用于改善的側向流動測定法的單一墊條及使用其的測試裝置制造方法

用于改善的側向流動測定法的單一墊條及使用其的測試裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在單一平面上生物學樣品的改善的側向流動測定法的條及使用含有其的測試裝置的側向流動層析測定法。本發(fā)明的條由單一墊組成，所述單一墊可以通過提供容易且簡單的規(guī)程和清楚的視覺讀出來改善側向流動測定法。本發(fā)明的條由樣品應用(樣品)區(qū)和反應物-所得物區(qū)(在那里反應混合物均在相同平面上沉積(反應物))組成。另外，本發(fā)明提供了層析方法，其中在固相上通過差別層析將血紅蛋白與分析物分開。本發(fā)明消除血紅蛋白對結果檢測的任何干擾。本發(fā)明提供了優(yōu)點，包括具有快速且清楚的應答的容易且簡單的規(guī)程。
【專利說明】用于改善的側向流動測定法的單一墊條及使用其的測試裝
[0001]對相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年7月22日提交的美國臨時專利申請流水號61/510，762的優(yōu)先權權益，其內容通過提及并入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]在護理點(POC)實施的測試已經不僅在健康護理設施，包括醫(yī)院和醫(yī)生診所中，而且還在其它臨床位置，包括工作場所或遠程現(xiàn)場位置中變成常見且非常有用的診斷工具。由于測試的緊迫和目的，簡單且有效的測試裝置和以成本和時間有效的方式獲得結果的方法是很想要的。更具體而言，在非健康護理設施中，諸如在用于快速增長的流行性疾病的遠程現(xiàn)場臨床位置測試，用于戰(zhàn)場的生物戰(zhàn)試劑的測試，用于污染物的環(huán)境測試，或用于藥物濫用的工作場所測試中的測試需要簡單且容易實施。有時，由于這些測試經常由具有很少(若有的話)臨床診斷學培訓的個體實施，這些護理測試點需要是簡單的，快速的，且容易使用的。此外，環(huán)境中需要對貯存條件諸如溫度或濕度沒有大量控制的裝置。如此，理想地，用于護理測試點點的裝置需要最小量的設備，并且裝置內體現(xiàn)的測試方法在對于嚴格環(huán)境條件，包括溫度或濕度穩(wěn)定時會是想要的。
[0005]隨著不斷需要用于不斷增加的目的和變化環(huán)境的護理測試點，本領域中仍然需要提供用于以成本和時間有效的方式實施用于生物學標本的測試的方法和裝置。
[0006]發(fā)明概述
[0007]在一個實施方案 中，本發(fā)明提供了一種用于側向流動測定法的基于單一墊(single-pad)的條,其中樣品應用(樣品)區(qū)和反應物-所得物區(qū)(reactant-resultantzone)(在那里沉積有反應混合物(反應物))均在同一平面的、單一的、單墊上(asingle, one-pad)。
[0008]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于預先選擇的分析物的酶驅動的側向層析流動測定法(enzyme-driven, lateral chromatographic flow assay)的條，其由下列各項組成:單一墊；和以干形式(dry form)沉積的底物。
[0009]在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于預先選擇的分析物的酶驅動的側向層析流動測定法(assay),其包括:
[0010](a)提供包含條的測試裝置，所述條由下列各項組成:
[0011]⑴單一墊；和
[0012](ii)以干形式沉積的底物；
[0013](b)對其中沉積有所述底物的所述單一墊應用樣品；
[0014](c)容許所述樣品流過消化墊以到達所述底物；
[0015](d)容許所述樣品與所述底物起反應以產生應答；并
[0016](e)鑒定并解讀所述應答以指示所述樣品中所述分析物的存在或濃度。
[0017]在別的實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)存在的酶驅動的側向層析流動測定法，其包括:[0018](a)提供包含單一墊條的測試裝置，所述單一墊條包含:
[0019](i)用裂解緩沖液處理的消化單一墊；
[0020](?)測定混合物，其包含葡萄糖-6-磷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氫化物或電子轉移劑及其混合物；和
[0021](iii)四唑鹽，
[0022](b)在所述消化單一墊上應用樣品；
[0023](C)容許所述樣品流過所述消化墊以接觸所述測定混合物；
[0024](d)容許所述樣品與所述測定混合物起反應以產生應答，并
[0025](e)鑒定并解讀(interprete)所述應答以指示所述樣品中所述分析物的存在或濃度。
[0026]在另一個實施方案中，本發(fā)明基于干形式測定法，其中樣品應用區(qū)中應用的樣品通過毛管力(capillary force)行進至反應區(qū)，而應用區(qū)和反應區(qū)在同一平面上。反應物含有組分的組合，包括引發(fā)顏色反應并且以干形式沉積的組合物和酶。在本發(fā)明中，樣品行進至反應物區(qū)，并且與反應物混合。由于樣品與反應物混合，所得的組合物會緩慢遷移并且在反應物-所得物區(qū)上保留，而樣品中的其它組分，諸如血紅蛋白比所得的組合物更快移動，并且通過諸如毛管力繼續(xù)行進以與期望的所得物分開。在與含有分析物的樣品起反應后，反應物結果區(qū)會呈現(xiàn)指示劑，諸如顏色的結果。所得物的保留和樣品的其它組分的繼續(xù)毛細管移動會消除其它組分，諸如血紅蛋白的任何干擾，并且改善結果的鑒定。樣品在樣品(諸如血液)或另外應用有樣品的緩沖溶液中含有的液體中通過毛管力行進。
[0027]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于護理測試點的單墊條上干形式測定法中的快速診斷測試(RDT)。單墊上的側向層析提供了穩(wěn)定的測試，簡單的方法及快速的測試結果O
[0028]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了層析方法，其中在固相上使用差別層析將血紅蛋白與分析物分開。血紅蛋白的顏色經常干擾紅細胞中分析物的顏色反應的視覺讀出。本發(fā)明提供了側向層析方法，其中樣品的差別遷移由于大小差異、粘度、分析物與反應物的沉淀、通過充滿會與分析物起反應的試劑的多孔基質的電荷差異而發(fā)生。
[0029]本發(fā)明的優(yōu)點包括容易且簡單過程的能力，和沒有血紅蛋白干擾的清楚視覺讀出。
[0030]貫穿本申請，以下術語具有下文所列的意義。
[0031]“生物學材料”、“生物學樣品”或“樣品”指從脊椎動物提取的流體或組織，諸如全血、血清、血漿、唾液、尿液和腦脊液。
[0032]“分析物”指生物學材料、生物學樣品、或樣品中含有作為測定法的目的以鑒定結果諸如存在、缺乏或濃度之一的比活的某種組分。
[0033]除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域普通技術人員的通常理解具有相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以在本發(fā)明的實施或測試中使用，但是下文描述了合適的方法和材料。本文中提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻通過提及完整并入。在沖突的情況中，應以本說明書，包括定義為準。另外，材料、方法和例子僅是例示性的而不意圖為限制性的。
[0034]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點從以下發(fā)明詳述及從權利要求書看會是顯而易見的。[0035]附圖簡述
[0036]圖1提供了與常規(guī)兩墊條相比本發(fā)明的單墊條(one-pad strip)的結構。
[0037]圖2提供了在G6H)缺乏測試方面本發(fā)明的單墊條與常規(guī)兩墊條之間的視覺比較測試結果。通過圖中提供的得分測量視覺顏色鑒定強度。
[0038]圖3提供了對G6H)測試使用酶測定法得到的本發(fā)明的單墊條與常規(guī)兩墊條之間的信號強度比較測試結果。通過圖中提供的得分測量視覺顏色鑒定強度。
[0039]圖4提供了在乳酸脫氫酶測試方面本發(fā)明的單墊條與常規(guī)兩墊條之間的視覺比較測試結果。
[0040]圖5提供了對乳酸脫氫酶測試使用酶測定法得到的本發(fā)明的單墊條與常規(guī)兩墊條之間的信號強度比較測試結果。通過aQzen閱讀器測量視覺顏色鑒定的強度。
[0041]圖6提供了在乙醇(alcohol)測試方面本發(fā)明的單墊條與常規(guī)兩墊條之間的視覺比較測試結果。
[0042]圖7提供了對醇脫氫酶測試使用酶測定法得到的本發(fā)明的單墊條與常規(guī)兩墊條之間的信號強度比較測試結果。通過aQzen閱讀器測量視覺顏色鑒定的強度。
[0043]圖8提供了對乳酸脫氫酶測試使用酶測定法得到的本發(fā)明的單墊條與常規(guī)兩墊條之間的信號強度比較測試結果。通過圖中提供的得分測量視覺顏色鑒定強度。
[0044]發(fā)明詳述
[0045]本發(fā)明提供了一種用于預先選擇的分析物的酶驅動的側向層析流動測定法的條，其由下列各項組成:
[0046]單一墊；和
[0047]以干形式沉積的底物。
[0048]在一個實施方案中，本發(fā)明的單一墊是用裂解緩沖液，諸如氯化鎂預處理的消化
墊。
[0049]在另一個實施方案中，分析物選自人和動物流體中的蛋白質、碳水化合物、脂質、核酸。
[0050]在另一個實施方案中，以干形式沉積的底物是測定混合物，其含有分析物的反應性底物，諸如對于葡萄糖磷酸脫氫酶(G6PD)為葡萄糖-6-磷酸，該測定混合物可以進一步包含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、氫化物轉移劑、及其混合物。
[0051]在某個實施方案中，分析物選自葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、乳酸脫氫酶、或醇(alcohol)。
[0052]在一個優(yōu)選的實施方案中，分析物是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)。
[0053]在別的實施方案中，底物含有指示劑，諸如染料化合物?？梢圆蛔鱿拗撇捎迷S多化合物，該化合物可以通過使底物與分析物接觸在電子上或結構上改變，并且以視覺或使用測量方法或儀器可檢測的任何形式表示變化。此類化合物的例子包括但不限于染料。表達各種顏色的化合物經常由于結構的任何化學或電子狀態(tài)改變而改變顏色。甲臜(formazan)染料是自脫氫酶和還原酶還原四唑鹽生成的生色化合物。甲臜染料具有從深藍色至深紅色至橙色的多種顏色，這取決于用作反應底物的初始四唑鹽。一批四唑鹽包括但不限于TTC (四唑、氯化四唑或 2，3，5-三苯基-2H-氯化四唑(2，3，5-triphenyl-2H_tetrazoliumchloride))、INT (2- (4-碘苯基)_3_ (4-硝基苯基)-5-苯基-2H-氯化四唑(2- (4-1odophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H_tetrazolium chloride))、MTT(3-(4, 5- 二甲基-2-噻唑基)-2，5- 二苯基-2H-溴化四唑((3- (4，5-dimethyl-2-thiazolyl) -2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)))、XTT (2, 3- 二 -(2-甲氧基-4-硝基-5-石黃苯基)-2H_ 四唑-5-甲酸苯胺(2，3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazoIium-5-carboxaniIide))、NBT (硝基藍四唑(Nitroblue Tetrazolium))、MTS (3-(4, 5- 二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)_5_(3-carboxymethoxyphenyl)~2~(4-sulfophenyl)-2H_tetrazolium))、或DCPIP (2，6-二氯靛酹(2，6-dichlorophenolindophenol))。在通過酶或化學條件(諸如與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氫化物(NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或任何氫化物轉移劑起反應)還原后，四唑鹽可以轉變顏色，并且可以甚至形成不溶性沉淀物?？梢酝ㄟ^方法檢測結果，所述方法包括但不限于視覺檢查、色度計、UV檢測儀、分光光度計、圖像分析閱讀器，等等。
[0054]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于預先選擇的分析物的酶驅動的側向層析流動測定法，其包括:
[0055](a)提供包含條的測試裝置，所述條由下列各項組成:
[0056](i)單一墊；和
[0057](ii)以干形式沉積的底物；
[0058](b)對其中沉積有所述底物的所述單一墊應用樣品；
[0059](C)容許所述 樣品流過消化墊以到達所述底物；
[0060](d)容許所述樣品與所述底物起反應以產生應答；并
[0061](e)鑒定并解讀所述應答以指示所述樣品中所述分析物的存在或濃度。
[0062]在一個優(yōu)選的實施方案中，分析物是酶諸如G6H)。
[0063]在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于檢測G6H)存在的酶驅動的側向層析流動測定法，其包括:
[0064](a)提供包含單一墊條的測試裝置，所述單一墊條包含:
[0065](i)用裂解緩沖液處理的消化單一墊；
[0066](ii)測定混合物，其包含葡萄糖-6-磷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氫化物或電子轉移劑及其混合物；和
[0067](iii)四唑鹽，
[0068](b)在所述消化單一墊上應用樣品；
[0069](C)容許所述樣品流過所述消化墊以接觸所述測定混合物；
[0070](d)容許所述樣品與所述測定混合物起反應以產生應答，并
[0071](e)鑒定并解讀所述應答以指示所述樣品中所述分析物的存在或濃度。
[0072]本發(fā)明提供了一種側向流動測定法，其中樣品應用(樣品)區(qū)和反應物-所得物區(qū)(在那里沉積有反應混合物(反應物))均在同一平面的、單一的、單墊上。
[0073]另外，本發(fā)明基于干形式測定法，其中樣品應用區(qū)中應用的樣品通過毛管力行進至反應區(qū)，而應用區(qū)和反應區(qū)在同一平面上。反應物含有組分的組合，包括引發(fā)顏色反應并且以干形式沉積的組合物和酶。在本發(fā)明中，樣品行進至反應物區(qū)，并且與反應物混合。
[0074]由于樣品與反應物混合，所得的組合物會沉淀，緩慢遷移并且在反應物-所得物區(qū)上保留，而樣品中的其它組分，諸如血紅蛋白通過諸如毛管力繼續(xù)行進以與期望的所得物分開。在與含有分析物的樣品起反應后，反應結果區(qū)會以可以視覺檢測的指示劑，諸如顏色呈現(xiàn)結果。同時，逆向讀出也是有可能的:在與含有分析物的樣品起反應后，具有指示劑，諸如顏色的反應結果區(qū)會消失。不含分析物的樣品:顏色保留于結果區(qū))。所得物的保留和樣品的其它組分的繼續(xù)毛細管移動會消除其它組分，諸如血紅蛋白的任何干擾，并且改善結果的鑒定。樣品在樣品(諸如血液)或另外應用有樣品的緩沖溶液中含有的液體中通過毛管力行進。
[0075]單墊條
[0076]本發(fā)明提供了單墊條裝置，其中樣品應用區(qū)和反應物結果區(qū)都在單墊上。單一墊中實施的測定法會提供分析物的一致遷移，并且通過消除樣品的不均勻遷移通過多層來產生一致的結果。例如，在將血液樣品應用于用裂解緩沖液預處理的單墊條時，可以將血紅蛋白容易地與所得物分開。
[0077]另外，可以通過增加與反應物起反應的分析物的實際量，而不是分析物的量在單墊條裝置中 提高靈敏性，因為樣品會行進到相同表面，而不是通過不同介質或層。還有，通過采用單墊條裝置，生產成本會較低，并且過程會比常規(guī)多層測定法的過程簡單。
[0078]例如，BinaxNOVV_:KX.16PD測試具有由兩個不同墊組成的條，所述兩個不同墊是樣品墊和反應墊。具有正常Gero活性的樣品產生截然不同的顏色變化。紅色樣品顏色在反應墊的上半部分上變化成褐色/黑色顏色。血液樣品中反應產物的顏色沒有消除血紅蛋白的顏色；因此，褐色/黑色顏色與血液的紅色顏色沒有清楚的差異。與包括BiiiaxNOW?G6PD的其它裝置中使用的二相或多相且不連續(xù)系統(tǒng)不一樣,本發(fā)明采用單相且連續(xù)層析。測試條由單一墊組成，并且連續(xù)層析比兩相層析提供與染料(諸如甲臜染料)的所得物與條上的血紅蛋白的更容易的分開。
[0079]本發(fā)明由三個區(qū)，即樣品應用(樣品)區(qū)、反應物和所得物區(qū)構成。反應區(qū)是以干形式沉積的引發(fā)顏色反應的組成組合，所得物區(qū)是視覺讀出區(qū)，并且樣品區(qū)是應用樣品的區(qū)域。由于這些區(qū)由相同基質構成，單墊、連續(xù)形式通過經由多層消除樣品不均勻遷移的可能性實現(xiàn)分析物的一致遷移并且產生一致的結果。另外，可以通過增加與反應物起反應的分析物的實際量而不是通過多層的分析物量來提高靈敏性。還有，本發(fā)明的形式降低產生成本，并且使產品過程比常規(guī)多層測定法的產品過程更容易。
[0080]側向流動層析測定法
[0081]分析物使用各種反應，諸如抗體-抗原反應間的免疫學反應、酶-底物反應、蛋白質-底物綴合、或底物-底物復合物形成與反應物起反應。
[0082]雖然免疫學測定法經常利用側向流動層析測定法，但是側向流動層析測定法用于酶促測定法尚不常見。側向流動酶測定法對某種酶鑒定其存在或缺乏和濃度，其使用與底物的反應并且使用可以表示與某種化學品，諸如氫化物起反應后通過酶和底物之間的反應產生的某種顏色的指示劑諸如染料檢測反應來進行。
[0083]葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)
[0084]本發(fā)明的一個特定的實施方案提供了基于酶的測定法，諸如直接檢測樣品中酶(諸如血液樣品中的G6PD)的存在，其利用來自酶與其底物之間的反應的代謝物活性進行，所述活性可以將染料還原以表示某些指示劑諸如顏色?？梢詫⑷玖戏肿又T如四唑化合物還原以形成不溶性甲臜。不溶性甲臜會呈現(xiàn)紫色顏色，其可以不用任何特定的設備容易視覺鑒定。
[0085]人酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)在人生物化學中實施至關重要的功能。它是氧化戊糖途徑的部分，其中它發(fā)揮功能以通過提供還原性等同物使自由基對細胞的氧化攻擊最小化。例如，G6PD將葡萄糖-6-磷酸轉化成6-磷酸葡萄糖酸，由此釋放質子，其將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)還原成NADPH，即NADP的還原形式。NADPH啟動一系列下游反應，其最終還原自由基氧化劑，并且使其中許多在正常人生物化學中不太有效。
[0086]G6PD存在于大多數(shù)人細胞中，但是它以較高濃度在紅細胞中，所述紅細胞在其主要功能之一中作用為氧轉運蛋白，并且因此對氧化攻擊特別易感。此酶幫助保護紅細胞免于氧化損傷和過早破壞。Gero系統(tǒng)的效率明顯較高，如實際上在正?；钚云陂g小于1%其能力用于對抗和阻止不想要的氧化反應反映的。然而，在必須對人體引入強氧化劑，諸如奎寧類抗瘧疾藥物的成員時，對還原劑的快速生成的需要大大增加。[0087]編碼Gero的基因的幾處突變是已知的，其降低酶在其基因組的兩個半份中都擁有此類突變的個體的生物化學中的效率，這引起其Gero的數(shù)量與具有正?；虻娜酥斜３钟谙嗤?，而且還引起其Gero顯示大大降低的比活。在這些個體中，施用強氧化劑諸如奎寧型抗瘧疾藥物類別的成員可以引起幾種臨床并發(fā)癥，諸如溶血性貧血，因為其G6DP的低比活沒有實現(xiàn)足夠還原劑的生成以阻止對其紅細胞的快速的不想要的氧化影響。在瘧疾感染常見且有時甚至流行的區(qū)域，因此需要快速的有效測試，其會容易區(qū)別具有低比活的G6ro的對象與其G6ro活性正常的對象，并且會使醫(yī)學人員能夠確保(I)僅對具有正?；蜉^好的G6ro比活的個體規(guī)定奎寧抗瘧疾藥物，以及(2)用備選類型的抗瘧疾藥物用藥治療具有低于正常的G6ro活性的對象。
[0088]另外，已知多種類型的藥物增加溶血性貧血，并且名單包括但不限于抗瘧藥(伯氨喹(primaquine),撲痕喹(pamaquine),等等),磺胺類藥(sulfonamides)(磺胺、磺胺醋酰(sulphacetamide)、磺胺批P定(sulphapyridine)、磺胺甲基異口惡唑,等等)，砜(氨苯砜，等等)，硝基呋喃類藥(nitrofurans)(呋喃妥因，等等)，等等(萘唳酸(nalidixacid)、萘、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、亞甲藍、甲苯胺藍,等等)。
[0089]為了測試G6H)的缺乏，含有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的紅細胞在其接觸用血液裂解劑預處理的樣品應用區(qū)時裂解到測試條上。裂解的紅細胞中的Gero與其在預處理的干條中的底物起反應，并且發(fā)生酶反應以在存在四唑染料和氫化物轉移劑的情況中起始顏色形成過程。催化性G6ro可以氧化葡萄糖-6-磷酸以釋放NADPH，并且釋放的NADPH還原四唑染料以將四唑染料的顏色改變?yōu)榧着H，諸如紫色或藍色等，其可以在同一墊上視覺檢查。
[0090]在一個特定的實施方案中，測試條在樣品應用和顏色形成反應區(qū)在同一墊上的單層中構建。若需要的話，測定條的上部由具有吸水性材料的吸收墊構成。測試條用包含離子型或非離子型表面活性劑的裂解試劑預處理。其提供實施測試的簡單規(guī)程，因為它不需要應用樣品前的血液裂解步驟。預處理的測試條用試劑浸潰，該試劑包含:作為Gero的特異性底物的葡萄糖-6-磷酸、輔酶NADP或NAD、四唑染料、和氫化物轉移劑和穩(wěn)定劑如糖模塊或水溶性聚合物。
[0091]快速診斷測試(RDT)和雙重測試[0092]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了供護理點測試用的單墊條上干形式測定法中的快速診斷測試(RDT)。干形式側向層析提供了穩(wěn)定的測試裝置，簡單的方法和快速的測試結果。Gero缺乏是影響4億人且在瘧疾地方病區(qū)域中高度流行的最常見人酶缺乏之一。此缺乏似乎提供某種保護免于瘧疾感染。然而，它也可以在施用某些瘧疾藥物，包括PRIMAQUINE后引起溶血。因此，迫切需要適合于現(xiàn)場篩選的快速診斷測試(RDT)。
[0093]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了測試方法，其中使用臨床樣品得到的GeroRDT測試結果可以與定量測試結果相關聯(lián)。測試可以將約≤4IU/gHb(于37°C正常12±2.09U/gHb)檢測為缺乏。截留可以隨G6H)缺乏患者中紅細胞對伯氨喹的耐受性而變化。結束的穩(wěn)定性研究提供了測試條對于于45°C持續(xù)3個月和于60°C持續(xù)10天是穩(wěn)定的。針對G6H)的此RDT可以與針對瘧疾的RDT組合，所述針對瘧疾的RDT能夠檢測每μ L血液的小于30種寄生物。此雙重測試試劑盒可以使用少量血液(通常小于10 μ L)同時診斷瘧疾感染和G6ro缺乏。測定條是快速的(〈10分鐘)且用少量樣品(〈10UL血液)，使用簡單，成本有效，輕便的，并且沒有特殊的貯存要求，其對于現(xiàn)場使用是至關重要的要素。
[0094]側向流動層析
[0095]許多常用的護理點測試基于利用多微孔膜的毛細管作用的基于膜的免疫層析的側向流動測定法。在側向流動層析測定法中，通過對固定固相上捕捉分子的親和力結合將流動相標本溶液中的分析物與其它組分分開。由硝酸纖維素或尼龍制成的膜為親和層析的固體固定相和分配層析的液相提供基質，所述液相通過毛細管作用驅動免疫復合物顆粒與其它液體溶劑分開。
[0096]由尼龍或硝酸纖維素制成的多微孔膜在其第一次證明蛋白質可以轉移通過膜時從約1979年起已經用于抗原/抗體測試。已經廣泛利用硝酸纖維素作為用于在研究技術諸如Western印跡和側 向流動免疫診斷學中固定化蛋白質的表面。微孔性和硝酸纖維素為快速免疫層析測定法提供許多益處，包括例如高結合能力、蛋白質的非共價附接、和穩(wěn)定的長期固定化環(huán)境。
[0097]—般地，在側向層析(包括酶驅動的測定法，諸如用于G6H)缺乏的測試)中，干底物是在層析條(即如本發(fā)明中的單墊條)上樣品接收區(qū)的接合(junction)附近且剛超出該接合預先沉積。然而，它可以置于樣品流動路徑中的別的地方以適應樣品或底物中的一種或多種成分的特定要求，只要它置于基本上在末端或“吸收墊”(在那里樣品流動停止，并且存在的任何過量流體流入吸收墊或可以提供的其它接收器(sink)裝置中)前的流動路徑中。
[0098]重要的是，干燥的底物在一定范圍中(優(yōu)選在限制區(qū)內)沉積，只要便于其通過樣品的向前流動被完全挑出。干燥的底物在流動路徑中的放置還應當考慮液體樣品內溶解或分散形式的底物的重建到樣品到達樣品流動停止的點的時間完成是期望的。
[0099]為了方便運輸、貯存和使用，優(yōu)選地，本發(fā)明的每個層析條可以在構建為使得該條側向放置的合適裝置內容納。許多此類裝置是本領域中公知的，并且可以適當利用其中任一種，其構建為使得通過側向流動實施置于其內的層析條上的測定法性能。
[0100]在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的單墊條提供特征，其包括但不限于下列各項:
[0101]1.單墊條包括選自下組的多孔性基質:硝酸纖維素膜、玻璃纖維、纖維素或聚酯，坐坐寸寸，
[0102]2.條包含單墊條，其中所述條的樣品應用區(qū)和干燥試劑混合物的沉積區(qū)在同一墊中，而不管兩個區(qū)域重疊與否。
[0103]3.本發(fā)明中的條具有接收樣品流體后發(fā)生的對反應混合物的液體流動的單一路徑。
[0104]4.任選地，本發(fā)明的單墊條可以用容許通過直接接觸樣品應用區(qū)而不用緩沖液預先裂解來裂解生物學流體的裂解試劑預包被，所述裂解試劑含有離子型(陰離子型、陽離子型和兩性離子型)或非離子型表面活性劑和氯化鎂。
[0105]5.本發(fā)明的單墊條含有選自下組的糖模塊(moiety):單糖、二糖、多糖或水溶性聚合物如穩(wěn)定劑以提高熱穩(wěn)定性。
[0106]6.本發(fā)明的單墊條差別設計并在雙重測試形式裝置中裝配以用肉眼區(qū)別中等(例如:正?；钚詸z測的10-60%)和嚴重G6H)缺乏(例如:正常活性檢測的小于10%)。檢測活性的％不限于10-60%或小于10%。
[0107]7.反應區(qū)中的組分包含酶底物、顏色顯現(xiàn)試劑和穩(wěn)定劑。可以采用單墊系統(tǒng)進行定量或半定量測定法，因為條上的顏色變化可以通過儀器可讀出，所述儀器諸如光學分光光度計、掃描儀、閱讀器、或密度計。
[0108]8.單墊系統(tǒng)也可適用于電化學系統(tǒng)。經由氧化還原酶或電子轉移介導物(mediator)從由G6H)生成的NADPH或NADH至電極的電子轉移可以通過干形式的電子量化。
[0109]9.可以采用單墊系統(tǒng)進行免疫測定法，其在固相上固定化捕捉分子。
[0110]通過差別層析分開血紅蛋白與分析物
[0111]控制側向層析測定法中的信號強度的關鍵參數(shù)是膜的毛細管流動率和蛋白質結合能力。毛細管流動率和結合能力由膜的孔徑、孔隙率和厚度決定。膜的蛋白質結合能力取決于其孔徑，和表面特性。
[0112]本發(fā)明提供了層析，其中在固相上使用差別層析將血紅蛋白與分析物分開。血紅蛋白的顏色經常干擾紅細胞中分析物的顏色反應的視覺讀出。本發(fā)明提供了側向層析方法，其中樣品的不同遷移是由于大小差異、粘性、分析物與反應物的沉淀、通過充滿會與分析物相互作用的試劑的多孔基質的電荷差異所致。在樣品區(qū)上應用血細胞，所述樣品區(qū)用裂解劑預處理以進行紅細胞裂解至反應區(qū)，并且在需要時應用緩沖液。裂解的血細胞移動至反應-結果區(qū)，并且與反應物混合，所得的組合物會保留在反應物-所得物區(qū)上，而血紅蛋白通過諸如毛管力繼續(xù)行進以與期望的所得物分開。血紅蛋白的分開會使指示劑諸如顏色的結果檢測更清楚且更容易鑒定。
實施例
[0113]下文具體描述了特定的Gero測定法，其可以由現(xiàn)場、家庭、醫(yī)生診所或缺乏培訓過的實驗室人員和儀器的任何地方工作的任何人容易成功使用，并且附圖1-3中提供了結
果O
[0114]實施例1:為G6H)缺乏測試條準備和進行樣品測試
[0115]將墊用裂解緩沖液預處理，并將其于室溫干燥。圖1中顯示了單墊和兩墊條的結構。將經預處理的墊在塑料支持物上附接，并且在塑料支持物上頭部部分中對墊覆蓋吸水紙作為吸附墊。制備含有葡萄糖-6-磷酸、NADP、四唑、和氫化物或電子轉移劑的測定混合物，并且將其浸潰至多孔墊上。容許經測定混合物浸潰的墊于室溫干燥過夜。
[0116].單墊的制備:塑料支持物上經測定混合物浸潰的墊。
[0117].兩墊的制備:通過在塑料支持物上重疊l_2mm將供樣品應用的墊附接于經測定混合物浸潰的墊的底部。
[0118]將正?；蛉狈Φ臉悠窇糜跅l上。結果呈現(xiàn)了正常樣品的確在本發(fā)明的單墊條系統(tǒng)中比在兩墊系統(tǒng)中產生更強且更清楚的紫色顏色，如圖2中顯示的。缺乏樣品在單墊和兩墊兩者中都沒有產生任何顏色，因為沒有Gero可用于產生NADPH。另外，結果呈現(xiàn)了流體遷移在單墊中比在兩墊中更一致且更快，并且血液清除的完成在本發(fā)明的單墊條系統(tǒng)中比在兩墊系統(tǒng)中更快。
[0119]實施例2:為乳酸脫氫酶測試條準備和進行樣品測試
[0120]將墊用含有氯化鎂的裂解緩沖液預處理，并且將其于室溫干燥過夜。將經預處理的墊在塑料支持物上附接，并且在塑料支持物上頭部部分中對墊覆蓋吸水紙作為吸附墊。制備含有乳酸鹽、NAD、四唑、和Tris-HCl緩沖液pH8.0、氫化物轉移劑的測定混合物，并將其浸潰至多孔墊上。容許經測定混合物浸潰的墊于室溫干燥過夜。
[0121].單墊的制備:塑料支持物上經測定混合物浸潰的墊。
[0122].兩墊的制備:通過在塑料支持物上重疊1-2_將樣品墊附接于經測定混合物浸潰的墊的底部。
[0123]將2微升血液樣品應用于條上。結果呈現(xiàn)了血液中的LDH酶的確在本發(fā)明的單墊條系統(tǒng)中比在兩墊系統(tǒng)中產生更強且更清楚的紫色顏色，如圖4中顯示的。另外，結果呈現(xiàn)了流體遷移在單墊中比在兩墊中更一致且更快，并且血液清除的完成在本發(fā)明的單墊條系統(tǒng)中比在兩墊系統(tǒng)中更快。通過aQzen閱讀器測量紫色顏色的強度，如表1中顯示的。單墊的強度高于兩墊系統(tǒng)的強度，如圖5中顯示的。
[0124]表1.
【權利要求】
1.一種用于預先選擇的分析物的酶驅動的側向層析流動測定法的條，其由下列各項組成: 單一墊；和 以干形式沉積的底物。
2.權利要求1的條，其中所述分析物選自下組:人和動物流體中的蛋白質、碳水化合物、脂質、核酸。
3.權利要求1的測定法，其中所述分析物選自下組:葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、乳酸脫氫酶、和醇。
4.權利要求1的條，其中所述單一墊用緩沖液或裂解緩沖液預處理。
5.權利要求1的條，其中所述底物是測定混合物，其包含葡萄糖-6-磷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氫化物或電子轉移劑及其混合物。
6.權利要求1的條，其中所述底物包含指示劑。
7.權利要求6的條，其中所述指示劑是染料化合物。
8.權利要求7的 條，其中所述染料化合物選自下組:TTC(四唑，氯化四唑或2，3，5-三苯基-2H-氯化四唑)、INT (2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)_5_苯基-2H-氯化四唑)、MTT (3- (4，5- 二甲基-2-噻唑基)-2、5- 二苯基-2H-溴化四唑)、XTT (2，3- 二 - (2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺)、NBT (硝基藍四唑)、MTS (3- (4，5_ 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺苯基)-2H-四唑)、和DCPIP (2，6- 二氯靛酚)。
9.權利要求8的條，其中所述染料化合物是氯化四唑或四唑。
10.一種用于預先選擇的分析物的酶驅動的側向層析流動測定法，其包括: (a)提供包含條的測試裝置，所述條由下列各項組成: (i)單一墊；和 (?)以干形式沉積的底物； (b)對其中沉積有所述底物的所述單一墊應用樣品； (c)容許所述樣品流過消化墊以到達所述底物； (d)容許所述樣品與所述底物起反應以產生應答；并 (e)鑒定并解讀所述應答以指示所述樣品中所述分析物的存在或濃度。
11.權利要求10的條，其中所述分析物選自下組:人和動物流體中的蛋白質、碳水化合物、脂質、核酸。
12.權利要求10的測定法，其中所述分析物選自下組:葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、乳酸脫氫酶、和醇。
13.權利要求10的條，其中所述單一墊用緩沖液或裂解緩沖液預處理。
14.權利要求10的測定法，其中所述底物是測定混合物，其包含葡萄糖-6-磷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氫化物或電子轉移劑及其混合物。
15.權利要求10的測定法，其中所述底物包含指示劑。
16.權利要求15的測定法，其中所述指示劑是染料化合物。
17.權利要求16的測定法，其中所述染料化合物選自下組:TTC(四唑，氯化四唑或2，3，5-三苯基-2H-氯化四唑)、INT (2- (4-碘苯基)-3- (4-硝基苯基)_5_苯基-2H-氯化四唑)、MTT(3-(4，5- 二甲基-2-噻唑基)-2,5- 二苯基-2H-溴化四唑)、XTT(2，3_ 二-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2Η-四唑-5-甲酰苯胺)、NBT (硝基藍四唑)、MTS (3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺苯基)-2Η-四唑)、和DCPIP (2，6- 二氯靛酹)。
18.權利要求17的測定法，其中所述染料化合物是氯化四唑或四唑。
19.權利要求13的測定法，其中所述裂解緩沖液包含氯化鎂。
20.一種用于檢測G6ro存在的酶驅動的側向層析流動測定法，其包括: (a)提供包含單一墊條的測試裝置，所述單一墊條包含: (i)用裂解緩沖液預處理的消化單一墊； (?)測定混合物，其包含葡萄糖-6-磷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氫化物轉移劑及其混合物；和 (iii)四唑鹽， (b)在所述消化單一墊上應用樣品； (c)容許所述樣品流過所述消化墊以接觸所述測定混合物； (d)容許所述樣品與所述測定混合物起反應以產生應答，并 (e)鑒定并解讀所述應答以指示所述樣品中所述分析物的存在或濃度。
【文檔編號】C12Q3/00GK103842523SQ201280043565
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年7月20日 優(yōu)先權日:2011年7月22日
【發(fā)明者】金賢淑, 具泰希, 崔永鎬 申請人:阿賽斯生物股份有限公司