從混合核酸樣品分離靶核酸的制作方法
【專利摘要】本發明提供了用于將靶核酸從混合核酸樣品中分離的方法、組合物和試劑盒。所述方法、組合物和試劑盒包括非進行型內切核酸酶(例如，限制性內切酶)或結合靶核酸(例如，具有甲基化特異性)的抗體。混合核酸樣品可包含原核和真核生物核酸和/或來自超過一種原核或真核生物體的核酸。
【專利說明】從混合核酸樣品分離靶核酸
[0001 ] 關于聯邦政府資助的研究或開發的聲明
[0002]本發明是在由國土安全部授予的合同號:
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[0007]發明背景
[0008]本發明總地來說涉及 用于從混合核酸樣品分離靶核酸的方法和組合物。
[0009]生物威脅物的快速檢測和詳盡分析在緩和對目標群體的影響中是非常重要的。檢測和分析的一般方法是收集環境樣品(空氣、水、食物、人組織)并且確定樣品是否包含來自生物威脅物(細菌、病毒等)的任何核酸(DNA或RNA)。該方法中主要遇到的問題是環境樣品不是純的，通常包含比靶生物威脅物核酸顯著更多的本底真核生物核酸，從而使得難以分離或擴增靶核酸。事實上，原核和真核生物核酸的復雜混合物在自然界中是常見的；生物體的混合群體存在于空氣、水和土壤中，并且細菌和植物或人的共生體是生命的真實狀態。除了檢測樣品中的這些生物威脅物外，還存在從更大的真核生物基因組(2.3兆堿基-16千兆堿基)分開和分離相對小的生物威脅物例如細菌(4-6兆堿基)的基因組的研究和商業原因。換句話說，該基因組大小差異相當于單個人細胞給混合物提供為單個大腸桿菌(E.coli)細胞的約1000倍的遺傳物質。這具有從大多數混合樣品產生巨大量的真核生物DNA的作用，從而妨礙混合樣品中細菌的檢測和鑒定。
[0010]敗血癥是其中生物威脅物的檢測是非常困難的狀況的一個實例。敗血癥是世界范圍內非冠脈重癥監護病房的首要致死原因，并且其復雜病原范圍包括革蘭陽性和革蘭陰性細菌。已報道血液中的細菌水平超過1000個菌落形成單位(CFU)/mL血液，在其它情況下少于lCFU/mL血液。即使在最高濃度水平(約1000個細菌/ml血液)，細菌DNA相較于相同體積中的IO9個血細胞(IO7個包含DNA)(這等同于人DNA是細菌DNA的1000萬倍)也是微不足道的。
[0011 ] 從包含真核生物DNA的混合樣品分開和分離細菌DNA的綜合解決方法目前還不可獲得。通常培養混合樣品以差異性擴大細菌在樣品中的百分比。實際上，對于敗血癥，參照實驗室中病原體鑒定的標準仍然是通過培養物的檢測。一般地，培養物需要I至5天來使病原體充足地生長出來以進行確認。培養法也是用于食品測試和環境樣品的標準。通過監控炭疽芽孢桿菌(B.anthraxcis)-特異性噬菌體產生的斑，細菌感染的鑒定在炭疽感染中變得更快，提供了大于90%的靈敏度和特異度。然而，FDA批準的噬菌體裂解測定是基于實驗室的，需要由熟練技術員花費8-24小時來完成，并且僅僅是枚舉細菌而非將其純化出來進行分析。
[0012]作為基于培養物的檢測法的替代法，可將從混合原核/真核生物環境樣品分離的核酸經歷基于高靈敏性聚合酶鏈式反應(PCR)的測定來檢測生物威脅物靶序列。例如，FDA已批準了用于從鼻拭子鑒定特定威脅物例如金黃色葡萄球菌(S.aureus)和鏈球菌屬的某些種(Streptococcus spp.)的快速實時PCR技術。金黃色葡萄球菌Gene Ohm試劑盒(Becton Dickinson, USA)需要鼻拭子的懸浮物,快速裂解,隨后在約2小時內以公布的98.9%的靈敏度和96.7%的特異度進行擴增。然而，鼻拭子樣品的真核生物核酸本底相較于血液樣品較低。此外，該方法限定于特定細菌的單純檢測，從而不允許分離和純化細菌靶基因組以進行分析，從而在檢測未知原核生物威脅物中是無效的。
[0013] 血液中細菌的檢測已從通過機械/化學裂解產生的粗制裂解物實現。在該方法中，原核生物DNA的檢測需要昂貴的實時PCR測定，例如Roche SeptiFastTM系統，或可選擇地，質譜測定例如Abbot Plex-1D系統。這些系統未被FDA批準，并且僅可處理1.5ml的血液，限制了其靈敏度。此外，這些測定也不允許從原核生物威脅物分離和純化遺傳物質以用于另外的分析。
[0014]因此，需要允許選擇性分離混合樣品中的原核生物核酸，從而允許進一步分析和表征靶原核生物基因組的方法。此外，需要允許基于非特異性原核生物性狀的分開和分離以便可能鑒定和表征先前未知的細菌威脅物的方法。最后，需要不需要昂貴的定量PCR測定的方法。
[0015]發明概述
[0016]鑒于與目前分離方案相關的問題，本發明提供了用于從核酸的混合樣品高效分離核酸(例如，將原核生物或細菌核酸與真核生物核酸分開)的方法、組合物和試劑盒。在一些實施方案中，方法利用對于原核生物界獨特的DNA的表觀遺傳學修飾，從而提供了原核生物核酸從混合環境或臨床樣品的快速高效分離和鑒定。這樣，本發明允許快速診斷和允許進一步基因組表征和分析生物威脅物。
[0017]在一個實施方案中，方法包括步驟:(I)在足以允許表觀遺傳結合劑與具有表觀遺傳學修飾的核酸形成復合物的條件下，將表觀遺傳結合劑應用于樣品；(2)分離表觀遺傳學結合劑/核酸復合物；(3)純化存在于分離的復合物中的核酸；和(4)分析純化的核酸。在一個方面，表觀遺傳學結合劑是特異性結合原核生物表觀遺傳學修飾的分子或分子復合物，所述表觀遺傳學修飾是例如選自N4-甲基胞嘧啶(MmC)、N6-甲基腺嘌呤(N6mA)和任何其它原核生物特異性表觀遺傳學修飾。表觀遺傳學結合劑選自多克隆抗體、單克隆抗體、綴合的多克隆或單克隆抗體、限制性內切酶、綴合的限制性內切酶、結合-突變型限制性內切酶以及具有對于上述表觀遺傳學修飾的特異性親和力的其它分子或分子復合物。
[0018]在另一個實施方案中，提供了表觀遺傳學特異性降解法。方法包括在足以允許表觀遺傳學特異性降解因子在缺乏特定表觀遺傳學修飾的序列上選擇性切割核酸的條件下將表觀遺傳學特異性降解因子應用于樣品，其中所述表觀遺傳學修飾存在于靶核酸中。在表觀遺傳學特異性切割后，非靶核酸被耗盡，并且靶核酸被分析。可向該方法添加額外的步驟，所述步驟將在下文中的詳細說明中進行進一步論述。
[0019]在另一個實施方案中，提供了表觀遺傳學-結合劑組合物。在優選實施方案中，表觀遺傳學結合劑是針對特異于靶核酸的表觀遺傳學修飾例如MmC或N6mA的單克隆抗體或其抗原結合片段。在相關實施方案中，表觀遺傳學結合劑是突變的限制性內切酶，其在具有特異于靶核酸的表觀遺傳學修飾的子序列上選擇性結合靶核酸，但不切割靶核酸。在任一實施方案中，任選地生物素化表觀遺傳學結合劑，或用第二分子綴合表觀遺傳學結合劑以幫助從樣品分離結合劑/核酸復合物。
[0020]本發明不限于上述實施方案，根據下文中的詳細說明中提供的論述和實施例其它實施方案和應用將變得顯然。
[0021]附圖概述
[0022]根據下列詳細說明和附圖，可更全面地理解本發明的不同實施方案，所述詳細說明和附圖形成了本申請的部分。
[0023]圖1A顯示了用于MADA展示的合成接頭的序列(SEQ ID NO:1)。接頭具有與GATC位點相容的多核苷酸懸突。引物使得能夠擴增包含接頭的片段(例如，引物#1和引物#2，如所標示)(SEQ ID N0:8和9)。必要時存 在NotI限制性位點以用于片段的線性化。圖1B顯示可用于MADA展示的替代性合成接頭序列(SEQ ID N0:2_7，其中SEQ ID N0:2與3退火，SEQ ID N0:4 與 5 退火，SEQ ID N0:6 與 7 退火)。
[0024]圖2顯示甲基化選擇性降解使得能夠分離原核生物(大腸桿菌)和真核生物(小麥)DNA。DpnI僅切割在GATC位點的腺嘌呤上甲基化的DNA。DpnII僅當GATC未被甲基化時才切割。細菌和真核生物DNA的混合物是差異限制性的，從而使得能夠通過限制性末端的尺寸或相容性來進行分離。
[0025]可作圖的序列讀出的超高通量篩選(UHTS)鑒定在圖3中顯示了細菌的富集。將序列的MegaBlast分類作圖，顯示了細菌序列的近30倍的富集(圖3A和3B)。還顯示了純化前和純化后降解的生物體混合物中包含GATC位點的序列讀出的分析(圖3C和3D)。
[0026]圖4顯示N6mA富集導致大腸桿菌K-12MG1655的高均勻覆蓋。將ICx BioassaysSPEED導管用于將每一個讀出的前32bp定位至染色體的線性圖示。(圖4A和4C)。覆蓋深度從富集前的0.24躍升至富集后的6.0X。列出了 99%的所得覆蓋水平。(圖4B和4D)。按位置的覆蓋顯示在整個染色體上的平均分布。
[0027]圖5顯示連接至粘性BamHI末端的接頭使分子環化并且保護它們免受降解，從而使得能夠進行PCR擴增。
[0028]圖6顯示線性相對于環狀DNA分子的選擇性降解，這使得能夠選擇性擴增靶分子。DpnII限制性酶切的人基因組DNA(gDNA)對質粒安全性DNA酶敏感(比較泳道2和3)，而通過接頭連接產生的環狀分子(泳道5，pUC19對照)對所述酶不敏感。
[0029]圖7顯示利用接頭連接的表觀遺傳學特異性降解法對于分離和擴增混合樣品中的靶DNA是有效的。
[0030]圖8顯示利用接頭連接的表觀遺傳學特異性降解法有效地擴增細菌基因組DNA，同時選擇性降解單個混合物中的人基因組DNA。
[0031]圖9在表觀遺傳學特異性富集后使用QPCR定量細菌基因組富集和人基因組降解的水平。針對人男性DNA的DYZ基因座和大腸桿菌細菌DNA的16S基因座的引物和探針用于測量擴增前和擴增后混合物中來自每一種生物體的基因組DNA的水平。
[0032]圖10顯示在修飾條件下，限制性內切酶能選擇性結合N6mA而不進行切割。
[0033]圖11顯示生物素化的DpnI (bDpnl)優先于重疊的未甲基化的651bp DNA片段特異性結合甲基化477bp DNA片段并且阻滯其凝膠遷移。
[0034]圖12顯示首先與甲基化的477bp DNA片段一起溫育、隨后與抗生物素蛋白珠粒一起溫育的bDpnl顯示出比用bDpnl預先涂覆抗生物素蛋白珠粒時更低的特異性。[0035]圖13顯示通過凝膠分析評估的靶DNA在前哨DNA片段上的結合的特異度。將IOOng的非靶DNA片段(651bp)和IOOng的靶DNA片段(477bp)混合，將其與80ul至180ul的bDpnl涂覆的抗生物素蛋白珠粒結合。30分鐘后，將來自洗滌或洗脫級份的樣品加載至瓊脂糖凝膠上。前哨片段可用作評估反應的效率的對照。
[0036]圖14顯示從包含Iug的人DNA的混合樣品回收細菌靶DNA的效率。將遞減量的大腸桿菌基因組DNA(IOng-1pg)摻入Iug的人DNA。利用針對細菌16S和人DYZ (各自針對它們各自的標記物頻率進行標準化)的定量聚合酶鏈式反應(qPCR)評估回收。
[0037]圖15顯示細菌和人DNA的結合時間過程，所述結合時間過程顯示本發明的實施方案的快速結合和高度特異性。將bDpnl涂覆的珠粒添加至500pg的大腸桿菌(帶方框的虛線)與Iug的人男性DNA(帶圓圈的虛線)的混合物中。在指定的時間上，利用磁鐵收集珠粒并洗滌。將大腸桿菌的16S基因和人的DYZ的qPCR用于定量結合的量。
[0038]圖16顯示示例性基因組混合物以及SCODA和DpnI富集法的作用。
[0039]圖17顯示DpnI富集使基因組覆蓋增加至約15倍而不在整個4.6MB基因組上引入顯著的偏向性。圖17A顯示富集前覆蓋，插圖以20倍增加的尺度顯示相同的數據來突出顯示富集前基因組覆蓋模式。圖17B顯示富集后覆蓋顯著增加。顯示了關鍵特征例如基因組覆蓋的低和高點(分別為末端和復制起始點(OriC))，和覆蓋中的人工摻入(細菌噬菌體DLP, Rec 和 Qin)。[0040]圖18顯示抗血清對N6-甲基-2-脫氧腺苷(N6mA)的特異性。通過利用不同水平的腺嘌呤(方塊)或N6mA (菱形)攻擊在競爭性ELISA版式中測試一式三份血清樣品。誤差棒描述了樣品間的標準差。僅IOOng的N6mA導致50%的血清對N6mA涂覆的ELISA板的結合的抑制。與之相比較，IOug的腺嘌呤(試劑的100倍增加)導致約30%的抑制。
[0041]圖19顯示來自甲基化和未甲基化的寡核苷酸上的測試的多克隆和單克隆抗體的ELISA信號。圖19A顯示將含腺嘌呤㈧或N6m-腺嘌呤(6mA或N6mA)的寡核苷酸固定在微量滴定孔中，并且測試其對不同抗體的結合。來自N6mA寡核苷酸的高信號和相應地來自未甲基化的寡核苷酸的低信號表示特異性，如通過3個分隔的克隆所例示的。可將這些與來自小鼠1、4、8、9的最終取血多克隆血清(4個分隔的克隆)相比較。也顯示了無抗體對照(無abs)。圖19B顯不6mA對A的信號比。
[0042]圖20顯示圖19的抗體對人和大腸桿菌基因組DNA的特異性。通過滴定每一個孔中的列出的基因組DNA進行ELISA。450mm處的光密度(0D450)顯示抗體對每一個基因組的反應性。
[0043]圖21顯示實施例7的方法的流程圖。
[0044]圖22顯示摻入土壤樣品的大腸桿菌DNA相較于單獨的大腸桿菌DNA不能擴增，這表明PCR的抑制劑存在于土壤樣品中。從喜林芋屬或雞蛋花屬植物下方收集富含腐殖酸的商業表層土壤樣品。級份表示為〃非靶〃或〃靶〃，如實施例8中描述的。
[0045]圖23顯示從河床淤泥或淺表河水、赭石包被的沙或火山泥分離的DNA的16S PCR特征譜。無模板對照(NTC)和人DNA不被16S引物擴增，而IOOng的大腸桿菌產生具有細菌生物體的特征的條帶。此外，來自河床淤泥、珊瑚砂丘和火山泥洗液的分離的DNA和未結合的級份不擴增。結合和洗脫的級份從所有樣品擴增。
[0046]圖24顯示黑麥花粉對利用和不利用DpnI富集的大腸桿菌16SqPCR測定的影響。將通過16S qPCR測定檢測的大腸桿菌DNA的量作為花粉輸入物的函數作圖(實線)，而大腸桿菌的水平保持恒定(虛線)。隨后將抑制水平的花粉(10，000和100，000ug/ml)摻入使用DpnI分離的大腸桿菌樣品。將結合的("DpnI結合的％")和未結合的("DpnI未結合的％〃)級份中檢測到的大腸桿菌DNA的量以占大腸桿菌DNA的總量的百分比作圖。
[0047]發明詳述
[0048]本發明涉及特異于來自特定來源的核酸的表觀遺傳學修飾的利用。在一個應用中，本發明的實施方案可用于分開和分離存在于包含過量真核生物DNA的樣品中的原核生物DNA。更具體地，本發明的實施方案涉及利用對于原核生物DNA獨特的表觀遺傳學修飾，以選擇性分離和分析在混合樣品中發現的原核生物DNA。
[0049]在一些實施方案中，本發明涉及用于從包含靶核酸和非靶核酸的混合樣品分離靶核酸的方法。在一些實施方案中，方法包括將所述混合樣品與非進行型內切核酸酶或結合靶核酸(例如，結合靶核酸的表觀遺傳學修飾或甲基化)的抗體或其抗原結合片段接觸。在一些實施方案中，方法包括(i)將混合樣品與非進行型內切核酸酶或結合靶核酸的抗體或其抗原結合片段接觸；和(ii)將包含復合物的樣品的第一級份與包含非靶核酸的樣品的第二級份分開。在一些實施方案中，方法包括(i)將所述混合樣品與非進行型內切核酸酶或結合靶核酸的抗體或其抗原結合片段接觸，其中形成非進行型內切核酸酶或抗體或其抗原結合片段與靶核酸的復合物；和(ii)將包含復合物的樣品的第一級份與包含非靶核酸的樣品的第二級份分離。在一些實施方案中，保留第一級份和第二級份。在一些實施方案中，非進行型內切核酸酶結合靶核酸，但不切割靶核酸。在一些實施方案中，方法還包括
(iii)將(ii)的第一級份與非進行型內切核酸酶或結合靶核酸的抗體或其抗原結合片段接觸；其中非進行型內切核酸酶結合靶核酸，但不切割靶核酸；其中形成非進行型內切核酸酶或抗體或其抗原結合片段與靶核酸的復合物；和(vi)將包含(iii)的復合物的級份與包含非靶核酸的樣品的級份分離。
[0050]本發明的其它實施方案涉及用于富集包含靶核酸和非靶核酸的混合樣品中的靶核酸的方法。在一些實施方案中，方法包括利用切割靶核酸但不切割非靶核酸的甲基化敏感性或甲基化依賴性內切核酸酶降解所述混合樣品，或用結合表觀遺傳學修飾的抗體或其抗原結合片段溫育所述混合樣品。在一些實施方案中，方法還包括利用內切核酸酶降解樣品；其中內切核酸酶切割非靶核酸但不切割靶核酸，從而導致與切割的靶核酸不相容的非靶核酸末端。在一些實施方案中，方法還包括將連接子連接至切割的靶核酸，或環化切割的靶核酸。在一些實施方案中，方法還包括耗盡非靶核酸。
[0051] 本發明還涉及用于將靶核酸與混合樣品分離的組合物和試劑盒。在一些實施方案中，組合物包含(i)含有靶核酸和非靶核酸的混合樣品和(ii)結合靶核酸但不切割靶核酸的非進行型內切核酸酶，或結合靶核酸的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，試劑盒包括(i)結合靶核酸但不切割靶核酸的生物素化的非進行型內切核酸酶；和(ii)具有適合于非進行型內切核酸酶結合靶核酸但不切割靶核酸的條件的緩沖液。在一些實施方案中，試劑盒包括識別甲基化核酸的生物素化的非進行型內切核酸酶。在其它實施方案中，試劑盒包括(i)結合靶核酸但不切割靶核酸的生物素化的非進行型內切核酸酶，或結合靶核酸的生物素化抗體或其抗原結合片段；(ii)固體支持材料；和(iii)特異于生物素化的結合劑。在一些實施方案中，試劑盒還包括甲基化核酸陽性對照。[0052]DNA的修飾見于所有界中。追尋本發明，檢查DNA甲基化的不同形式，并指出N4-甲基胞嘧啶(MmC)和N6-甲基腺嘌呤(N6mA)僅見于或主要見于細菌中。N6mA特別具有吸引力，因為其作為DNA腺嘌嶺甲基化酶(DAM)蛋白修飾的結果僅見于細菌中，雖然在原核生物中還存在其它腺嘌呤甲基化酶。DAM是在細菌(包括但不限于霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和假結核耶爾森菌(Yersinia pseudotubercolosis))中發現的必需腺嘌呤甲基化酶。表I提供了顯示dam甲基化的細菌的非完全列表。許多細菌在GATC序列內的腺嘌呤的N6位置甲基化，所述甲基化在染色體中大致每256個堿基發生一次，從而產生遍在的靶。細菌毒力通過N6mA進行控制，包括鞭毛、菌毛、粘著蛋白的產生、I1、III和IV型分泌、毒素合成和輸出。當細菌復制它們的基因組時，它們可通過甲基化的不存在將初生子鏈與親代區分開來。因此，本發明的實施方案利用了細菌籍以識別它們自己的親代DNA的該機制，這是對細菌的存活和病原性至關重要的功能，對于該功能已進行了研究。先前已利用抗體實現了除N6mA外的修飾的核苷酸的檢測。
[0053] 表1.使用dam甲基化的威脅性細菌
[0054]
【權利要求】
1.一種用于從包含靶核酸和非靶核酸的混合樣品分離靶核酸的方法，包括: (i)將所述混合樣品與非進行型內切核酸酶接觸； 其中所述非進行型內切核酸酶結合靶核酸，但不切割靶核酸； 其中形成所述非進行型內切核酸酶與所述靶核酸的復合物；和 (ii)將包含所述復合物的樣品的第一級份與包含所述非靶核酸的樣品的第二級份分開。
2.權利要求1的方法，其中保留所述第一級份和第二級份。
3.權利要求1的方法，其中所述混合樣品包含分離至所述第一級份或所述第二級份中的抑制劑。
4.權利要求3的方法，其中所述抑制劑是腐殖酸。
5.權利要求3的方法，其中所述抑制劑是柴油機煙塵。
6.權利要求3的方法，其中所述抑制劑是選自表6的抑制劑。
7.權利要求3的方法，其中所述抑制劑是環境或臨床污染物。
8.權利要求1的方法，其中所述混合樣品包含來自至少兩種不同原核生物體的核酸。
9.權利要求1的方法,其中所述混合樣品包含來自人和細菌生物體的核酸。
10.權利要求1的方法,其中所述混合樣品包含來自真核和原核生物體的核酸。
11.權利要求1的方法，其中所述混合樣品包含來自至少兩種不同真核生物體的核酸。
12.權利要求1的方法，其中所述混合樣品包含來自未知生物體的核酸。
13.權利要求1的方法，其中所述接觸在具有適合于所述非進行型內切核酸酶結合靶核酸但不切割所述靶核酸的條件的緩沖液中進行。
14.權利要求13的方法，其中所述述緩沖液包含適合于所述非進行型內切核酸酶結合靶核酸但不切割靶核酸的Mg2+濃度。
15.權利要求14的方法,其中所述Mg2+濃度低于10mM。
16.權利要求13的方法，其中所述述緩沖液不包含Mg2+。
17.權利要求13的方法，其中所述述緩沖液包含二價陽離子。
18.權利要求13的方法，其中所述緩沖液包含Ca2+、Cd2+、Sr2+、Ba2+、Co2+或Mn2+。
19.權利要求13的方法，其中所述緩沖液包含濃度為至少50mM的Ca2+。
20.權利要求13的方法，其中所述緩沖液包含為緩沖液的Mg2+濃度至少500倍的Ca2+濃度。
21.權利要求13的方法，其中所述緩沖液包含5-7的pH。
22.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶在內切核酸酶的陽離子結合基序中包含突變。
23.權利要求22的方法，其中突變是選自表3的突變。
24.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶包含選自ro基序、D/EXK基序、H-N-H基序或GIY-YIG基序的基序。
25.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶結合具有甲基化核酸的識別位點。
26.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶不結合具有甲基化核酸的識別位點。
27.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶具有甲基化特異性。
28.權利要求27的方法，其中所述非進行型內切核酸酶具有對于N4-甲基胞嘧啶或N6-甲基腺嘌呤的特異性。
29.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶包含可檢測的標記。
30.權利要求29的方法，其中所述可檢測的標記是生物素、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、多組氨酸(HIS)或地高辛。
31.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶不具有催化活性。
32.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶具有低于0.1%的催化活性。
33.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶具有低于1%的催化活性。
34.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶具有低于10%的催化活性。
35.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶是非進行型限制性內切酶。
36.權利要求1的方 法，其中所述非進行型內切核酸酶是Dpnl。
37.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶是重組酶、解離酶、轉座酶、整合酶、修復酶、硫代磷酸酯蛋白例如DptBCDE或DptFGH或其它DNA結合蛋白。
38.權利要求1的方法，其中所述非進行型內切核酸酶結合至固體基質。
39.權利要求38的方法，其中所述固體基質是磁珠、微量滴定板孔、柱子表面。
40.權利要求1的方法,其中分離的核酸是至少90%的靶基因組。
41.權利要求1的方法，其中所述方法需要少于80分鐘來完成。
42.權利要求1的方法，其中所述方法需要少于20分鐘來完成。
43.權利要求1的方法，其中所述混合樣品中的少于10%的非靶核酸被分離至所述第一級份中。
44.權利要求1的方法，其中所述混合樣品中的少于1%的非靶核酸被分離至所述第一級份中。
45.權利要求1的方法，其中所述混合樣品中的至少90%的靶核酸被分離至所述第一級份中。
46.權利要求1的方法，其中所述混合樣品包含5或更多log的非靶核酸。
47.權利要求1的方法，其中所述混合樣品包含少于IOpg的靶核酸。
48.權利要求1的方法，其還包括: (iii)將(ii)的第一級份與非進行型內切核酸酶接觸； 其中所述非進行型內切核酸酶結合所述靶核酸，但不切割所述靶核酸； 其中形成所述非進行型內切核酸酶與所述靶核酸的復合物；和 (vi)將包含(iii)的復合物的級份與包含非靶核酸的樣品的級份分開。
49.用于富集包含靶核酸和非靶核酸的混合樣品中的靶核酸的方法，包括: (i)利用切割靶核酸但不切割非靶核酸的甲基化敏感性或甲基化依賴性內切核酸酶降解所述混合樣品； (ii)利用內切核酸酶降解樣品；其中所述內切核酸酶切割非靶核酸但不切割靶核酸，從而產生與切割的靶核酸不相容的非靶核酸末端； (iii)將連接子連接至切割的靶核酸，或環化切割的靶核酸；和 (iv)耗盡所述非靶核酸。
50.權利要求49的方法，其中(iii)的環化靶核酸抗利用DNA酶或外切核酸酶的降解。
51.權利要求50的方法，其中(iii)的環化靶核酸抗利用質粒安全DNA酶、λ外切核酸酶、外切核酸酶V(RecB⑶)或外切核酸酶III的降解。
52.權利要求49的方法，其中所述連接子抗(iv)的耗盡。
53.權利要求49的方法，其中所述連接子包含選自顛倒的dT、硫代磷酸酯、莖環、甲基化、羥甲基化、腺苷酰化、葡糖基化和4個核苷酸或更長的3’ OH末端懸突的修飾。
54.權利要求49的方法，其中(ii)的內切核酸酶是在非靶核酸上形成平端的限制性內切核酸酶。
55.權利要求49的方法，其中非靶核酸的限制性內切核酸酶識別序列位于靶核酸的限制性內切核酸酶識別序列內。
56.權利要求49的方法，還包括使用針對連接子的引物擴增所述靶核酸。
57.權利要求56的方法，其中通過滾環擴增進行所述擴增。
58.權利要求56的方法，其中通過聚合酶鏈式反應進行所述擴增。
59.權利要求56的方法，其中使用Phi29DNA聚合酶進行所述擴增。
60.權利要求49的方法，其中同時進行(i)和(ii)。
61.權利要求49的方法，其中在(ii)之前進行(iv)。
62.權利要求49的方法，其中通過凝膠分離、大小排阻或外切核酸酶降解來進行所述耗盡。
63.一種用于從混合樣品分離靶核酸的組合物，其包含: (i)包含靶核酸和非靶核酸的混合樣品； (ii)結合至靶核酸但不切割所述靶核酸的非進行型內切核酸酶。
64.權利要求63的組合物，其中所述混合樣品包含來自人和細菌生物體的核酸。
65.權利要求63的組合物，其中所述混合樣品包含來自真核和原核生物體的核酸。
66.權利要求63的組合物，其中所述非進行型內切核酸酶在所述內切核酸酶的陽離子結合基序中包含突變。
67.權利要求63的組合物，其中所述非進行型內切核酸酶具有甲基化特異性。
68.權利要求63的組合物，其中所述非進行型內切核酸酶具有對于N4-甲基胞嘧啶或N6-甲基腺嘌呤的特異性。
69.權利要求63的組合物，其中所述非進行型內切核酸酶包含可檢測的標記。
70.權利要求63的組合物，其中所述非進行型內切核酸酶具有少于10%的催化活性。
71.權利要求63的組合物，其中所述非進行型內切核酸酶是非進行型限制性內切酶。
72.權利要求63的組合物，其中所述非進行型內切核酸酶是Dpnl。
73.一種用于從包含靶核酸和非靶核酸的混合樣品擴增靶核酸的試劑盒，其包括: (i)結合靶核酸但不切割所述靶核酸的生物素化的非進行型內切核酸酶；和 (ii)具有適合所述非進行型內切核酸酶結合靶核酸但不切割所述靶核酸的條件的緩沖液。
74.權利要求73的試劑盒，其中所述緩沖液包含適合所述非進行型內切核酸酶結合靶核酸但不切割所述靶核酸的Mg2+濃度。
75.權利要求74的試劑盒，其中所述Mg2+濃度低于10mM。
76.權利要求73的試劑盒，其中所述緩沖液包含至少50mM的Ca2+濃度。
77.權利要求73的試劑盒，其中所述緩沖液包含5-7的pH。
78.一種用于從包含靶核酸和非靶核酸的混合樣品擴增靶核酸的試劑盒，其包括:(i)結合靶核酸但不切割所述靶核酸的生物素化的非進行型內切核酸酶；(ii)固體支持材料；和(iii)特異于生物素化的結合劑。
79.權利要求78的試劑盒，其還包括:(iv)甲基化的核酸陽性對照。
80.權 利要求1的方法，其中所述非進行型酶以等于或大于靶DNA的摩爾比存在。
【文檔編號】C12N9/16GK103958697SQ201280039177
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年6月26日 優先權日:2011年6月27日
【發明者】R·A·弗塞斯 申請人:前視紅外系統股份有限公司