免疫原性組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及包含來自艱難梭菌的毒素A和/或毒素B的片段的融合蛋白，具體而言，本發明涉及包含第一片段和第二片段的蛋白，其中(v)所述第一片段是毒素A重復結構域片段；(vi)所述第二片段是毒素B重復結構域片段；(vii)所述第一片段具有第一近端；(viii)所述第二片段具有第二近端；并且其中所述第一片段和所述第二片段彼此鄰近，并且其中所述多肽誘導中和毒素A或毒素B或兩者的抗體。本發明還涉及包含SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33或SEQIDNO:34或SEQIDNO:35的片段或變體的組合物。
【專利說明】免疫原性組合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及來自艱難梭菌iflostridium difficile)的抗原。具體而言,本發明涉及包含毒素A和/或毒素B的片段的重組蛋白抗原。本發明還涉及包含這些抗原的免疫原性組合物或疫苗，以及本發明的疫苗和免疫原性組合物在預防或治療中的用途。本發明還涉及使用本發明的組合物的免疫方法，以及本發明的組合物在藥物制造中的用途。
[0002]背景
艱難梭菌是醫院腸道感染的最重要原因并且是人中假膜性結腸炎的主要原因(Bartlett 等人，J?.J.Clin.Nutr.11 suppl:2521-6 (1980))。感染艱難梭菌的個體的總體相關死亡率在診斷的3個月內計算為5.99%,并且更聞的死亡率與聞齡相關，在超過80歲的患者中為 13.5% (karas 等Jk，Journal of Infection 561:1-9 (2010))。目前對艱難梭菌感染的治療是施用抗生素(甲硝唑和萬古霉素)，然而，已經存在對這些抗生素具有抗性的菌株的證據(Shah 等人，Expert Rev.Anti Infect.Ther.8 (5) 555-564 (2010))。因此，存在對能夠誘導針對艱難梭菌的抗體和/或保護性免疫應答的免疫原性組合物的需求。
[0003]發明簡述
艱難梭菌的腸毒性主要由于毒素A和毒素B兩種毒素的作用。這些均是有效的細胞毒素(Lyerly 等人,Current Microbiology 21:29-32 (1990)。毒素 A和毒素B 的 C末端結構域包含重復單位，例如毒素A的C末端由連續的重復單位構成(Dove等)K,Infect.1mmun.58:480-499 (1990))，由于這一原因，C末端結構域也可以稱為“重復結構域”。如Ho等人在(PNAS 102:18373-18378 (2005))中描述，這些重復部分可以進一步分為短重復(SRs)和長重復(LRs)。`
[0004]已經確定了毒素A重復結構域的C末端的127-aa片段的結構(Ho等人，PNAS102:18373-18378 (2005))。該片段形成螺線管類折疊，主要由β鏈和低比例的α螺旋構成。
[0005]已經表明毒素A具體為C末端結構域的片段能夠導致在倉鼠中的保護性免疫應答(Lyerly 等人，Current Microbiology 21:29-32 (1990))、W096/12802 和 W000/61762。
[0006]已知設計在表達過程中能夠正確折疊的融合蛋白是困難的。本發明的多肽是融合蛋白，其中，保持天然β_螺線管類結構，并且發現其能夠在小鼠中提供針對毒素A和毒素B 二者的免疫應答。
[0007]在本發明的第一個方面，提供包含第一片段和第二片段的多肽，其中 (i)所述第一片段是毒素A重復結構域片段；
(?)所述第二片段是毒素B重復結構域片段；
(iii)所述第一片段具有第一近端；
(iv)所述第二片段具有第二近端；并且 多肽誘導中和毒素A或毒素B或兩者的抗體。
[0008]在本發明的第二個方面，提供多肽，其包括:
【權利要求】
1.一種多肽，其包含第一片段和第二片段，其中 (i)所述第一片段是毒素A重復結構域片段； (?)所述第二片段是毒素B重復結構域片段； (iii)所述第一片段具有第一近端； (iv)所述第二片段具有第二近端；并且 其中所述第一片段和所述第二片段彼此鄰近，并且其中所述多肽誘導中和毒素A或毒素B或兩者的抗體。
2.權利要求1的多肽，其中所述多肽在哺乳動物宿主中誘導針對艱難梭菌菌株的保護性免疫應答。
3.權利要求1-2中任一項的多肽，其中所述第一片段和/或所述第二片段包含少于25%、20%、18%或15%的α螺旋結構。
4.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第一片段和/或所述第二片段包含多于25%、30%、35%、38% 或 40% 的 β 折疊結構。
5.前述權利要求 中任一項的多肽，其中所述第一近端在短重復內。
6.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第二近端在短重復內。
7.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第一近端不破壞短重復-長重復-短重復部分。
8.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第二近端不破壞短重復-長重復-短重復部分。
9.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第一近端和所述第二近端不破壞短重復-長重復-短重復部分。
10.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第一近端不在毒素A的氨基酸1878-1940、2012-2074、2146-2208、2258-2322、2394-2456、2507-2569 或 2598-2660 內。
11.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第二近端不在毒素B的氨基酸1881-1942、2012-2074、2144-2208 或 2278-2339 內。
12.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第一片段包含至少100、250、400或450個氨基酸。
13.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第二片段包含至少100、200、300或400個氨基酸。
14.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重復部分VIII(氨基酸 2645-2710)內。
15.權利要求1-14中任一項的多肽，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2700-2710或 2680-2690 內。
16.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第二近端在毒素B的重復部分I(氨基酸1834-1926)內。
17.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述第二近端在氨基酸1860-1878、1854-1876 內。
18.權利要求1-15中任一項的多肽，其中所述第二近端在毒素B的重復部分II(氨基酸 1927-2057)內。
19.權利要求1-15或18中任一項的多肽，其中所述第二近端在毒素B的氨基酸1960-1970、1988-1998 或 1867-1877 內。
20.權利要求1-13和16-19中任一項的多肽，其中所述第一片段由整個毒素A重復結構域(氨基酸1832-2710)組成。
21.權利要求1-15和20中任一項的多肽，其中所述第二片段由整個毒素B重復結構域(氨基酸1833-2366)組成。
22.權利要求14、15、16或17中任一項的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重復部分VIII (氨基酸2645-2710)內，并且其中所述第二近端在毒素B的重復部分I (氨基酸1834-1926)內。
23.權利要求14、15、18或19中任一項的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重復部分VIII (氨基酸2645-2710)內，并且其中所述第二近端在毒素B的重復部分II (氨基酸1927-2057)內。
24.權利要求14、15、18或19中任一項的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重復部分VIII的短重復3 (氨基酸2687-2710)內，并且所述第二近端在毒素B的重復部分II的短重復4 (氨基酸1988-2007)內。
25.權利要求14、15、18或19中任一項的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重復部分VIII的短重復2 (氨基酸2665-2686)內，并且所述第二近端在毒素B的重復部分II的短重復3 (氨基酸1968-1987)內。
26.權利要求14、15、16或17中任一項的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重復部分VIII的短重復2 (氨基酸2665-2686)內，并且所述第二近端在毒素B的重復部分I的短重復3 (氨基酸1877-1896)內。
27.權利要求1-13、14、15、16、17和22中任一項的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重復部分VIII的短重復3 (氨基酸2645-2686)內，并且所述第二近端在毒素B的重復部分I的短重復I (氨基酸1834-1854)內。
28.權利要求14、15、18或19中任一項的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重復部分VIII的短重復3 (氨基酸2687-2710)內，并且所述第二近端在毒素B的重復部分II的短重復4 (氨基酸1988-2007)內。
29.權利要求23的多肽，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2700-2710內，并且所述第二近端在毒素B的氨基酸1960-1970內。
30.權利要求23的多肽，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2680-2690內，并且所述第二近端在毒素B的氨基酸1960-1970內。
31.權利要求23的多肽，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2700-2710內，并且所述第二近端在毒素B的氨基酸1988-1998內。
32.權利要求23的多肽，其中所述第一近端在氨基酸2680-2690內，并且所述第二近端在氨基酸1860-1878內。
33. 前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽還包含接頭。
34.權利要求33的多肽，其中所述接頭包含1-19個之間的氨基酸。
35.權利要求33-34中任一項的多肽，其中所述接頭是甘氨酸接頭。
36.權利要求33-35中任一項的多肽，其中所述接頭在所述第一片段的近端和所述第二片段的近端之間。
37.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽是更大的融合蛋白的一部分。
38.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:23,SEQ ID N0:25 或 SEQ ID N0:27 的免疫原性片段。
39.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:23,SEQ ID N0:25 或 SEQ ID N0:27 的至少500、600、700、750、800、850或900個氨基酸的免疫原性片段。
40.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:27 的變體。
41.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽包含多于450、475、500、525、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825 或 850 個來自毒素 A 的氨基酸。
42.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽包含少于850、825、800、775、750、725、700、675、650、625或600個來自毒素A的氨基酸。
43.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽包含多于350、375、400、425、450、475、500或525個來自毒素B的氨基酸。
44.前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽包含少于525、500、475或450個來自毒素B的氨基酸。
45.一種多肽，其包含:
(i)SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或SEQ ID NO:35 ；
(ii)與SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO: 35具有至少90%、95%、98%、99%或100%相似性的變體;或
(iii)SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或SEQ ID NO:35 的至少 250、280、300、350、380、400、430、450、480、500、530、550、580或600個氨基酸的片段。
46.權利要求45的多肽，其中所述多肽包含多于450、475、500、525、575、600、625、650、.675、700、725、750、775、800、825 或 850 個來自毒素 A 的氨基酸。
47.權利要求45或46的多肽，其中所述多肽包含少于850、825、800、775、750、725、.700、675、650、625或600個來自毒素A的氨基酸。
48.權利要求45-47中任一項的多肽，其中所述多肽包含多于350、375、400、425、450、.475、500或525個來自毒素B的氨基酸。
49.權利要求45-48中任一項的多肽，其中所述多肽包含少于525、500、475或450個來自毒素B的氨基酸。
50.權利要求45-49中任一項的多肽，其中所述多肽誘導中和毒素A或毒素B或兩者的抗體。
51.權利要求45-50中任一項的多肽，其中所述多肽在哺乳動物宿主中誘導針對艱難梭菌菌株的保護性免疫應答。
52.權利要求45-51中任一項的多肽，其中所述多肽包含少于25%、20%、18%或15%的α螺旋結構。
53.權利要求45-52中任一項的多肽，其中所述多肽包含多于25%、30%、35%、38%或40%的β折疊結構。
54.—種多核苷酸,其編碼權利要求1-53中任一項的多肽。
55.—種載體，其包含與誘導型啟動子連接的權利要求54的多核苷酸。
56.權利要求47的載體，其中通過加入足量的IPTG激活所述誘導型啟動子。
57.—種 宿主細胞,其包含權利要求54或55的載體或權利要求46的多核苷酸。
58.權利要求57的宿主細胞，其中所述宿主細胞是革蘭氏陰性細菌。
59.權利要求57的宿主細胞，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
60.—種免疫原性組合物，其包含權利要求1-45中任一項的多肽和藥學上可接受的賦形劑。
61.權利要求60的免疫原性組合物，其還包含佐劑。
62.權利要求60-61中任一項的免疫原性組合物，其還包含額外抗原。
63.權利要求62的免疫原性組合物，其中所述額外抗原是來源于選自以下的細菌的抗原:肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、大腸桿菌、卡他莫拉氏菌、破傷風、白喉、百日咳、表皮葡萄球菌、腸球菌和金黃色葡萄球菌。
64.一種疫苗，其包含權利要求60-63中任一項的免疫原性組合物。
65.權利要求60-63中任一項的免疫原性組合物或權利要求64的疫苗在治療或預防艱難梭菌疾病中的用途。
66.權利要求60-63中任一項的免疫原性組合物或權利要求64的疫苗,其用于治療或預防艱難梭菌疾病。
67.權利要求60-63中任一項的免疫原性組合物或權利要求64的疫苗在制備用于預防或治療艱難梭菌疾病的藥物中的用途。
預防或治療艱難梭菌疾病的方法，其包括向患者施用權利要求60-63的免疫原性組合物或權利要求64的疫苗。
【文檔編號】C12N15/62GK103717742SQ201280037472
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年5月25日 優先權日:2011年5月27日
【發明者】C.卡斯塔多 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司