發酵戊糖的細胞的制作方法

發酵戊糖的細胞的制作方法
【專利摘要】本發明涉及下述細胞，所述細胞包含序列編碼木糖異構酶的核苷酸序列，其中木糖異構酶的氨基酸序列與SEQ?ID?NO：2中所示的氨基酸序列具至少75％序列同一性并且其中所述核苷酸序列對宿主而言是異源的。本發明的細胞可用在生產發酵產物，比如乙醇的方法中。這種方法可包括用本發明的細胞發酵含有木糖來源的培養基，從而所述細胞將木糖發酵成為發酵產物。
【專利說明】發酵戊糖的細胞
【技術領域】
[0001]本發明涉及能夠將木糖異構化為木酮糖的細胞。本發明還涉及其中使用這類細胞生產發酵產物，比如乙醇的方法。
[0002]發明背景
[0003]最近幾十年，傳統化石燃料(基于石油的燃料)的大規模消耗造成了高水平的污染。這與化石燃料的世界儲備并非有限的認識以及增長的環境意識一起刺激了研究替代性燃料(如乙醇)可行性的新動機，所述替代性燃料是以每升為基礎比無鉛汽油釋放更少CO2的無粒子燃燒燃料來源。
[0004]盡管生物量衍生的乙醇可以通過得自許多不同來源的己糖的發酵來生產，但是，典型地用于商業規模生產燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂貴的。因此，燃料乙醇生產的提高會需要使用更低成本的原料。
[0005]目前，只有衍生自植物生物量的木質纖維素原料能夠足量獲得，用于代替目前用于乙醇生產的作物。在大部分木質纖維素材料中，次于葡萄糖的第二常見糖是木糖。因此，對于經濟上可行的燃料生產工藝而言，己糖和戊糖均必須被發酵形成乙醇。酵母Saccharomyces cerevisia是魯棒的(robust)并且充分適合乙醇生產,但是不能夠使用木糖作為碳源生產乙醇。另外，沒有一種天然存在的生物是已知能夠以高乙醇產率(yiled)以及高乙醇生產力將木糖發酵成乙醇的。因此，對下述生物存在需要，所述生物具有這些特性從而能夠在商業上有活力地從木質纖維素原料生產乙醇。

【發明內容】

[0006]根據本發明，提供了能夠發酵，比如醇發酵并能使用木糖作為碳源的細胞。這類細胞包含編碼木糖異構酶的核苷酸 序列，其中木糖異構酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列具有至少75%序列同一性，并且，其中，核苷酸序列對宿主而言是異源的。當使用木糖作為碳源時，與野生型絲狀真菌相比較，這種細胞生產更高量的乙醇。
[0007]本發明還提供了:
[0008]——生產發酵產物的方法，所述方法包括用本發明的細胞發酵含有木糖來源的培養基，使得細胞將木糖發酵成為發酵產物；
[0009]——生產發酵產物的方法，所述方法包括用本發明所定義的能利用L-阿拉伯糖的細胞發酵至少含有木糖來源和L-阿拉伯糖來源的培養基，使得細胞將木糖和L-阿拉伯糖發酵成為發酵產物；和
[0010]——生產發酵產物的方法，所述方法包括用本發明的細胞和能使用L-阿拉伯糖的細胞發酵至少含有木糖來源和L-阿拉伯糖來源的培養基，借以每種細胞將木糖和/或阿拉伯糖發酵成為發酵產物。
[0011]在一種實施方式中，所述細胞包含編碼可從Clostridium屬,例如從Clostridiumbeijerinckii細胞獲得的木糖異構酶的核苷酸序列。在一種實施方式中，核苷酸可以是野生型的或經密碼子優化的或經密碼子對優化的。[0012]本發明還提供了本發明的細胞在用于生產發酵產物的方法中的用途。
[0013]附圖簡沭
[0014]圖1展示了編碼來自Clostridium beijerinckii的木糖異構酶、用于在Saccharomyces cerevisiae中表達的p427_TEF質粒圖譜。CpO表示經密碼子對優化的。
[0015]圖2展示了用pPWT215轉化的BIE104P1和用沒有DNA的質粒轉化(模擬轉化)的參照菌株在2%木糖作為唯一碳源上的生長曲線。數字“I”和“2”表示培養物的等分試樣向新鮮培養基的轉移。所有的培養物在存在空氣的情況下孵育，(第二次轉移后的)最后一次培養物例外。
[0016]圖3展示了來自實施例6的菌株BIE292XI(C.beyerinCkii)(黑線)和模擬菌株(灰線)的生長曲線。
[0017]序列表簡沭
[0018]SEQ ID NO:1展示了來自Clostridium beijerinckii的經密碼子對優化的木糖
異構酶序列。
[0019]SEQ ID NO:2展示了來自Clostridium beijerinckii的木糖異構酶的氨基酸序列。
[0020]SEQ ID NO:3展示了正向引物的序列。
[0021]SEQ ID NO:4展示了反向引物的序列。
[0022]發明詳沭
[0023]在本說明書和附帶的權利要求書中，詞語“包含”和“包括”及其變體如“包含”("comprises"，"包含")、“包括包括"和"包括")應被解釋為包含在內(inclusive) 0也就是說，在上下文允許時，這些詞語旨在傳達可能包括未明確指出的其它元素或整數。
[0024]本發明涉及包含編碼木糖異構酶的核苷酸序列的細胞，其中木糖異構酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少75%同一性，并且，其中核苷酸序列對宿主而言是異源的。
[0025]編碼木糖異構酶的核苷酸序列的存在賦予細胞將木糖異構化為木酮糖的能力。
[0026]“木糖異構酶” (EC5.3.1.5)在本文中被定義為催化D-木糖直接異構化為D-木酮糖和/或其反向的酶。所述酶還已知為D-木糖酮異構酶。本文的木糖異構酶也可以能夠催化D-葡萄糖和D-果糖之間的轉化(并因此可以被稱作葡萄糖異構酶)。本文的木糖異構酶可需要二價陽離子，比如鎂、錳或鈷作為輔因子。
[0027]因此，本發明的細胞能夠將木糖異構化為木酮糖。通過用下述核酸構建體轉化宿主細胞對所述宿主細胞賦予將木糖異構化為木酮糖的能力，所述核酸構建體包含編碼確定的木糖異構酶的核苷酸序列。本發明的細胞通過木糖到木酮糖的直接異構化將木糖異構化為木酮糖。這被理解為表示，在木糖異構酶催化的單一反應中木糖被異構化為木酮糖，與分別由木糖還原酶和木糖醇脫氫酶催化的、木糖經由木糖醇中間產物成為木酮糖的兩步法轉化相對。
[0028]木糖異構酶活性單位(U)在本文中可以被定義為:在Kuyper等人(2003，FEMSYeast Res.4:69-78)所述條件下,每分鐘生產Ihmol木酮糖的酶的量。
[0029]本發明的細胞參照具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或與所述序列具有至少74%序列同一性的木糖異構酶定義。同樣地，本發明的細胞可以參照木糖異構酶和編碼這種氨基酸序列的核苷酸序列來定義。
[0030]SEQ ID NO:2展不了來自Clostridium beijerinckii的木糖異構酶氨基酸序列。本發明的細胞包含編碼下述木糖異構酶的核苷酸序列，所述木糖異構酶具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列或與所述序列具有至少74%序列同一性的氨基酸序列。
[0031]優選地，根據本發明的細胞是包含編碼具有下述序列的木糖異構酶的核苷酸序列的細胞，所述序列與SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少約75%、優選地至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%或至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %序列同一性。根據本發明的細胞可包含編碼木糖異構酶的、具有下述序列的核苷酸序列，所述序列與SEQ ID NO:1中所示的核酸序列具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、優選地至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約92%、至少約93 %、至少約94%、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %或至少約99 %或至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
[0032]序列同一性(或序列相似性)在本文中被定義為，如通過比較序列測定的，兩條或多條氨基酸(多肽或蛋白質)序列或兩條或多條核酸(多核苷酸)序列之間的關系。通常，典型地在被比較的序列全長上比較序列同一性或相似性。但是，可在更短的比較窗口上比較序列。本領域中，“同一性”也表示兩條氨基酸或核酸序列之間的序列相關度，根據情況通過這些序列串之間的匹配測定。[0033]測定同一性的優選方法被設計為在所測試的序列之間給出最大匹配。測定同一性和相似性的方法在公眾可獲得的計算機程序中編碼。測定兩條序列之間的同一性和相似性的優選計算機程序方法，包括例如BestFit、BLASTP, BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)，公眾可從 NCBI 和其他來源(BLAST Manual,Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD20894)獲得。使用 BLASTP 進行氨基酸序列比較的優選參數是缺口開放11.0、缺口延伸l、Blosum62矩陣。使用BLASTP進行核酸序列比較的優選參數是缺口開放11.0、缺口延伸1、DNA完全矩陣(DNA同一性矩陣)。
[0034]任選地，在氨基酸相似性程度的測定中，本領域技術人員可還將稱為“保守的”氨基酸替換考慮進去，這對本領域技術人員而言是明確的。
[0035]保守的氨基酸替換是指具有相似側鏈的殘基的可交換性。例如，具有脂肪族側鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳基側鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和具有含硫側鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。
[0036]優選的保守氨基酸替換組是:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公開的氨基酸序列替換變體是其中在所公開的序列中至少一個殘基已被去除且在其位置處插入不同的殘基的那些。優選地，氨基酸改變是保守的。如下為對于每一個天然存在的氨基酸而言優選的保守替換:丙氨酸替換為絲氨酸；精氨酸替換為賴氨酸；天冬酰胺替換為谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸替換為組氨酸；半胱氨酸替換為絲氨酸或丙氨酸；谷氨酰胺替換為天冬酰胺；谷氨酸替換為天冬氨酸；谷氨酸替換為脯氨酸；組氨酸替換為天冬酰胺或谷氨酰胺；苯丙氨酸替換為亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸替換為異亮氨酸或纈氨酸；賴氨酸替換為精氨酸；谷氨酸酰胺或谷氨酸；蛋氨酸替換為亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸替換為蛋氨酸、亮氨酸或酪氨酸；絲氨酸替換為蘇氨酸；蘇氨酸替換為絲氨酸；色氨酸替換為酪氨酸；酪氨酸替換為色氨酸或苯丙氨酸；和纈氨酸替換為異亮氨酸或亮氨酸。
[0037]根據本發明編碼催化木糖向木酮糖轉化的酶的核苷酸序列也可以通過它們在中度雜交條件下或優選地在嚴格雜交條件下與編碼下述酶的核苷酸序列雜交的能力來定義，所述酶具有SEQ ID NO:2所示的序列或與SEQ ID NO:2所示的序列具有至少74%序列同一性的序列。
[0038]形式上，這種核苷酸序列與編碼下述酶的核苷酸序列的反向互補鏈雜交，例如是與SEQ ID NO:1或2的反向互補序列雜交的序列,所述酶具有SEQ ID NO:2所示的序列或與SEQ ID NO:2所示的序列具有至少74%序列同一性的序列。
[0039]嚴格雜交條件在本文被定義為下述條件，所述條件允許至少約25個、優選地約50個核苷酸、75或100和最優選地約200或更多個核苷酸的核酸序列于約65°C下在包含約IM鹽的溶液(優選6 XSSC (氯化鈉、檸檬酸鈉))或具有與之相當的離子強度的任何其它溶液中雜交，以及于65°C下在包含約IM鹽，或更少的鹽，優選地0.2X SSC的溶液中或具有與之相當的離子強度的任何其它溶液中洗滌。優選地，雜交過夜進行，即，至少進行10個小時，以及優選地，洗滌進行至少一個小時，其中至少將洗滌溶液更換兩次。這些條件通常允許具有約90 %或更高序列同一性的序列的特異性雜交。
[0040]中度條件在本文中被定義為下述條件，所述條件允許至少50個核苷酸、優選約200或更多個核苷酸的核酸序列，在約45°C的溫度下，在包含約IM鹽的溶液(優選6 X SSC)或具有與之相當的離子強度的任何其它溶液中雜交，以及在室溫下，在包含約IM鹽的溶液(優選6XSSC)或具有與之相當的離子強度的任何其它溶液中洗滌。優選地，雜交過夜進行，即至少進行10小時，以及優選地，洗滌進行至少I小時，其中至少將洗滌溶液更換兩次。這些條件通常會允許具有多達50%`序列同一性的序列的特異性雜交。本領域技術人員應當能夠調整這些雜交條件，從而特異性地鑒定同一性在50%和90%之間變化的序列。
[0041]為了提高引入的酶在本發明的細胞中以活性形式表達的可能性，可以改變相應的編碼核苷酸序列，從而使其密碼子使用(codon usage)針對選用的酵母細胞而被優化。用于密碼子優化的若干方法是本領域已知的。針對酵母優化核苷酸序列密碼子選擇的一種優選的方法是W02006 / 077258和/或W02008 / 000632中公開的密碼子對優化技術。W02008 /000632提到密碼子對優化。密碼子對優化是下述一種方法，其中編碼多肽的核苷酸序列在其密碼子使用方面(特別是使用的密碼子對)進行了修飾，從而獲得編碼多肽的核苷酸序列提高的表達和/或所編碼的多肽提高的生產。密碼子對被定義為編碼序列中兩個相繼三聯體(密碼子)的集合。
[0042]本文中使用如Xuhua Xia, Evolutionary Bioinformatics2007,:353-58 中所述的密碼子適應指數(Codon Adaptation Index, CAI)作為基因表達和翻譯效率的簡單度量。所述指數使用來自一個物種的高度表達基因的參照組來評價每種密碼子的相對考績(merits)，并從所述基因中所有密碼子的使用頻率計算基因的分值。指數評價選擇在塑造密碼子使用模式中的有效程度。在這一方面中，預測基因的表達水平來評價病毒基因對其宿主的適應和比較不同生物中的密碼子使用是有用的。指數也可給出異源基因表達可能成功的大致指示。在根據本發明的經密碼子對優化的基因中，CAI為0.6或更多、0.7或更多、
0.8或更多、0.85或更多、0.87或更多0.90或更多、0.95或更多或約1.0。
[0043]在本發明的細胞中，木糖異構酶對細胞而言典型地是異源的。也就是說，木糖異構酶具有下述序列，所述序列不做為其存在的生物、細胞、基因組DNA或RNA序列的一部分而天然存在于所考慮的細胞中。也就是說，木糖異構酶對細胞而言是外源的或在細胞中不天然存在。因此，編碼木糖異構酶的核苷酸序列在經轉化的宿主細胞中典型地以活性形式被表達或能以活性形式被表達。
[0044]本發明的細胞因而是包含下述核酸構建體(即，用所述核酸構建體轉化)的細胞，所述核酸構建體包含編碼如上文所定義的木糖異構酶的核苷酸序列。包含木糖異構酶編碼序列的核酸構建體優選地能在所述宿主細胞中表達木糖異構酶。
[0045]用于在細胞中表達異源木糖異構酶序列的方法對本領域技術人員而言是熟知的。
[0046]因此，本發明 的細胞是重組細胞。也就是說，本發明的細胞包含下述核苷酸序列，或用下述核苷酸序列轉化或遺傳修飾過，所述核苷酸序列不天然存在于所考慮的細胞中。
[0047]用于在細胞中重組表達木糖異構酶酶以及用于對本發明的細胞進行其他遺傳修飾的技術是本領域技術人員公知的。典型地，此類技術涉及用包含相關序列的核酸構建體轉化細胞。此類方法可例如從標準手冊中獲知，例如Sambrook andRussel (2001)" Molecular Cloning:A Laboratory Manual (3rd edition), Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或 F.Ausubel et al.,eds., " Current protocols in molecular biology", Green Publishing and WileyInterscience, New York (1987) ?用于對真菌宿主細胞進行轉化和遺傳修飾的方法可從例如 EP-A-0635574、W098 / 46772、W099 / 60102、TOOO / 37671、W090 / 14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574 和 US6, 265，186 中獲知。
[0048]大部分附加體Gpisomal)或2 μ質粒是相對不穩定的，在每個世代后在約10-2或更多細胞中丟失。即便是在選擇性生長的條件下，僅60%到95%的細胞保留附加體質粒。大部分附加體質粒的拷貝數范圍為每個cir+宿主細胞中10-40個。然而，質粒并非相等地分布于細胞間，并且種群中每個細胞的拷貝數存在高度變化。用整合性質粒轉化的菌株極度穩定，即便是不存在選擇性壓力時也是如此。然而，質粒損失可通過隨機重復的DNA之間的同源重組以約10_3到10_4的頻率發生，所述同源重組導致載體序列的成環離開(loopingout)。優選地，穩定整合情況下的載體設計因而是，在選擇標記物基因丟失(也可以通過分子內、同源重組發生)后，被整合的構建體的成環離開不再可能。優選地，所述基因因此被穩定整合。穩定整合在本文中被定義為整合進基因組中，其中被整合的構建體的成環離開不再可能。優選地，不存在選擇標記物。
[0049]典型地，核酸構建體可以是質粒，例如低拷貝質粒或高拷貝質粒。根據本發明的細胞可包含單個或多個拷貝的編碼木糖異構酶的核苷酸序列，例如通過使用多拷貝核苷酸構建體或通過使用具有多拷貝木糖異構酶序列的構建體來實現。
[0050]核酸構建體可以作為附加體維持，并因此包含用于自主復制的序列，比如常染色體復制序列序列。合適的附加體核酸構建體可以例如基于酵母2μ或PKDl質粒(Gleer etal., 1991, Biotechnology9:968_975)或 AMA 質粒(Fierro et al., 1995, Curr Genet.29:482-489)。或者，可以將每種核酸構建體以一個或多個拷貝整合進細胞的基因組中。進入細胞基因組的整合可通過非同源重組隨機發生，但優選地，核酸構建體可以通過同源重組被整合進細胞的基因組中，如本領域所公知的(見，例如W090 / 14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574 和 US6, 265，186)。
[0051]典型地，木糖異構酶編碼序列應當與能夠提供或幫助木糖異構酶序列轉錄和/或翻譯的一條或多條核酸序列可操作地連接。
[0052]術語“可操作地連接”是指下述并置(juxtaposition)，其中所述組分處于允許它們以期望的方式發揮作用的關系中。例如，啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接，所述啟動子或增強子影響所述編碼序列的轉錄。
[0053]在本文中使用時，“啟動子”是指下述核酸片段，其發揮控制一個或多個基因轉錄的功能，相對于基因轉錄起點的轉錄方向而言位于上游，并且在結構上通過DNA-依賴性RNA聚合酶的結合位點、轉錄起點和本領域技術人員已知的任何其它DNA序列的存在來識另O。“組成型”啟動子是在大部分環境和發育條件下有活性的啟動子。“誘導型”啟動子是在環境或發育調節下有活性的啟動子。
[0054]能夠用于實現編碼本發明酶的核苷酸序列表達的啟動子對編碼要表達的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的，即對與之可操作地連接的核苷酸序列(編碼序列)而言異源的啟動子。然而，啟動子對宿主細胞而言可以是同源的，即內源的。
[0055] 本文上下文中合適的啟動子包括組成型和誘導型的天然啟動子以及經改造的啟動子，這是本領域技術人員公知的。真核宿主細胞中合適的啟動子可以是GAL7、GALlO或GAL1、CYC1、HIS3、ADHl、PGL、PH05、GAPDH、ADCU TRPU URA3、LEU2、ENO1、TP11 和 AOXI。其它合適的啟動子包括roCl、GPDl、PGKl、TEFl和TDH3。
[0056]在本發明的細胞中，編碼木糖異構酶的核苷酸序列的3’ -端優選地與轉錄終止子序列可操作地連接。優選地，終止子序列在選擇的宿主細胞、比如例如選擇的酵母物種中是可操作的。在任何情況下終止子的選擇不是關鍵性的；其可以例如來自于任何酵母基因，盡管如果來自于非酵母、真核基因時終止子有時可能發揮功能。通常，編碼木糖異構酶的核苷酸序列包含終止子。優選地，這類終止子與預防本發明宿主細胞中無義介導的mRNA衰變的突變組合(見例如:Shirley et al.,2002, Geneticsl61:1465-1482)。
[0057]轉錄終止序列還優選地包含多聚腺苷酸化信號。
[0058]任選地，適用于本發明的核酸構建體中可存在可選擇標記物。在本文中使用時，術語“標記物”是指編碼性狀或表型的基因，所述性狀或表型允許選擇或篩選含有所述標記物的宿主細胞。標記物基因可以是抗生素抗性基因，從而可使用適當的抗生素從未經轉化的細胞中選擇經轉化的細胞。合適的抗生素抗性標記物包括例如二氫葉酸還原酶、潮霉素B磷酸轉移酶、3' -O-磷酸轉移酶II (卡那霉素、新霉素和G418抗性)。盡管對于多倍體宿主細胞的轉化而言抗生素抗性標記物可以是最為便利的，然而優選地使用非抗生素抗性標記物，比如營養缺陷型標記物(URA3、TRP1、LEU2)或S.pombe TPI基因(由Russell P R，1985，Gene40:125-130描述)。在一個優選的實施方式中，用核酸構建體轉化的宿主細胞是無標記物基因的。用于構建重組的無標記物基因的微生物宿主細胞的方法公開于EP-A-0635574中，并且基于雙向標記物，比如A.nidulans amdS(乙酰胺酶)基因或酵母URA3和LYS2基因的使用。或者，可以將可篩選的標記物，比如綠色熒光蛋白、lacL、螢光素酶、氯霉素乙酰轉移酶、葡萄糖苷酸酶并入本發明的核酸構建體中，允許篩選經轉化的細胞。
[0059]可存在于適用于本發明的核酸構建體中任選的其它元件包括但不限于，一條或多條前導序列、增強子、整合因子、和/或報告基因、內含子序列、著絲點(centoomer)、調聚物和/或基質附著(MAR)序列。本發明的核酸構建體可還包含用于自主復制的序列，比如ARS序列。
[0060]優選地，木糖異構酶在胞質溶膠中表達。胞質溶膠表達可通過線粒體或過氧化物酶體靶向信號的缺失或修飾來實現。
[0061]本發明的細胞可以是任何合適的細胞，比如原核細胞比如細菌，或真核細胞。典型地，細胞會是真核細胞，例如酵母或絲狀真菌。
[0062]酵母在本文中被定義為真核微生物，并且包括主要以單細胞形式生長的真菌亞門的所有物種(Alexopoulos, C.J., 1962, In JntroductoryMycology, John ffiley&Sons,Inc., New York)。
[0063]酵母可以通過單細胞原植體的出芽生長，或可通過生物的裂變生長。作為本發明細胞的一種優選的酵母可屬于 Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces 或 Yarrowia 屬。優選地，酵母是能夠厭氧發酵的酵母，更優選地是能夠厭氧醇發酵的酵母。
[0064]絲狀真菌在本文中被定義為下述真核微生物，其包括真菌亞門的所有絲狀形式。這些真菌的特征是由甲殼質、纖維素和其它復合多糖組成的營養性菌絲體。
[0065]適合用作本發明細胞 的絲狀真菌在形態學、生理和遺傳上區別于酵母。可有利地使用絲狀真菌細胞，因為大部分真菌不需要無菌條件來繁殖，并且對噬菌體感染敏感。絲狀真菌的營養生長通過菌絲延長進行，并且大部分絲狀真菌的碳代謝是專性需氧的。作為本發明宿主細胞的優選的絲狀真菌可屬于Aspergillus、Trichoderma、Humicola、Acremoniurra>Fusarium或Penicillium屬。更優選地，絲狀真菌細胞可以是Aspergillusniger、Aspergillus oryzae、Penicillium chrysogenum 或 Rhizopus oryzae 細胞。
[0066]許多年來，建議引入多種生物用于從作物糖生產生物乙醇。然而在實踐中，所有主要的生物乙醇生產方法繼續使用Saccharomyces屬的酵母作為乙醇生產者。這歸因于Saccharomyces物種對工業方法而言的許多有吸引力的特征，即高度耐酸、耐乙醇和耐滲透，厭氧生長的能力，當然及其高的醇發酵能力。作為宿主細胞的優選的酵母物種包括
S.cerevisiae>S.bulder1、S.barnett1、S.exiguus、S.uvarum>S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus 或 K fragilis。
[0067]本發明的細胞可以能夠將植物生物量、纖維素、半纖維素、果膠、鼠李糖、半乳糖、巖藻糖、麥芽糖、麥芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油轉化成例如可發酵的糖。因此，本發明的細胞可表達將纖維素轉化為葡萄糖單體和將半纖維素轉化為木糖和阿拉伯糖單體所需的一種或多種酶，比如纖維素酶(內切纖維素酶或外切纖維素酶)、半纖維素酶(內切或外切木聚糖酶或阿拉伯糖酶)、能夠將果膠轉化成葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果膠酶，或能夠將淀粉轉化成葡萄糖單體的淀粉酶。
[0068]本發明的細胞優選地是能夠將木糖主動或被動轉運進入細胞的宿主。[0069]優選地，本發明的細胞:
[0070]能夠進行主動糖酵解；和/或
[0071]顯示經過戊糖磷酸通路的通量；和/或
[0072]展示木酮糖激酶活性，使得由木糖異構化而來的木酮糖可以被代謝成丙酮酸。
[0073]細胞還優選地包含將丙酮酸轉化成期望的發酵產物，比如乙醇、丁醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、反丁烯二酸、蘋果酸、衣康酸(itaconic acid)、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-內酰胺抗生素或頭孢菌素所需的這些酶活性。
[0074]本發明的一種優選的細胞是天然能夠進行醇發酵、優選地進行厭氧醇發酵的細胞。本發明的細胞優選地具有對乙醇的高度耐性、對低PH的高度耐性(即能夠在低于約5、約4、約3或約2.5的pH下生長)和對有機酸如乳酸、乙酸或甲酸和/或糖降解產物，比如糠醛和羥基-甲基糠醛的高度耐性，和/或對提高的溫度的高度耐性。
[0075]本發明細胞的任何上述特征或活性可以天然存在于細胞中，或者可以通過遺傳修飾引入或修飾。
[0076]在經轉化的宿主中，編碼木糖異構酶的核苷酸序列典型地以活性形式被表達，或者能夠以活性形式被表達。因此，宿主細胞中核苷酸序列的表達生產活性木糖異構酶，典型地其比活性在約30°C下為每mg蛋白質至少約IOU木糖異構酶活性,在約30°C下每mg優選地至少約20、至少約25、至少約30、至少約50、至少約100、至少約200、至少約300、至少約500、至少約750或至少約1000U。經轉化的宿主細胞中表達的木糖異構酶的比活性在本文中被定義為宿主細胞無細胞裂解物(例如酵母無細胞裂解物)的每mg蛋白質的木糖異構酶活性單位的量。木糖異構酶活性的測定、蛋白質的量和無細胞裂解物的制備如本文所述。優選地，編碼木糖異構酶的核苷酸序列在宿主細胞中的表達產生下述木糖異構酶，其對木糖的Km小于50、40、30或25mM，更優選地，`對木糖的Km約為20mM或更少。
[0077]本發明的細胞可包含一種或多種提高戊糖磷酸通路通量的遺傳修飾。具體地，遺傳修飾可導致通過戊糖磷酸通路非氧化性部分的通量提高。引起戊糖磷酸通路非氧化性部分通量提高的遺傳修飾在本文中被理解為表示下述修飾，與除了引起通量提高的遺傳修飾之外遺傳上相同的菌株中的通量相比，所述修飾將所述通量提高至約1.1、約1.2、約1.5、約2、約5、約10或約20的倍數。戊糖磷酸通路非氧化部分的通量可以如下測量:在木糖作為唯一碳源時培養經修飾的宿主，測定木糖消耗的比速率,并在產生任何木糖醇時從木糖消耗的比速率中減去木糖醇生產的比速率。然而，戊糖磷酸通路非氧化部分的通量與木糖作為唯一碳源時的生長速率成比例，優選地與木糖作為唯一碳源時的厭氧生長速率成比例。木糖作為唯一碳源時的生長速率(μ_)和戊糖磷酸通路非氧化部分的通量之間存在線性相關。木糖消耗的比速率(Qs)等于生長速率(P)除以基于糖的生物量產率(Yxs)，因為基于糖的生物量產率是恒定的(在給定的一組條件下:厭氧、生長培養基、pH、菌株的遺傳背景等JPQs=U /Yxs。因此，戊糖磷酸通路非氧化部分通量的提高可能演繹自這些條件下最大生產速率的提高，除非轉運(攝取受到限制)。
[0078]可以通過多種方式在宿主細胞中引入提高戊糖磷酸通路通量的一種或多種遺傳修飾。這些方式包括例如，實現木酮糖激酶和/或非還原性部分戊糖磷酸通路的一種或多種酶的更高的穩態活性水平，和/或非特異性醛糖還原酶活性的降低的穩態水平。穩態活性水平的這些改變可以通過(自發或化學誘導或輻射誘導的)突變體的選擇和/或重組DNA技術(例如分別過表達或失活編碼酶的基因或調節這些基因的因子)來實現。[0079]在一種優選的宿主細胞中，遺傳修飾包括(非氧化部分)戊糖磷酸通路的至少一種酶的過表達。優選地，所述酶選自由編碼核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶、轉酮酶和轉醛酶的酶組成的組。可以過表達(非氧化性部分)戊糖磷酸通路的酶的多種組合。例如被過表達的酶可以至少是酶核酮糖-5-磷酸異構酶和核酮糖-5-磷酸差向異構酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸異構酶和轉酮酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸-異構酶和轉醛酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向異構酶和轉酮酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向異構酶和轉醒酶；或至少是酶轉酮酶和轉醒酶；或至少是酶核酮糖5-磷酸差向異構酶、轉酮酶和轉醛酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸異構酶、轉酮酶和轉醛酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶和轉醒酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶和轉酮酶。在本發明的一個實施方式中，酶核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶、轉酮酶和轉醒酶的每一種都在宿主細胞中被過表達。更優選的是下述宿主細胞，其中遺傳修飾至少包含酶轉酮酶和轉醛酶二者的過表達，因為這樣的宿主細胞已經能夠在木糖上厭氧生長。實際上，在一些條件下，僅過表達轉酮酶和轉醛酶的宿主細胞在木糖上已經具有與下述宿主細胞相同的厭氧生長速率，所述宿主細胞過表達所有四種酶，即核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶、轉酮酶和轉醛酶。另外，過表達酶核酮糖-5-磷酸異構酶和核酮糖-5-磷酸差向異構酶二者的宿主細胞是超過下述宿主細胞而被優選的，所述宿主細胞僅過表達異構酶或僅過表達差向異構酶，因為這些酶中僅一種的過表達可產生代謝失衡。
[0080]酶“核酮糖-5-磷酸差向異構酶”(EC5.1.3.1)在本文中被定義為催化D-木酮糖5-磷酸差向異構化為D-核酮糖5-磷酸以及反向的酶。所述酶也已知為磷酸核酮糖(phosphoribulose)差向異構酶；赤蘚糖_4_磷酸異構酶；磷酸酮戍糖3_差向異構酶；木酮糖磷酸3-差向異構酶；磷酸酮戊糖差向異構酶；核酮糖5-磷酸3-差向異構酶；D-核酮糖磷酸-3-差向異構酶；D-核酮糖5-磷酸差向異構酶；D-核酮糖-5-P3-差向異構酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向異構酶；戊糖-5-磷酸3-差向異構酶；或D-核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶。核酮糖5-磷酸差向異構酶還可通過其氨基酸序列定義。類似地，核酮糖5-磷酸差向異構酶可以通過編碼酶的核苷酸序列定義，以及通過與編碼核酮糖5-磷酸差向異構酶的參照核苷酸序列雜交的核苷酸序列來定義。編碼核酮糖5-磷酸差向異構酶的核苷酸序列在本文中稱作RPEl。
[0081]酶“核酮糖5-磷酸異構酶”(EC5.3.1.6)在本文中被定義為催化D-核糖5_磷酸直接異構化為D-核酮糖5-磷酸以及反方向的酶。所述酶也已知為磷酸戊糖異構酶；磷酸核糖異構酶；核糖磷酸異構酶；5_磷酸核糖異構酶；D-核糖5-磷酸異構酶；D-核糖-5-磷酸酮醇-異構酶；或D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-異構酶。核酮糖5-磷酸異構酶還可通過其氨基酸序列定義。類似地，核酮糖5-磷酸異構酶可以通過編碼所述酶的核苷酸序列以及與編碼核酮糖5-磷酸異構酶的參照核苷酸序列雜交的核苷酸序列來定義。編碼核酮糖5-磷酸異構酶的核苷酸序列在本文中稱作RPII。
[0082]酶“轉酮酶”(EC2.2.1.1)在本文中被定義為催化下述反應的酶:D_核糖5_磷酸+D-木酮糖5-磷酸< - >景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸以及反方向。所述酶也已知為羥乙醛轉移酶或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸羥乙醛轉移酶。轉酮酶還可通過其氨基酸定義。類似地，轉酮酶可以通過編碼酶的核苷酸序列以及與編碼轉酮酶的參照核苷酸序列雜交的核苷酸序列來定義。編碼轉酮酶的核苷酸序列在本文中稱作TKL1。
[0083]酶“轉醛酶”(EC2.2.1.2)在本文中被定義為催化下述反應的酶:景天庚酮糖7_磷酸+D-甘油醛3-磷酸< -> D-赤蘚糖4-磷酸+D-巖藻糖6-磷酸以及反方向。所述酶還已知為二羥基丙酮轉移酶；二羥基丙酮合酶；甲醛轉酮酶；或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸甘油酮轉移酶。轉醛酶還可通過其氨基酸序列定義。類似地，轉醛酶可以通過編碼酶的核苷酸序列以及與編碼轉醛酶的參照核苷酸序列雜交的核苷酸序列來定義。編碼轉酮酶的核苷酸序列在本文中稱作TALl。
[0084]本領域技術人員已知用于在本發明的細胞中表達和過表達酶的多種手段。具體地，可以通過提高宿主細胞中編碼酶的基因的拷貝數(例如通過在宿主細胞的基因組中整合額外的基因拷貝，通過表達來自附加體多拷貝表達載體的基因，或通過引入包含多拷貝基因的附加體表達載體)來過表達酶。
[0085]或者，可以通過使用對編碼要過表達的酶的序列而言不是天然的啟動子(即對與之可操作地連接的編碼序列而言為異源的啟動子)來實現本發明宿主細胞中酶的過表達。盡管啟動子優選地對與之可操作地連接的編碼序列而言是異源的，但是還優選啟動子是同源的，即對宿主細胞而言是內源的。優選地，與對編碼序列而言天然的啟動子相比，異源啟動子能夠生產更高穩態水平的包含所述編碼序列的轉錄本(或者每單位時間能夠生產更多轉錄本分子，即mRNA分子)，優選地在可獲得木糖或木糖與葡萄糖作為碳源、更優選地作為主要碳源(即多于50%可獲得的碳源由木糖或木糖和葡萄糖組成)、最優選地作為唯一碳源的條件下。在本文上下文中，合適的啟動子包括組成型和誘導型兩種天然啟動子，以及經改造的啟動子。用于本發明中的一種優選的啟動子還應當對代謝產物(葡萄糖)阻抑不敏感，和/或應當優選地不需要木糖來誘導。具有這些特征的啟動子是可廣泛獲得的，并是對技術人員而言已知的。這類啟動子的合適例子包括例如來自糖酵解基因的啟動子，比如來自酵母或絲狀真菌的果糖磷酸激酶(PKF)、丙糖磷酸異構酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子；關于來自酵母的這類啟動子的更多細節可在(W093 / 03159)中找到。其它有用的啟動子是核糖體蛋白編碼基因的啟動子、乳糖酶基因啟動子(LAC4)、醇脫氫酶啟動子(ADH1、ADH4等等)和烯醇化酶啟動子(ENO)。其它(組成型以及誘導型)啟動子和增強子或上游活化序列應當是本領域技術人員已知的。本發明宿主細胞中使用的啟動子可以在需要時被修飾，來影響它們的控制特征。
[0086]用于上述酶過表達的編碼序列可優選地對本發明的宿主細胞而言是同源的。然而，可以使用對本發明宿主細胞而言異源的編碼序列。
[0087]涉及經遺傳修飾的宿主細胞中酶的生產時，酶的過表達表示與相同條件下未經修飾的宿主細胞相比，所述酶以更高水平的酶比活性被生產。通常，這表示與相同條件下未經修飾的宿主細胞相比酶活性蛋白質(或在多亞基酶的情況下多種蛋白質)以更大量被生產，或者以更高的穩態水平被生產。類似地，這通常表示與相同條件下未經修飾的宿主細胞相比，編碼酶活性蛋白質的mRNA以更大量被生產，或者也以更高的穩態水平被生產。因此，優選地使用本文所述的適當酶測定法，通過測量宿主細胞中的酶比活性水平，來測定酶的過表達。或者，可以例如使用酶的特異性抗體，通過量化酶蛋白質的比穩態水平，或者通過定量編碼所述酶的mRNA的比穩態水平，來間接測定酶的過表達。后者可尤其適用于戊糖磷酸通路，對所述戊糖磷酸通路而言酶測定法不是容易可行的，因為所述酶的底物不可商業獲得。優選地，在本發明的宿主細胞中，與除了引起過表達的遺傳修飾之外在遺傳上相同的菌株相比時，要過表達的酶被過表達至至少約1.1、約1.2、約1.5、約2、約5、約10或約20的倍數。應當理解這些過表達水平可適用于酶活性的穩態水平，酶蛋白質的穩態水平以及編碼酶的轉錄本的穩態水平。
[0088]本發明的細胞可包含提高特異性木酮糖激酶活性的一種或多種遺傳修飾。優選地，所述一種或多種遺傳修飾引起木酮糖激酶的過表達，例如通過編碼木酮糖激酶的核苷酸序列的過表達來實現。編碼木酮糖激酶的基因對宿主細胞而言可以是內源的，或者可以是對宿主細胞異源的木酮糖激酶。用于本發明宿主細胞中木酮糖激酶過表達的核苷酸序列是編碼具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。
[0089]酶“木酮糖激酶”(EC2.7.1.17)在本文中被定義為催化反應ATP+D-木酮糖=ADP+D-木酮糖5-磷酸的酶。所述酶還已知為磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或ATP:D-木酮糖5-磷酸轉移酶。本發明的木酮糖激酶還可以通過其氨基酸序列定義。類似地，木酮糖激酶可以通過編碼所述酶的核苷酸序列以及與編碼木酮糖激酶的參照核苷酸序列雜交的核苷酸序列來定義。
[0090]在本發明的細胞中，提高特異性木酮糖激酶活性的一種或多種遺傳修飾可以與上文所述提高戊糖 磷酸通路通量的任何修飾組合。然而，這不是必需的。
[0091]因此，本發明的宿主細胞可僅包含提高特異性木酮糖激酶活性的一種或多種遺傳修飾。用于實現和分析本發明宿主細胞中木酮糖激酶過表達的本領域可獲得的多種手段與上文針對戊糖磷酸通路酶所述相同。優選地，在本發明的宿主細胞中，與除了引起過表達的遺傳修飾之外在遺傳上相同的菌株相比，要過表達的木酮糖激酶被過表達至少約1.1、約
1.2、約1.5、約2、約5、約10或約20的倍數。還應當理解這些過表達水平可適用于酶活性的穩態水平，酶蛋白質的穩態水平以及編碼酶的轉錄本的穩態水平。
[0092]本發明的細胞可包含降低宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活性的一種或多種遺傳修飾。優選地，通過一種或多種下述遺傳修飾降低宿主細胞中的非特異性醛糖還原酶活性，所述遺傳修飾降低編碼非特異性醛糖還原酶的基因的表達或使其失活。優選地，所述遺傳修飾使宿主細胞中編碼非特異性醛糖還原酶的基因的每種內源拷貝的表達降低或失活。宿主細胞可由于二倍性、多倍性或非整倍性而包含多拷貝的編碼非特異性醛糖還原酶的基因，和/或宿主細胞可含有具有醛糖還原酶活性的若干不同的(同工)酶，所述酶氨基酸序列不同并且各自由不同基因編碼。還在這類情況下，優選地編碼非特異性醛糖還原酶的每種基因的表達被降低或失活。優選地，通過缺失基因的至少一部分或者通過破壞基因使基因失活，其中在該語境中，術語基因還包括編碼序列上游或下游的任何非編碼序列，其(部分)缺失或失活導致宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活性表達的降低。
[0093]編碼要在本發明宿主細胞中降低其活性的醛糖還原酶的核苷酸序列是編碼具有醛糖還原酶活性的多肽的核苷酸序列。
[0094]在本發明的宿主細胞中，降低宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活性的遺傳修飾可以與上文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修飾和/或提高上述宿主細胞中特異性木酮糖激酶活性的任何修飾組合。然而，這不是必需的。[0095]因此，僅包含下述一種或多種遺傳修飾的本發明的宿主細胞明確地包括在本發明中，所述修飾降低宿主細胞中的非特異性醛糖還原酶活性。
[0096]酶“醛糖還原酶”(EC1.1.1.21)在本文中被定義為能夠將木糖或木酮糖還原為木糖醇的任何酶。在本發明的語境中，醛糖還原酶可以是對本發明宿主細胞而言天然(內源)的并且能夠將木糖或木酮糖還原為木糖醇的任何非特異性醛糖還原酶。非特異性醛糖還原酶催化反應:
[0097]1?;糖+NAD (P) H+H 4.^ 糖醇+NAD (P) +
[0098]所述酶具有廣泛特異性并且也已知為醛糖還原酶；多元醇脫氫酶(NADP+);糖醇:NADP氧化還原酶；糖醇=NADP+1-氧化還原酶；NADPH_戊醛糖還原酶；或NADPH-醛糖還原酶。
[0099]這類非特異性醒糖還原酶的一個具體的例子對S.cerevisiae而言是內源的并且是由 GRE3 基因編碼的醒糖還原酶(Traff et al., 2001, Appl.Environ.Microbiol.67:5668-74)。因此，本發明的醛糖還原酶還可通過其氨基酸序列定義。類似地，醛糖還原酶可以通過編碼酶的核苷酸序列以及與編碼醛糖還原酶的參照核苷酸序列雜交的核苷酸序列來定義。
[0100]可以針對在木糖上、優選地木糖作為唯一碳源上、更優選地在厭氧條件下的生長，來選擇自發或(例如通過輻射或化學品)誘導的突變體，使本發明的細胞適應木糖使用。突變體的選擇可以通過包括例如Kuyper等人(2004, FEMS Yeast Res.4:655_664)所述的培養物連續傳代在內的技術來進行，或者通過在恒化器培養中的選擇壓力下培養來進行。在本發明的一種優選的宿主細胞中，至少一種上述遺傳修飾(包括通過突變體選擇獲得的修飾)賦予宿主細胞在木糖作為碳源、優選地作為唯一碳源時、并且優選地在厭氧條件下生長的能力。優選地，經修飾的宿主細胞基本上不生產木糖醇，例如生產的木糖醇低于檢出界限，或者例如以摩爾為基礎少于消耗的碳的約5%、約2%、約I %、約0.5%或約0.3%。
[0101]本發明的細胞可具有在木糖作為唯一碳源時在需氧條件下以至少約0.05、約
0.1、約0.2、約0.25或約0.3h-1的速率，或可行時在厭氧條件下以至少約0.03、約0.05、約
0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.12、約0.15或約0.2h-1的速率生長的能力。優選地，經修飾的宿主細胞具有在葡萄糖和木糖(重量比1:1)混合物作為唯一碳源時在需氧條件下以至少約0.05、約0.1、約0.2、約0.25或約0.3h-1的速率，或可行時在厭氧條件下以至少約0.03、約0.05、約0.1、約0.12、約0.15或約0.2h-1的速率生長的能力。
[0102]本發明的細胞可具有至少約200、約250、約300、約346、約350、約400、約500、約600、約750或約1000mg木糖/ g細胞/ h的木糖比消耗速率。本發明的細胞在木糖上發酵產物(比如乙醇)的產率至少是宿主細胞在葡萄糖上發酵產物(比如乙醇)產率的約40%、約 50%、約 55%、約 60%、約 70%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 98%或約 99%。更優選地，本發明的細胞在木糖上發酵產物(比如乙醇)的產率等于細胞在葡萄糖上發酵產物(比如乙醇)的產率。類似地，細胞在木糖上生物量的產率至少是宿主細胞在葡萄糖上生物量產率的約40%、約50%、約55%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%或約99%。更優選地，細胞在木糖上生物量產率可等于宿主細胞在葡萄糖上的生物量產率。應當理解，在葡萄糖和木糖上產率的比較中，兩種產率均在需氧條件下比較或均在厭氧條件下比較。[0103]本發明的細胞可以能夠使用阿拉伯糖。因此，本發明的細胞因此可以能夠將L-阿拉伯糖轉化為L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或需要的發酵產物，例如本文提到的發酵產物之一。
[0104]能夠從L-阿拉伯糖生產乙醇的生物例如S.cerevisiae菌株可以通過修飾細胞，引入來自合適來源的araA(L_阿拉伯糖異構酶)、araB(L_核酮糖激酶)和araD(L_核酮糖-5-P4-差向異構酶)基因來產生。這類基因可被引入本發明的細胞中，使其能夠使用阿拉伯糖。這樣的途徑描述于W02003 / 095627中。
[0105]本發明的細胞可以是適合生產乙醇的細胞。然而，本發明的細胞可適用于生產除乙醇以外的發酵產物。這類非乙醇發酵產物原則上包括可由真核微生物，比如酵母或絲狀真菌生產的任何大宗化學品(bulk chemical)或精細化學品。
[0106]這類發酵產物可以是，例如丁醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-內酰胺抗生素或頭孢菌素。用于生產非乙醇發酵產物的一種優選的本發明經修飾的宿主細胞是下述宿主細胞，所述宿主細胞含有導致降低的醇脫氫酶活性的遺傳修飾。
[0107]在又一個方面中，本發明涉及多種發酵方法，其中使用本發明經修飾的宿主細胞來發酵包含木糖來源的碳源，比如木糖。除了木糖來源以外，發酵培養基中的碳源還可包含葡萄糖來源。木糖或葡萄糖來源可以是原樣的木糖或葡萄糖，或者可以是包含木糖或葡萄糖單元的任何碳水化合物寡聚體或多聚體，比如例如木質纖維素、木聚糖、纖維素、淀粉等等。為了從這類碳水化合物釋放木糖或葡萄糖單元，可以向發酵培養基中添加或者可由經修飾的宿主細胞生產適當的糖酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)。在后一情況下，經修飾的宿主細胞可以被遺傳改造為生產和分泌這類碳水化合物。使用葡萄糖的寡聚體或多聚體來源的一個額外的優點是其例如通過使用限速量的碳水化合物，使得能夠在發酵期間維持(更)低的游離葡萄糖濃度。這隨即會預防對非葡萄糖的糖(比如木糖)代謝和轉運所需的系統的阻抑。
[0108]在一種優選的方法中，經修`飾的宿主細胞發酵木糖以及葡萄糖，優選地同時發酵，在這種情況下優選地使用下述經修飾的宿主細胞，所述宿主細胞對葡萄糖阻抑不敏感從而防止兩階段生長(diauxic growth) 0除了作為碳源的木糖(和葡萄糖)來源以外，發酵培養基還會包含經修飾的宿主細胞生長所需的適當成分。用于微生物(比如酵母)生長的發酵培養基的組成是本領域公知的。發酵方法是用于生產以下發酵產物的方法，比如例如乙醇、丁醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β -內酰胺抗生素，比如青霉素G或青霉素V及其發酵衍生物，和頭孢菌素。
[0109]發酵方法可以是需氧或厭氧的發酵方法。厭氧發酵方法在本文中被定義為在不存在氧時運行的發酵方法，或者其中基本不消耗氧，優選地消耗少于約5、約2.5或約Immol /L / h，更優選地消耗Ommol / L / h(即，氧消耗不可檢出)的發酵方法，并且其中有機分子發揮電子供體和電子受體兩種用途。在不存在氧時，糖酵解和生物量形成中產生的NADH不能夠被氧化磷酸化氧化。為了解決這一問題，許多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作為電子和氫受體，從而再生NAD+。
[0110]因此，在一種優選的厭氧發酵方法中，丙酮酸被用作電子(和氫受體)，并且被還原成發酵產物，比如乙醇、丁醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-內酰胺抗生素和頭孢菌素。
[0111]發酵方法優選地在對經修飾的宿主細胞而言最適的溫度下進行。因此，對大部分酵母或真菌宿主細胞而言，發酵方法在低于約42°c、優選地低于約38°C的溫度下進行。對酵母或絲狀真菌宿主細胞而言，發酵方法優選地在低于約35、約33、約30或約28°C的溫度且高于約20、約22或約25 °C的溫度下進行。
[0112]一種優選的方法是用于生產乙醇的方法，其中所述方法包括步驟:(a)用上文定義的經修飾的宿主細胞發酵含有木糖來源的培養基，其中所述宿主細胞將木糖發酵成乙醇；和任選地(b)回收乙醇。所述發酵培養基可還包含也被發酵成乙醇的葡萄糖來源。在所述方法中，體積乙醇生產力優選地為至少約0.5、約1.0、約1.5、約2.0、約2.5、約3.0、約5.0或約10.0g乙醇/升/小時。所述方法中基于木糖和/或葡萄糖的乙醇產率至少約50 %、約60 %、約70 %、約80 %、約90 %、約95 %或約98 %。乙醇產率在本文中被定義為理論最大產率的百分比。
[0113]本發明還涉及 用于生產發酵產物、比如選自下組的產物的方法，所述組由丁醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-內酰胺抗生素和頭孢菌素組成。所述方法優選地包含用上文定義的經修飾的宿主細胞發酵含有木糖來源的培養基，其中所述宿主細胞將木糖發酵成所述發酵產物。
[0114]本發明還提供了用于生產發酵產物、比如選自下組的產物的方法，所述組由乙醇、丁醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β -內酰胺抗生素和頭孢菌素組成。所述方法優選地包含用上文定義的能夠使用木糖以及L-阿拉伯糖二者的細胞發酵至少含有木糖來源和L-阿拉伯糖來源的培養基，從而所述細胞將木糖和L-阿拉伯糖發酵成所述發酵產物。
[0115]本發明還提供了用于生產發酵產物、比如選自下組的產物的方法，所述組由乙醇、丁醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-內酰胺抗生素和頭孢菌素組成。所述方法優選地包含用上文定義的細胞和能夠使用L-阿拉伯糖的細胞發酵至少含有木糖來源和L-阿拉伯糖來源的培養基，其中每種細胞將木糖和/或L-阿拉伯糖發酵成所述發酵產物。
[0116]本發明的方法還可包含發酵產物的回收。進行所述方法的培養基也可含有葡萄糖來源。
[0117]根據本發明的方法可以在需氧和厭氧條件下進行。優選地，所述方法在微需氣(aerophilic)或氧受限的條件下進行。
[0118]厭氧發酵方法在本文中被定義為在不存在氧時進行的發酵方法，或其中基本不消耗氧，優選地消耗少于約5、約2.5或約lmmol / L / h的發酵方法，并且其中有機分子發揮電子供體和電子受體兩種作用。
[0119]氧受限的發酵方法是下述方法，其中氧消耗受到從氣體到液體的氧轉移的限制。氧受限的程度由進入氣流的量和組成以及使用的發酵設備的實際混合/物量轉移特性決定。優選地，在氧受限條件下的方法中，氧消耗速率為至少約5.5、更優選地至少約6、如至少 7mmol / L / h。[0120]以下述實施例闡述本發明:
實施例
[0121]一般分子生物學技術
[0122]除非另有說明，使用的方法是標準生物化學技術。合適的一般方法論教科書的例子包括 Sambrook 等，Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989)和 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley&Sons, Inc。
[0123]如實施例中所示的，使用補充有糖的Verduyn培養基(Verduyn，1992)或YEPh-培養基(IOg / I酵母提取物，20g / I植物蛋白胨)進行生長實驗。對于固體YEPh培養基而言，滅菌之前將20g / I的瓊脂添加到液體培養基中。
[0124]用環狀DNA轉化酵母細胞
[0125]在質粒DNA 的情況下，根據 Chen 等人(Current Genetics (1992), Volume21,Number 1,83-84)描述的方法，進行酵母轉化。
[0126]通過電穿孔用線形DNA片段轉化酵母細胞
[0127]通過用單酵母菌落對含2%葡萄糖的25 ml YEPh-培養基接種，來培養酵母細胞。將燒瓶在30°C、280rpm下孵育過夜。
[0128]測定600nm下的光密度值并且將獲得0.2的光密度值所需的量轉移至有2%葡萄糖的100ml YEPh-培養基中。將細胞在30°C、280rpm下培養4到5個小時，以實現約1.2到1.3的光密度值，這相當于2到3個世代。通過離心收集細胞并在28ml TE(IOmM Tris.HCl，ImM EDTA,pH7.5)中再懸浮。添加3ml的IM LiAC溶液( 用稀釋的HAc設定為ρΗ7.5)。將細胞在旋轉式孵育器中輕輕搖動(30°C、150rpm)45分鐘。添加500 μ I的IM DTT (二硫蘇糖醇)溶液后，將細胞在這些條件下再次孵育15分鐘。用無菌、冰冷的milliQ水將體積補至100ml。通過離心收集細胞。
[0129]將上清液丟棄并用50ml無菌、冰冷的milliQ水洗滌成團的細胞，并通過離心收集。隨后的洗滌處理用30ml冰冷的IM山梨糖醇溶液處理。離心之后，丟棄上清液并將成團的細胞再懸浮在4ml冰冷的IM山梨糖醇溶液中。離心之后，丟棄上清液并將成團的細胞再懸浮在300 μ I冰冷的IM山梨糖醇溶液中。
[0130]對于每次轉化，將40 μ I的細胞懸浮液轉移進冰冷的Eppendorf管中。添加轉化用DNA和5 μ g鮭魚精DNA (作為載體DNA)，合起來最大體積為20 μ I。DNA應當溶于TE中。小心敲打Eppendorf管以將內容物輕輕地混合。隨后，將內容物轉移至(在冰上)預冷的有0.2cm孔隙的電穿孔試管中，并(使用例如BioRad電穿孔裝置)應用在1.5kV，2000hm和25 μ F下的脈沖。脈沖時間應為約5ms。
[0131]將細胞立即轉移至200 μ I的IM山梨糖醇中。隨后，添加4ml的YEPh2%葡萄糖，并將細胞懸浮液在30°C下孵育I小時。I小時之后，通過離心收集細胞，丟棄上清液并將球團再懸浮在4ml的IM山梨糖醇中。再次通過離心收集細胞,棄去上清液并將球團懸浮在300 μ IlM的山梨糖醇中。將細胞適當稀釋并用在選擇培養基中。
[0132]乙醇牛產
[0133]通過用冷凍的培養物原液或來自瓊脂平板的單菌落對于100ml搖瓶中的補充有2%葡萄糖的 25ml Verduyn-培養基(Verduyn 等人，Yeast8:501-517, 1992)接種，制備預培養物。30°C下在軌道搖床(280rpm)中孵育約24小時后，收獲這種培養物并用于測定二氧化碳釋放量(carbon dioxide evolution)和用于乙醇生產實驗。
[0134]在BAM(Biological Activity Monitor, Halotec,荷蘭)中 30 °C 下在 100ml 合成模式培養基(有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖、I %半乳糖和0.5%甘露糖的Verduyn-培養基(Verduyn等人，Yeast8:501-517, 1992)中進行乙醇生產的培養。在滅菌之前，用2M NaOH / H2SO4將培養基的pH調至4.2。對厭氧培養的合成培養基補充溶于乙醇的 0.01g / I 麥角留醇和 0.42g / I Tween80 (Andreasen and Stier.J.Cell Physiol.41:23-36，1953 ;and Andreasen and Stier.J.Cell Physiol.43:271-281,1954)。在約 2 的初始OD-下對培養基接種。通過磁性攪拌器攪拌培養物。厭氧條件在發酵期間快速發展，因為培養未被通氣。持續監測二氧化碳生產。通過NMR分析糖轉化和產物形成(乙醇，甘油)。通過觀察LKB Ultrospec K分光光度計上的600nm下的培養物的光密度值，來監測生長。
[0135]實施例1
[0136]木糖異構酶表達載體的構建
[0137]基于之前的氨基酸序列設計合成的密碼子對優化的xylA基因，并通過GeneArt (Regensburg，德國)合成。如前面所述(W02008000632)的進行密碼子對優化。在此包括作為SEQ ID NOl的核苷酸序列和對應的作為SEQ ID N02的氨基酸序列。
[0138]使用限制性酶SpeI和XmaI將開放讀碼框克隆進酵母穿梭載體p427_TEF(圖1 ;DualSystems Biote ch, Schlieren,瑞士)中。
[0139]質粒被稱為PPWT215。
[0140]實施例2
[0141]用pPWT215 轉化 BIE104P1
[0142]使用Chen等人(1992)所描述的一步法酵母轉化方法，用質粒pPWT215
轉化如 W02009109633 中所述的 S.cerevisiae 菌株-BIE104P1 (MATa
URA3HIS3LEU2TRP1MAL2-8SUC2GRE3::[TPIlp-TALl_ADHlp-TKLl_PGIIp-RPE1_ENOlp-RKIl])，其中GRE3-基因被戊糖磷酸通路非氧化部分的基因所代替。使用milliQ作為陰性對照。將轉化程序的最終球團再懸浮在Iml的YEPh2%葡萄糖(見上述)中。將50 μ I的該轉化混合物在補充有2%葡萄糖和200 μ g G418 / ml的YEPh瓊脂平板上涂板。剩余的950 μ I被轉移至含有補充有2%木糖、10 μ g G418 / ml和250 μ I的Pen-Str印溶液(Gibco / Invitrogen)的 25ml Verduyn 培養基的 100ml 搖瓶中。在 30°C和 280rpm 下于旋轉搖床中孵育接種的搖瓶(模擬轉化和質粒轉化)。隨著時間觀察光密度值。
[0143]實施例3
[0144]生長實驗
[0145]轉化之后的生長實驗的進展在圖2中示出。
[0146]在生長實驗的頭10天期間，培養物的600nm下的光密度值幾乎不增加。20天之后(在圖2中用“I”表示)，質粒轉化的細胞培養物的光密度值達到大于20的值。隨后，將一定量的培養物轉移至新鮮的25ml Verduyn培養基的等分試樣(含有2%木糖、10 μ gG418 / ml和250 μ I Pen-Strep)中。從圖2中清楚地看出，成功進行了 4次轉移。在存在空氣的情況下進行生長實驗，第四次轉移之后的最后一次培養例外，所述最后一次培養在有水鎖(厭氧條件)的搖瓶中進行。
[0147]從圖2中可推斷出，用pPWT215轉化的菌株BIE104P1酵母細胞已獲得了利用木糖作為唯一碳源和能量來源的能力，而模擬轉化的相同菌株的酵母細胞沒有顯示光密度值增加，因而不能在木糖上生長。
[0148]實施例4
[0149]構建發酵戊糖的細胞
[0150]S.cerevisae 菌株是菌株 BIE201 的衍生菌株。在 PCT / EP2011 / 056242 的實施例7中描述了該菌株的構建。這是下述菌株BIE201與適應性進化之前的其親本菌株BIE104A2Pla的回交結果，所述菌株BIE201通過用于有效阿拉伯糖發酵的轉化和適應性進化而被優化。菌株BIE292組成型表達來自Lactobacillus pi ant arum的基因araA、araB和araD和非氧化戊糖磷酸通路基因TAL1、TKL1、RPE1和RKII，并且缺失編碼醛糖還原酶的GRE3基因。此外，BIE292具有GAL80基因中的SNP (核苷酸改變A436C，其中起始密碼子ATG的A是I)和在染色體VII上的該阿拉伯糖表達盒的擴增。
[0151]隨后，用密碼子對優化的xylA基因的PCR片段(包括啟動子和終止子序列，側翼是與基因組中Tyl序列的IOObp重疊區)轉化菌株BIE292。使用pPWT215作為模板通過PCR擴增xylA表達盒。根據供應商的說明書，使用引物序列SEQ ID N03和SEQ ID N04，使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes),進行PCR反應。對擴增的表達盒進行乙醇沉淀并在使用前存儲于_20°C下。
[0152] 通過離心收集沉淀的DNA并且用70%乙醇洗滌DNA球團，隨后晾干。DNA以約I μ gDNA / μ I的濃度溶于TE-緩沖液。
[0153]將酵母菌株ΒΙΕ292在含有2%葡萄糖的YEPh-培養基中培養。如上所述的，制備感受態細胞用于電穿孔。將感受態細胞用20μ8 PCR產物轉化。使用milliQ水作為陰性對照。
[0154]將XyIA-轉化和模擬轉化二者的轉化混合物直接轉移到各含有補充有2%木糖和250 μ I pen / strep的25ml Verduyn培養基的4個不同的搖瓶中。因為不使用顯性選擇標記物，所以轉化后不對平板上正確轉化體進行選擇。
[0155]在30°C和280rpm下于旋轉搖床中孵育8個搖瓶。通過經常測量600nm下的光密度值來監測生長。
[0156]實施例5
[0157]發酵戊糖的酵母菌株的選擇和表征
[0158]如果實施例4中所述的培養物已在600nm下達到了大于15的光密度值，將250 μ I的等分試樣轉移至含有補充有2%木糖的Verduyn培養基的搖瓶中。經常監測600nm下的光密度值。使用光密度數據測定生長速率。
[0159]在含木糖的培養基上接種若干個循環之后，使用含有2%阿拉伯糖作為碳源的Verduyn培養基，以保持對阿拉伯糖利用的選擇壓力。類似地，使用含有下述Verduyn培養基的搖瓶，所述Verduyn培養基補充有己糖(即葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖)和戍糖(即阿拉伯糖和/或木糖)混合物。在阿拉伯糖和木糖二者上，最初在需氧條件下進行培養實驗，但隨后例如當生長速率超過約0.07 /小時或更高的值時，在厭氧條件下進行培養實驗。[0160]在厭氧條件下培養且再接種若干個循環后，將培養物的一份等分試樣稀釋至每毫升約100-1000個菌落形成單位(CFU)并隨后將10-100 μ I的等分部分在含有2%葡萄糖的YEPh-瓊脂平板上涂板。將平板在30°C下孵育至少48小時，或直到單菌落可見。
[0161]在BAM中測試單菌落隔離物(見上文)。基于如從二氧化碳譜和糖、乙醇和副產物的NMR數據推斷的高效發酵所有五種糖的能力，選擇單菌落隔離物。
[0162]通過對本領域技術人員而言已知的遺傳和分子生物學技術，比如PCR、Southern印跡、FIGE和再測序，表征最優菌株。
[0163]實施例6
[0164]發酵戊糖的酵母菌株的選擇和表征
[0165]當實施例4中所述的培養物已在600nm下達到大于10的光密度值時，將25 μ I的等分試樣轉移到含有補充有2%木糖的Verduyn培養基的搖瓶中。經常監測光密度值并使用這些數據測定生長速率。當培養物在600nm下達到大于15的光密度值時，將培養物的等分試樣轉移到含有補充有2%木糖的Verduyn培養基的搖瓶，并將搖瓶用能實現厭氧培養的水鎖來封閉。從此時起，在30°C和IOOrpm下于軌道搖床中進行孵育。通過測量600nm下的光密度值監測培養物的生長，并且基于這些數據計算生長速率。當培養物的600nm下的光密度值達到大于3.75的值時，將培養物的等分試樣轉移到含有補充有2%阿拉伯糖的Verduyn培養基的搖瓶中。將搖瓶用水鎖封閉。600nm下培養物達到光密度值大于5的值的情況下，將培養物的等分試樣再次轉移到含有補充有2%木糖的Verduyn培養基的搖瓶中，并將搖瓶用水鎖封閉。該生長實驗的典型的結果在圖3中給出。
[0166]從圖3清楚 地看出，用來自Clostridium beyerinckii的XylA對BIE292的轉化使得該菌株快速獲得消耗木糖的表型，而模擬轉化不會導致消耗木糖的細胞。
[0167]表1列出了用來自若干生物體的木糖異構酶基因轉化的S.cerevisiae菌株的生長速率。轉化后當在作為唯一碳源的木糖上初始生長后，菌株BIE292XI (C.beyerinckii)表示在需氧條件下的最大生長速率。此外，BIE292XI (C.beyerinckii)是能在厭氧條件下在木糖上生長而進行沒有廣泛的進化工程改造的唯一菌株。
[0168]表1:當在木糖上初始生長后，BIE292XI(C.beyerinckii)的生長速率和用Clostridium phytofermentans (參照 I)、Orpinomyces (參照 2)、Piromyces (RWB202)(參照 3)和 Thermus thermophilus (參照 4)的 XI 轉化的 Saccharomyces cerevisiae 菌株的
公眾可得到的數據。
[0169]
木糖異構酶[1S|11

C.beyerincki0.061h_10.056h_1

C.phytofermentans0.039h_1—
Orpinomyces0.01h"1--
Piromvces0.005h_1--
T.thermophilus——
[0170]上表中列出的數據都獲得自不同的菌株背景。一表示未測量出或未檢測出。對于負載來自τ.thermophilus的XI的S.cerevisiae菌株,應當注意到,觀察到木糖的消耗,但是消耗水 平太低以致不能支持生長。
【權利要求】
1.包含編碼木糖異構酶的核苷酸序列的細胞，其中所述木糖異構酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列具有至少75%的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列對所述宿主來說是異源的。
2.根據權利要求1的細胞，其為酵母細胞。
3.根據權利要求1或2的細胞，其中所述編碼木糖異構酶的核苷酸序列可獲得自Clostridium屬的細胞。
4.根據權利要求2或3的細胞,所述細胞是Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia>Schizosaccharomyces>Hansenula>Klockera>Schwanniomyces 或 Yarrowia 屬的酵母細胞。
5.根據權利要求4的細胞，其中所述酵母細胞是物種S.cerevisiae、S.bulder1、S.barnett1、S.exiguus、S.uvarum>S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus 或 K.fragilis的酵母細胞。
6.根據前述權利要求中任一項的細胞，其中所述細胞包含一種或多種遺傳修飾，所述遺傳修飾導致: a.所述細胞中木糖轉運提高； b.木酮糖激酶活性提高； c.通過戊糖磷酸途徑的通量提高； d.醛糖還原酶活性降低； e.對分解代謝物阻遏的敏感性降低； f.對乙醇、滲量或有機分子的耐性提高；或 g.副產物的生產減少。
7.根據權利要求6的細胞，其中所述一種或多種遺傳修飾導致編碼戊糖磷酸通路的非氧化部分的酶的至少一種基因的過表達。
8.根據權利要求7的細胞，其中所述基因是編碼核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶、轉酮酶或轉醛酶的基因。
9.根據權利要求6至8中任一項的細胞，其中所述一種或多種遺傳修飾導致編碼木酮糖激酶的基因過表達。
10.根據權利要求6至9中任一項的細胞，其中所述一種或多種遺傳修飾導致所述細胞中非特異性醛糖還原酶活性的降低。
11.前述權利要求中任一項的細胞，所述細胞具有使用L-阿拉伯糖的能力，其中基因TALK TKLU RPEl 和 RKIl 被過表達。
12.根據權利要求6至11中任一項的細胞，其中GRE3-基因的編碼區通過用包含基因TALl、TKLl、RPEl和RKIl的核苷酸序列來代替所述編碼區而被失活。
13.根據權利要求6至12中任一項的細胞,其中來自Lactobacilluspi ant arum的基因araA、araB和araD被表達。
14.根據權利要求6至13中任一項的細胞，其中一種或多種組成型表達或組成型過表達的基因被穩定整合進所述細胞的基因組中。
15.用于生產發酵產物的方法，所述方法包括用根據前述權利要求中任一項的細胞發酵含有木糖來源的培養基，使得所述細胞將木糖發酵成為所述發酵產物。
16.根據權利要求15的方法，其中所述發酵產物是乙醇、丁醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、丁醇、β -內酰胺抗生素和頭孢菌素。
17.根據權利要求15或16的方法，其中所述方法是厭氧的。
【文檔編號】C12N15/52GK103717733SQ201280037246
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年8月2日 優先權日:2011年8月4日
【發明者】保羅·克萊斯森, 芮妮·馬賽爾·德·鐘, 吉斯博蒂娜·皮特奈拉·范·蘇勒庫姆 申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司