計算優化的寬反應性的h1n1流感抗原的制作方法
【專利摘要】本發明描述了用于引起針對H1N1流感病毒分離株的寬反應性的免疫應答的優化的H1N1流感HA多肽的產生。基于選擇的分離自1918-2011年的H1N1病毒，通過一系列的HA蛋白比對和隨后的共有序列產生，開發了優化的HA多肽。本文提供了優化的H1N1HA多肽以及包含所述HA多肽的組合物、融合蛋白和VLP。還提供了編碼所述HA多肽的密碼子優化的核酸序列。本公開還提供了在受試者中引起針對流感病毒的免疫應答的方法。
【專利說明】計算優化的寬反應性的H1N1流感抗原
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2011年6月20日提交的美國臨時申請N0.61/498，800的優先權，所述臨時申請以引用的方式全文納入本文。
【技術領域】
[0003]本公開涉及可引起針對H1N1病毒分離株的寬反應性的免疫應答的優化的流感血凝素蛋白及其作為疫苗的用途。
【背景技術】 [0004]流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族的成員。有三個亞型的流感病毒，命名為A型流感、B型流感和C型流感。所述流感病毒粒子含有分段的負義RNA基因組，所述基因組編碼以下蛋白:血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)、基質(Ml)、質子離子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶堿性蛋白1 (PB1)、聚合酶堿性蛋白2 (PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)和非結構蛋白2 (NS2)。通、嫩^1和12為膜相關蛋白，而咿沖81、？82、？4和吧2為核衣殼相關蛋白。Ml蛋白是流感顆粒中最豐富的蛋白質。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，負責病毒吸附和病毒顆粒侵入細胞，并且是用于病毒中和及保護性免疫的主要免疫顯性表位的來源。HA和NA蛋白都被認為是預防性流感疫苗的最重要組分。
[0005]每年，季節性流感僅在美國就導致超過300000例入院和36000例死亡(Simonsen等Lancet Infect Dis7:658-66, 2007)o 2009年新型H1N1流感病毒的出現表明新的流感大流行可如此快速地橫掃全球。
[0006]目前在美國有兩種獲得批準的流感疫苗方法——滅活的裂解疫苗和減毒活病毒疫苗。滅活疫苗可有效地誘導體液免疫應答、但通常只有弱的細胞免疫應答。活病毒疫苗不能給予免疫減弱的或懷孕的患者，因為這些患者具有增加的感染風險。因此，存在對寬保護性流感病毒疫苗的需求。
【發明內容】
[0007]本文公開了用于引起針對H1N1流感病毒分離株的寬反應性的免疫應答的優化的H1N1流感HA多肽的產生。基于選擇的分離自1918-2011年的H1N1病毒，通過一系列的HA蛋白比對和隨后共有序列的產生，開發了所述優化的HA多肽。
[0008]本文提供了用于引起針對H1N1流感的寬反應性的免疫應答的具有優化的氨基酸序列的重組流感HA多肽。在一些實施方案中，所述HA多肽包含與SEQ ID N0:U SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 11 至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%或至少99%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO: 10或SEQ ID NO: 11相比，所述多肽的氨基酸序列包含不多于5、不多于6、不多于7、不多于8、不多于9或不多于10個氨基酸置換。在一些實施方案中，所述流感HA多肽沒有N-末端的甲硫氨酸殘基。
[0009]本公開內容還提供了編碼所述重組HA多肽的分離的核酸分子和載體。還提供了包含所述載體的分離的細胞。
[0010]還提供了包含本文公開的優化的HA多肽的流感病毒樣顆粒(VLP)和融合蛋白。
[0011]還提供了在可藥用載體中包括本文公開的優化的流感HA多肽、融合蛋白或VLP的組合物。本公開內容還提供了通過給予所公開的組合物、融合蛋白或VLP而在受試者中引起針對流感病毒的免疫應答的方法。
[0012]還提供了通過給予受試者包含含有優化的HA多肽的VLP的組合物而針對流感病毒免疫所述受試者的方法。
[0013]根據以下參照附圖進行的詳細描述，本公開內容的上述和其他目的、特征和優點
會變得更加清楚。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為用于根據方法1產生H1 N1HA共有序列的方法的示意圖。
[0015]圖2為用于根據方法2產生H1N1HA共有序列的方法的示意圖。
[0016]圖3為用于根據方法4產生H1N1HA共有序列的方法的示意圖。
[0017]圖4為用于根據方法5產生H1N1HA共有序列的方法的示意圖。
[0018]圖5為用于根據方法6產生H1N1HA共有序列的方法的示意圖。
[0019]圖6的圖示出了由小鼠COBRA H1N1感染所誘導的血凝抑制(HAI)血清抗體滴度。在用COBRA H1N1流感VLP (COBRA方法1)感染的小鼠中確定了 HAI血清抗體滴度。針對季節性H1N1流感病毒A/新喀里多尼亞/20/1999測試了抗血清。結果表示為感染后第3周、第5周、第8周和第12周收集的抗血清的log2轉化的幾何平均滴度(+S.E.M.)。
[0020]圖7為示出COBRA HA蛋白(方法1共有序列)表達的蛋白質印跡(Western blot)。在體外翻譯COBRA H1N1HA,并通過SDS-PAGE和蛋白質印跡分析細胞培養物裂解液。泳道1，A/新喀里多尼亞/20/1999病毒；泳道2，H1N1C0BRA分泌的HA ;泳道3，H1N1C0BRA5 μ gVLP ；泳道4，C0BRA10 μ g VLP。所述COBRA HA (泳道2)以其預期的分子量遷移，證實了所述合成蛋白的表達。
[0021]序列表
[0022]列于所附序列表的核酸和氨基酸序列使用在37C.F.R.1.822中定義的核苷酸堿基的標準字母縮寫和氨基酸的三字母編碼顯示。只顯示每條核酸序列的一條鏈，但是應理解任何提及所示鏈包括其互補鏈在內。在所附序列表中:
[0023]SEQ ID NO: 1-11為優化的H1N1HA蛋白的氨基酸序列。
[0024]SEQ ID NO: 12為所述優化的H1N1HA蛋白的共有氨基酸序列。
[0025]SEQ ID NO: 13為密碼子優化的H1N1HA的核酸序列。
【具體實施方式】
[0026]1.縮寫
[0027]C0BRA:計算優化的寬反應性抗原[0028]HA:血凝素
[0029]HA1:血凝抑制
[0030]HRP:辣根過氧化物酶[0031 ] Ml:基質蛋白1
[0032]NA:神經氨酸酶
[0033]PFU:空斑形成單位
[0034]VLP:病毒樣顆粒
[0035]I1.術語和方法
[0036]除非另有說明，技術術語以常規用法使用。分子生物學中的常用術語的定義可見于 Benjamin Lewin, genes V,由 Oxford University Press 出版，1994(ISBN0-19-854287-9) ；Kendrew 等(eds.)，The Encyclopedia of MolecularBiology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)和 RobertA.Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive DeskReference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。
[0037]為了便于閱讀本公開內容的各個實施方案，提供了以下對具體術語的解釋:
[0038]佐劑:非特異增強對抗原的免疫應答的物質或載體。佐劑可包括抗原可吸附于其上的礦物質(明礬、氫氧化 鋁或磷酸鹽)的懸浮物；或其中抗原溶液乳化在礦物油中的油包水乳劑(例如，弗氏不完全佐劑)，有時包括滅活的分枝桿菌(mycobacteria)(弗氏完全佐劑)以進一步增強抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可用作佐劑(例如，見美國專利 N0.6，194，388; 6, 207，646; 6, 214，806; 6, 218，371; 6，239，116; 6，339，068; 6,406, 705;和6，429，199)。佐劑還包括生物分子，例如共刺激分子。示例性生物佐劑包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF- a、IFN- y、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、0X-40L 和 41BBL。
[0039]給藥:本文使用的給予受試者組合物是指給予、施用所述組合物或使其與所述受試者接觸。給藥可通過許多途徑中的任一種來完成，例如，局部、口服、皮下、肌肉、腹膜內、靜脈、鞘內和真皮內給藥。
[0040]抗體:由B淋巴細胞產生的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。抗體在人或其他動物中由特異的抗原(免疫原)誘發。抗體通過以某些可證明的方式與抗原特異性反應來表征，抗體和抗原各自以對方來定義。“引起抗體應答”是指抗原或其他分子誘導抗體產生的能力。
[0041]抗原:可在動物中刺激抗體產生或T細胞應答的化合物、組合物或物質，包括注射或吸收到動物中的組合物。抗原與特異性體液或細胞免疫的產物(包括由異源性免疫原誘導的那些)反應。在本公開的組合物和方法的一些實施方案中，所述抗原為流感HA蛋白。
[0042]密碼子優化的:“密碼子優化的”核酸是指已經改變使得密碼子在具體系統(例如物種群中的具體物種)中的表達被優化的核酸序列。例如，核酸序列可為在哺乳動物細胞中表達而進行優化。密碼子優化不改變所編碼的蛋白質的氨基酸序列。
[0043]融合蛋白:通過表達從編碼兩種不同(異源)蛋白質的至少一部分的核酸序列設計的核酸序列而產生的蛋白質。為了產生融合蛋白，所述核酸序列必須在相同的讀碼框內并且不包含內部的終止密碼子。例如，融合蛋白包括融合至異源蛋白的流感HA。
[0044]血凝素(HA):流感病毒表面糖蛋白。HA介導病毒顆粒結合到宿主細胞和隨后的病毒進入所述宿主細胞。本領域已知并可公開獲得許多流感HA蛋白的核苷酸和氨基酸序列，例如儲存于GenBank的那些。HA (和NA —起)是兩個主要的流感病毒抗原決定簇之一。
[0045]免疫應答:免疫系統的細胞(例如B細胞、T細胞、巨噬細胞或多形核細胞)對刺激物(例如抗原或疫苗)的應答。免疫應答可包括參與宿主防衛反應的機體的任何細胞，包括例如，分泌干擾素或細胞因子的上皮細胞。免疫應答包括但不限于先天免疫應答或炎癥。本文所使用的保護性免疫應答是指保護受試者免受感染(預防感染或預防與感染相關的疾病的發生)的免疫應答。測量免疫應答的方法在本領域中已知，包括例如測量淋巴細胞(例如B細胞或T細胞)的增殖和/或活性、細胞因子或趨化因子的分泌、炎癥、抗體產生等等。
[0046]免疫原:在合適的條件下能夠刺激產生免疫應答(例如在動物中產生抗體或T細胞應答)的化合物、組合物或物質，包括注射或吸收到動物中的組合物。本文所使用的“免疫原性組合物”是包含免疫原(例如HA多肽)的組合物。
[0047]免疫:給予受試者保護使其免于患上傳染性疾病，例如通過疫苗接種。
[0048]流感病毒:屬于正粘病毒科家族的分段的負鏈RNA病毒。有A、B和C三種類型的流感病毒。A型流感病毒感染多種鳥和哺乳動物，包括人、馬、海洋哺乳動物、豬、雪貂和雞。在動物中，大多數A型流感病毒引起溫和的呼吸道和腸道的局部感染。然而，高致病性A型流感毒株，例如H5N1，引起家禽的全身感染，其中死亡率可達到100%。2009年，H1N1流感是人流感的最常見原因。2009年出現起源于豬的H1N1的新毒株，并被世界衛生組織宣布為大范圍流行的。該毒株被稱為“豬流感”。H1N1A型流感病毒還是1918年的西班牙流感大流行、1976年的Fort Dix大爆發和1977-1978年的俄羅斯流感大流行的病因。
[0049]分離的:“分離的”生物組分(例如核酸、蛋白質或病毒)已經基本上從其他生物組分中(例如細胞碎片，或其他蛋白質或核酸)分離或純化。已經被“分離的”生物組分包括那些通過標準純化方法純化的組分。該術語還包括重組核酸、蛋白質或病毒(或VLP)，以及化學合成的核酸或肽。
[0050]接頭:在融合蛋白的兩個`多肽之間充當間隔物的一個或多個氨基酸。
[0051]基質(Ml)蛋白:見于病毒包膜中的流感病毒結構蛋白。Ml被認為在裝配和芽殖中起作用。
[0052]神經氨酸酶(NA):—種流感病毒膜糖蛋白。NA通過在被感染細胞的表面從碳水化合物部分切割末端的唾液酸殘基，參與破壞病毒HA的細胞受體。NA還從病毒蛋白上切割唾液酸殘基，防止病毒聚集。NA (和HA—起)為兩種主要的流感病毒抗原決定簇之一。
[0053]可操作地連接:當第一核酸序列與第二核酸序列以有功能關系的方式放置時，所述第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則所述啟動子可操作地連接于所述編碼序列。當需要連接兩個蛋白編碼區域時，所述可操作地連接的DNA序列通常是連續的并且位于相同的讀碼框中。
[0054]優化的流感HA蛋白:本文所使用的“優化的流感HA蛋白”是指通過對選擇的在1918-2011年分離的H1N1流感病毒進行序列比對而產生的HA蛋白共有序列(如下文實施例1所描述)。通過密碼子優化和RNA優化(例如增加RNA穩定性)將(或可以將)編碼優化的HA蛋白的核苷酸序列為在哺乳動物細胞中表達而進一步優化。本文公開(如本文SEQ IDNO: 1-11所示)的優化的流感HA蛋白也稱作“COBRA”序列。設計優化的HA多肽以在受試者中引起寬反應性的免疫應答。在本公開內容的上下文中，“寬反應性”意為所述蛋白序列在受試者中引起足以抑制、中和或預防寬范圍的流感病毒(例如特定亞型中的大多數或全部流感病毒)感染的免疫應答。在一些實例中，所述優化的流感HA蛋白能夠引起針對大多數或全部H1N1流感病毒分離株的免疫應答，例如保護性免疫應答。
[0055]爆發:本文所使用的流感病毒“爆發”是指在給定年份中來自單個國家的病毒分離株的集合。
[0056]可藥用載體:可在本公開中使用的可藥用載體(carrier或vehicle)是常規的° Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E.ff.Martin, Mack PublishingC0., Easton, PA,第15版，(1975),描述了適于一種或多種治療組合物(例如一種或多種流感疫苗，以及其他的藥劑)的藥物遞送的組合物和制劑。
[0057]通常，所述載體的性質取決于采用的具體給藥模式。例如，非消化道的制劑常常包含可注射流體作為載體，所述可注射流體包括可藥用和生理上可接受的流體例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。對于固體組合物(例如，粉劑、丸劑、片劑或膠囊劑形式)，常規的無毒固體載體可包括，例如藥品級甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除生物學中性的載體之外，待給予的藥物組合物可含有少量的無毒輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑和pH緩沖劑等，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。
[0058]多肽:其中單體為通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。當所述氨基酸為α-氨基酸時，可使用L-光學異構體或D-光學異構體。本文所用的術語“多肽”或“蛋白質”意圖包括任何氨基酸序列和包括修飾序列例如糖蛋白。術語“多肽”特別意欲覆蓋天然存在的蛋白質，以及重組或合成產生的那些。術語“殘基”或“氨基酸殘基”包括提及整合入蛋白質、多肽或肽中的氨基酸。
[0059]保守性氨基酸置換是對原來的蛋白質的性質有最少干擾的那些置換，即，所述蛋白的結構，特別是功能被保留 ，且沒有被這些置換而顯著地改變。保守性置換的實例如下所
/j、l Ο:.ImMx'.保守性置換
AlaSer
ArgLys
AsiiCiln, His
AspGIu
CysSer
GinAsn
GluAsp
[0060]Η?8 AM; GlflHeLcll Val
Leulie; Val
LysArg; Gin; Glu
MetLeu; He
PheViet: \ ,cu: Tyr
SerThr
ThrSer
TrpTyr
TyrTrp; Phe
Vallie: Leu[0061]保守置換通常保持了(a)在置換區域中多肽骨架的結構，例如，為片層或螺旋構象，(b)在靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積。
[0062]通常預期在蛋白質性質上產生最大變化的置換會是不保守的，例如發生如下改變(a)親水殘基例如絲氨酰或蘇氨酰置換(或被置換為)疏水殘基例如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨酰或丙氨酰；(b)半胱氨酸或脯氨酸置換(或被置換為)任何其他殘基；(c)具有帶正電荷的側鏈的殘基例如賴氨酰、精氨酰或組氨酰置換(或被置換為)帶負電荷的殘基例如谷氨酰、天冬氨酰；或(d)具有龐大側鏈的殘基例如苯丙氨酸置換(或被置換為)沒有側鏈的殘基例如甘氨酸。
[0063]預防、治療或改良疾病:“預防”疾病是指抑制疾病的全面發生。“治療”是指當疾病已經開始發生后，改良疾病或病理狀態的征象或癥狀的治療干預。“改良”是指減少疾病征象或癥狀的數量或嚴重性。
[0064]啟動子:啟動子是指導核酸轉錄的核酸控制序列的陣列。啟動子包括在轉錄起始位點附近的必需核酸序列。啟動子還任選地包括遠端增強子或抑制子元件。“組成型啟動子”是連續地有活性且不受外部信號或分子調節的啟動子。相反，“誘導型啟動子”的活性受外部信號或分子(例如轉錄因子)調節。在本文的一些實施方案中，所述啟動子為CMV啟動子。
[0065]純化的:術語“純化的”不需要絕對的純度；而是意欲作為相對的術語。因此，例如，純化的肽、蛋白質、 病毒、VLP或其他活性化合物是全部或部分與天然相關的蛋白質和其他污染物分離的化合物。在某些實施方案中，術語“基本上純化的”是指已經從細胞、細胞培養基或其他粗制品中分離且經過分級以去除最初制品的各種組分(例如蛋白質、細胞碎片和其他組分)的肽、蛋白質、病毒、VLP或其他活性化合物。
[0066]重組:重組核酸、蛋白質、病毒或VLP具有非天然存在的序列或具有通過人工組合兩個原本獨立的序列片段而產生的序列。該人工組合常常通過化學合成，或更常見地通過人工操縱分離的核酸片段(例如通過基因工程技術)完成。
[0067]序列同一性:氨基酸或核酸序列之間的相似性被表示為所述序列之間的相似性，或者稱作序列同一性。序列同一性常常以同一性(或相似性或同源性)百分比來度量；所述百分比越高，兩個序列越相似。當使用標準方法進行比對時，給定基因或蛋白質的同系物或變體具有相對高程度的序列同一性。
[0068]用于比較的序列比對方法在本領域是熟知的。多種程序和比對算法描述于:Smith 和 Waterman, Adv.Appl.Math.2: 482，1981 ；Needleman 和 Wunsch, J.Mol.Biol.48: 443，1970 ; Pear son 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85: 2444, 1988 ；Higgins 和 Sharp, Gene73:237-244, 1988 ;Higgins 和 Sharp,CAB10S5:151-153，1989 ;Corpet 等 Nucleic Acids Researchl6:10881-10890，1988 以及 Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444, 1988。Altschul 等 Nature Genet.6:119-129，1994。
[0069]NCBI基礎局部比對搜索工具(BLAST?) (Altschul等J.Mol.Biol.215:403-410, 1990)可以從若干來源獲得，包括美國國立生物技術信息中心(NCBI, Bethesda, MD)和互聯網，用于與序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn 和tblastx聯合使用。
[0070]受試者:活的多細胞脊椎生物——包括人和非人哺乳動物(例如非人靈長類)的種類。
[0071]治療有效量:足以在用特定試劑治療的受試者中達到所需效果的那種試劑的量。例如，這可以是用于在受試者中引起免疫應答和/或用于預防由流感病毒引起的感染或疾病的流感病毒疫苗的量。理想地，在本公開的上下文中，流感疫苗的治療有效量是足以在受試者中增加對流感病毒引起的感染的抵抗力、預防、改良和/或治療所述感染，而不會在所述受試者中產生明顯的細胞毒性效應的量。用于在受試者中增加對感染的抵抗力、預防、改良和/或治療感染的流感疫苗的有效量取決于，例如，被治療的受試者、治療組合物的給藥方式及其他因素。
[0072]轉化的:轉化的細胞是已經通過分子生物學技術將核酸分子導入其中的細胞。本文所使用的術語轉化包括可將核酸分子導入這種細胞中的所有技術，包括用病毒載體轉染、用質粒載體轉化以及通過電穿孔、脂轉染和基因槍加速導入裸露的DNA。 [0073]疫苗:能夠刺激免疫應答的免疫原性材料的制品，其被給予用于預防、改良或治療疾病(例如傳染性疾病)。所述免疫原性材料可包括，例如，弱化或滅活的微生物(例如弱化的病毒)，或來自它們的抗原性蛋白質、肽或DNA。疫苗可引起預防性的和治療性的應答。給藥方法根據所述疫苗有所不同，但可包括接種、食入、吸入或其他給藥形式。接種可通過許多途徑(包括非消化道途徑)中的任一種遞送，例如靜脈、皮下或肌肉。疫苗可與佐劑一起給藥以加強免疫應答。
[0074]載體:載體是允許插入外源核酸而不會破壞所述載體在宿主細胞內的復制和/或整合的能力的核酸分子。載體可包含使其能夠在宿主細胞內復制的核酸序列，例如復制起點。插入型載體能夠將自身插入宿主核酸中。載體還可包括一種或多種選擇性標記基因和其他遺傳元件。表達載體是含有必需調控序列以允許轉錄和翻譯插入的一個或多個基因的載體。在本公開的一些實施方案中，所述載體編碼流感HA、NA或Ml蛋白。在一些實施方案中，所述載體是PTR600表達載體(美國專利申請公開文本N0.2002/0106798; Ross等NatImmunol.1 (2):102-103，2000;Green 等，Vaccine20:242-248，2001)。
[0075]病毒樣顆粒(VLP):由一個或多個病毒結構蛋白組成、但沒有病毒基因組的病毒顆粒。由于VLP沒有病毒基因組，他們是非傳染性的。此外，VLP經常可通過異源表達產生，且可容易地被純化。大多數VLP至少包括驅動芽殖以及從宿主細胞釋放顆粒的病毒核心蛋白。這類核心蛋白的一個實例是流感Ml。在本文的一些實施方案中，流感VLP包含HA、ΝΑ和/或Ml蛋白。流感VLP可通過使用編碼HA和NA蛋白和任選的Ml蛋白的質粒轉染宿主細胞來產生。將所述轉染的細胞孵育適當的一段時間以使得蛋白表達(例如約72小時)后，可從細胞培養物上清液中分離VLP。實施例2提供了從細胞上清液中純化流感VLP的示例性方法。在這個實施例中,通過低速離心(以去除細胞碎片)、真空過濾以及通過20%甘油的超速離心來分離VLP。產生流感VLP的其他方法在本領域中已知(見，例如，美國專利申請公開文本 N0.2006/0263804 ；2008/0031895 ；2010/0166769 ;和 2010/0239610)。
[0076]除非另有說明，本文所用的所有技術術語和科學術語的含義與本公開所屬【技術領域】普通技術人員通常所理解的含義相同。除非文中另有明確說明，單數術語“一”、“一個”和“該”包括復數指代物。類似地，除非文中另有明確說明，“或”意欲包括“和”。因此，“包含A或B”意指包括A或B，或者A和B。還應該理解，為核酸或多肽給出的全部堿基大小或氨基酸大小以及全部分子量或分子質量值是近似值，用于表述目的。雖然與本文描述的方法和材料相似或等價的方法和材料可以用于本公開的實施或測試，但適合的方法和材料在下文描述。本文提到的所有的出版物、專利申請、專利和其他參考文獻以引用的方式全文納入本文。如果出現沖突，以本說明書(包括對術語的解釋)為準。另外，材料、方法和實施例僅是示例性的，不意欲進行限制。
[0077]II1.若干實施方案概述
[0078]本文公開了用于引起針對H1N1流感的寬反應性的免疫應答的優化的H1N1流感HA多肽的產生。基于選擇的分離自1918-2011年的H1N1病毒，通過一系列的HA蛋白比對和隨后的共有序列產生，開發了所述優化的HA多肽。用于產生所述11個HA共有序列的方法在實施例1和附圖1-5中描述。所述11個共有HA多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-11所示。此外，本文提供的SEQ ID NO: 1-11的氨基酸共有序列為SEQ ID N0:12。
[0079]本文提供了具有用于引起針對H1N1流感的寬反應性的免疫應答的優化氨基酸序列的重組流感HA多肽。在一些實施方案中，所述HA多肽包含與SEQ ID N0:USEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO: 9、SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 11 至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98% 或至少 99%相同的氨基酸序列。在其他實施方案中，相對于SEQ ID N0:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO: 10或SEQ ID NO: 11，所述多肽的氨基酸序列包含不多于5個、不多于6個、不多于7個、不多于8個、不多于9個或不多于10個氨基酸置換。
[0080]在具體的實施方案中，提供了包含與SEQ ID N0:1至少99%相同；與SEQ ID NO:2至少99.2%相同；與SEQ ID NO: 3至少99%相同；與SEQ ID NO:4至少99%相同；與SEQ IDNO: 5至少98%或至少99%相同；與SEQ ID NO: 6至少99%相同；與SEQ ID NO: 7至少97%、至少98%或至少99%相同；與SEQ ID NO: 8至少99%相同；包含SEQ ID N0:9 ;與SEQ IDNO: 10至少99%相同；或與SEQ ID NO: 11至少99%相同的氨基酸序列的重組流感HA多肽。
[0081]在其他具體的實施方案中，所述重組流感HA多肽包含與SEQ ID NO: 1的2_566位殘基至少99%相同；與SEQ ID NO: 2的2-566位殘基至少99.2%相同；與SEQ ID NO: 3的2-566位殘基至少99%相同；與SEQ ID NO: 4的2-566位殘基至少99%相同；與SEQ ID NO: 5的2-566位殘基至少98%或至少99%相同；與SEQ ID NO: 6的2-566位殘基至少99%相同；與SEQ ID NO: 7的2-566位殘基至少97%、至少98%或至少99%相同；與SEQ ID NO: 8的2-566位殘基至少99%相同；包含SEQ ID NO:9的2-566位殘基；與SEQ ID NO: 10的2-566位殘基至少99%相同；或與SEQ ID NO: 11的2-566位殘基至少99%相同的氨基酸序列。
[0082]在其他實施方案中、所述HA多肽的氨基酸序列包括⑴相對于SEQ ID NO: 1，不多于5個、不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；(ii)相對于SEQID N0:2，不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；(iii)相對于SEQID NO:3，不多于6個、不多于5個、不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；(iv)相對于SEQ ID N0:4，不多于8個、不多于7個、不多于6個、不多于5個、不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；(v)相對于SEQ ID NO: 5，不多于10個、不多于9個、不多于8個、不多于7個、不多于6個、不多于5個、不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；(vi)相對于SEQ ID N0:6，不多于8個、不多于7個、不多于6個、不多于5個、不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；(vii)相對于SEQ ID N0:7，不多于10個、不多于9個、不多于8個、不多于7個、不多于6個、不多于5個、不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；
(viii)相對于SEQ ID NO:8，不多于10個、不多于9個、不多于8個、不多于7個、不多于6個、不多于5個、不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；(ix)相對于SEQ ID NO: 10,不多于8個、不多于7個、不多于6個、不多于5個、不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；或(X)相對于SEQ ID NO: 11，不多于5個、不多于4個、不多于3個、不多于2個或不多于1個氨基酸置換；
[0083]在一些實例中，所述流感HA多肽包含SEQ ID NO: 1的2_566位殘基、SEQ ID NO: 2的 2-566 位殘基、SEQ ID NO: 3 的 2-566 位殘基、SEQ ID NO: 4 的 2-566 位殘基、SEQ ID NO: 5的 2-566 位殘基、SEQ ID NO: 6 的 2-566 位殘基、SEQ ID NO: 7 的 2-566 位殘基、SEQ ID NO: 8的 2-566 位殘基、SEQ ID NO:9 的 2-566 位殘基、SEQ ID NO: 10 的 2-566 位殘基或 SEQ IDNO: 11的2-566位殘基的氨基酸序列或由其組成。
[0084]在其他實例中，所述重組HA多肽包含SEQ ID N0:U SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQID NO: 10或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或由其組成。
[0085]在另一實例中，所述重組HA多肽包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或由其組成。在另一實例中，所述重組HA多肽包括SEQ ID NO: 12的2-566位殘基的氨基酸序列或由其組成。
[0086]還提供了編碼本文公開的重組HA多肽的分離的核酸分子。在一些實施方案中，將所述核酸分子為在哺乳動物細胞中表達而進行密碼子優化。還任選將所述核酸分子為RNA穩定性而進行優化。在一些實施方案中，所述核酸分子的序列與SEQ ID N0:13至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。在具體實例中，所述核酸分子的序列包括SEQID NO: 13或由其組成。
`[0087]本公開還提供了包含編碼重組HA多肽的核酸分子的載體。所述載體可以是任何適用于表達所述HA多肽的載體，例如哺乳動物表達載體。在具體實例中，所述載體為PTR600表達載體(美國專利申請公開文本N0.2002/0106798,以引用的方式納入本文；Ross等 Nat Immunol.1 (2):102-103，2000;Green 等 Vaccine20:242-248，2001)。
[0088]在一些實例中，所述載體包括可操作地連接至編碼所述HA多肽的核酸序列上的啟動子。在具體實例中，所述啟動子為CMV啟動子。
[0089]還提供了包含所公開的載體的分離的細胞。在某些情況下，所述細胞為任何適用于產生和表達VLP的細胞類型，例如哺乳動物細胞。
[0090]還提供了包含本文公開的優化HA多肽的流感VLP。所述流感VLP還可包括形成病毒顆粒所必需的任何其他流感蛋白。在一些實施方案中，所述流感VLP還包括流感神經氨酸酶(NA)蛋白、流感基質(Ml)蛋白或其兩者。
[0091]還提供了包含本文公開的流感HA多肽的流感VLP，所述流感VLP通過在足以允許表達所述HA、M1和NA蛋白的條件下用編碼所述HA多肽的載體、編碼流感NA蛋白的載體和編碼流感Ml蛋白的載體轉染宿主細胞而產生。
[0092]本公開還提供了包含優化的流感HA多肽的融合蛋白。
[0093]本文還提供了這樣的組合物，即其包含本文公開的優化的流感HA蛋白、或包含所述優化的流感HA蛋白的融合蛋白或VLP。在一些實施方案中，所述組合物還包含可藥用載體和/或佐劑。例如，所述佐劑可為明礬、弗氏完全佐劑、生物佐劑或免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)。
[0094]還 提供了一種通過給予如本文所公開的優化的流感HA蛋白、含有優化的流感HA的融合蛋白、含有優化的流感HA的VLP、或其組合物，在受試者中引起針對流感病毒的免疫應答的方法。在一些實施方案中，所述流感病毒為H1N1流感病毒。在一些實施方案中，可使用任何適合的給藥途徑(例如，肌肉)給予所述HA蛋白、HA融合蛋白或VLP。在一些實施方案中，所述HA蛋白、融合蛋白或VLP作為還包含可藥用載體和/或佐劑的組合物被給予。例如，所述佐劑可為明礬、弗氏完全佐劑、生物佐劑或免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)。
[0095]還提供了一種通過給予受試者含有本文公開的優化的流感HA蛋白的VLP或給予其組合物，針對流感病毒免疫所述受試者的方法。在所述方法的一些實施方案中，所述組合物還包含可藥用載體和/或佐劑。例如，所述佐劑可為明礬、弗氏完全佐劑、生物佐劑或免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)。在一些實施方案中，所述VLP (或其組合物)通過肌肉內給予。
[0096]在引起免疫應答或免疫受試者的方法的一些實施方案中，給予所述受試者約1-約25 μ g的含有優化的HA蛋白的VLP。在具體實例中，給予所述受試者約5-約20 μ g的所述VLP，或約10-約15 μ g的所述VLP。在一個具體的非限制性的實例中，給予所述受試者約15 μ g的所述VLP。然而，本領域技術人員能夠確定給予受試者的VLP的治療有效量(例如提供針對H1N1流感病毒感染的保護的量)。
[0097]IV.優化的H1N1流感HA多肽和多核苷酸
[0098]本文提供了 11個不同的優化的H1N1HA多肽序列。H1N1HA氨基酸序列是從NCBI流感病毒資源數據庫下載。來自分離自1918-2011年的1134個分離株的H1N1HA蛋白被用于產生共有序列。實施例1描述了用于產生每個共有序列的方法(也見圖1-5)。
[0099]COBRA 方法 1 (SEQ ID N0:1)
[0100]MKAKLLVLLCAFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGNCSIAGWILGNPECESLFSKESWSYIVETPNSENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSffPNHTVTKGVTASCSHNGKSSFYRNLLWLTEKNGSYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPSNI⑶QRAIYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEP⑶TIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
[0101]COBRA 方法 2 (SEQ ID NO:2)
[0102]MKAKLLVLLCALTATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGNCSIAGWILGNPECESLFSKKSWSYIAETPNSENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSffPNHTVTKGVTAACSHKGKSSFYRNLLWLTEKNGSYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPSNIGDQRAIYHTENAYVSVVSSHYNRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSG
【權利要求】
1.一種重組流感血凝素(HA)多肽，包含與SEQ ID NO: 1的2-566位殘基至少99%相同，與SEQ ID NO: 2的2-566位殘基至少99.2%相同，與SEQ ID NO: 3的2-566位殘基至少99%相同，與SEQ ID NO:4的2-566位殘基至少99%相同，與SEQ ID NO: 5的2-566位殘基至少98%相同，與SEQ ID NO:6的2-566位殘基至少99%相同，與SEQ ID NO: 7的2-566位殘基至少97%相同，與SEQ ID NO:8的2-566位殘基至少99%相同，包含SEQ ID NO:9的2-566位殘基，與SEQ ID NO: 10的2-566位殘基至少99%相同，或與SEQ ID NO: 11的2-566位殘基至少99%相同的氨基酸序列。
2.權利要求1的流感HA多肽，包含與SEQID NO: 1至少99%相同，與SEQ ID NO:2至少99.2%相同，與 SEQ ID NO:3 至少 99%相同，與 SEQ ID NO:4 至少 99%相同，與 SEQ ID NO:5至少98%相同，與SEQ ID NO:6至少99%相同，與SEQ ID NO: 7至少97%相同，與SEQ IDN0:8 至少 99%相同，包含 SEQ ID N0:9，與 SEQ ID NO: 10 至少 99%相同，或與 SEQ ID NO: 11至少99%相同的氨基酸序列。
3.權利要求1或權利要求2的流感HA多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含:(i)相對于SEQID NO: 1不多于5個氨基酸置換；(ii)相對于SEQID NO:2不多于4個氨基酸置換；(iii)相對于SEQID NO:3不多于6個氨基酸置換；(iv)相對于SEQID NO:4不多于8個氨基酸置換；(v)相對于SEQID NO:5不多于10個氨基酸置換；(vi)相對于SEQID NO:6不多于8個氨基酸置換；(vii)相對于SEQID NO:7不多于10個氨基酸置換；(viii)相對于SEQID NO:8不多于10個氨基酸置換；(ix)相對于SEQID NO: 10不多于8個氨基酸置換；或(X)相對于SEQ ID NO: 11不多于5個氨基酸置換。
4.權利要求1的流感HA多肽，包含SEQID NO: 1的2-566位殘基，SEQ ID N0:2的2-566 位殘基，SEQ ID NO: 3 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO: 4 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO: 5 的2-566 位殘基，SEQ ID NO:6 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO:7 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO:8的 2-566 位殘基，SEQ ID NO:9 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO: 10 的 2-566 位殘基或 SEQ IDNO: 11的2-566位殘基的氨基酸序列。
5.權利要求1的流感HA多肽，由SEQID NO: 1的2-566位殘基，SEQ ID NO: 2的2-566位殘基，SEQ ID NO: 3 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO: 4 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO: 5 的 2-566位殘基，SEQ ID NO: 6 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO: 7 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO: 8 的 2-566位殘基，SEQ ID NO:9 的 2-566 位殘基，SEQ ID NO: 10 的 2-566 位殘基或 SEQ ID NO: 11 的2-566位殘基的氨基酸序列組成。
6.權利要求2 的流感 HA 多肽，包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
7.權利要求2 的流感 HA 多肽，由 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列組成。
8.編碼權利要求1-7任一項的流感HA多肽的分離的核酸分子。
9.權利要求8的分離的核酸分子，其中所述核酸分子為在哺乳動物細胞中表達而進行密碼子優化。
10.包含權利要求8或權利要求9的核酸分子的載體。
11.權利要求10的載體，還包含可操作地連接至編碼所述流感HA多肽的核酸序列的啟動子。
12.包含權利要求10或權利要求11的載體的分離的細胞。
13.包含權利要求1-7任一項的流感HA多肽的流感病毒樣顆粒(VLP)。
14.權利要求13的流感VLP，還包含流感神經氨酸酶(NA)蛋白、流感基質(Ml)蛋白或其二者。
15.包含權利要求1-7任一項的流感HA多肽的流感VLP，其通過在足以使所述HA、Ml和NA蛋白表達的條件下，使用編碼所述HA多肽的載體、編碼流感NA蛋白的載體和編碼流感Ml蛋白的載體轉染宿主細胞來產生。
16.包含權利要求1-7任一項的流感HA多肽的融合蛋白。
17.—種組合物，其包含權利要求1-7任一項的流感HA多肽、權利要求16的融合蛋白或權利要求13-15任一項的VLP和可藥用載體。`
18.一種在受試者中引起針對流感病毒的免疫應答的方法，包括給予權利要求1-7任一項的流感HA多肽、權利要求16的融合蛋白、權利要求13-15任一項的VLP或權利要求17的組合物。
19.一種針對流感病毒免疫受試者的方法，包括給予所述受試者包含權利要求13-15任一項的VLP和可藥用載體的組合物。
20.權利要求19的方法，其中所述組合物還包含佐劑。
21.權利要求19或權利要求20的方法，其中所述組合物通過肌肉給予。
22.權利要求19-21任一項的方法，其中所述組合物包含約1-約25μ g的所述VLP。
23.權利要求22的方法，其中所述組合物包含約15μ g的所述VLP。
24.—種包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的重組流感HA多肽。
25.權利要求1-7任一項的流感HA多肽、權利要求16的融合蛋白、權利要求13-15任一項的VLP或權利要求17的組合物在用于在受試者中引起針對流感病毒的免疫應答的方法中的用途。
【文檔編號】C12N15/33GK103732749SQ201280039877
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年6月20日 優先權日:2011年6月20日
【發明者】T·M·羅斯, B·M·吉爾斯, C·J·克里瓦爾 申請人:高等教育聯邦系統-匹茲堡大學