濃度顆粒淀粉的液化和糖化
[0001]相關專利申請的交叉引用
[0002]本專利申請要求提交于2011年9月29日的美國臨時申請N0.61/541，031的權益，該申請全文以引用方式并入。
【背景技術】
[0003]將不溶性顆粒淀粉轉化為葡萄糖或其他可溶性糊精是獲得最終產物和生物燃料行業的重要大規模工藝，所述最終產物例如糖甜味劑、專用糖漿、酶、蛋白質、醇(如，乙醇、丁醇)、有機酸(乳酸、琥珀酸、檸檬酸)和專用生物化學品例如氨基酸(賴氨酸、谷氨酸單鈉)和1，3-丙二醇。淀粉顆粒的部分晶體性質賦予其在冷水中的不溶性。淀粉顆粒在水中的增溶需要大量熱能來破壞晶體結構。用于溶解顆粒的水越多，則加熱水所需的能量越多。在后續的糖化之后，蒸發水也需要更多的能量。
[0004]可通過直接或間接加熱系統進行溶解，例如通過蒸汽噴射直接加熱。(參見例如Starch Chemistry and Technology, eds R.L.Whistler et al., 2nd Ed., 1984AcademicPress Inc., Orlando, FL (《淀粉化學和技術》，R.L.Whistler等人編輯，第2版，1984年，學術出版社公司，佛羅里達州奧蘭多)和Starch Conversion Technology, Eds.G.M.A.VanBeynum et al., Food Science and Technology Series, Marcel Dekker Inc., NY (《淀粉轉化技術》，G.M.A.Van Beynum等人編輯，“食品科學與技術系列”，馬塞爾.德克爾公司，紐約州))。典型的常規淀粉液化系統在高壓下將水性淀粉漿料遞送到直接蒸汽噴射蒸煮器，該蒸煮器使漿料溫度從約35 - 40°C升至107 - 110°C。漿料通常包含熱穩定α淀粉酶，在該情況下，調整PH以促 進α淀粉酶。濕磨得到的顆粒淀粉通常具有40至42%的干固體含量。在加熱至高于液化溫度之前，通常將濃度稀釋到32%至35%的干固體。如果沒有該稀釋和隨后粘度降低，高溫噴射蒸煮單元操作系統的進料泵就不能處理漿料。
[0005]上述常規工藝的替代形式已有所描述，其中粘度過大的問題通過使顆粒淀粉漿料加熱至不高于液化溫度而避免(參見，例如US7，618，795和US20050136525)。相反，顆粒淀粉通過低于液化溫度的酶水解而增溶。此類“低溫”系統能夠加工比常規系統更高濃度(如，最多至45%)的干固體已有所報道。然而，非蒸煮系統的缺點是在適當高溫下，相對長的溫育(約24小時或更長)對于基本上完全增溶是必需的。長時間溫育本身與高能耗相關。
[0006]由于顆粒淀粉加工是大規模進行，即使看似很小的效率提高也可具有很大的經濟優勢。然而，已對轉化工藝進行充分分析來識別和進行此類提高(參見，例如Martin&Brummat pp.45_77in “Starch Hydrolysis Products:Worldwide Technology, production andapplications New York, VCH Publishers, Inc.1992(Martin 和 Brumm,第 45 - 77 頁，《淀粉水解產物:世界技術、生產和應用》，紐約，VCH出版公司，1992年)和Luenser，Dev.1n Ind.Microbiol.24.79-96(1993) (Luenser,《工業微生物學發展》，第 24 卷，第 79 - 96 頁，1993年))。

【發明內容】
[0007]本發明提供加工顆粒淀粉的方法，所述方法包括:(a)使顆粒淀粉、水和一種或多種顆粒淀粉水解酶，包括α -淀粉酶和/或葡糖淀粉酶，接觸以生成漿料，所述顆粒淀粉水解酶包括α -淀粉酶和/或葡糖淀粉酶，其中干固體的濃度大于38重量％，(b)在高于40°C并且在等于或低于顆粒淀粉的糊化溫度的溫度下溫育漿料至少五分鐘，生成其中顆粒淀粉已通過一種或多種酶部分地水解為寡糖和/或單糖的組合物；以及(C)將部分地水解的組合物的溫度提升并保持高于顆粒淀粉的糊化溫度，生成液化組合物。
[0008]一些方法還包括(d)使液化組合物與支鏈淀粉酶和葡糖淀粉酶接觸并且溫育以生成葡萄糖。在一些方法中，在步驟(b)中溫育足夠長的時間，使得步驟(b)結束時不溶性干固體的濃度不超過38重量％。在一些方法中，2 - 30%的干固體在步驟(b)結束時是可溶的。在一些方法中，干固體的百分比在步驟(a) - (d)期間為至少39%。在一些方法中，干固體的濃度在步驟(a)_ (d)期間為39 - 45重量％。在一些方法中，干固體的百分比在步驟(a)和(d)之間保持相同或增加。在一些方法中，在步驟(b)、(c)和(d)期間向漿料加入不超過10重量％的水。在一些方法中，在步驟(b)、(c)和(d)期間不再向漿料加入水。在一些方法中，一種或多種酶包括α淀粉酶。在一些方法中，α淀粉酶是芽孢桿菌α淀粉酶。在
一些方法中，α 淀粉酶是 SPEZYMEk' ΑΑ、SPEZYME" XTRAu、SPEZYME? FRED,
GYZME? G997、TERMAMYL?、120-L、LC、SC、SUPRA 或Fuelzyme?。在一些方法中,
一種或多種酶包括至少兩種類型的α淀粉酶。在一些方法中，α淀粉酶是熱穩定的，并且在步驟(C)中保持活性。
[0009]在一些方法中，步驟(b)中的溫度為55 - 67°C。在一些方法中，在步驟(b)中的溫育達5分鐘至四小時。在一些方法中，步驟(c)的溫度為90-110°C。在一些方法中，組合物保持在90 - 110°C達5分鐘至4小時。在一些方法中，組合物保持在100- 110°C達5-20分鐘，并且保持在90 - 100°C達1- 2小時。在一些方法中，步驟(d)中支鏈淀粉酶與葡糖淀粉酶的比率按單位計為至少9:1。在一些方法中，步驟(d)在40 - 80°C的溫度下進行。在一些方法中，步驟(d)進行20 - 150小時。在一些方法中，葡萄糖的產率為至少95重量％的顆粒淀粉。在一些方法中，葡萄糖的產率為95 - 96重量％的顆粒淀粉。在一些方法中，一種或多種酶包括α-淀粉酶，并且方法還包括在步驟(c)之后使α淀粉酶失活。
[0010]在一些方法中，α淀粉酶的失活通過加熱或酸處理進行。在一些方法中，在步驟Ca)之后不添加酸或堿來改變pH。在一些方法中，在步驟(b)、(c)和(d)期間pH在4.9和
5.5之間。在一些方法中，在步驟(d)期間或之后進行不超過一次蒸發步驟，以濃縮葡萄糖。[0011 ] 在一些方法中，步驟(d)中的支鏈淀粉酶來自芽孢桿菌，并且葡糖淀粉酶來自黑曲霉或灰腐質霉。在一些方法中，支鏈淀粉酶和葡糖淀粉酶作為共混物被提供。
[0012]在一些方法中，顆粒淀粉通過濕磨制得。在一些方法中，顆粒淀粉是小麥、大麥、玉米、裸麥、稻米、高粱、豆類、木薯、粟、馬鈴薯、甘薯或木薯的顆粒淀粉。
[0013]在一些方法中，一種或多種酶是一種或多種α淀粉酶，并且方法還包括允許液化組合物冷卻，從而步驟(a)的一種或多種α淀粉酶或一種或多種新鮮α淀粉酶將液化組合物中的淀粉水解為寡糖，生成麥芽糖糊精組合物。在一些方法中，允許液化組合物冷卻包括在高于大氣溫度和低于步驟(c )溫度的溫度下溫育液化組合物。
[0014]在一些方法中，顆粒淀粉在一個溫度范圍糊化，并且步驟(b)中的溫度低于所述范圍的低限。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:本發明的淀粉液化工藝的流程圖比較
[0016]圖2:在60°C下干物質對不含添加α淀粉酶的漿料的影響。
[0017]圖3:使用45%干固體玉米淀粉底物時，顆粒淀粉的部分增溶和水解對糊化溫度下峰值粘度的影響。
[0018]定義
[0019]除非另外指明，否則所用的所有技術和科學術語在相關科學領域有其普遍含義。Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., JohnWiley and Sons, New York(1994) (Singleton等人，《微生物學和分子生物學詞典》,第2版，約翰威立父子出版公司，紐約，1994年)和Hale&Markham, Harper Collins Dictionaryof Biology, Harper Perennial, NY (1991) (Hale 和 Markham,《哈拍柯林斯生物學詞典》，哈珀永久出版社，紐約州，1991年)提供了描述本發明的多個術語的普遍含義。
[0020]“淀粉”是指包括植物的復合多糖碳水化合物的任何材料，所述復合多糖碳水化合物包括具有式(C6HltlO5) x的直鏈淀粉和/或支鏈淀粉，其中X為任何數字。具體地講，該術語指任何基于植物的材料，例如谷物、草、塊莖和根，更具體地講，指小麥、大麥、玉米、裸麥、稻米、高粱、豆類、木薯、粟、馬鈴薯、甘薯和木薯。
[0021]“顆粒淀粉” 是指未蒸煮的(生的)淀粉，其未進行糊化。
[0022]“淀粉糊化”是指淀粉分子增溶而形成粘性懸浮液。
[0023]“糊化溫度”是包含底物的淀粉糊化開始的最低溫度。糊化的確切溫度取決于具體的淀粉，并且可根據多個因素變化，例如植物物種以及環境和生長條件。多種顆粒淀粉的初始淀粉糊化溫度范圍可根據本文的工藝使用，其包括大麥(52 - 59 °C )、小麥(58 - 64°C)、裸麥(57 - 70°C)、玉米(62 - 72°C)、高直鏈淀粉玉米(67 - 80°C)、稻米(68 -77°0、高粱(68 - 77°0、馬鈴薯(58 - 68°0、木薯淀粉(59 - 69°0 和甘薯(58 - 72 °C)(Swinkels, pg.32-38in STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Eds Van Beynum et al., (1985)Marcel Dekker Inc.New York (Swinkels,第 32 - 38 頁，《淀粉轉化技術》，Van Beynum 等人編輯，1985年，馬塞爾?德克爾公司，紐約)和The Alcohol Textbook3.sup.rd ED.AReference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacqueset al., (1999)Nottingham University Press, UK (《醇教科書:飲料、燃料和工業酒精行業參考》，第3版增補，Jacques等人編輯，1999年，諾丁漢大學出版社，英國))。糊化涉及結晶區的熔化、分子的水合以及顆粒的不可逆溶脹。對于給定的顆粒，糊化溫度發生在一定范圍內，因為結晶區的大小和/或分子有序性或晶格完整程度不同。STARCH HYDROLYSISPRODUCTS Worldwide Technology,Production, and Applications(eds/Shenck andHebeda, VCH Publishers, Inc, New York, 1992) at p.26(《淀粉水解產物:世界技術、生產和應用》，Shenck和Hebeda編輯，VCH出版公司，紐約，1992年，第26頁)。
[0024]“DE”或“右旋糖當量”是總還原糖的濃度的行業標準，并且以按干重計的D-葡萄糖％表示。非水解的顆粒淀粉的DE幾乎為0，而D-葡萄糖的DE為100。
[0025]“葡萄糖漿”是指包含葡萄糖固體的水性組合物。葡萄糖漿具有大于20的DE。一些葡萄糖漿包含不超過21%的水和以右旋糖計算不少于25%的還原糖。一些葡萄糖漿包括至少90%的D-葡萄糖或至少95%的D-葡萄糖。有時術語葡萄糖和葡萄糖漿可互換使用。
[0026]“淀粉的水解”是加入水分子切割糖苷鍵。
[0027]“漿料”是水中包含不溶性淀粉顆粒的水性混合物。
[0028]術語“總糖含量”是指包括單糖、寡糖和多糖的淀粉組合物中存在的總糖含量。
[0029]術語“干固體”(ds)是指溶解于水的干固體、分散于水中的干固體或二者的組合。因此干固體包括顆粒淀粉及其水解產物，包括葡萄糖。
[0030]“干固體”含量是指相對于其中分散和/或溶解干固體的水的以重量百分比計溶解的和分散的干固體的百分比。初始干固體含量為根據含水量折算的顆粒淀粉的重量除以顆粒淀粉的重量加上水的重量。后續的干固體含量可由針對任何加入或損失的水和化學增益而調整的初始含量確定。后續的溶解干固體含量可由如下所示的折射率測量。
[0031 ] 術語“高DS”是指包含的干固體大于干固體加上水的38重量％的水性淀粉漿料。
[0032]“干物質淀粉”是指顆粒淀粉的干淀粉含量，并且可通過顆粒淀粉的質量減去水的任何貢獻而確定。例如，如果顆粒淀粉具有20%的水含量，則IOOkg顆粒淀粉具有80kg的干淀粉含量。干物質淀粉可用于確定要使用的酶單位數。
[0033]“折射率干物質”(RIDS)是在已知DE、在控制溫度下測定淀粉溶液的折射率，然后使用適當的關系，例如玉米提煉協會關鍵數據表(Critical Data Tables of the CornRefiners Association),將 RI 轉換為干物質。
[0034]“聚合度(DP)”是指給定糖中脫水吡喃葡糖單位的數目(n)。DPI的實例是單糖，如葡萄糖和果糖。DP2的實例是二糖，如麥芽糖和蔗糖。DP4+ODP3)表示聚合度大于3的聚合物。
[0035]“接觸”是指一種或多種酶和/或其他反應組分足夠接近底物放置，使酶能夠將底物轉化為最終產物。可通過酶溶液與各自的底物組合或混合而實現接觸。
[0036]“酶活性”是指酶對其底物的作用。
[0037]“淀粉的水解”是指加入水分子切割糖苷鍵。
[0038]“ α -淀粉酶(E.C.分類3.2.1.1) ”是催化α -1, 4_糖苷鍵水解的酶。這些酶也被描述成在含有1，4- α -連接的D-葡萄糖單位的多糖中實現1，4- a -D-糖苷鍵的外切水解或內切水解的酶。用于描述這些酶的另一術語是糖原酶。示例性的酶包括α-1，4_葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α -1, 4-glucan4-glucanohydrase glucanohydrolase)。
[0039]“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶類的酶(EC.3.2.1.3、葡糖淀粉酶、α -1, 4_D_葡聚糖葡糖水解酶)，該酶從淀粉的非還原末端連續移除葡萄糖單元。該酶可同時水解淀粉的直鏈和支鏈糖苷鍵，即可同時水解直鏈淀粉和支鏈淀粉。該酶還水解α -1，6和α -1, 3_鍵，但速率比水解α-1，4_鍵慢得多。
[0040]“支鏈淀粉酶”也稱為脫支酶(E.C.3.2.1.41、支鏈淀粉6_葡聚糖水解酶)，能夠水解支鏈淀粉分子中的α-1,6-糖苷鍵。
[0041]“淀粉酶活性單位”(LU)是使碘溶液產生顏色變化所需的消化時間的量度，其指示實例I的淀粉底物在特定條件下糊精化的確切階段(參見，例如US5，756，714)。
[0042]“最終產物”是任何碳源來源分子產物，其從顆粒淀粉底物酶促轉化。優選地，最終產物是葡萄糖或葡萄糖漿。葡萄糖可用作其他所需最終產物的前體。[0043]“產率”是指所需一種或多種最終產物(如，葡萄糖)的量與起始顆粒淀粉的干重的百分比。
[0044]可通過使用算法，例如威斯康星遺傳學軟件包7.0版(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release7.0)(威斯康星州麥迪遜市575科學大道的遺傳學計算機小組(Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison, WI))中的 BESTFIT、FASTA 和TFASTA，使用默認空位參數，或通過檢測和最佳比對(即，生成序列相似性與比較窗口的最高百分比)來比對序列而確定序列同一性。序列同一性的百分比通過如下方法計算:比較兩個最佳比對序列除以較短序列(如果長度不相等)的長度，確定相同殘基在兩個序列中出現的位置數，得到匹配位置數，將匹配位置數除以匹配和不匹配位置的總數，不計算空位，將結果乘以100得到序列同一性的百分比。
[0045]術語“包含”及其同源詞以其包括性的含義使用；也就是說，與術語“包括”及其相應的同源詞等同。
[0046]數值范圍包括限定該范圍的數值。還列出了一些優選的子范圍，但在任何情況下，提及范圍包括該范圍內包括的整數限定的所有子范圍。
【具體實施方式】
[0047]1.概沭
[0048]本發明提供加工顆粒淀粉的方法。本發明部分地基于如下結果:使用一種或多種顆粒淀粉水解酶在相對低的溫度下預處理顆粒淀粉，所述預處理基本上減少了后續的粘度和膨脹性(剪切增稠) ，當溫度隨后升高至高于糊化溫度時，顆粒淀粉增溶而變得液化。與常規工藝相比，預處理產生顯著更多的溶解顆粒淀粉，其中在加入酶后，顆粒淀粉的溫度立即升高至高于糊化溫度。然而，與在低溫下進行的工藝完全不同的是，預處理留下很多不溶解的顆粒淀粉。雖然溶解的固體的最終量保持未變，但可獲得非常顯著的降低的粘度。即使少量預處理也允許在高于38%干固體的初始濃度下使用通用行業設備來加工顆粒淀粉。因此，通過本發明的方法，在40 - 42%干固體的典型濃度下，可在常規設備上加工從濕磨機接收的顆粒淀粉，而不必首先稀釋。在增加濃度下進行加工，這減少了水量、熱能以及加工給定量顆粒淀粉所需的試劑。對于顆粒淀粉的大規模加工，這些節省具有很大的現實意義。本發明的方法可加工的高濃度淀粉對于下游糖化也具有優勢，因為可通過較少的加工(如，蒸發步驟)獲得相同或更高的葡萄糖產率。使用支鏈淀粉酶和葡糖淀粉酶的適當共混物，可由高于38%的干固體的初始濃度實現95%或更高的葡萄糖產率。
[0049]I1.原料
[0050]加工所用的原料是顆粒淀粉。包含顆粒淀粉的植物材料可以得自以下來源:例如小麥、玉米、裸麥、高粱(蜀黍)、稻米、粟、大麥、黑小麥、木薯(木薯淀粉)、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆類例如大豆和豌豆。優選的植物材料包括玉米、大麥、小麥、稻米、蜀黍以及它們的組合。植物材料可包括雜交品種和基因修飾品種(如包含異源基因的轉基因玉米、大麥或大豆)。植物的任何部分均可用作植物材料，包括例如葉、莖、殼、皮、塊莖、穗軸、谷粒等的植物部分。全谷物也可用作顆粒淀粉的來源。優選的全谷物包括玉米、小麥、裸麥、大麥、高粱以及它們的組合。優選地通過技術例如研磨(如錘磨或輥磨)、乳化技術、旋轉脈動、分餾等減小全谷物的粒度。[0051]優選地通過濕磨玉米產生顆粒淀粉。典型的濕磨工藝始于干玉米粒，其經檢查和清潔，移除了穗軸、谷殼和其他殘渣。然后將玉米浸泡于含少量二氧化硫和乳酸的大槽中。這兩種化學品在溫水中經過24 - 48小時的浸泡時間幫助軟化玉米粒。在此期間，玉米溶脹并且軟化，弱酸條件解開了谷蛋白鍵以釋放出淀粉。在浸泡之后，對玉米進行粗磨，使粗磨玉米和一些浸潰水通過分離器，其基本上允許微生物或輕質含油部分懸浮于混合物的頂部，并且被移除。纖維材料被篩出，然后使用大型離心機按密度分離顆粒淀粉和蛋白質。通常以按干重計約40 - 42%顆粒淀粉的濃度提供顆粒淀粉。可按照如下工藝原樣使用濃度，或可通過稀釋或過濾離心調整濃度，得到按干重計超過38%的任何所需濃度。
[0052]顆粒淀粉還包括來自干磨機的谷物粉,包括研磨全谷物或通過移除非淀粉級分例如果皮和微生物和蛋白質而純化的各種級分。
[0053]HL轉化工藝[0054]通過使顆粒淀粉、水和一種或多種顆粒淀粉水解酶接觸而形成漿料。漿料的組分可以任何順序組合。優選地，水和顆粒淀粉首先組合，然后加入酶。水通常為普通自來水，但可以是任何類型的水(如，直接來自天然來源的水、循環水例如蒸發冷凝水或蒸餾水)。水可加熱到等于或接近預期溫育溫度，或在等于任何其他溫度(如，大氣溫度)下來供應水，在該情況下，可供應熱量，以使漿料達到預期溫育溫度。如按重量計與水的重量相比小于1:100的少量添加劑，例如酸、堿、鹽或其他賦形劑，可組合到漿料中，以調整pH或者提高酶活性。此類組分可以作為水的組分添加或者組合到漿料中。pH優選地在4-6.5，更優選地在4.9-5.5的范圍內。
[0055]當顆粒淀粉首先組合到漿料中時，以干固體重量:水加上漿料中的干固體的重量測得的顆粒淀粉的濃度大于38%。在此處，如本專利申請別處所用，根據其含水量(通常為約11%)來折算引入漿料的顆粒淀粉的實際重量。例如，如果45g具有含水量的顆粒淀粉與55g水混合，則干固體的濃度為45X0.89/100=40.05%。對除水之外的顆粒淀粉的任何非碳水化合物組分的干固體百分比的計算沒有進行修正。雖然可存在一些蛋白質和脂質，但其重量與碳水化合物的重量相比可忽略不計。
[0056]任選地，按干固體百分比計的顆粒淀粉的初始濃度為至少38.5、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50%，任選地還小于65%、60%、55%或50%，包括上限和下限的所有排列。例如，初始濃度有時為 39 - 50%,39 - 45%,40 - 50% 或 40 - 45% 或 41 - 50% 或 41 - 45%或 42 - 50% 或 42 - 45%ο 優選地，初始濃度為 38.5 - 42,38.5 - 43,39 - 42,39 - 43。酶或漿料的任何其他微量組分的重量通常可忽略不計，并且在確定按水的重量計的顆粒淀粉的百分比時不需要予以考慮。最初，基本上無顆粒淀粉溶解于水中。但隨著顆粒淀粉加工酶作用于顆粒淀粉，淀粉部分地水解為單糖和寡糖。單糖和寡糖是水溶性的并且溶解。
[0057]酶的量取決于酶的類型及其活性。通常，將含量為約0.01至5.0kg的熱穩定α淀粉酶添加到公噸(MT)原料干固體，優選地約0.5至2.0kg干固體或約0.1至1.0kg干固體。如果使用的話，則可以與α淀粉酶所述相同的重量范圍提供葡糖淀粉酶。例如，通常將含量在約0.01至1.0kg之間的SPEZYME? XTRA和SPEZYME? FRED (丹尼斯克.杰
能科(Danisco-Genencor))或其變體添加到公噸淀粉干固體。例如，可以按每公噸淀粉干固體約0.05至1.0kg之間的干固體、約0.1至0.6kg之間的干燥固體、約0.2至0.6kg之間和約0.4至0.6kg之間的SPEZYME? XTRA和SPEZYME? FRED的量來添加所述酶。
[0058]可對漿料進行攪拌，以增加水中顆粒淀粉的分散度，并且促進顆粒淀粉加工酶的作用。
[0059]選擇漿料溫育的溫度，以促進顆粒淀粉加工酶在部分水解顆粒淀粉時的活性，但如果存在除水解產物溶解之外的顆粒淀粉的液化，則結果不顯著。這可通過使用高于室溫的溫度，通常高于40°C，并且基本上不高于顆粒淀粉的液化溫度來實現。優選地，溫度高于40°C并且等于或低于顆粒淀粉的糊化溫度。顆粒淀粉的糊化溫度可根據制備和來源而變化，但通常在52 - 80°C的范圍內。對于多個給定原料，糊化溫度可以表示為52 - 80°C內的子范圍(參見定義中提供的示例性范圍)。在這種情況下，溫育溫度優選地等于或低于子范圍的下限，或可等于或低于子范圍的中點或上限。優選地，溫育溫度低于溫度范圍的下限，其中針對給定來源的顆粒淀粉發生糊化。
[0060]具有顆粒淀粉水解活性的一種或多種酶包括α -淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。包括α-淀粉酶是優選的。如果轉化為麥芽糖糊精是所需的，則優選地不使用除α淀粉酶之外的酶。α淀粉酶優選地是熱穩定的，使得其在漿料的溫度升高至高于糊化溫度時保持活性。一種或多種酶可包括相同類型的兩種酶(如，兩種不同來源的α-淀粉酶)，在這種情況下，按質量或單位計添加的酶量適用于酶的共混。如果存在不止一種具有顆粒淀粉加工活性的酶，則酶可以共混物形式提供或單獨提供。
[0061]如此溫育漿料的周期可取決于顆粒淀粉的濃度和酶的活性以及其他因素。其他情況相等時，顆粒淀粉越濃，則時間越長，而酶活性越大，則時間越短。酶活性繼而依賴于組合到漿料中的酶的量和類型以及溫育溫度。溫育的目的是獲得顆粒淀粉的足夠的部分水解和溶解，使得在無需無用的粘度增加的情況下即可液化漿料。然而，該階段的過度溫育和部分水解則是不必要的，因為 當溫度升高超過糊化溫度時，在后續步驟中會發生進一步水解和溶解。溫育優選地在所用條件下進行足夠長的時間，使得在以水的重量加上初始提供的顆粒淀粉的重量的百分比表示的溫育條件下，剩余的不溶于水的淀粉濃度不超過38重量％。或者，溫育可進行足夠長的時間，使得至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20%，以及任選地最多至25%、30%、40%或50%的顆粒淀粉干固體在溫育條件下具有水溶性，包括上限和下限的所有排列。優選地，在溫育條件下，溫育提供2 - 30或5 - 30重量％的可溶性顆粒淀粉。
[0062]周期通常為至少五分鐘，典型地5分鐘至4小時。例如，漿料可溫育至少10、20、30,60,120或180分鐘，并且不超過4小時。漿料有時溫育10分鐘至2小時或20分鐘至I或2小時或30分鐘至I或2小時。溫育也可進行更長時間，如最多至24小時或最多至48小時。
[0063]在顆粒淀粉進行足夠的部分水解和溶解之后，所得的部分水解組合物的溫度升高并且保持高于顆粒淀粉的糊化溫度。對于其中糊化溫度以范圍(參見上文)表示的給定來源，溫度優選地保持高于范圍的上限，但也可保持高于范圍的中點。可通過直接或間接加熱來提升溫度，例如使組合物流過加熱線圈或通過蒸汽噴射。該步驟中所用的溫度反映了多個考慮因素的平衡。溫度越高，顆粒淀粉液化越迅速。然而，優選的是，溫度不高至使顆粒淀粉水解活性完全失活。高于糊化溫度的淀粉水解有時稱為糊精化。
[0064]熱穩定α淀粉酶可在該步驟中通過適當溫度選擇來保持活性。因此，例如通常將溫度升高并且保持在至少80°C，更優選地至少90°C，但通常不超過120或110°C的溫度下，持續至少5、10、30或60分鐘，并且通常不超過3或4小時的時段。例如，可將溫度升高并且保持在90- 110°C的范圍內，持續5分鐘至4小時、5- 120分鐘、5-60分鐘、10- 180分鐘、10 - 120分鐘、10 - 60分鐘、20 - 180分鐘、20 - 120分鐘或20 - 60分鐘的時段。有時，將溫度升高并且保持在100 - 110°C，持續5-20分鐘，然后降至90 - 100°C，持續60 - 120分鐘。在該步驟中，顆粒淀粉繼續由一種或多種酶部分地水解，假設酶仍然保持活性，并且還通過溶于水而被直接液化。無需預先水解的直接液化可一定程度地增加組合物的粘度。然而，由于液化之前通過酶進行了預先溫育，所以粘度增加不超出可控水平。[0065]溫育優選地繼續直到顆粒淀粉基本上或完全被液化(如，至少95、96、97、98、98.5或優選地99%液化)。
[0066]后續加工取決于所需產物。如果要生產麥芽糖糊精組合物，則允許液化組合物冷卻，并且任選地保持在用于液化的溫度和大氣溫度之間的溫度下。在該溫度下的溫育允許α -淀粉酶介導的進一步水解。α -淀粉酶可以是初始供應的酶(如果仍然有活性)，和/或可以是新鮮供應的酶。生成的麥芽糖糊精具有約3 - 19個葡萄糖單元的單體含量和3 - 20的DE值。可通過蒸發為干粉末來分離麥芽糖糊精。麥芽糖糊精在多種加工的食品中用作添加劑。
[0067]或者，如果要生產葡萄糖，則可使液化的組合物中任何剩余α -淀粉酶失活，因為由α淀粉酶作用而產生的寡糖與較長的淀粉分子相比，受葡糖淀粉酶作用的影響較少。可通過將溫度升至超過1101:或通過在低溫下酸處理(如，在951:下將pH降至4.2持續30分鐘)來進行去活。
[0068]允許所得組合物在剩余α淀粉酶活性失活或不失活的情況下冷卻，并且與新鮮酶混合，使現在液化的淀粉完全水解為葡萄糖。任選地，可將pH調整為適用于這些酶。5.5至6的pH對于一些酶是優選的。與組合物混合的酶包括至少支鏈淀粉酶和葡糖淀粉酶。兩種酶優選地以支鏈淀粉酶與葡糖淀粉酶按單位計至少9:1的比率存在。比率可以為例如在以葡糖淀粉酶與支鏈淀粉酶按單位計1:9和1:50之間，例如在1:9和1:20或1:9和1:15之間。優選地以至少0.08GAU/g干物質淀粉(gdss)固體，例如在0.08 - 0.14GAU/gdss的范圍內添加葡糖淀粉酶。由GAU單位乘以反映所需比率的因子(如1:9比率的因子為9)來計算支鏈淀粉酶單位。在從高于液化溫度冷卻后，組合物在適于酶活性的溫度下溫育，通常為40 - 800C >50 - 70°C或優選地55 - 60°C。繼續溫育，直到按起始顆粒淀粉的重量百分比計，葡萄糖產率為至少90%，并且優選地至少93%或至少95%或超過95%。產率優選地為93 - 96% (或更高)，有時為95 - 96%。實現此類產率的溫育時間可變化，如至少5、20或20小時和最多100或150小時。
[0069]在獲得令人滿意的葡萄糖產率之后，可通過蒸發水來增加葡萄糖漿的濃度。由于初始使用的是較高濃度的顆粒淀粉，葡萄糖漿的干固體的濃度通常也高于前述方法中的濃度。結果，可通過不超過一個蒸發步驟來獲得足夠濃度的葡萄糖漿。
[0070]上述生成葡萄糖的工藝可概念化為四個步驟，其涉及形成漿料，使用一種或多種酶在相對低的溫度下部分地水解漿料的顆粒淀粉，升高溫度使顆粒淀粉液化，然后提供新鮮酶并且完成淀粉至葡萄糖的轉化。如上所述，顆粒淀粉的初始濃度可高于38%干重。然后，顆粒淀粉及其寡糖和單糖水解產物(總稱為干固體)的濃度在上述步驟期間可保持高于38%，而不存在無法控制的粘度增加。事實上，干固體的百分比可增加，因為一些水通過水解過程化學結合到固體(稱為化學增益)和/或由于水通過蒸發損失。在一些方法中，干固體的百分比在上述步驟期間大于38、38.5、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50%。在一些此類方法中，干固體的百分比在上述步驟期間不超過65、60、55或50%。在一些方法中，干固體的百分比為至少38.5、39、40、41、42、43或44并且不超過45、50或55%，包括上限和下限的所有排列。優選地，干固體的百分比在上述步驟期間為38.5 - 45%或39 - 45%。可能的例外是加入少量酸或堿來調整PH，通常在上述步驟期間不必加入大量的水(如，聚集增加大于10重量％已經存在的水)。在一些方法中，在形成漿料之后不加入水。
[0071]因此，總體效率可超過那些常規工藝的效率，通過使濃度不超過38重量％的顆粒淀粉或通過不使顆粒淀粉加熱到高于其糊化溫度來避免無法控制的粘度，在該情況下，需要使用顆粒加工酶進行時間較長效率較低的溫育。
[0072]圖1是本發明方法的示例性實施例與前述報道的非蒸煮方法水解顆粒淀粉的比較。在每種情況下，使用具有顆粒淀粉水解活性的酶在低于液化溫度的中等溫度(即，55 -65°C)下溫育溶于水的顆粒淀粉的初始漿料。然而，根據本發明方法的溫育時間短得多(如，與20 - 120小時相比，縮 短為5分鐘至4小時)。在本發明的方法中，溫育可使2 - 30%的顆粒淀粉在5分鐘至4小時內液化。低溫方法根據溫育的時間長度產生2 - 100%的液化，對于接近100%的溶解度，則需要約120小時的溫育。
[0073]在非蒸煮方法中，通過離心和過濾來移除殘余的未溶解淀粉。可通過工藝對未溶解的顆粒淀粉進行再次循環處理。對液化淀粉進行糖化。在本發明的方法中，隨后將中等溫度溫育產生的組合物的溫度升至高于液化溫度，初始為103 - 110°C，然后為95°C。加熱液化了顆粒淀粉。如果存在熱穩定α-淀粉酶，則它繼續水解顆粒淀粉。然后對溶解的顆粒淀粉進行糖化。
[0074]IV.具有顆粒淀粉水解活性的酶
[0075]具有顆粒淀粉水解活性的酶(GSHE)能夠水解顆粒淀粉。此類酶可從真菌、細菌和植物細胞，例如芽孢桿菌(Bacillus sp)、青霉(Penicillium sp.)、腐質霉(Humicolasp.)、木霉(Trichoderma sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucor sp.)和根霉(Rhizopus sp.)獲得。這些酶包括具有葡糖淀粉酶活性和/或α _淀粉酶活性的酶(參見，Tosi et al, (1993) Can.J.Microbiol.39:846-855 (Tosi 等人，1993 年，《加拿大微生物學雜志》，第39卷，第846 - 855頁))。
[0076]優選地，用于本發明方法的GSHE包括至少一種α淀粉酶。α淀粉酶是E.C.編號為E.C.3.2.1.1-3尤其是E.C.3.2.1.1的微生物酶。優選地，α淀粉酶是熱穩定α淀粉酶。合適的α淀粉酶可以是天然存在的以及重組的和突變的α淀粉酶。任選地，α淀粉酶來源于芽孢桿菌屬菌種。優選的芽孢桿菌屬菌種包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(B.stearothermophilus)、遲緩芽抱桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)>凝結芽孢桿菌(B.coagulans)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) (USP5, 763，385、USP5, 824，532、USP5, 958，739、USP6, 008，026和USP6，361，809)。特別優選的α淀粉酶來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的芽孢桿菌菌株。一些優選的菌株包括ATCC39709、ATCCl 1945、ATCC6598、ATCC6634、ATCC8480、ATCC9945A 和 NCIB8059。
[0077]具有α-淀粉酶活性的GSHE的另一個例子來源于曲霉菌株，例如泡盛曲霉(A.awamori)、黑曲霉、米曲霉(A.0ryzae)或白曲霉(A.kawachi)菌株，尤其是白曲霉菌株。任選地，來源于白曲霉的具有GSHE活性的酶與W005/118800和W005/003311的SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。
[0078]適用于本發明方法的市售α淀粉酶包括SPEZYMEx ΑΑ、SPEZYME" XTRA,
SPEZYME" FRED(酸穩定、低Ca、熱穩定，來源于地衣芽孢桿菌)、GZYME?G997(熱穩定、非基因修飾)(丹尼斯克的杰能科部門(Genencor A Danisco Division)^PTERMAMYLTM120-L、LC、SC和SUPRA地衣芽孢桿菌耐熱α淀粉酶(諾維信(Novozymes))和FUELZYME"' LF(熱穩定)(范恩尼姆(Verenium))。
[0079]作為另外一種選擇或除此之外，可使用具有葡糖淀粉酶活性的GSHE。一種此類酶來源于灰腐質霉菌株，尤其是灰腐質霉高溫變種(Humicola grisea var.thermo idea)菌株(參見，USP4, 618，579)。任選地，來源于腐質霉的具有GSH活性的酶與W005/052148的SEQID NO: 3的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。具有葡糖淀粉酶活性的GSHE的另一個例子來源于泡盛曲霉菌株，尤其是泡盛曲霉河內變種(A.awamori var.kawachi)菌株。任選地,來源于泡盛曲霉河內變種的具有GSH活性的酶與 W005/052148 的 SEQ ID NO: 6 的氨基酸序列具有至少 85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。具有葡糖淀粉酶活性的GSHE的另一個例子來源于根霉菌株，例如雪白根霉(R.niveus)或米根霉(R.0ryzae)。來源于清酒曲菌株雪白根霉的酶以商品名“CUC0NC”銷售，或來源于根霉的酶以商品名GLUZYME銷售。另一個可用的具有葡糖淀粉酶活性的 GSHE 是 SPIRIZYME?Plus (諾維信(Novozymes Α/S))。
[0080]具有葡糖淀粉酶活性的米根霉GSHE在Ashikari et al., (1986)Agric.Biol.Chem.50:957-964 (Ashikari等人，1986年，《農業生物學和化學》，第50卷，第957 - 964頁)和USP4，863，864中有所描述。包括葡糖淀粉酶和增強活性的灰腐質霉GSHE混合物在Allison et al., (1992) Curr.Genet.21:225_229(Allison 等人，1992 年，《當代遺傳學》，第21卷，第225 - 229頁);W005/052148和歐洲專利N0.171218中有所描述。泡盛曲霉河內變種 GSHE 在 Hayashida et al., (1989) Agric.Biol.Chem53:923-929 (Hayashida 等人，1989年，《農業生物學和化學》，第53卷,第923 - 929頁)中有所描述。Aspergillus shirousami葡糖淀粉酶 GSHE 在 Shibuya et al., (1990) Agric.Biol.Chem.54:1905-1914 (Shibuya 等人，1990年，《農業生物學和化學》，第54卷，第1905 - 1914頁)中有所描述。
[0081]具有GSHE活性的酶還包括雜交酶，例如包含α -淀粉酶的催化結構域例如黑曲霉α-淀粉酶、米曲霉α-淀粉酶或白曲霉α-淀粉酶的催化結構域和不同真菌α -淀粉酶或葡糖淀粉酶的淀粉結合域例如白曲霉或灰腐質霉淀粉結合域的雜交酶。或者，具有GSHE活性的雜交酶可包括葡糖淀粉酶的催化結構域例如曲霉、籃狀菌(Talaromyces sp.)、蜀葵(Althea sp.)、木霉或根霉的催化結構域和不同葡糖淀粉酶或α -淀粉酶的淀粉結合域。具有 GSH 活性的其他雜交酶在 W005/003311、W005/045018 ;Shibuya et al., (1992) Biosc1.Biotech.Biochem56:1674-1675(Shibuya等人，1992年，《生物科學、生物技術和生物化學》，第 56 卷，第 1674 - 1675 頁)和 Cornett et al., (2003) Protein Engineeringl6:521-520(Cornett等人，2003年，《蛋白質工程》，第16卷，第521 - 520頁)中有所公開。
[0082]V.糖化酶[0083]A.葡糖淀粉酶
[0084]一種或多種葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3.)可用作糖化酶(以及或代替用作液化酶)。相同的或不同的葡糖淀粉酶可用于作為液化的糖化。然而，對于液化，葡糖淀粉酶應對顆粒淀粉有活性，對于糖化，葡糖淀粉酶應對溶解的淀粉有活性。用于糖化的葡糖淀粉酶不需要對顆粒淀粉有活性。合適的葡糖淀粉酶包括由細菌、植物和/或真菌內源性表達的那些以及與宿主細胞(如，細菌、植物和/或真菌)異源的重組表達的葡糖淀粉酶。重組表達的葡糖淀粉酶可以是天然序列、突變序列或雜交序列。絲狀真菌和酵母的多個菌株產生合適的葡糖淀粉酶。例如，可使用曲霉和木霉菌株產生的市售葡糖淀粉酶。雜交葡糖淀粉酶包括例如具有來自一個生物體的GA (如，籃狀菌GA)的催化結構域和來自不同生物體(如，木霉GA)的淀粉結合域(SBD)的葡糖淀粉酶。接頭可包括在淀粉結合域(SBD)或催化結構域中。
[0085]可使用的葡糖淀粉酶的例子包括黑曲霉Gl和G2葡糖淀粉酶(參見如Boel etal., (1984)EMBO J.3:1097 - 1102 (Boel等人，1984年，《歐洲分子生物學組織雜志》，第 3 卷，第 1097 - 1102 頁)；W092/00381、W000/04136 和 USP6, 352，851);泡盛曲霉葡糖淀粉酶(參見如W084/02921);米曲霉葡糖淀粉酶(參見如Hata et.al.，(1991)Agric.Biol.Chem.55:941-949 (Hata等人，1991年，《農業生物學和化學》，第55卷，第941 - 949頁))和 Aspergillus shirousami (參見如 Chen et.al., (1996)Prot.Eng.9:499-505(Chen 等人，1996 年，《蛋白質工程》，第 9 卷，第 499 - 505 頁)；Chen et al.(1995)Prot.Eng.8:575-582 (Chen等人，1995年，《蛋白質工程》，第8卷，第575 - 582頁)；和Chen etal., (1994)Biochem J.302:275-281 (Chen 等人，1994 年，《生物化學雜志》，第 302 卷，第275 - 281頁))。[083]。可使用的其他葡糖淀粉酶包括來自籃狀菌菌株(如，埃默森籃狀菌(T.emersonii)> T.leycettanus、T.duponti 和嗜熱籃狀菌(T.thermophilus)葡糖淀粉酶(參見如 W099/28488 ；USP N0.RE:32, 153 ；USP N0.4，587，215));木霉菌株(如，里氏木酶(T.reesei))，以及與 美國專利公開N0.2006-0094080中公開的SEQ ID N0:4具有至少約80%、約85%、約90%和約95%序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉菌株(如，雪白根霉和米根霉)；毛霉菌株和腐質霉菌株(如，灰腐質霉(參見如Boel et al., (1984)EMBO J.3:1097-1102(Boel等人，1984年，《歐洲分子生物學組織雜志》，第3卷，第1097 - 1102頁);W092/00381 ；W000/04136 ；Chen et al., (1996)Prot.Eng.9:499_505(Chen等人，1996年，《蛋白質工程》，第 9 卷，第 499 - 505 頁);Taylor.et al., (1978) Carbohydrate Res.61:301-308(Taylor 等人，1978 年，《碳水化合物研究》，第 61 卷，第 301 - 308 頁);USP.4，514，496 ；USP4, 092，434 ；USP4, 618, 579 Jensen et al., (1988)Can.J.Microbiol.34:218 - 223 (Jensen 等人，1988年，《加拿大微生物學雜志》，第34卷，第218 - 223頁)和W02005/052148的SEQID NO: 3))。任選地，葡糖淀粉酶與W005/052148的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少約85%、約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%和約99%的序列同一性。可使用的其他葡糖淀粉酶包括得自羅氏阿太菌(Athelia rolfsii)及其變體(參見如W004/111218)和青霉(參見如產黃青霉(Penicillium chrysogenum))的那些以及根霉產生的三種形式的葡糖淀粉酶，即 “Glucl” (MW74, 000)、“Gluc2” (MW58, 600)和 “Gluc3” (MW61, 400)。用于本發明方
法的市售葡糖淀粉酶包括例如DISTILLASE? L-400、OPTIDEX? L-400和G ZYME?G9904X、GC480、G-ZYME480 (丹尼斯克美國公司，杰能科部門(Danisco US, Inc, GenencorDivision))、CU.CONC?(日本新日化公司(Shin Nihon Chemicals, Japan))、GLUCZYME (來自雪白根霉的清酒曲培養小麥麩皮的提取物)(日本天野制藥公司(AmanoPharmaceuticals, Japan))(參見如 Takahashi et al., (1985) J.Biochem.98:663-671(Takahashi等人，1985年，《生物化學雜志》，第98卷，第663 - 671頁))。
[0086]B.支鏈淀粉酶
[0087]這些酶通常由芽孢桿菌菌種分泌。例如Bacillus deramificans (美國專利N0.5, 817, 498 ;1998 年)、嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(Bacillus acidopullulyticus)(歐洲專利N0.0063909)和長野芽抱桿菌(Bacillus naganoensis)(美國專利 N0.5，055，403)。商用
的具有支鏈淀粉酶活性的酶產生自例如芽孢桿菌菌種(商品名GP了IlVIA^x L-1000,來自
丹尼斯克?杰能科(Danisco-Genencor)的酸穩定支鏈淀粉酶和來自諾維信(Novozymes)的嗜酸普魯蘭芽胞桿菌Promozyme?支鏈淀粉酶)。巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)淀粉酶/轉移酶(BMA):巨大芽胞桿菌淀粉酶能夠將支鏈糖類轉化為易被葡糖淀粉酶水解的形式(Hebeda et al., Starch/Starke, 40, 33-36 (1988) (Hebeda 等人,《淀粉與淀粉糖》,第40卷，第33 - 36頁，1988年))。該酶在ρΗ5.5和75°C的溫度下表現出最大活性(David etal., Starch/Starke, 39436-440 (1987) (David 等人,《淀粉與淀粉糖》，第 39 卷,第 436 - 440頁，1987年))。該酶被克隆到基因工程的枯草芽孢桿菌中，并且在其中表達，以商業規模制備(Brumm et al., Starch/Starke, 43315-329 (1991) (Brumm 等人，《淀粉與淀粉糖》,第 43卷，第315 - 329頁，1991年))。該酶以商品名MEGADEX?銷售。
[0088]C.葡糖淀粉酶-支鏈淀粉酶共混物
[0089]葡糖淀粉酶和支鏈淀粉酶可單獨或預包裝為共混物供應。此類共混物以OPTIMax^ HDS 或 4060VHP 商購獲得。OPTIMAX? HDS 為 20:80GAU:ASPU，并且
0PTIMAX4060VHP 為 40 單位 GAU 和 60 單位 ASPU。
[0090]SM
[0091]方法:
[0092]1.碳水化合物組合物的高壓液相色譜(HPLC)測定
[0093]通過高壓液相色譜法((美國加利福尼亞州富勒頓(Fullerton, California, USA)的Beckman System Gold32Karat)來測定寡糖反應產物的組合物,該方法配備有HPLC柱(Rezex RCM 鈣型單糖柱(8%) (Rezex RCM-Mono sac char i de Ca+(8%)),保持在 80°C,配有折射率(RI)檢測器(ERC-7515A,得自 Anspec 公司(The Anspec Company, Inc.)的 RI 檢測器)。逆滲透(RO)水用作流動相，流速為0.6ml/分鐘。將20μΙΑ0%溶液注入柱中。柱根據糖類的分子量進行分離。例如，標識DPl為單糖，例如葡萄糖；標識DP2為二糖，例如麥芽糖；標識DP3為三糖，例如麥芽三糖，以及標識“DP4+”為聚合度(DP)為4或更高的寡糖。
[0094]2.葡糖淀粉酶活性單位(GAU)
[0095]一個葡糖淀粉酶單位為在60°C和用20mM乙酸鈉緩沖的pH4.3下，每小時從2.5%干物質可溶性里氏淀粉底物釋放一克以葡萄糖計算的還原糖的酶量。
[0096]3.支鏈淀粉酶活性單位(ASPU)
[0097]一個酸穩定支鏈淀粉酶單位(ASPU)為在pH4.5和60°C的溫度下，每分鐘從支鏈淀粉釋放一當量以葡萄糖計的還原力的酶量。
[0098]4.α淀粉酶活件(AAU)[0099]一個AAU的細菌α -淀粉酶活性為在60°C和用30mM乙酸鈉緩沖的pH6.0下，每分鐘從包含31.2mM氯化鈣的5%干物質可溶性里氏淀粉溶液水解IOmg淀粉所需的酶量。
[0100]5.粘度測暈
[0101]對由于顆粒的溶脹和糊化而增加的淀粉粘度以及由于α淀粉酶而減少的粘度的測量，則使用Newport Instruments SUPER4粘度計進行自動化和微型化。該高度自動化的器械允許對升溫速率和由此產生的水解進行精確控制，以用于評價和表征淀粉、淀粉酶，以及作為控制淀粉的蒸煮補充的各種技術。
[0102]實例I
[0103]42%干固體淀粉漿料的粘度研究及其與38%干固體淀粉漿料的比較
[0104]使用RVA Super4(瑞典胡丁厄(Huddinge Sweden)的Newport Scientif ic/PertenInstruments)進行一系列實驗，以比較38%干固體淀粉衆料與42%干固體淀粉衆料的高溫粘度曲線。還使用酶改性的42%干固體淀粉漿料進行比較，以比較峰值粘度。
[0105]本測試使用兩種粘度測試曲線。第一種測試曲線用于測試在60°C下溫育的38或42%干固體的淀粉漿料的粘度變化，在160rpm下經過30分鐘溫育期進行持續混合，不加入酶。所用的RVA項目設置為:步驟I)測試在30°C下開始，以160rpm混合，步驟2)溫度保持在30°C下I分鐘，步驟3)漿料在I分鐘內加熱到60°C，步驟4)漿料保持在60°C下以160rpm持續混合，以及步驟5)漿料冷卻至30°C并且終止測試。
[0106]圖2示出當漿料在60°C下溫育30分鐘，以160rpm混合，不加入任何酶時，粘度幾乎呈指數級持續增加。 圖3示出在30分鐘溫育期間使淀粉接觸濃度增加的α淀粉酶將使漿料減少至小于200cP。
[0107]實例2
[0108]高干固體實驗室級液化
[0109]1329g淀粉漿料的制備如下:在2升不銹鋼燒杯中，將693g顆粒淀粉(88.15%干固體)加入636g水中，得到46.4%干固體。用碳酸鈉將pH調整到5.7。將兩升不銹鋼燒杯懸浮于60°C水浴中，加熱至60°C，持續攪拌。加入0.2GAU/gdss (0.3093g)和4AAU/gdss(0.1758g)。在20分鐘處理之后，收集淀粉漿料樣品，LC結果發現16%可溶，可溶性級分包含 43%DP1、18%DP2、8%DP3 和 31% 高級糖。
[0110]保持在60°C下30分鐘后，將淀粉漿料泵入由兩個懸浮于溫控油浴中的延時線圈組成的實驗室級蒸煮器。第一個線圈為預熱線圈，停留時間約105秒，第二個線圈為主要蒸煮線圈，包含7-8分鐘停留時間。測量溫度并在蒸煮線圈的入口和出口對其進行控制。對于該測試，溫度設置為108.6°C。在15psi的背壓下保持系統中的溫度，使用彈簧加載安全閥使蒸煮在>100°C下進行。使250ml蒸煮淀粉的等分試樣保持在95°C，以模擬商業液化系統中的糊精化步驟。在30、60、90和120分鐘測定DE0 DE發展速率為0.075DE/分鐘，120分鐘時DE為21.4。
[0111]使用0PTIMAX?HDS糖化酶向120分鐘樣品加入0.llGAU/gdss，其比率為20:80GA:ASPU,得自丹尼斯克?杰能科公司(Genencor A Danisco Company)。在不同時間收集樣品，通過LC測試糖分布，結果在表1中示出。
[0112]在制備液化淀粉用于糖化時，通過RI確定DS為48%。由于來自水解的化學增益，糖化結束時由RI確定的最終干物質為52.1%。[0113]表1
【權利要求】
1.一種加工顆粒淀粉的方法，包括: (a)使顆粒淀粉、水和一種或多種顆粒淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶，接觸以生成漿料，其中干固體的濃度大于38重量％， (b)在高于40°C并且在等于或低于所述顆粒淀粉的糊化溫度的溫度下溫育所述漿料至少五分鐘，生成其中所述顆粒淀粉已通過所述一種或多種酶部分地水解為寡糖和/或單糖的組合物；以及 (c)將所述部分地水解的組合物的所述溫度升高并且保持高于所述顆粒淀粉的所述糊化溫度，以生成液化組合物。
2.根據權利要求1所述的方法，還包括(d)使所述液化組合物接觸支鏈淀粉酶和葡糖淀粉酶并且溫育以生成葡萄糖。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中在步驟(b)中所述溫育持續足夠的時間，使得步驟(b)結束時不溶性干固體的濃度不超過38重量％。
4.根據權利要求1- 3中任一項所述的方法，其中2% - 30%的所述干固體在步驟(b)結束時是可溶的。
5.根據權利要求2-4中任一項所述的方法，其中干固體的百分比在步驟(a)- (d)期間為至少39%。
6.根據權利要求2-4中任一項所述的方法，其中干固體的濃度在步驟(a)- (d)期間為39重量％ - 45重量％。
7.根據權利要求2-6中任一項所述的方法，其中所述干固體的百分比在步驟(a)和(d)之間保持相同或增加。
8.根據權利要求2-7中任一項所述的方法，其中在步驟(b)、(c)和(d)期間向所述漿料加入不超過10重量％的水。
9.根據權利要求2-7中任一項所述的方法，其中在步驟(b)、(c)和(d)期間不再向所述衆料加入水。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述一種或多種酶包括α淀粉酶。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述α淀粉酶為芽孢桿菌α淀粉酶。
12.根據權利要求10所述的方法，其中所述α淀粉酶為SPEZYME?ΑΑ、SPEZYME k XTRA k、SPEZYME li FRED, GYZMEu G997、TERMAMYL l1、120-L、LC、SC、SUPRA 或Fuelzyme?。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述一種或多種酶包括至少兩種類型的α淀粉酶。
14.根據權利要求10所述的方法，其中所述α淀粉酶是耐熱的并且在步驟(c)中保持活性。
15.根據權利要求1-14中任一項所述的方法，其中步驟(b)中的所述溫度為55°C-67 V。
16.根據權利要求1- 15中任一項所述的方法，其中步驟(b)中的所述溫育持續5分鐘至四小時。
17.根據任何前述權利要求1所述的方法，其中步驟(c)中的溫度為90°C-110°C。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述組合物保持在90°C-110°C達5分鐘至4小時。
19.根據權利要求17所述的方法，其中所述組合物保持在100°C- 110°C達5 - 20分鐘，并且保持在90°C - 100°C達1- 2小時。
20.根據權利要求2- 19中任一項所述的方法，其中步驟(d)中支鏈淀粉酶與葡糖淀粉酶的比率按單位計為至少9:1。
21.根據權利要求2-20中任一項所述的方法，其中步驟(d)在40°C-80°C的溫度下進行。
22.根據權利要求21所述的方法，其中步驟(d)進行20- 150小時。
23.根據權利要求2-22中任一項所述的方法，其中葡萄糖的產率為至少95重量％的顆粒淀粉。
24.根據權利要求23所述的方法，其中葡萄糖的產率為95重量％- 96重量％的顆粒淀粉。
25.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述一種或多種酶包括α-淀粉酶，并且所述方法還包括在步驟(C)之后使所述α淀粉酶失活。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述α淀粉酶的所述失活是通過熱處理或酸處理來進行。
27.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟(a)之后不加入酸或堿來改變所述pH。
28.根據權利要求2-27中任一項所述的方法，其中在步驟(b)、(c)和(d)期間所述pH在4.9和5.5之間。
29.根據權利要求2- 28中任一項所述的方法，其中在步驟(d)期間或之后進行不超過一個蒸發步驟來濃縮所述葡萄糖。
30.根據權利要求2- 29中任一項所述的方法，其中步驟(d)中的所述支鏈淀粉酶來自芽孢桿菌，并且所述葡糖淀粉酶來自黑曲霉或灰腐質霉。
31.根據權利要求2- 30中任一項所述的方法，其中所述支鏈淀粉酶和葡糖淀粉酶作為共混物被提供。
32.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述顆粒淀粉通過濕磨來產生。
33.根據權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種酶是一種或多種α淀粉酶，并且所述方法還包括允許所述液化組合物冷卻，從而步驟(a)的所述一種或多種α淀粉酶或一種或多種新鮮α淀粉酶將所述液化組合物中的淀粉水解為寡糖，生成麥芽糖糊精組合物。
34.根據權利要求33所述的方法，其中允許所述液化組合物冷卻包括在高于大氣溫度和低于步驟(C)溫度的溫度下溫育所述液化組合物。
35.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述顆粒淀粉在一個溫度范圍糊化，并且步驟(b)中的溫度低于所述范圍的低限。
36.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述顆粒淀粉是小麥、大麥、玉米、裸麥、稻米、高粱、豆類、木薯、粟、馬鈴薯、甘薯或木薯的顆粒淀粉。
【文檔編號】C12P19/14GK103842516SQ201280047663
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年9月7日 優先權日:2011年9月29日
【發明者】S·H·李, J·K·舍蒂, B·A·斯托姆 申請人:丹尼斯科美國公司