細胞培養方法

細胞培養方法
【專利摘要】提供了一種用于生產具有羧基端（C端）賴氨酸或精氨酸殘基的目標水平的重組多肽的方法，包括抗體。該方法涉及在細胞培養基中培養表達所述多肽的細胞，該細胞培養基具有充足水平的改變細胞內pH的賴氨酸、精氨酸，和/或制劑。在此類條件下培養這些細胞并不影響細胞生長、細胞活力，或效價。
【專利說明】細胞培養方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年7月8日提交的美國臨時申請序列號61/505，681的權益，其全部內容通過引用結合在此。
發明領域
[0003]本發明總體上涉及細胞培養方法。
[0004]發明背景
[0005]治療性多肽是一種重要類別的治療性生物技術產品，并且治療性抗體(包括鼠類的、嵌合體的、人源化的和人類抗體以及其片段)占治療性生物制劑產品的大部分。
[0006]概述
[0007]在一個方面中，本發明的特征是一種生產重組多肽群的方法，該方法包括:提供一種重組多肽的C端變體的目標值，提供包括編碼該重組多肽的核酸的一種宿主細胞，將該宿主細胞在以下條件下培養:(i)其中該細胞表達該編碼的重組多肽的C端變體群以及
(ii)增加該細胞的細胞內PH，并且分離該群，其中該群包括該重組多肽的C端變體的提供的目標值。
[0008]在一些實施例中，增加該細胞的細胞內pH的條件包括在一種培養基中培養這些細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(a)大約lg/L至大約50g/L賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸；(b)大約0.lg/L葡萄糖至大約10g/L葡萄糖；(c)大約2mM至大約IOmMNH4Cl ； (d)大約10 μ M至大約500 μ M氯喹；以及(e)大約IOmM至大約30mM谷氨酰胺。
[0009]在一些實施例中，相對于對照培養條件,細胞內pH增加至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約100%，或者更多。在一些實施例中，相對于對照培養條件，細胞內 pH 值增加至少大約 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、1.1,1.2,1.3,1.4,1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3，或更多。
[0010]在一些實施例中，該目標值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的多肽的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的多肽的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的多肽的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的多肽的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的多肽的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的多肽的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的多肽的水平大約是0.1、大約是
0.2、大約是0.3、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、或者大約是I。
[0011]在一些實施例中，該重組多肽是一種包含Fe的重組多肽(例如，抗體)。在一些實施例中，該目標值是在群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0012]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該群中一種或多種C端變體的水平。在一些實施例中，該群是含Fe多肽或抗體的群，并且該方法進一步包括測量該群中K0、K1、或Κ2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例 如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、Κ1、或Κ2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0013]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產含Fe多肽的群的方法，該方法包括:提供一種含Fe多肽的ΚΟ、Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體的目標值，提供包括編碼該含Fe多肽的核酸的一種宿主細胞，將該宿主細胞在以下條件下培養:(i)其中該細胞表達該編碼的含Fe多肽的K0、K1、和/或Κ2賴氨酸變體的群以及(ii)增加該細胞的細胞內pH ;并且分離該群，其中該群包括該含Fe多肽的ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體的提供的目標值。
[0014]在一些實施例中，增加該細胞的細胞內pH的條件包括在一種培養基中培養這些細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(a)大約2g/L至大約50g/L賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸；(b)大約0.lg/L葡萄糖至大約10g/L葡萄糖；(c)大約2mM至大約IOmMNH4Cl ； (d)大約10 μ M至大約500 μ M氯喹；以及(e)大約IOmM至大約30mM谷氨酰胺。
[0015]在一些實施例中，增加該細胞的細胞內pH的條件包括在一種培養基中培養這些細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(a)至少大約lg/L的賴氨酸、精氨酸或組氨酸；(b)大約0.5g/L葡萄糖至大約2g/L的葡萄糖；(c)大約2mM至大約IOmM的NH4Cl ； (d)大約10 μ M至大約500 μ M氯喹；以及(e)大約IOmM至大約30mM谷氨酰胺。
[0016]在一些實施例中，相對于對照培養條件,細胞內pH增加至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約100%，或者更多。在一些實施例中，相對于對照培養條件，細胞內 pH 值增加至少大約 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、1.1,1.2,1.3,1.4,1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3，或更多。
[0017]在一些實施例中，該目標值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多妝的水平大約是0.1、大約是0.2、大約是0.3、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、或者大約是I。
[0018]在一些實施例中，該目標值是在群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0019]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該群中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0020]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產抗體群的方法，該方法包括:提供一種抗體的ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體的目標值；提供包括編碼該抗體的核酸的一種宿主細胞；將該宿主細胞在以下條件下培養:(i)其中該細胞表達該編碼的抗體的ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體的群以及(ii)增加該細胞的細胞內pH;并且分離該群，其中該群包括該抗體的K0、K1、和/或Κ2賴氨酸變體的提供的目標值。
[0021]在一些實施例中，增加該細胞的細胞內pH的條件包括在一種培養基中培養這些細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(a)大約2g/L至大約50g/L賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸；(b)大約0.lg/L葡萄糖至大約10g/L葡萄糖；(c)大約2mM至大約IOmMNH4Cl ； (d)大約10 μ M至大約500 μ M氯喹；以及(e)大約IOmM至大約30mM谷氨酰胺。
[0022]在一些實施例中，相對于對照培養條件,細胞內pH增加至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約100%，或者更多。在一些實施例中，相對于對照培養條件，細胞內 pH 值增加至少大約 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、1.1,1.2,1.3,1.4,1.5、
1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3，或更多。
[0023]在一些實施例中，該目標值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平大約是0.1、大約是0.2、大約是0.3 、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、或者大約是I。
[0024]在一些實施例中，該目標值是在該群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0025]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該群中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種 或多種的水平。
[0026]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組抗體群的方法，該方法包括:提供一種重組抗體的C端變體的目標值，提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞，將該宿主細胞在包括大約2g/L至大約50g/L賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸的培養基中，在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體的群的條件下培養；并且分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
[0027]在一些實施例中，該培養基包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸或賴氨酸、精氨酸、和/或組氨酸的組合，其濃度至少大約1.5g/L、至少大約2g/L、至少大約2.5g/L、至少大約3g/L、至少大約3.5g/L、至少大約4g/L、至少大約4.5g/L、至少大約5g/L、至少大約5.5g/L、至少大約6g/L、至少大約6.5g/L、至少大約7g/L、至少大約7.5g/L、至少大約8g/L、至少大約8.5g/L、至少大約9g/L、至少大約9.5g/L、至少大約10g/L、至少大約10.5g/L、至少大約llg/L、至少大約11.5g/L、至少大約12g/L、至少大約12.5g/L、至少大約13g/L、至少大約
13.5g/L、至少大約14g/L、至少大約14.5g/L、至少大約15g/L、至少大約15.5g/L、至少大約16g/L、至少大約16.5g/L、至少大約17g/L、至少大約17.5g/L、至少大約18g/L、至少大約18.5g/L、至少大約19g/L、至少大約19.5g/L、至少大約20g/L、至少大約25g/L、至少大約30g/L、至少大約35g/L、至少大約40g/L、至少大約45g/L、至少大約50g/L,或更多。
[0028]在一些實施例中，該目標值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平大約是0.1、大約是0.2、大約是0.3、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、
或者大約是I。
[0029]在一些實施例中，該目標值是在該群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0030]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該群中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0031]特征在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組抗體群的方法，該方法包括:提供一種重組抗體的C端 變體的目標值，提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞，將該宿主細胞在包括大約0.lg/L葡萄糖至大約10g/L葡萄糖的培養基中，在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體的群的條件下培養；并且分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
[0032]在一些實施例中，該培養基包括濃度在大約0.5g/L至大約2g/L的葡萄糖。在一些實施例中，該培養基包括濃度大約在0.lg/L至大約10g/L的葡萄糖，例如，大約0.2g/L、大約 0.3g/L、大約 0.4g/L、大約 0.5g/L、大約 0.6g/L、大約 0.7g/L、大約 0.8g/L、大約 0.9g/L、大約 lg/L、大約 1.lg/L、大約 1.2g/L、大約 1.3g/L、大約 1.4g/L、大約 1.5g/L、大約 1.6g/L、大約 1.7g/L、大約 1.8g/L、大約 1.9g/L、大約 2g/L、大約 2.lg/L、大約 2.2.g/L、大約 2.3g/L、大約 2.4g/L、大約 2.5g/L、大約 2.6g/L、大約 2.7g/L、大約 2.8g/L、大約 2.9g/L、大約 3g/L、大約 3.5g/L、大約 4g/L、大約 4.5g/L、大約 5g/L、大約 5.5g/L、大約 6g/L、大約 6.5g/L、大約7g/L、大約7.5g/L、大約8g/L、大約8.5g/L、大約9g/L、大約9.5g/L、大約10g/L、或更多。在一些實施例中，該葡萄糖濃度是一種受控的葡萄糖濃度。
[0033]在一些實施例中，該目標值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平大約是0.1、大約是0.2、大約是0.3、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、
或者大約是I。
[0034]在一些實施例中，該目標值是在該群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0035]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該群中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0036]特征在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組抗體群的方法，該方法包括:提供一種重組抗體的C端變體的目標值，提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞，將該宿主細胞在包括大 約ImM至大約50mMNH4Cl的培養基中，在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體的群的條件下培養；并且分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
[0037]在一些實施例中，該培養基包括NH4Cl的濃度大約ImM至大約30mM，例如，大約ImM、大約2mM、大約3mM、大約4mM、大約5mM、大約6mM、大約7mM、大約8mM、大約9mM、大約10mM、大約I ImM、大約12mM、大約13mM、大約14mM、大約15mM、大約16mM、大約17mM、大約18mM、大約19mM、大約20mM、大約25mM、大約30mM、大約40mM、大約50mM、或更多。
[0038]在一些實施例中，該目標值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平大約是0.1、大約是0.2、大約是0.3、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、或者大約是I。
[0039]在一些實施例中，該目標值是在該群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0040]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該群中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0041]特征在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組抗體群的方法，該方法包括:提供一種重組抗體的C端變體的目標值，提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞，將該宿主細胞在包括大約?ο μ m至大約500 μ m氯喹的培養基中，在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體的群的條件下培養；并且分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
[0042]在一些實施例中，該培養基包括以下濃度的氯喹:大約ΙΟμΜ、大約20μΜ、大約30 μ Μ、大約40 μ Μ、大約50 μ Μ、大約60 μ Μ、大約70 μ Μ、大約80 μ Μ、大約90 μ Μ、大約100 μ Μ、大約 110 μ Μ、大約 120 μ Μ、大約 130 μ Μ、大約 140 μ Μ、大約 150 μ Μ、大約 160 μ Μ、大約 170 μ Μ、大約 180 μ Μ、大約 190 μ Μ、大約 200 μ Μ、大約 210 μ Μ、大約 220 μ Μ、大約 230 μ Μ、大約250 μ Μ、大約250 μ Μ、大約260 μ Μ、大約270 μ Μ、大約280 μ Μ、大約290 μ Μ、大約300 μ Μ、大約 310 μ Μ、大約 320 μ Μ、大約 330 μ Μ、大約 340 μ Μ、大約 350 μ Μ、大約 360 μ Μ、大約 370 μ Μ、大約 380 μ Μ、大約 390 μ Μ、大約 400 μ Μ、大約 410 μ Μ、大約 420 μ Μ、大約 430 μ Μ、大約440 μ Μ、大約450 μ Μ、大約460 μ Μ、大約470 μ Μ、大約480 μ M?大約490 μ Μ、大約500 μ Μ、或更多。
[0043]在一些實施例中，該目標值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平大約是0.1、大約是0.2、大約是0.3、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、或者大約是I。
[0044]在一些實施例中，該目標值是在該群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0045]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該群中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0046]特征在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組抗體群的方法，該方法包括:提供一種重組抗體的C端變體的目標值，提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞，將該宿主細胞在包括大約5mM至大約80mM谷氨酰胺的培養基中，在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體的群的條件下培養；并且分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
[0047]在一些實施例中，該培養基包括谷氨酰胺的濃度大約在IOmM至大約30mM。在其他實施例中，該培養基包括以下濃度的谷氨酰胺:大約5mM、大約10mM、大約15mM、大約20mM、大約25mM、大約30mM、大約35mM、大約40mM、大約45mM、大約50mM、大約55mM、大約60mM、大約65mM、大約70mM、大約75mM、大約80mM、或更多。
[0048]在一些實施例中，該目標`值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平大約是0.1、大約是0.2、大約是0.3、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、或者大約是I。
[0049]在一些實施例中，該目標值是在該群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0050]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該群中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0051]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組的含Fe多肽的方法，該方法包括:在包括大約lg/L至大約50g/L組氨酸的培養基中，在其中一種細胞表達該重組抗體的群的條件下培養該細胞；分離該群；并且測量該群的K0、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該含Fe多肽是一種抗體。
[0052]在一些實施例中，該培養基包括以下濃度的組氨酸:至少大約1.5g/L、至少大約2g/L、至少大約2.5g/L、至少大約3g/L、至少大約3.5g/L、至少大約4g/L、至少大約4.5g/L、至少大約5g/L、至少大約5.5g/L、至少大約6g/L、至少大約6.5g/L、至少大約7g/L、至少大約7.5g/L、至少大約8g/L、至少大約8.5g/L、至少大約9g/L、至少大約9.5g/L、至少大約10g/L、至少大約10.5g/L、至少大約llg/L、至少大約11.5g/L、至少大約12g/L、至少大約
12.5g/L、至少大約13g/L、至少大約13.5g/L、至少大約14g/L、至少大約14.5g/L、至少大約15g/L、至少大約15.5g/L、至少大約16g/L、至少大約16.5g/L、至少大約17g/L、至少大約
17.5g/L、至少大約18g/L、至少大約18.5g/L、至少大約19g/L、至少大約19.5g/L、至少大約20g/L、至少大約25g/L、至少大約30g/L、至少大約35g/L、至少大約40g/L、至少大約45g/L、至少大約50g/L,或更多。
[0053]在一些實施例中，該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體是以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0054]在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體水平。
[0055]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組的含Fe多肽的方法，該方法包括:特征在包括大約0.lg/L至大約10g/L葡萄糖的培養基中,在其中一種細胞表達該重組抗體的群的條件下培養該細胞；分離該群；并且測量該群的K0、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該含Fe多肽是一種抗體。
[0056]在一些實施例中，該培養基包括濃度在大約0.5g/L至大約2g/L的葡萄糖。在一些實施例中，該培養基包括濃度大約在0.lg/L至大約10g/L的葡萄糖，例如，大約0.2g/L、大約 0.3g/L、大約 0.4g/L、大約 0.5g/L、大約 0.6g/L、大約 0.7g/L、大約 0.8g/L、大約 0.9g/L、大約 lg/L、大約 1.lg/L、大約 1.2g/L、大約 1.3g/L、大約 1.4g/L、大約 1.5g/L、大約 1.6g/L、大約 1.7g/L、大約 1.8g/L、大約 1.9g/L、大約 2g/L、大約 2.lg/L、大約 2.2.g/L、大約 2.3g/L、大約 2.4g/L、大約 2.5g/L、大約 2.6g/L、大約 2.7g/L、大約 2.8g/L、大約 2.9g/L、大約 3g/L、大約 3.5g/L、大約 4g/L、大約 4.5g/L、大約 5g/L、大約 5.5g/L、大約 6g/L、大約 6.5g/L、大約7g/L、大約7.5g/L、大約8g/L、大約8.5g/L、大約9g/L、大約9.5g/L、大約10g/L、或更多。在一些實施例中，該葡萄糖濃度是一種受控的葡萄糖濃度。
[0057]在一些實施例中，該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體是以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。 [0058]在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體水平。
[0059]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組的含Fe多肽的方法，該方法包括:特征在包括大約ImM NH4Cl至大約50mM NH4Cl的培養基中，在其中一種細胞表達該重組抗體的群的條件下培養該細胞；分離該群；并且測量該群的K0、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該含Fe多肽是一種抗體。
[0060]在一些實施例中，該培養基包括NH4Cl的濃度大約ImM至大約30mM，例如，大約ImM、大約2mM、大約3mM、大約4mM、大約5mM、大約6mM、大約7mM、大約8mM、大約9mM、大約10mM、大約I ImM、大約12mM、大約13mM、大約14mM、大約15mM、大約16mM、大約17mM、大約18mM、大約19mM、大約20mM、大約25mM、大約30mM、大約40mM、大約50mM、或更多。
[0061]在一些實施例中，在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體是以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0062]在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體水平。
[0063]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組的含Fe多肽的方法，該方法包括:特征在包括大約5mM至大約SOmM谷氨酰胺的培養基中，在其中一種細胞表達該重組抗體的群的條件下培養該細胞；分離該群；并且測量該群的K0、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該含Fe多肽是一種抗體。
[0064]在一些實施例中，該培養基包括谷氨酰胺的濃度大約在IOmM至大約30mM。在其他實施例中，該培養基包括以下濃度的谷氨酰胺:大約5mM、大約10mM、大約15mM、大約20mM、大約25mM、大約30mM、大約35mM、大約40mM、大約45mM、大約50mM、大約55mM、大約60mM、大約65mM、大約70mM、大約75mM、大約80mM、或更多。
[0065]在一些實施例中，在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體是以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0066]在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體水平。
[0067]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組的含Fe多肽的方法，該方法包括:特征在包括大約10 μ M至大約500 μ M氯喹的培養基中，在其中一種細胞表達該重組抗體的群的條件下培養該細胞；分離該群；并且測量該群的Κ0、Κ1、或Κ2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該含Fe多肽是一種抗體。
[0068]在一些實施例中，該培養基包括以下濃度的氯喹:大約ΙΟμΜ、大約20μΜ、大約30 μ Μ、大約40 μ Μ、大約50 μ Μ、大約60 μ Μ、大約70 μ Μ、大約80 μ Μ、大約90 μ Μ、大約100 μ Μ、大約 110 μ Μ、大約 120 μ Μ、大約 130 μ Μ、大約 140 μ Μ、大約 150 μ Μ、大約 160 μ Μ、大約 170 μ Μ、大約 180 μ Μ、大約 190 μ Μ、大約 200 μ Μ、大約 210 μ Μ、大約 220 μ Μ、大約 230 μ Μ、大約250 μ Μ、大約250 μ Μ、大約260 μ Μ、大約270 μ Μ、大約280 μ Μ、大約290 μ Μ、大約300 μ Μ、大約 310 μ Μ、大約 320 μ Μ、大約 330 μ Μ、大約 340 μ Μ、大約 350 μ Μ、大約 360 μ Μ、大約 370 μ Μ、大約 380 μ Μ、大約 390 μ Μ、大約 400 μ Μ、大約 410 μ Μ、大約 420 μ Μ、大約 430 μ Μ、大約440 μ Μ、大約450 μ Μ、大約460 μ Μ、大約470 μ Μ、大約480 μ M?大約490 μ Μ、大約500 μ Μ、或更多。
[0069]在一些實施例中，該群中Kl賴氨酸變體和/或Κ2賴氨酸變體是以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0070]在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體水平。
[0071]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組的含Fe多肽的制品的方法，該方法包括:在一種培養基中培養細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(i)大約2g/L至大約50g/L組氨酸；(ii)大約0.5g/L葡萄糖至大約2g/L葡萄糖；(iii)大約2mM至大約IOmM NH4Cl ； (iv)大約5mM至大約80mM谷氨酰胺；以及(V)大約10 μ M至大約500 μ M氯喹；在其中這些細胞表達重組抗體的條件下；并且從這些細胞或該培養基中分離這些重組抗體以生產一種制品，該制品包括這些重組的含Fe多肽的Κ0、Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體的目標值。在一些實施例中，該含Fe多肽是抗體。[0072]在一些實施例中，該目標值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多肽的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的含Fe多妝的水平大約是0.1、大約是0.2、大約是0.3、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、或者大約是I。
[0073]在一些實施例中，該目標值是在該群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0074]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該群中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水 平。
[0075]在一個方面中，本發明的特征是一種生產重組多肽的方法，該方法包括:在包括至少大約lg/L賴氨酸，至少大約lg/L精氨酸，或至少大約lg/L的賴氨酸和精氨酸的組合的培養基中，在其中一種細胞表達一種重組多肽的條件下培養該細胞。
[0076]在一些實施例中，該方法進一步包括分離該重組多肽。在一些實施例中，該方法進一步包括測量該分離的重組多肽的C末端的賴氨酸和/或精氨酸殘基的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄賴氨酸和/或精氨酸殘基的水平。
[0077]在一些實施例中，該重組多肽是一種重組抗體或一種重組Fe融合蛋白。
[0078]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組抗體或重組Fe融合蛋白的方法，該方法包括:在包括至少大約lg/L賴氨酸，至少大約lg/L精氨酸，或至少大約lg/L的賴氨酸和精氨酸的組合的培養基中，在其中一種細胞表達一種重組抗體或一種重組Fe融合蛋白的條件下培養該細胞。
[0079]在一些實施例中，該方法進一步包括分離該重組抗體或該重組Fe融合蛋白。在一些實施例中，該方法進一步包括測量該分離的重組抗體或該重組融合蛋白的制品中K0、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、Κ1、或Κ2賴氨酸殘基中的一種或多種的水平。
[0080]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組抗體制品的方法，該方法包括:在包括至少大約lg/L賴氨酸，至少大約lg/L精氨酸，或者至少lg/L的賴氨酸和精氨酸的組合的培養基中，在其中細胞表達重組抗體的條件下培養這些細胞；并且從這些細胞或該培養基中分離這些重組抗體以生產一種包括ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體的目標值的制品。
[0081]在一些實施例中，該方法進一步包括測量該制品中ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄K0、K1、和/或Κ2賴氨酸變體水平。
[0082]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組抗體制品的方法，該方法包括:特征在包括至少大約lg/L賴氨酸，至少大約lg/L精氨酸，或者至少lg/L的賴氨酸和精氨酸的組合的培養基中，在其中細胞表達重組抗體的條件下培養這些細胞；并且從這些細胞或該培養基中分離這些重組抗體以生產一種包括至少大約1%的Kl和/或K2賴氨酸變體的制品。
[0083]在一些實施例中，該方法進一步包括測量K0、K1和/或Κ2賴氨酸變體的水平以及將它們與參考標準比較(例如，以FDA標簽上的產品說明書、醫囑(Physician’ s Insert)、USP專論,或者EP專論)。在一些實施例中，該方法進包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄K0、K1、和/或Κ2賴氨酸變體的水平。
[0084]在一些實施例中，該方法進一步包括確定該制品中Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該制品包括至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多的Kl和/或Κ2賴氨酸變體。
[0085]在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體水平。
[0086]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產具有ΚΟ、Κ1、或Κ2賴氨酸變體中的一種或多種的目標值的重組抗體的制品的方法，該方法包括:在包括賴氨酸和/或精氨酸的培養基中，在其中細胞表達重組抗體的條件下培養這些細胞；測量培養中Κ0、Κ1、或Κ2賴氨酸變體中的一種或多種的水平；并且當該培養中的ΚΟ、Κ1、或Κ2賴氨酸變體中的一種或多種的水平是一個目標值時，從這些細胞或該培養基中分離這些重組抗體以生產這些重組抗體的一種制品。
[0087]在一些實施例中，該方法進一步包括以印刷體或電腦可讀介質(例如，以測試報告、物質安全數據表(MSDS)或檢測證書或分析證書(CofA))記錄ΚΟ、Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體水平。[0088]在另一個方面中，本發明的特征是一種在重組抗體的制品中減小KO賴氨酸變體的水平和/或增加Kl或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平的方法，該方法包括:在包括一個量的賴氨酸、精氨酸，和/或賴氨酸和精氨酸的組合(多于在標準培養基中賴氨酸、精氨酸，和/或賴氨酸和精氨酸的組合的量)的培養基中培養細胞，其中這些細胞在其中這些細胞表達重組抗體的條件下培養；并且分離這些重組抗體，由此相對于從在標準培養基中培養的細胞生產的重組抗體的制品而言，減少該制品中KO賴氨酸變體的水平和/或增加Kl或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0089]在另一個方面中，本發明的特征是一種在重組抗體的制品中減小KO賴氨酸變體的水平和/或增加Kl或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平的方法，該方法包括:在包括至少大約lg/L賴氨酸，至少大約lg/L精氨酸，或至少lg/L的賴氨酸和精氨酸的組合的培養基中，在其中細胞表達重組抗體的條件下培養這些細胞；并且分離這些重組抗體，由此相對于不使用包括至少大約lg/L賴氨酸,至少大約lg/L精氨酸，或者至少lg/L的賴氨酸和精氨酸的組合的培養基生產的重組抗體制品，在該制品中減小KO賴氨酸變體水平和/或增加Kl或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0090]在另一個方面中，本發明的特征是一種培養生產重組抗體的細胞的方法，該方法包括:在包括至少大約lg/L賴氨酸，至少大約lg/L精氨酸，或至少大約lg/L賴氨酸和精氨酸的組合的培養基中，在其中細胞表達一種重組抗體的條件下培養這些細胞。
[0091]在一些實施例中，該方法進一步包括監測該培養中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。在一些實施例中，該方法進一步包括當ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平達到目標值時，將這些細胞從該培養中去除。
[0092]在另一個方面中，本發明的特征是由在此描述的方法生產的一種重組多肽，例如一種重組抗體。
[0093]在另一個方面中，本發明的特征是包括至少大約lg/L賴氨酸，至少大約lg/L精氨酸，或者至少lg/L的賴氨酸和精氨酸`的組合的細胞培養基。
[0094]在另一個方面中，本發明的特征是一種細胞培養，包括:表達重組抗體的細胞；以及包括至少大約lg/L賴氨酸，至少大約lg/L精氨酸，或至少lg/L的賴氨酸和精氨酸的組合的培養基。
[0095]在一些實施例中，該培養包括K0、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的目標值。
[0096]在一些實施例中，該培養是一種分批培養,連續培養或流加培養。
[0097]在另一個方面中，本發明的特征是包括在此描述的細胞培養的生物反應器。
[0098]在此描述的一些方面中，該培養基包括以下量的賴氨酸(例如，L-賴氨酸)，精氨酸(例如，L-精氨酸)，或者賴氨酸(例如，L-賴氨酸)和精氨酸(例如，L-精氨酸)組合:至少大約1.5g/L、至少大約2g/L、至少大約2.5g/L、至少大約3g/L、至少大約3.5g/L、至少大約4g/L、至少大約4.5g/L、至少大約5g/L、至少大約5.5g/L、至少大約6g/L、至少大約6.5g/L、至少大約7g/L、至少大約7.5g/L、至少大約8g/L、至少大約8.5g/L、至少大約9g/L、至少大約9.5g/L、至少大約10g/L、至少大約10.5g/L、至少大約llg/L、至少大約11.5g/L、至少大約12g/L、至少大約12.5g/L、至少大約13g/L、至少大約13.5g/L、至少大約14g/L、至少大約14.5g/L、至少大約15g/L、至少大約15.5g/L、至少大約16g/L、至少大約16.5g/L、至少大約17g/L、至少大約17.5g/L、至少大約18g/L、至少大約18.5g/L、至少大約19g/L、至少大約19.5g/L、至少大約20g/L、至少大約25g/L、至少大約30g/L、至少大約35g/L、至少大約40g/L、至少大約45g/L、至少大約50g/L,或更多。
[0099]在其他方面中，該培養基包括以下量的賴氨酸(例如，L-賴氨酸)，精氨酸(例如，L-精氨酸)，或者賴氨酸(例如，L-賴氨酸)和精氨酸(例如，L-精氨酸)組合:至少大約ImM、大約2mM、大約3mM、大約4mM、大約5mM、大約6mM、大約7mM、大約8mM、大約9mM、大約10mM、大約I ImM、大約12mM、大約13mM、大約14mM、大約15mM、大約20mM、大約25mM、大約30mM、大約35mM、大約40mM、大約45mM、大約50mM、大約55mM、大約60mM、大約65mM、大約70mM、大約75mM、大約80mM、大約85mM、大約90mM、大約95mM、大約lOOmM、大約125mM、大約150mM、大約200mM、大約250mM、大約300mM、大約350mM、大約400mM、大約450mM、大約500mM、或更多。
[0100]在另一個方面中，本發明的特征是一種在重組抗體的制品中增加KO賴氨酸變體的水平和/或減小Kl或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平的方法，該方法包括:在包括一個量的賴氨酸、精氨酸，和/或賴氨酸和精氨酸的組合(少于在標準培養基中賴氨酸、精氨酸，和/或賴氨酸和精氨酸的組合的量)的培養基中培養細胞，其中這些細胞在其中這些細胞表達重組抗體的條件下培養；并且分離這些重組抗體，由此相對于從在標準培養基中培養的細胞生產的重組抗體的制品而言，增加該制品中KO賴氨酸變體的水平和/或減小Kl或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
[0101]在此描述的一些方面中，該方法進一步包括在培養步驟期間，例如在培養步驟期間至少一次，兩次，三次或多次監測培養基中的賴氨酸、精氨酸、組氨酸、葡萄糖、NH4C1、氯喹，和/或谷氨酰胺。
[0102]在此描述的一些方面中，該目標值是在參考標準中列舉出的水平，例如用于包含該重組抗體制品的藥物制品的產品說明書或質量標準。例如，該產品說明書是一種在FDA標簽、醫囑、USP專論，或E P專論中的產品說明。
[0103]在具體的實施例中，該目標值是在相應的重組抗體制品中ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體的水平。
[0104]在另一個方面中，本發明的特征是一種生產重組抗體制品的方法，該方法包括:特征在一種培養基中培養細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(i)大約2g/L至大約50g/L組氨酸；(ii)大約0.5g/L葡萄糖至大約2g/L葡萄糖；(iii)大約2mM至大約IOmMNH4Cl ； (iv)大約5mM至大約80mM谷氨酰胺；以及(V)大約10 μ M至大約500 μ M氯喹；在其中這些細胞表達重組抗體的條件下；從這些細胞或該培養基中分離這些重組抗體；測量該制品中這些重組抗體的Κ0、Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體的水平；并且如果Κ0、Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體的水平是目標值，那么將該制品配制進入一種藥物產品。
[0105]在一些實施例中，該目標值是在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，該目標值是相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平和在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平。在一些實施例中，相對于在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平與在羧基端不包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平的總和而言，在羧基端包括賴氨酸殘基或精氨酸殘基的抗體的水平大約是0.1、大約是0.2、大約是0.3、大約是0.4、大約是0.5、大約是0.6、大約是0.7、大約是0.8、大約是0.9、或者大約是I。[0106]在一些實施例中，該目標值是在該群中包括C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈的以下水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。在一些實施例中，該目標值是在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，該目標值是在群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:至少大約1%、至少大約2%、至少大約3%、至少大約4%、至少大約5%、至少大約6%、至少大約7%、至少大約8%、至少大約9%、至少大約10%、至少大約11%、至少大約12%、至少大約13%、至少大約14%、至少大約15%、至少大約16%、至少大約17%、至少大約18%、至少大約19%、至少大約20%、至少大約25%、至少大約30%、至少大約35%、至少大約40%、至少大約45%、至少大約50%、或更多。
[0107]在另一個方面中，本發明的特征是一種制造藥物抗體制品的方法，該方法包括:為一種治療性重組抗體提供C端賴氨酸變體的目標值，提供包括編碼一種重組抗體的輕鏈和重鏈的核酸的一種宿主細胞，在以下條件下培養該宿主細胞:(i)其中該細胞表達該編碼的輕鏈和重鏈以形成該重組抗體以及(ii)增加該細胞的細胞內pH，從該細胞或細胞培養中分離該治療性重組抗體的群，并且如果該群包括C端賴氨酸變體的提供的目標值則將該分離的群配制進入藥物產品中，由此制造一種藥物抗體制品。
[0108]在一些實施例中，相對于該群中的總重鏈，C端賴氨酸變體的目標值是C端包含賴氨酸的重鏈的預選擇水平。在一些實施例中，C端賴氨酸變體的目標值是在該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的預選擇水平。
[0109]在此描述的一些方面中，其中細胞(例如，哺乳動物細胞)表達重組多肽或重組抗體的條件包括(i)具有以下PH的培養基:大約6、大約6.5、大約6.6、大約6.7、大約6.8、大約6.9、大約7、大約7.1、大約7.2、大約7.3、大約7.4、大約7.5、或大約8 ； (ii)以下溫度:25°C、大約26°C、大約27°C、大約28°C、大約29°C、大約30°C、大約31°C、大約32°C、大約33°C、大約34°C、大約35°C、大約36 V、大約37°C、大約38 V、大約39 V、或大約40 V ;和/或(iii)以下的培養體積:大約100mL、大約200mL、大約300mL、大約400mL、大約500mL、大約600mL、大約700mL、大約800mL、大約900mL、大約1L、大約2L、大約3L、大約5L、大約10L、大約20L、大約30L、大約40L、大約50L、大約100L、大約200L、大約300L、大約400L、大約500L、大約600L、大約700L、大約800L、大約900L、大約1000L、或更多。
[0110]在此描述的一些方面中，這些細胞是哺乳動物細胞。在某些實施例中，這些哺乳動物細胞是 CHO、Vero, BHK、HeLa, COS、MDCK、或 HEK-293 細胞。
[0111]在此描述的一些方面中，該重組抗體是阿昔單抗、阿達木單抗、阿侖單抗、巴利昔單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、塞妥珠單抗、達利珠單抗、依庫麗單抗、依法利珠單抗、吉妥珠單抗、替伊莫單抗、英利昔單抗、莫羅莫那、那他珠單抗、奧馬珠單抗、帕利珠單抗、帕尼單抗、蘭尼單抗、利妥昔單抗、托西莫單抗、或曲妥單抗。
[0112]在此描述的一些方面中，該多肽是一種融合蛋白。在某些實施例中，該融合蛋白是阿發賽特、阿巴西普、依那西普，或地尼白介素。[0113]附圖簡要說明
[0114]當與伴隨的附圖一起閱讀時，在此描述的傳授內容將從以下不同說明性實施例的描述中更完整地理解。應當理解的是以下描述的附圖僅僅是為了說明目的并且并不是旨在以任何形式限制本傳授內容的范圍。
[0115]圖1是來自細胞的模型抗體制品中Kl和K2賴氨酸殘基的水平的圖示，這些細胞生長在對照方法、補充有10g/L賴氨酸的方法、補充有10g/L精氨酸的方法中，與阿達木單抗⑧制品中的Kl和K2賴氨酸殘基的水平相比較。
[0116]詳細說明
[0117]發明人已經發現具有羧基端(C端)賴氨酸或精氨酸殘基的目標水平的多肽(例如，抗體)可以從在具有充分水平的賴氨酸、精氨酸，和/或改變細胞內pH的制劑的培養基中培養的細胞生產。出人意料的是，在此類條件下培養細胞并不影響細胞生長、細胞活力或效價。本披露包含具有C端賴氨酸和/或精氨酸殘基的目標水平的多肽(例如，抗體)，生產此類多肽(例如，抗體)的方法，以及使用此類多肽(例如，抗體)的方法。
[0118]定義
[0119]如在此使用的，“純化的”(或“分離的”)是指一種核酸序列(例如，多核苷酸)或一種基本上不含其他組分的氨基酸序列(例如，多肽)。在一些實施例中，將一種純化的多核苷酸或純化的多肽從存在于其天然環境中的其他組分移除或者分離。例如，一種分離的多肽是從生產它的細胞的其他組分分離的一種(例如，內質網或細胞質蛋白和RNA )。一種分離的多核苷酸是從其他細胞核組分(例如，組蛋白)和/或從上游或下游核酸序列中分離的一種。一種分離的核酸序列或氨基酸序列可以是至少60%、或至少75%、或至少90%，或至少95%無存在于指示核酸序列或氨基酸序列天然環境中的其他組分。
[0120]如在此使用的，“多核苷酸”(或“核苷酸序列”或“核酸分子”)是指一種寡核苷酸、核苷酸，或多核苷酸，和其片段或部分，并且是指可以是單鏈或雙鏈以及代表正義或反義鏈的基因組來源或合成來源的DNA和RNA。
[0121]如在此使用的，“多肽”(或“氨基酸序列”或“蛋白質”)是指一種寡肽、肽、多肽，或蛋白質序列，和其片段或部分，并且是指天然發生的或合成分子。“氨基酸序列”以及類似術語，例如“多肽”或“蛋白質”，并不旨在將指示的氨基酸序列限制在與該引用的蛋白質分子相關的完全的、天然氨基酸序列。
[0122]在此使用的冠詞“一種(a)”和“一種(an)”是指一個或多于一個的(例如，至少一個)冠詞的語法對象。通過舉例，“一種元素”是指一個元素或多于一個元素。
[0123]術語“藥學有效量”或“治療有效量”是指在治療具有在此描述的紊亂或病癥的病人的有效量(例如，劑量)。在此還應理解的是“藥學有效量”可以解釋為給予所希望的治療效果的量，以一個劑量或以任何劑量或途徑攝取，單獨或與其他治療制劑組合攝取。
[0124]如在此使用的術語“治療(treatment)”或“治療(treating)”是指以一種有效改進與紊亂或病癥相關的病癥、癥狀或參數或者預防或減少紊亂或病癥的進程到本領域普通技術人員可檢測的程度的量、方式，和/或模式給予治療。一種有效量、方式或模式可以根據該受試者而改變并且可以調適于該受試者。
[0125]如在此所使用的，術語“受試者”意為對于其希望進行診斷、預測或治療的任何受試者。例如，一個受試者可以是哺 乳動物，例如，人類或非人類靈長類動物(例如猿、猴子、猩猩，或黑猩猩)，狗，貓，幾內亞豬、兔、大鼠、小鼠、馬、牛或母牛。
[0126]如在此使用的，術語“抗體”是指包括至少一個免疫球蛋白可變區的多肽，例如一種提供免疫球蛋白可變結構域或免疫球蛋白可變結構域序列的氨基酸序列。例如，抗體可以包括重(H)鏈可變區(在此縮寫為VH)，以及輕鏈(L)可變區(在此縮寫為VL)。在另一個實例中，抗體包括兩個重(H)鏈可變區以及兩個輕(L)鏈可變區。術語“抗體”包含抗體的抗原結合片段(例如，單鏈抗體4&13 4(&13’)2、？(141和dAb片段)連同完全抗體，例如類型IgA、IgG、IgE、IgD、IgM的完整免疫球蛋白(連同其亞型)。免疫球蛋白的輕鏈可以是κ型或λ型。在一些實施例中,抗體包括Fe區。在一些實施方案中,抗體是一種治療性抗體。
[0127]如在此使用的，術語“恒定區”是指對應于或衍生自抗體的一個或多個恒定區免疫球蛋白結構域的多肽。恒定區可以包括任何或所有以下免疫球蛋白結構域=CHl結構域、鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域(衍生自IgA、IgD、IgG、IgE、或IgM)，以及CH4結構域(衍生自IgE 或 IgM)。
[0128]如在此使用的，術語“Fe區”是指包括排除第一恒定區免疫球蛋白結構域之外的抗體恒定區的多肽。“Fe區”是指IgA、IgDjP IgG的最后兩個恒定區免疫球蛋白結構域，以及IgE和IgM的最后三個恒定區免疫球蛋白結構域，并且可以包括這些結構域的N端的部分或所有的柔性鉸鏈區。對于IgG，“Fe區”包括免疫球蛋白結構域C伽馬2 (Cy 2)和C伽馬
3(Cy 3)以及C伽馬I (Cy I)和C伽馬2之間鉸鏈區較低的部分。盡管Fe區的邊界可以改變，人類IgG重鏈Fe區通常定義為包括在T223或C226或P230起始至它的羧基端的殘基，其中編號是根據歐洲索引，如在Kabat et al (卡巴特等人)(1991, NIH Publication(國家衛生研究所出版)91-3242，NationalTechnical Information Services (《國家科技信息服務》)，斯普林菲爾德，弗吉尼亞州)。對于IgA，該Fe區包括免疫球蛋白結構域C阿爾法2 (Ca 2)和C阿爾法3 (Ca 3)以及C阿爾法I (C a I)和C阿爾法2之間鉸鏈區的較低部分。
[0129]如在此使用的，術語“含Fe多肽”是指包括兩個包含Fe區多肽的二聚體的多肽，例如一種完整抗體或Fe-受體融合蛋白。
[0130]如在此使用的，術語“Fe區突變”是指具有一個或多個在此描述的Fe介導的活性的Fe區的類似物。這個術語包括以下這樣的Fe區:這些區包括相對于一種野生型或天然存在的Fe區而言的一個或多個氨基酸修飾。例如，變體Fe區與天然存在的Fe區可以具有至少大約50%同源性、至少大約75%同源性、至少大約80%同源性、至少大約85%同源性、至少大約90%同源性、至少大約95%同源性、或更多。Fe區變體還包括以下這樣的Fe區:這些區包括將一個或多個氨基酸殘基添加至野生型Fe區N末端或C末端或者從野生型Fe區N末端或C末端缺失一個或多個氨基酸殘基。
[0131]如在此使用的，術語“偶聯的”，“連接的”、“結合的”、“融合的”和“融合”可以互換
使用。這些術語是指將兩個以上的元素或組分通過任何方式，包括化學連接或重組方式結
合在一起。
[0132]術語“過表達” “過量表達”或“過表達的”可互換地是指與對照細胞中的水平相t匕，轉錄的和翻譯的蛋白質或者轉錄的核酸處于一種可檢測地更高的水平。該術語包括與對照細胞相比，由于轉錄、轉錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細胞定位(例如，細胞器、細胞質、細胞核、細胞表面)，以及RNA和蛋白質穩定性的表達。過量表達可以使用傳統技術進行檢測，例如，用于檢測mRNA (例如，RT-PCR、PCR、雜交)或蛋白質(例如，ELISA、免疫組織化學技術)。過量表達可以是與在對照細胞中的表達相比，以高于大約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的量的表達。在某些實例中，與對照細胞中的表達相比，過量表達是I倍、2倍、3倍、4倍或更高水平的轉錄或翻譯。
[0133]如在此使用的，一種多肽的“C端變體”(例如，一種抗體或含Fe多肽)是此種多肽(例如，抗體或含Fe多肽)的版本，僅僅由于在它們的羧基末端存在或缺失一個具體的氨基酸殘基而在氨基酸序列方面不同。在一些實施例中，多肽的“C端變體”僅僅是由于在它們的C末端存在或缺失賴氨酸或精氨酸殘基而不同。在一些實施例中，抗體或含Fe多肽的“C端變體”是KO賴氨酸變體、Kl賴氨酸變體、K2賴氨酸變體、RO精氨酸變體、Rl精氨酸變體，和/或R2精氨酸變體。
[0134]如在此使用的，抗體或含Fe多肽的“K0賴氨酸變體” “K1賴氨酸變體”，和“K2賴氨酸變體”是此類抗體或含Fe多肽(例如，包括Fe 二聚體的多肽，例如，一種完整抗體)的版本，僅僅由于在它們的重鏈羧基末端存在或缺失賴氨酸殘基而在氨基酸序列方面不同。“K0賴氨酸變體”在任一重鏈C端不具有賴氨酸殘基。“K1賴氨酸變體”在一個重鏈C端具有賴氨酸殘基。“K2賴氨酸變體”在每個重鏈C端具有賴氨酸殘基。
[0135]如在此使用的，抗體或含Fe多肽的“ RO精氨酸變體” “R1精氨酸變體”，和“R2精氨酸變體”是此類抗體或含Fe多肽(例如，包括Fe 二聚體的多肽，例如，一種完整抗體)的版本，僅僅由于在它們的重鏈羧基末端存在或缺失精氨酸殘基而在氨基酸序列方面不同。“RO精氨酸變體”在任一重鏈C端都不具有精氨酸殘基。“R1精氨酸變體”在一個重鏈C端具有精氨酸殘基。“R2精氨酸變體”在每個重鏈C端具有精氨酸殘基。
[0136]如在此使用的 ，在多肽、融合蛋白、抗體、或含Fe多肽的背景中的“制品”分別是指一組的單獨多肽、融合蛋白、抗體、或含Fe多肽，各自包括一種具體的氨基酸序列。在一些實施例中，一種制品包括此類多肽、融合蛋白、抗體、或含Fe多肽的C端變體。在一些實施例中，制品中的單獨多肽、融合蛋白、抗體或含Fe多肽具有相同的氨基酸序列但是不同在于在羧基端存在或缺失一種具體的氨基酸殘基(例如，一種賴氨酸殘基或一種精氨酸殘基)。例如，一種“抗體的制品”是指包括一種或多種C端變體的一組抗體。在一些實施例中，“抗體的制品”包括KO賴氨酸變體、Kl賴氨酸變體、K2賴氨酸變體、RO精氨酸變體、Rl精氨酸變體、以及R2精氨酸變體中的一種或多種。
[0137]如在此使用的，“目標值”是一種或多種C端變體的預確定水平，例如KO賴氨酸變體、Kl賴氨酸變體、K2賴氨酸變體、RO精氨酸變體、Rl精氨酸變體、和/或R2精氨酸變體。在一些實施例中，目標值是一種絕對值。在一些實施例中，目標值是一種相對值。在一些實施例中，目標值是相對于包含C端賴氨酸的多肽和無C端賴氨酸的多肽的水平的總和而言，包含C端賴氨酸的多肽的水平，例如，在此類多肽的群中檢測到的。
[0138]在一些實施例中，“目標值”是含Fe多肽(包括C端賴氨酸或精氨酸)(例如，抗體)的制品中的重鏈的水平。在一些實施例中，目標值是具有C端賴氨酸或精氨酸的重鏈在此類制品中的以下的水平:高于大約5%、高于大約10%、高于大約15%，或高于大約20%，或更多的。
[0139]在一些實施例中，“目標值”是在分離的重組的含Fe多肽的制品中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的水平。在一些實施例中，目標值是在此類制品中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的以下的水平:高于大約5%、高于大約10%、高于大約15%，或高于大約20%，或更多。
[0140]如在此使用的，一種“相應重組抗體”意為與具體抗體相同的重組抗體，但是由不同的重組方法產生。例如,相應重組抗體可以是生物等價的或生物相似的抗體。
[0141]羧肽酶[0142]C端賴氨酸或精氨酸殘基通常在分離自哺乳動物細胞培養物的蛋白質中缺失，盡管可以在基因序列的基礎上期待它們的存在。這種差異通常來源于一種或多種羧肽酶的活性。外肽酶的羧肽酶家族組成了在多肽中水解羧基端酰胺鍵的酶的不同組。羧肽酶B是一種催化C端堿性氨基酸殘基的精氨酸和賴氨酸從肽和蛋白質的的水解釋放的包含鋅的外肽酶。除了羧肽酶B的特異地移除末端堿性氨基酸的其他哺乳動物羧肽酶包括羧肽酶H(也稱為腦啡肽轉化酶或羧肽酶E (Frickler et al.(弗里克勒等人)，.T.Mol.Endocrinol.(《內分泌分子雜志》)，3:666-673 (1989) ；Manser et al.(曼瑟等人),Biochem..T.(《牛.物化學雜志》)，267:517-525 (1990))，羧肽酶 M (EC3.4.17.12) (Tan et al.(坦等人)，T.Biol.Chem.(《牛物化學雜志》)，264:13165-13170 (1989)),羧狀酶 N (Tan et al.(坦等人)，L Biol.Chem.(《牛物化學雜志》)，265:13-19 (1990))。
[0143]用于多肽的C端修飾的制劑
[0144]在一些實施例中，使用羧肽酶的激活劑或抑制劑以生產多肽的C端變體的目標水平(例如，抗體)。已知不同羧肽酶的激活劑和抑制劑。示例性的，用于羧肽酶E和/或M的非限制性的激活劑包括Co2\Zn2\NiCl2,Na2SO4,KCl,NaNO3>NaCl,KNO30用于這些酶的抑制劑包括，但不限于1，10-二氮雜菲；4_氯代汞苯磺酸酯；氨丙基巰基琥珀酸；精氨酸；CdCl2(Cd化合物);CuCl2 ；EDTA ；FeS04 ;胍基乙基巰基琥珀酸(GEMSA)5HgCl2 ;Leu_腦啡肽；促黃體素釋放素；賴氨酸；Met-腦啡肽；Met-腦啡肽-Arg-Gly-Leu ;催產素；對氯代汞苯磺酸酯；P物質；巰基試劑；促甲狀腺激素釋放激素；[Leu5]腦啡肽_Arg6 ； [Met5]腦啡肽_Arg6 ;和Met-腦啡肽-Arg6-Phe7。在本披露中有用的具體抑制劑是賴氨酸和精氨酸，例如L-賴氨酸、D-賴氨酸、L-精氨酸、D-精氨酸、及其衍生物和鹽。
[0145]在一些實施例中，使用一種可以直接或間接改變pH(例如，在此描述的細胞的細胞內pH)的試劑(“pH改性劑”)以生產多肽(例如，抗體)的C端變體的目標水平。不希望受理論限制，相信改變(例如，增加)細胞內pH可以改變(例如，，增加)多肽(例如，抗體)上的C端賴氨酸和/或精氨酸殘基水平，這是通過直接或間接改變一個或多個涉及C端賴氨酸和/或精氨酸殘基的調節的機制。此類機制可以包括，或者可以不依賴于羧肽酶活性。例如，不希望受到理論限制，相信增加涉及分泌途徑的細胞內隔室的PH可以增加多肽(例如，抗體)的C端賴氨酸和/或精氨酸殘基的水平。相應地，在一些實施例中，使用可以在細胞的一個或多個分泌途徑的隔室(例如，ER、高爾基體、分泌泡)中增加pH的pH改性劑以增加多肽(例如，抗體)的C端賴氨酸和/或精氨酸殘基水平，例如，至目標水平。
[0146]此類pH改性劑包括，但不限于，銨鹽(例如，硝酸銨、碳酸銨、乙酸銨、甲基磺酸銨、對甲苯磺酸銨、氯化銨、溴化銨、硫酸銨，或磷酸銨)，堿性氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸，和/或組氨酸)，極性氨基酸(例如，谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸，或蘇氨酸)，葡萄糖、氯喹、甲胺、三丁胺、芐胺，和三乙胺。
[0147]在一些實施例中，羧肽酶的激活劑或抑制劑也是一種pH改性劑。例如，賴氨酸和/或精氨酸可以抑制羧肽酶并且也可以增加細胞內pH。不希望受到理論限制，此類試劑可以通過抑制羧肽酶，通過增加細胞內PH，或者兩者來增加多肽(例如，抗體)的C端賴氨酸和/或精氨酸殘基的水平。
[0148]如在此描述的，使用羧肽酶激活劑、羧肽酶抑制劑，和/或pH改性劑以生產多肽(例如，抗體)的C端變體的目標水平。在具體的例子中，生產抗體的KO賴氨酸變體、Kl賴氨酸變體、K2賴氨酸變體、RO精氨酸變體、Rl精氨酸變體、和/或R2精氨酸變體。例如，使用羧肽酶抑制劑(例如，精氨酸和/或賴氨酸)、羧肽酶激活劑、和/或PH改性劑以制備KO賴氨酸變體、Kl賴氨酸變體、K2賴氨酸變體、RO精氨酸變體、Rl精氨酸變體，和/或R2精氨酸變體的目標水平。
[0149]細朐
[0150]可以用來表達感興趣的多肽(例如，抗體)的任何宿主細胞可以用于在此描述的方法中。這些細胞可以包含編碼感興趣的多肽(例如，抗體)的核酸序列，例如，基因。例如，有用的細胞可以表達一種重組的多肽。編碼一種多肽的基因的重組表達可以包括包含編碼該多肽的多核苷酸的表達載體的構建。一旦獲得了多核苷酸，可以通過重組DNA技術使用本領域已知的技術生產用于該多肽生產的載體。可以使用已知的方法構建包含多肽編碼序列和適當的轉錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術、合成技術，以及體內遺傳重組。
[0151]表達載體可以通過常規技術轉移到宿主細胞，并且然后這些轉染細胞可以通過常規技術培養以生產多肽。可以使用不同的宿主表達載體系統(參見，例如，美國專利號5，807，715)。可以使用此類宿主表達系統以生產多肽(例如，抗體)并且，當希望時，隨后純化。此類宿主表達系統包括，但不限于，轉化了包含多肽編碼序列的重組酵母表達載體的酵母(例如，酵母菌屬和畢赤酵母)；使用包含多肽編碼序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)侵染的昆蟲細胞系統；使用重組病毒表達載體(例如，花椰菜嵌合病毒，CaMV ;煙草花葉病毒TMV)侵染的或用包含多肽編碼序列的重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)轉化的植物細胞系統；或含有重組表達構建體的哺乳`動物細胞系統(例如，C0S、CH0、BHK、293、NS0、和3T3)，這些構建體包含衍生自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或者衍生自哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)。
[0152]對于哺乳動物宿主細胞中的表達，可以利用基于病毒的表達系統(參見，例如，Logan et al.(洛根等人)，1984, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (《美國科學院院干丨J》)8:355-359)。表達的效率可以通過包含適當的轉錄增強子元件、轉錄終止子等等來增強(參見，例如，Bittner et al.(比特納等人)，1987, Methods in Enzymo1.(《酶學中的方法》)153:516-544)。
[0153]除此之外，可以選擇調節插入序列的表達，或者以所希望的特殊形式修飾和處理基因產物的宿主細胞菌株。不同的宿主細胞對于蛋白質和基因產物的翻譯后加工和修飾具有特征性的和具體的機制。可以選擇適當的細胞系或宿主系統以確保該表達的多肽(例如，抗體)的正確修飾和加工。此類細胞包括，例如，建立的哺乳動物細胞系和昆蟲細胞系，動物細胞、真菌細胞，和酵母細胞。哺乳動物宿主細胞包括，但不限于，CHO、Vero, BHK、HeLa,COS、MDCK, HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO (一種并不內源性地生產任何免疫球蛋白鏈的鼠科動物骨髓瘤細胞系)、CRL7030、HsS78Bst細胞、PER.C6、SP2/0-Agl4,以及雜交瘤細胞。此外，動物或哺乳動物宿主細胞的非限制性實例包括中國倉鼠卵巢細胞，例如 CHO-Kl (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al.(蔡辛等人)，1986.Som.Cell Molec.Genet.(《索姆細胞分子遺傳學》)，12:555-556:和 Kolkekar et al.(寇克卡等人)，1997.Biochem.(《牛物化學》)，36:10901-10909), CHO-DXB11 (G.Urlaub (G.烏爾勞布)和L.A.Chasin (L.A.蔡辛)，1980Proc.Natl.Acad.Sc1.(《美國國家科學院院flj))), 77:4216-4220, L.H.Graf (L.H.格拉芙)，和 L.A.Chasin (LA.蔡辛)1982，Molec.Cell.Biol.(《分子細胞生物學》)，2:93-96)，CHO-KlTet-On 細胞系(Clontech 公司)，CHO指定ECACC (歐洲動物細胞庫)85050302 (應用微生物研究中心(CAMR)，塞爾斯貝里(Salisbury)，威爾特郡(Wiltshire)，英國)，CHO 克隆 13 (GE MG, Genova, IT)，CHO 克隆 B(GEIMG, Genova, IT), CHO-KI/SF指定ECACC93061607 (應用微生物研究中心，塞爾斯貝里，威爾特郡，英國)，RR-CHOKl指定ECACC92052129 (應用微生物研究中心，塞爾斯貝里，威爾特郡，英國)，二氫葉酸還原酶陰性CHO細胞(CH0/-DHFR，Urlaub (烏爾勞布)和Chasin(蔡辛)，1980.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (《美國國家科學院院刊》)，77:4216),和 dpl2.CHO細胞(美國專利號5，721，121);通過SV40轉化的猴腎細胞CVl (COS細胞，C0S-7, ATCCCRL-1651);人胚胎腎細胞(例如，293細胞，或者亞克隆用于在懸浮培養中生長的293細胞，Graham et al.(格柃哈姆等人)，1977, T.Gen.Virol.(《某閔病毒學雜志》)，36:59):幼奮鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL-1O);猴腎細胞(CVl，ATCC CCL-70);非洲綠猴腎細胞(VER0-76，ATCCCRL-1587 ；VER0, ATCC CCL-81);小鼠睪丸支持細胞(TM4，Mather (馬瑟)，1980, Biol.Reprod.(《繁葙牛物學》)，23:243-251);人類宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL-2);犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL-34);人肺細胞(W138, ATCC CCL-75);人類肝癌細胞(HEP-G2, HB8065);小鼠乳腺瘤細胞(MMT060562，ATCC CCL-51);布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL3A，ATCCCRL-1442) ；TR1 細胞(Mather (馬瑟)，1982, Ann.NY Acad.Sc1.(《紐約科學學院年鑒》),383:44-68) ；MCR5 細胞；和 FS4 細胞。
[0154]對于長期、高產量的重組蛋白的生產，將宿主細胞工程化以穩定表達一種多肽(例如，抗體)。可以使用受本領域已知的適當的表達控制元件控制的DNA轉化宿主細胞，這些控制元件包括啟動子、增 強子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點，以及可選擇性標記。可以使用重組DNA【技術領域】已知的常見方法選擇所希望的重組克隆。
[0155]一旦通過重組表達生產了在此描述的多肽(例如，一種在此描述的抗體)，可以通過本領域已知的用于純化的任何方法進行純化，例如通過色譜法(例如，離子交換、親和、和篩柱色譜)、離心分離、差別性溶解度，或通過任何其他用于蛋白質純化的標準技術。例如，一種抗體可以通過適當地選擇并且將親和柱(例如蛋白質A柱)與色譜柱，過濾、超濾、鹽析和透析程序進行組合而進行分離和純化(參見Antibodies:A Laboratory Manual (《抗.體:實駘室豐冊》),Ed Harlow (Ed哈洛)，David Lane (大衛萊恩)，冷泉港實驗室，1988)。進一步的，如在此描述的，可以將一種多肽(例如，一種抗體)融合至異源多肽序列以促進純化。可以通過本領域已知的方法使用凝集素柱分離具有所希望糖鏈的多肽(參見，例如，W002/30954)。
[0156]根據本披露，可以采用本領域中的常規分子生物、微生物，和重組DNA技術。在文獻中描述了此類技術(參見，例如，Sambrook (薩姆布魯克)，Fritsch (費里奇)&Maniatis(馬尼亞蒂斯),Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Second Edition (《分子克隆:實驗室手冊，第二版》)(1989)冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約:DNA Cloning:A PracticalApproach (《DNA克降:實用方法》)，卷I和II (D.N.Glover ed (格洛維爾編輯)，1985);Oligonucleotide Synthesis (《寡核苷酸合成》)(M.J.Gait ed (M.J.蓋特編輯)，1984);Nucleic Acid Hybridization (《核酸雜交》)(B.D.Hames&S.J.Higgins eds (B.D.黑姆絲 &S.J.希金斯編輯)，(1985)) !Transcription And Translation (《轉錄和翻譯》)(B.D.Hames&S.J.Higgins, eds.(B.D.黑姆絲 &S.J.希金斯編輯)(1984)):Animal CellCulture(《動物細胞培養》)(R.1.Freshney, ed.(R.1.弗萊士內編輯)(1986)):Tmmobi I i zedCells and Enzymes (《固定化細胞和酶》)(IRL出版社，(1986));B.Perbal (B.佩巴爾),ΑPractical Guide To Molecular Cloning (《分子克隆的實用指南》)(1984);F.M.Ausubelet al.(F.Μ.奧蘇貝爾等人)(編輯),Current Protocols in Molecular Biology (〈〈分子牛.物學實驗指南》)，Tohn ffiley&Sons, Inc.(約翰威利父子出版社)(1994)。
[0157]培養方法
[0158]通常，多肽(例如，抗體)的C端變體的目標水平可以通過在培養基中培養的細胞進行生產，該培養基包含一種或多種羧肽酶激活劑、羧肽酶抑制劑，和/或pH改性劑。例如，對于生產具有降低水平的C端賴氨酸和/或精氨酸殘基的多肽(例如，抗體)的C端變體的制品，表達此類多肽的細胞可以培養在一種培養基中，該培養基包括升高水平的羧肽酶激活劑、降低水平的羧肽酶抑制劑(例如，精氨酸或賴氨酸)、和/或包括降低細胞內PH的試劑。在一些實施例中，對于生產具有較高水平的C端賴氨酸和/或精氨酸殘基的多肽(例如，抗體)的C端變體的制品，表達此類多肽的細胞可以培養在一種培養基中，該培養基包括升高水平的羧肽酶抑制劑(例如，精氨酸或賴氨酸)、降低水平的羧肽酶激活劑、和/或包括增加細胞內PH的試劑。
[0159]如在此使用的，一種組分的“升高的水平”意為與存在于標準培養基中相比一種組分的較高濃度，和/或與存在于生產多肽的培養基中相比一種組分的較高濃度。在一些實施例中，一種組分并不存在于一種標準培養基中，并且一種“升高的水平”是此類此類組分的任何量。一種培養基最初可以包括一種組分的升高的水平(例如，在培養的起始)，或者起始培養基可以使用一種組分進行補充以在培養期間的具體的一個時間或多個時間達到該組分的升高的水平。例如，該起始培養基可以包括至少大約2g/L精氨酸、至少大約2g/L賴氨酸、或至少大約2g/L的精氨酸和賴氨酸的組合。
[0160]如在此使用的，一種組分的“降低的水平”意為與存在于標準培養基中相比一種組分的較低濃度，和/或與存在于生產多肽的培養基中相比一種組分的較低濃度。一種培養基最初可以包括一種組分的降低水平(例如，在培養的起始)，起始培養基可以在培養期間的具體的一個時間或多個時間進行稀釋以降低一種組分的水平，或者起始培養基可以在培養期間的具體的一個時間或多個時間使用一種具有降低水平的一種組分的培養基進行取代。
[0161] 在一些實施例中，通過培養一種細胞來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，該細胞表達該多肽(例如，抗體)，該培養是在以下這樣的條件下進行:這些條件增加該細胞的細胞內pH，例如增加在此描述的細胞的一種或多種分泌隔室的pH。細胞內PH可以使用已知的方法進行測量，例如通過使用pH敏感的綠色熒光蛋白(參見，例如，Tomkins et al.(湯姆金斯等人)，Am.J.Phys.Cell Physiol.(《美國細胞生理學物理雜志》)283:C429-37 (2002) ;Blackmore et al.(布萊克默等人)，J.Physol.(《生理學雜志》)531:605-617(2001) ；Miesenbock et al.(米森伯克等人)，Nature (《自然》)394:192-195(1998))。在一些實施例中，使用pH調節試劑，例如一種在此描述的試劑增加細胞內pH。在一些實施例中，細胞內pH (例如，分泌隔室的pH)增加了:至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約100%、或更多。在一些實施例中，細胞內pH (例如，分泌隔室的 pH)增加以下的值:至少大約 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、1.1,1.2、
1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3，或更多。
[0162]在一些實施例中，通過在一種培養基中培養一種細胞來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，該細胞表達該多肽(例如，抗體)，該培養基具有升高水平的銨鹽(例如，NH4Cl )。 在一些實施例中，培養基包含濃度在大約ImM至大約30mM的NH4Cl,例如，大約ImM、大約2mM、大約3mM、大約4mM、大約5mM、大約6mM、大約7mM、大約8mM、大約9mM、大約10mM、大約I ImM、大約12mM、大約13mM、大約14mM、大約15mM、大約16mM、大約17mM、大約18mM、大約19mM、大約20mM、大約25mM、大約30mM、大約40mM、大約50mM、或更多。
[0163]在一些實施例中，通過在一種培養基中培養一種細胞來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，該細胞表達該多肽(例如，抗體)，該培養基具有升高水平的氯喹。在一些實施例中，一種培養基包含大約10 μ M至大約500 μ M濃度的氯喹，例如，大約10 μ Μ、大約20 μ Μ、大約30 μ Μ、大約40 μ Μ、大約50 μ Μ、大約60 μ Μ、大約70 μ Μ、大約80 μ Μ、大約90 μ Μ、大約100 μ Μ、大約110 μ Μ、大約120 μ Μ、大約130 μ Μ、大約140 μ Μ、大約150 μ Μ、大約 160 μ Μ、大約 170 μ Μ、大約 180 μ Μ、大約 190 μ Μ、大約 200 μ Μ、大約 210 μ Μ、大約 220 μ Μ、大約 230 μ Μ、大約 250 μ Μ、大約 250 μ Μ、大約 260 μ Μ、大約 270 μ Μ、大約 280 μ Μ、大約290 μ Μ、大約300 μ Μ、大約310 μ Μ、大約320 μ Μ、大約330 μ Μ、大約340 μ Μ、大約350 μ Μ、大約 360 μ Μ、大約 370 μ Μ、大約 380 μ Μ、大約 390 μ Μ、大約 400 μ Μ、大約 410 μ Μ、大約 420 μ Μ、大約 430 μ Μ、大約 440 μ Μ、大約 450 μ Μ、大約 460 μ Μ、大約 470 μ Μ、大約 480 μ M?大約490 μ Μ、大約500 μ Μ、或更多。
[0164]在一些實施例中，通過在一種培養基中培養一種細胞來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，該細胞表達該多肽(例如，抗體)，該培養基具有升高水平的甲胺、三丁胺、節胺，和/或三乙胺。在一些實施例中，一種培養基包含濃度在大約ΙΟμΜ至大約3mM的甲胺、三丁胺、芐胺、三乙胺，或其組合，例如，大約ΙΟμΜ、大約50 μ Μ、大約100 μ Μ、大約 150 μ Μ、大約 200 μ Μ、大約 250 μ Μ、大約 300 μ Μ、大約 350 μ Μ、大約 400 μ Μ、大約 450 μ Μ、大約 500 μ Μ、大約 550 μ Μ、大約 600 μ Μ、大約 650 μ Μ、大約 750 μ Μ、大約 800 μ Μ、大約850 μ Μ、大約900 μ Μ、大約950 μ Μ、大約ImM、大約1.25mM、大約1.5mM、大約1.75Mm、大約2mM、大約2.25mM、大約2.5mM、大約2.75mM、大約3mM、或更多。
[0165]在一些實施例中，通過在一種培養基中培養一種細胞來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，該細胞表達該多肽(例如，抗體)，該培養基具有升高水平的葡萄糖。在一些實施例中，一種培養基包含濃度大約在0.lg/L至大約10g/L的葡萄糖，例如，大約0.2g/L、大約0.3g/L、大約0.4g/L、大約0.5g/L、大約0.6g/L、大約0.7g/L、大約
0.8g/L、大約 0.9g/L、大約 lg/L、大約 1.lg/L、大約 1.2g/L、大約 1.3g/L、大約 1.4g/L、大約
1.5g/L、大約 1.6g/L、大約 1.7g/L、大約 1.8g/L、大約 1.9g/L、大約 2g/L、大約 2.lg/L、大約2.2.g/L、大約 2.3g/L、大約 2.4g/L、大約 2.5g/L、大約 2.6g/L、大約 2.7g/L、大約 2.8g/L、大約2.9g/L、大約3g/L、大約3.5g/L、大約4g/L、大約4.5g/L、大約5g/L、大約5.5g/L、大約6g/L、大約 6.5g/L、大約 7g/L、大約 7.5g/L、大約 8g/L、大約 8.5g/L、大約 9g/L、大約 9.5g/L、大約10g/L、或更多。
[0166]在一些實施例中，通過在一種培養基中培養一種細胞來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，該細胞表達該多肽(例如，抗體)，該培養基具有升高水平的葡萄糖組氨酸、賴氨酸、精氨酸、或組氨酸、賴氨酸，和/或精氨酸的組合。在一些實施例中，一種培養基包含濃度在大約lg/L至大約50g/L的組氨酸、賴氨酸、精氨酸、或組氨酸、賴氨酸、和/或精氨酸的組合，例如，至少大約lg/L、至少大約1.5g/L、至少大約2g/L、至少大約 2.5g/L、至少大約3g/L、至少大約3.5g/L、至少大約4g/L、至少大約4.5g/L、至少大約5g/L、至少大約5.5g/L、至少大約6g/L、至少大約6.5g/L、至少大約7g/L、至少大約7.5g/L、至少大約8g/L、至少大約8.5g/L、至少大約9g/L、至少大約9.5g/L、至少大約10g/L、至少大約10.5g/L、至少大約llg/L、至少大約11.5g/L、至少大約12g/L、至少大約12.5g/L、至少大約13g/L、至少大約13.5g/L、至少大約14g/L、至少大約14.5g/L、至少大約15g/L、至少大約15.5g/L、至少大約16g/L、至少大約16.5g/L、至少大約17g/L、至少大約17.5g/L、至少大約18g/L、至少大約18.5g/L、至少大約19g/L、至少大約19.5g/L、至少大約20g/L、至少大約25g/L、至少大約30g/L、至少大約35g/L、至少大約40g/L、至少大約45g/L、至少大約50g/L、或更多。
[0167]在一些實施例中，通過在一種培養基中培養一種細胞來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，該細胞表達該多肽(例如，抗體)，該培養基具有升高水平的谷氨酰胺。在一些實施例中，一種培養基包含濃度在大約5mM至大約80mM的谷氨酰胺，例如，大約5mM、大約10mM、大約15mM、大約20mM、大約25mM、大約30mM、大約35mM、大約40mM、大約45mM、大約50mM、大約55mM、大約60mM、大約65mM、大約70mM、大約75mM、大約80mM、或更多。
[0168]細胞可以在本領域已知的不同細胞培養基中培養，這些培養基根據本披露修改以包括在此描述的一種或多種羧肽酶激活劑、一種或多種羧肽酶抑制劑、和/或一種或多種PH改性劑(例如，在一種升高的或降低的水平)。由本領域那些普通技術人員理解的細胞培養基是指細胞(例如動物細胞或哺乳動物細胞)在其中生長的營養溶液。通常一種細胞培養基包括一種或多種以下組分:一種能量來源(例如，例如碳水化合物，如葡萄糖);氨基酸；維生素；脂類或游離脂肪酸；和微量元素，例如，在微摩爾范圍中的無機化合物或天然發生的元素。細胞培養基也可以包含另外的組分，例如激素和其他生長因子(例如，胰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子、血清和類似物)；鹽類(例如，鈣、鎂，和磷酸鹽)；緩沖液(例如，HEPES);核苷和堿基(例如，腺苷、胸苷、次黃嘌呤);抗體(例如，慶大霉素);和細胞保護試劑(例如，普朗尼克多聚醇(普朗尼克F68))。
[0169]已經制備的培養基或者商業可購得的培養基可以根據本披露進行改變以在于此描述的方法中利用。此類培養基的非限制性實例包括基本成分培養基(MEM，Sigma (西格瑪公司)，St.Louis (圣路易斯)，密蘇里州);哈姆氏FlO培養基(Sigma (西格瑪公司));杜貝爾科氏改良伊格爾氏培養基(DMEM，Sigma (西格瑪公司));RPM 1-1640培養基(Sigma (西格瑪公司));HyClone細胞培養基(HyClone公司，Logan (洛根市)，猶他州);Power CH02 (LonzaInc.(龍沙公司)，Allendale (艾倫代爾)，新澤西)；以及用于特殊細胞型而配制的化學限定性(⑶)培養基，例如，⑶-CHO培養基(Invitrogen (英杰公司)，Carlsbad (卡爾斯巴德)，加利福尼亞州)。適合于特殊細胞培養的培養基可以通過本領域普通技術人員確定而不需要過度實驗。
[0170]適合于在此描述的多肽(例如，抗體)的細胞生產的細胞培養條件(包括pH、02、C02，和溫度)是本領域已知的那些，例如用于細胞的分批、連續或流加式培養的條件。例如，通常細胞培養基的PH保持在大約6.8至大約7.6。
[0171]通常，細胞培養方法被分為分批培養、連續培養，和流加式培養。可以使用任何這些培養方法以培養生產C端變體的目標水平的細胞。
[0172]在分批培養中，將少量的種子培養溶液添加至培養基中并且在培養期間的細胞生長不添加任何新的培養基或者不排放該培養溶液。對于使用分批培養的C端變體的目標水平的生產，該培養基包括自細胞培養最初階段的升高水平或降低水平的一種或多種羧肽酶激活劑，一種或多種羧肽酶抑制劑，和/或一種或多種PH改性劑。
[0173]在一些實施例中，通過在一種培養基中分批培養細胞來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，這些細胞表達該多肽，該培養基具有至少大約2g/L的精氨酸、至少大約2g/L的賴氨酸、至少大約2g/L的組氨酸、至少大約2g/L的精氨酸、賴氨酸和/或組氨酸的組合、至少大約5mM的NH4C1、大約10 μ M至大約500 μ M的氯喹、大約IOmM至大約30mM的谷氨酰胺、和/或大約0.5g/L至大約2g/L的葡萄糖。
[0174]連續培養是一種在培養期間連續添加并且連續排放培養基的培養方法。這種連續方法包括灌流培養。例如，在使用連續培養的C端變體的目標水平的生產中，在培養期間添加的培養基可以具有升高水 平或降低水平的一種或多種羧肽酶激活劑、一種或多種羧肽酶抑制劑，和/或一種或多種PH改性劑。在某些方法中，該初始培養基并不包括升高水平或降低水平的一種或多種羧肽酶激活劑、一種或多種羧肽酶抑制劑，和/或一種或多種PH改性劑，但是在連續培養期間(例如在生產階段)的一個具體時間點，在培養期間添加的培養基在一種或多種羧肽酶激活劑、一種或多種羧肽酶抑制劑，和/或一種或多種PH改性劑的水平方面是升高或降低的。
[0175]在一些實施例中，通過在一種培養基中連續培養細胞來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，這些細胞表達該多肽，該培養基具有至少大約2g/L的精氨酸、至少大約2g/L的賴氨酸、至少大約2g/L的組氨酸、至少大約2g/L的精氨酸、賴氨酸和/或組氨酸的組合、至少大約5mM的NH4C1、大約10 μ M至大約500 μ M的氯喹、大約IOmM至大約30mM的谷氨酰胺、和/或大約0.5g/L至大約2g/L的葡萄糖。
[0176]流加式培養是一種在分批培養和連續培養之間的方法。在流加式培養中，在培養期間培養基是連續或順序饋入，但是不同于連續培養，在培養期間并不實施該培養溶液的排放。例如，對于使用流加式培養的C端變體的目標水平的生產，在培養期間添加的培養基可以具有升高水平或降低水平的一種或多種羧肽酶激活劑、一種或多種羧肽酶抑制劑、和/或一種或多種pH改性劑。
[0177]在一些實施例中，通過將培養基添加至細胞的流加式培養中來生產具有C端變體的目標值的多肽(例如，抗體)制品，這些細胞表達該多肽，該添加足以在培養基中達到至少大約2g/L的精氨酸、至少大約2g/L的賴氨酸、至少大約2g/L的組氨酸、至少大約2g/L的精氨酸、賴氨酸和/或組氨酸的組合、至少大約5mM的NH4C1、大約10 μ M至大約500 μ M的氯喹、大約IOmM至大約30mM的谷氨酰胺、和/或大約0.5g/L至大約2g/L的葡萄糖。
[0178]根據本披露，細胞培養可以在用于大批量或小批量多肽(例如，抗體)生產的條件下實施，使用動物或哺乳動物細胞培養常規采用的培養瓶和/或培養裝置。例如，可以實驗室規模使用組織培養皿、T-燒瓶、振蕩燒瓶和旋轉燒瓶。對于更大規模(例如，500L，5000L,或更多)的培養，可以使用流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶培養，或攪拌槽生物反應器系統(例如，如在美國專利號7，541，164和7，332，303中描述的)。
[0179]在具體的方法中，在具體細胞培養期間監測了多肽(例如，抗體)制品中C端變體的水平，由此 允許調整(例如，在培養中增加或減少一種或多種羧肽酶抑制劑、一種或多種羧肽酶激活劑，和/或一種或多種PH改性劑的量)或者可能地終止該培養，例如，以達到C端變體的目標水平。
[0180]Ui
[0181]可以使用在此描述的方法生產任何感興趣的多肽，例如一種抗體，一種含Fe多肽和/或融合蛋白。
[0182]IgG抗體的基本結構由二硫鍵連接的兩個相同的輕多肽鏈和兩個相同的重多肽鏈組成。定位于每條鏈氨基端的第一結構域在氨基酸序列方面是可變的，提供了在每個單一抗體中發現的抗體結合特異性。這些是被稱為可變重(VH)區和可變輕(VL)區。每條鏈的其他結構域在氨基酸序列方面是相對不變的并且被稱為恒定重區(CH)和恒定輕區(CL)。對于IgG抗體，該輕鏈包括一個可變區(VL)和一個恒定區(CL)。一個IgG重鏈包括可變區(VH)，第一恒定區(CH1)，鉸鏈區，第二恒定區(CH2)，和第三恒定區(CH3)。在IgE和IgM抗體中，該重鏈包括另外的恒定區(CH4 )。
[0183]典型地，編碼抗體和含Fe多肽的核酸序列在該重鏈的C端編碼賴氨酸殘基。然而，在從哺乳動物細胞培養中分離的抗體和含Fe多肽中，C端賴氨酸通常是缺失的或者以降低的水平存在。在一些實施例中，本發明的方法可以增加在抗體制品中或含Fe多肽的制品中在抗體或含Fe多肽上的賴氨酸殘基的量。如在此使用的，“K0”意為在任一重鏈C端不具有賴氨酸殘基的抗體或含Fe多肽。如在此使用的，“K1”意為在一條重鏈C端具有賴氨酸殘基的抗體或含Fe多肽。如在此使用的，“K2”意為在每條重鏈C端具有賴氨酸殘基的抗體或含Fe多肽。
[0184]抗體可以包括，例如，單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、駱5它化的抗體(camelized antibodies)、嵌合抗體、單鏈Fvs (scFv)、二硫連接的Fvs(sdFv)、和抗獨特型(抗-1d)抗體、和任何以上的抗原結合片段。抗體可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)，任何種類(例 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或子類。
[0185]如此使用的，術語“Fe片段”是指一種或多種保留Fe功能和/或活性(例如連接至Fe受體)的Fe區片段。此類片段的實例包括這樣的片段，這些片段包括Fe區的N糖基化位點(例如，IgG重鏈的Asn297或其他抗體同種型的同源位點)，例如CH2結構域。如此使用的，術語抗體的“抗原結合片段”是指保留特異結合抗原能力的一種或多種抗體片段。包含在術語抗體的“抗原結合片段”中的結合片段的實例包括Fab片段、F(ab’ )2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段、dAb片段(Ward et al.(沃德等人)，(1989) Nature (《自然》)341:544-546)、和分離的互補決定區(⑶R)。這些抗體片段可以使用本領域普通技術人員熟知的常規技術獲得，并且這些片段被篩選用于與完整抗體相同的方式使用。
[0186]在此描述的組合物和方法的抗體或片段可以通過本領域已知的任何用于抗體合成的方法生產(參見，例如，Harlow et al.(哈洛等人)，Antibodies:A Laboratory Manual(《抗體:實驗室手冊》),(冷泉港實驗室出版社，第二版1988) ;Brinkman et al.(布林克曼等人)，1995，T.1mmunol.Methods (《免瘡學方法雜志》)182:41-50 ；W092/22324 ；W098/46645)。可以使用描述于例如，Morrison (莫里森)，1985，Science (《科學》)229:1202中的方法生產嵌合抗體，和通過描述于例如，美國專利號6，180, 370中的方法生產人源化抗體。
[0187]在此描述的組合物和方法的另外抗體是雙特異性抗體和多價抗體，如描述于例如，Segal et al.(西格爾等人)，T.1mmunol.Meth.(《免疫學方法雜志》)248:1~6 (2001)；和Tutt et al.(塔特等人)，L Immunol.(《免瘡學雜志》)147:60(1991)。
[0188]含Fe多肽包括，但不限于，融合蛋白，例如，結合或融合至一個或多個異源部分的Fe區或Fe片段。異源部分包括，但不限于，肽、多肽、蛋白、融合蛋白、核酸分子、小分子、模擬劑、合成藥物、無機分子、和有機分子。在一些情況下，含Fe多肽是或者包括一種融合蛋白，該融合蛋白包括一種肽、多肽、蛋白質支架、scFv、dsFv、雙抗體、Tandab、或者融合至Fe區的抗體模擬物、例如糖基化Fe區。該融合蛋白可以包括將Fe區連接至該異源部分的接頭區(參見，例如，Hallewell et al.(哈勒威爾等人)(1989), T.Biol.Chem.(《牛物化學雜志11264，5260-5268 ; Alfthan et al.(阿爾夫坦等人)(1995) Protein Eng.(《蛋白質工稈》)8:725-731 )。
[0189]在一些情況下，含Fe多肽是或者包括共軛至以下異源多肽的Fe區，該異源多肽至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個氨基酸。在一些情況下，含Fe多肽是或者包括一種共軛至標記物序列(例如一種多肽)的Fe區(或Fe片段)以促進純化。一種具體的標記物氨基酸序列是六組氨酸肽，例如在PQE載體中的提供標簽(QIAGEN (凱杰公司)，9259EtonAvenue (伊頓大道9259),Chatsworth (查茨沃思)，加利福尼亞，91311 )。其他用于純化的肽標簽包括，但不限于，對應于衍生自流感血球凝集素蛋白的表位的血球凝集素“HA”標簽(Wilson et al.(威爾遜等人)，1984，￡^11 (《細胞》)37:767)以及“Flag”標簽。
[0190]在其他情況下，含Fe多肽是或者包括一種共軛至診斷或可檢測試劑的Fe區。此類含Fe多肽可以是作為臨床檢測程序的部分用于監測或預測疾病或紊亂的發展和進展有用的，例如確定具體治療的療效。此類診斷和檢測可以通過將糖蛋白偶聯至可檢測的物質上完成，這些可檢測的物質包括但不限于，不同的酶，例如但不限于，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、半乳糖苷酶、或乙酰膽堿酯酶；輔基，例如，但不限于，鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；熒光物質，例如，但不限于，傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪氨熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發光物質，例如，但不限于，魯米諾；生物性發光物質，例如但不限于，熒光素酶、熒光素、和水母發光蛋白質；放射性物質，例如但不限于，碘(1311、1251、1231)、碳(14c)、硫磺(35S)、氚(3Η)、銦(115In、113In、112In、mIn)、锝("Tc)、鉈(2Q1Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(1Q3Pd)、鑰("Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、153Gd、159Gd,149Pm,140La,169Yb,175Yb,166Ho,90Y^47Sc,186Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru,68Ge,57Co,65Zn,85Sr,32P、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、和117Sn ;使用不同的正電子放射斷層造影術的正電子發射金屬、非放射性順磁金屬離子、放射性同位素標記的或共軛至特異放射性同位素的分子。
[0191]用于將治療性部分共軛至抗體和/或含Fe多肽的技術是已知的(參見，例如，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，，(〈〈癌癥治療中用于免疫尋$P1藥物的單克降抗體》)，在Monoclonal Antibodies and CancerTherapy (《單克降抗體和癌癥治療》)中,Reisfeld et al.(萊斯菲爾德等人)(編輯)，pp.243-56 (Alan R.Liss, Inc.(阿蘭 R _斯有限公司)1985);Hellstrom et al.(赫爾斯特倫等人)，“Antibodies For Drug Delivery”(《用于藥物遞送的抗體》)，在ControlledDrug Delivery (《受控藥物遞送》)中，(第二版)，Robinson et al.(羅賓遜等人)(編輯)，pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc.(馬塞爾德克公司)1987))。
[0192]可以使用在此描述的方法生產的非限制性，示例性多肽包括阿巴西普(奧瑞希納?, Bristol-Myers Squibb (施貴寶公司))、阿普單抗(ReoPro?，Roche (羅氏公司))、阿
達木單抗(阿達木單抗?，Bristol-Myers Squibb (施貴寶公司))、阿法賽特(阿密凡夫?，Astellas Pharma (阿斯泰來制藥公司))、阿侖單抗(阿侖單抗⑧，Genzyme/Bayer (健贊公司/拜耳公司))、巴利昔單抗(巴利昔單抗? Novartis (諾華公司))、貝伐單抗(阿瓦斯丁?，Roche (羅氏公司))、賽妥珠單抗(賽妥珠單抗?，UCB (優時比公司)，布魯塞爾、比利時)、西妥昔單抗(愛必妥?，Merck-Serono (默克-雪蘭諾公司))、達利珠單抗(賽尼哌?，Hoffmann-La Roche (豪夫邁-羅氏公司))、地尼白介素(Ontak ?、Eisai (衛材公司))、依庫麗單抗(依庫珠單抗?，Alexion Pharmaceuticals (亞力兄制藥公司))、依法利珠單抗(瑞體膚⑧、Genentech (基因泰克公司))、依那西普(依那西普通，Amgen-Pfizer (輝瑞公司))、吉妥珠單抗(麥羅塔? Pfizer (輝瑞制藥)、替伊莫單抗(澤娃靈?、SpectrumPharmaceuticals (頻譜制藥八欠夫利昔(英利昔單抗?、Centocor (山陶克公司))、莫羅莫那(Orthoclone 0KT3 ?、Janssen-Cilag (楊森制藥公司))、那他珠單抗(那他珠單抗展，Biogen Idec (但健艾迪公司)，Elan (宜蘭公司))、奧馬珠單抗(奧馬珠單抗?，Novartis (諾華制藥))、帕利珠單抗(帕利珠單抗,?、MedImmune (醫學免疫公司))、帕尼單抗(Vectibix ?、Amgen (安進公司))、蘭尼單抗(雷珠早抗?、Genentech (基因泰克公司))、利那西普(Arcalystfe，Regeneron制藥公司)、利妥昔單抗(利妥昔單抗?，Roche(羅氏公司))、
托西莫單抗(托西莫單抗展、GlaxoSmithKline (葛蘭素史克公司))、和曲妥單抗(赫賽汀?，Roche (羅氏公司))。
[0193]一種在此描述的重組多肽(例如，抗體)可以合并進入藥物組合物。此類藥物組合物在疾病的預防和/或治療中是有用的。包括多肽(例如，抗體)的藥物組合物可以通過本領域普通技術人員已知的方法進行配制。該藥物組合物可以以可注射配制品形式(該配制品包括在水中或在另外的藥學上可接受的液體中的無菌溶液或懸浮液)腸胃外給藥。例如，該藥物組合物可以通過適當地將該多肽與藥學上可接受的載體或介質組合，例如無菌水和生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、調味賦形劑、稀釋劑、載體、防腐劑、粘合劑，隨后在通常可接受的醫學實踐所需的單位劑型中混合而進行配制。在藥學制品中包括的活性成分的量是提供在指定范圍中的這種合適劑量。
[0194]給藥途徑可以是腸胃外的，例如，通過注射給藥、經鼻給藥、經肺給藥或者經皮給藥。給藥可以是通過靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射的全身或局部的。
[0195]—種合適的給藥方式可以根據病人的年齡和病癥來選擇。一種包含多肽(例如，抗體)的單一劑量的藥物組合物可以從0.0Olmg/kg的體重至1000mg/kg的體重的范圍選擇。另一方面，一種劑量可以在0.001mg/kg的體重至100000mg/kg的體重的范圍內選擇,但是本披露并不限于此范圍。給藥的劑量和方法根據病人的體重、年齡、病癥，以及等等而改變，并且可以適當地由本領域普通技術人員按照需要選擇。
[0196]在其他的情況下，可以使用一種重組多肽(例如，抗體)對于疾病或對于可以治療或預防疾病的制劑進行篩選。
[0197]C端變體和多肽活性水平的測定方法
[0198]參考多肽(例如，參考抗體)的C端變體的水平可以通過已知的方法進行測定(參見，例如，Dick et al.(迪'克等人)，Biotechnol.Bioeng.(《牛.物技術與牛.物工程》)100:1132-1143(2008))。例如，多肽(例如，抗體)可以通過色譜方法進行分析，包括但不限于，液相色譜(LC)，高效液相色譜(HPLC)，超高效液相色譜(UPLC)，薄層色譜(TLC)，酰胺柱色譜，和其組合。
[0199]在其他方法中，多肽(例如，抗體)可以通過質譜法(MS)以及相關的方法進行分析，包括但不限于:串聯MS、LC-MS, LC-MS/MS、基質輔助激光解吸電離質譜法(MALD1-MS)、傅里葉變換質譜法(FTMS)、離子遷移率分離質譜法(MS-MS)、電子轉移解離(ETD-MS)、以及它們的組合。
[0200]其他分析多肽(例如，抗體)的方法包括電泳法,包括但不限于:毛細管電泳法(CE)、CE-MS、凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、丙烯酰胺凝膠電泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)跟隨有使用識別特定氨基酸的抗體的蛋白質印跡法、以及它們的組合。
[0201]又其他分析方法包括核磁共振(NMR)以及相關方法，包括但不限于:一維匪R(1D-NMR)、二維NMR (2D-NMR)、相關譜磁性角自旋NMR (COSY-NMR)、全相關光譜NMR(T0CSY-NMR)、異核單量子相干NMR (HSQC-NMR)、異核多級量子相干(HMQC-NMR)、旋轉核歐沃豪斯效應譜NMR (R0ESY-NMR)、核歐沃豪斯效應譜(N0ESY-NMR)、以及它們的組合。
[0202]在一些情況下，使用在此描述的方法生產的多肽制品中的C端變體的水平(例如，在抗體或含Fe多肽制品中K0、K1、和/或K2賴氨酸變體的水平)可以與目標值(例如，參考標準)進行比較，例如，以關于該多肽制品組合物做出的決定，例如，做出分類、選擇、接受或丟棄、釋放或留存、加工成一種藥物產品、以船運送、移動到一個不同的位置、配制、貼標簽、包裝、準予進入貿易、或銷售或許諾銷售該多肽(例如，一種重組抗體)的決定。在其他的情況中，該決定可以是接受、改變或拒絕用來生產該多肽(例如，一種抗體)的一個或多個產品參數。特別地，參考標準的非限制性實例包括對照水平(例如，由不同方法生產的多肽)或者在產品說明書中的范圍或值(例如，FDA標簽或醫囑)或者包含該多肽制品的用于藥物制品的質量標準。
[0203]在一些情況下，方法(例如，評估、鑒別，和生產方法)包括采取行動(例如，身體活動)對在此披露的方法進行響應。例如，多肽制品可以根據該預選擇或目標值是否達到而被分類、選擇、接受或丟棄、釋放或保留、加工成一種藥物產品、以船運送、移動到一個不同的位置、配制、貼標簽、包裝、準予進入貿易、或銷售或許諾銷售。在一些情況中，加工可以將多肽制品的至少一部分進行配制(例如，與藥物賦形劑組合)，包裝(例如，以注射器或小瓶)，貼標簽，或以船運送。在一些情況中，加工包括將作為在此描述的藥物產品的制品的至少部分進行配制(例如，與藥物賦形劑組合)，包裝(例如，以注射器或小瓶)，以及貼標簽。加工可以包括指導和/或聯系另一方如在此描述地進行加工。
[0204]在一些情況中，評估了多肽制品(例如，抗體制品)的生物活性。該制品的生物活性可以通過任何已知方法分析。在一些實施例中，可以評估一種多肽的結合活性(例如，結合至受體)。在一些實施例中，評估了多肽的治療活性(例如，在減少疾病或病癥的嚴重性或癥狀方面的多肽活性，或者在延遲疾病或病癥的癥狀的出現方面的多肽活性)。在一些實施例中，評估了多肽的藥理學活性(例如，生物利用率、藥物代謝動力學、藥效動力學)。用于分析糖蛋白治療劑的生物利用率、藥物代謝動力學，和藥效動力學的方法，參見，?列如，ffeiner et al.(韋納等人)，T.Pharm.Biomed.Anal.(《牛.物醫學藥物分析雜志》)15 (5): 571-9, 1997; Srinivas et al.(斯里尼瓦桑等人)，.T.Pharm.Sc1.(《藥物科學雜志》)85 (I): 1-4，1996 ;以及Srinivas et al.(斯里尼瓦桑等人)，Pharm.Res.(《藥物研究》)14(7):911-6, 1997。
[0205]可以檢測的具體的生物活性或治療活性將根據具體多肽(例如，抗體)而改變。可以通過任何可用的方法分析多肽制品的潛在不利活性或毒性(例如，導致高血壓、過敏反應、血栓形成事件、癲癇，或其他不良反應的傾向)。在一些實施例中，評估一種多肽制品的免疫原性，例如，通過確定該制品是否在受試者中引發了抗體反應。
[0206]所有出版物、專利申請、專利和其他在此提到的引用以其全部通過引用結合。此外，材料、方法和實例僅僅是說明性的而并非旨在進行限定。除非另外限定，在此使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬的本領域普通技術人員通常所理解的相同的含義。盡管在本發明的實踐或檢測中可以使用與在此描述的那些相似或等價的方法和材料，但是在此描述了合適的方法和材料。
[0207]本披露由以下實例進一步說明。僅僅提供了用于說明性目的的實例。不應解釋為以任何方式限制本披露的范圍或內容。
實施例
[0208]具有增加的Kl和K2賴氨酸殘基的抗體的制備
[0209]方法
[0210]分析了由CHO細胞產生的模式抗體的羧基端賴氨酸殘基。CL320CH0細胞最初培養在具有4mM L-谷氨酰胺和不具有其他補充物的基礎培養基(Power CH02，目錄號#BE15-771, Lonza Inc.(龍沙有限公司)，Allendale (艾倫代爾)，新澤西)的搖瓶中。細胞培養4天,并且細胞的數目從0.54E6/mL增加至4E6/mL。在第4天,細胞以20%Lonza PowerFeed A培養基或者以補充有10g/L L-Lys或L-Arg的20%Power Feed A培養基進行飼養。在第5天，添加了 10g/L的棉籽水解產物。測定了 V⑶和生活力，并且在第10天收獲細胞。通過離子交換色譜評價了在不同條件下產生的抗體的效價和C端賴氨酸。
[0211]結果[0212]如圖1中所示，來自以L-Lys饋入或以L-Arg饋入飼養的細胞的抗體均具有與阿達木單抗?相似的Kl和K2賴氨酸水平。出人意料的是,添加10mg/L L-Lys或10mg/L L-Arg并不影響生長、生活力或效價。添加L-Lys (10mg/L)和L-Arg (10mg/L)的組合導致了細胞死亡，這可能是沒有將pH調整至適當細胞培養水平的結果。
[0213]進一步地，當將產生的抗體隨后使用羧肽酶進行消化時，Kl和K2賴氨酸殘基的水平回到了基線，表明Kl和K2的水平并不是由于非特異性電荷差異(例如，由于該抗體的酰胺化)。
[0214]另外的數據顯示受控葡萄糖進料導致了與大劑量葡萄糖進料相比，增加的Kl賴氨酸水平。不希望受到理論限制，相信在培養期間通過控制葡萄糖水平，乳酸鹽水平可以降低,導致了增加的細胞內pH。
[0215]另外的數據顯示在培養基中包含NH4Cl導致了與對照相比增加的Kl和K2賴氨酸殘基水平。
[0216]等效物
[0217]應當理解的是雖然已經與其詳細說明相連地描述了本披露，上述說明旨在說明而不是限制在本發明的范圍內，上述說明由附帶的權利要求書的范圍所限定。其他方面、優勢和修改在以下權利要求書的范圍中。
【權利要求】
1.一種生產重組多肽群的方法，該方法包括: 提供一種重組多肽的C端變體的目標值， 提供包括編碼該重組多肽的核酸的一種宿主細胞， 在以下條件下培養該宿主細胞(i)其中該細胞表達該編碼的重組多肽的C端變體群并且(ii)增加該細胞的胞內pH，并且 分離該群，其中該群包括該重組多肽的C端變體的提供的目標值。
2.如權利要求1所述的方法，其中增加該細胞的細胞內pH的條件包括在一種培養基中培養這些細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(a)至少大約2g/L的賴氨酸、精氨酸或組氨酸；(b)大約0.5g/L的葡萄糖至大約2g/L的葡萄糖；(c)大約2mM至大約IOmM的NH4Cl ； (d)大約10 μ M至大約500 μ M氯喹；以及(e)大約IOmM至大約30mM谷氨酰胺。
3.一種生產含Fe多肽群的方法,該方法包括: 提供一種含Fe多肽的K0、K1、和/或K2賴氨酸變體的目標值； 提供包括編碼該含Fe多肽的核酸的一種宿主細胞； 在以下條件下培養該宿主細胞(i)其中該細胞表達該編碼的含Fe多肽的K0、K1、和/或K2的賴氨酸變體群以及(ii)增加該細胞的胞內pH ;并且 分離該群，其中該群包括該含Fe多肽的K0、K1、和/或K2賴氨酸變體的提供的目標值。
4.如權利要求3所述的方法，其中增加該細胞的細胞內pH的條件包括在一種培養基中培養這些細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(a)至少大約2g/L的賴氨酸、精氨酸或組氨酸；(b)大約0.5g/L葡萄糖至大約2g/L葡萄糖；(c)大約2mM至大約IOmM的NH4Cl ； (d)大約10 μ M至大約500 μ M氯喹；以及(e)大約IOmM至大約30mM谷氨酰胺。
5.—種生產抗體群的方法，該方法包括: 提供一種抗體的K0、K1、和/或K2賴氨酸變體的目標值； 提供包括編碼該抗體的核酸的一種宿主細胞； 在以下條件下培養該宿主細胞(i)其中該細胞表達該編碼的抗體的K0、K1、和/或K2賴氨酸變體群以及(ii)增加該細胞的胞內pH;并且 分離該群，其中該群包括該抗體的K0、K1、和/或Κ2賴氨酸變體的提供的目標值。
6.如權利要求5所述的方法，其中增加該細胞的細胞內pH的條件包括在一種培養基中培養這些細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(a)至少大約2g/L的賴氨酸、精氨酸或組氨酸；(b)大約0.5g/L葡萄糖至大約2g/L葡萄糖；(c)大約2mM至大約IOmM的NH4Cl ； (d)大約10 μ M至大約500 μ M氯喹；以及(e)大約IOmM至大約30mM谷氨酰胺。
7.—種生產重組抗體群的方法，該方法包括: 提供一種重組抗體的C端變體的目標值， 提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞， 在包括至少大約2g/L賴氨酸、精氨酸或組氨酸的培養基中，在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體群的條件下培養該宿主細胞；并且 分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
8.—種生產重組抗體群的方法，該方法包括: 提供一種重組抗體的C端變體的目標值， 提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞，在包括大約0.5g/L葡萄糖至大約2g/L葡萄糖的培養基中，在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體群的條件下培養該宿主細胞；并且 分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
9.一種生產重組抗體群的方法，該方法包括: 提供一種重組抗體的C端變體的目標值， 提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞， 在包括大約5mM至大約IOmM NH4Cl的培養基中，在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體群的條件下培養該宿主細胞；并且 分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
10.一種生產重組抗體群的方法，該方法包括: 提供一種重組抗體的C端變體的目標值， 提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞， 在包括大約10 μ m至大約500 μ m氯喹的培養基中， 在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體群的條件下培養該宿主細胞；并且 分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
11.一種生產重組抗體群的方法，該方法包括: 提供一種重組抗體的C端變體的目標值， 提供包括編碼該重組抗體的核酸的一種宿主細胞， 在包括大約IOmM至大約30mM谷氨酰胺的培養基中，在其中該細胞表達該編碼的重組抗體的C端變體群的條件下培養該宿主細胞；并且 分離該群，其中該群包括該重組抗體的C端變體的提供的目標值。
12.—種生產重組多肽的方法，該方法包括: 在包括至少大約2g/L賴氨酸和/或精氨酸的培養基中，在其中一種細胞表達一種重組多肽的條件下培養該細胞；并且分離該重組多肽。
13.如權利要求12所述的方法，進一步包括測量該重組多肽的C端的賴氨酸和/或精氨酸殘基的水平。
14.一種生產重組抗體的方法，該方法包括: 在包括至少大約2g/L賴氨酸和/或精氨酸的培養基中，在其中一種細胞表達一種重組抗體的條件下培養該細胞；并且分離該重組抗體。
15.如權利要求14所述的方法，進一步包括測量該分離的重組抗體上的K0、K1、或K2賴氨酸殘基中的一種或多種的水平。
16.—種生產重組抗體制品的方法，該方法包括: 在包括至少大約2g/L賴氨酸和/或精氨酸的培養基中，在其中細胞表達重組抗體的條件下培養這些細胞；并且 將這些重組抗體從這些細胞或該培養基中分離以生產一種包括這些重組抗體的K0、K1、和/或K2賴氨酸變體的目標值的制品。
17.如權利要求16所述的方法，其中目標值是在產品說明書中闡明的水平。
18.如權利要求16所述的方法，其中該目標值是在相應的重組抗體的制品中K0、K1、和/或Κ2賴氨酸變體的水平。
19.如權利要求16所述的方法，進一步包括測量該制品中ΚΟ、Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體的水平。
20.一種生產重組抗體制品的方法，該方法包括: 在包括至少大約2g/L賴氨酸和/或精氨酸的培養基中，在其中細胞表達重組抗體的條件下培養這些細胞；并且 將這些重組抗體從這些細胞或該培養基中分離以生產一種包括這些重組抗體的至少大約5%的Kl和/或K2賴氨酸變體的制品。
21.如權利要求20所述的方法，進一步包括測量該制品中K1、和/或K2賴氨酸變體的水平。
22.—種生產具有ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的目標值的重組抗體制品的方法，該方法包括: 在包括賴氨酸和/或精氨酸的培養基中，在其中細胞表達重組抗體的條件下培養這些細胞； 測量該培養中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平；并且 當該培養中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平是目標值時，將這些重組抗體從這些細胞或該培養基中分離以生產這些重組抗體的一種制品。
23.一種在重組抗體制品中增加Kl或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平的方法，該方法包括: 在包括至少大約2g/L賴氨酸和/或精氨酸的培養基中，在其中細胞表達重組抗體的條件下培養這些細胞；并且 分離這些重組抗體，由此相對于沒有使用包括至少大約2g/L賴氨酸和/或精氨酸產生的重組抗體制品而言增加了該制品中Kl或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
24.一種培養生產重組抗體的細胞的方法，該方法包括: 在包括至少大約2g/L賴氨酸和/或精氨酸的培養基中，在其中細胞表達一種重組抗體的條件下培養這些細胞。
25.如權利要求24所述的方法，進一步包括測量該培養中ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平。
26.如權利要求25所述的方法，進一步包括當ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的水平是預定水平時，將這些細胞從該培養中去除。
27.—種通過如權利要求5-11或14-23中任一項所述的方法生產的重組抗體。
28.—種包括至少大約2g/L的精氨酸或賴氨酸的細胞培養基。
29.—種細胞培養，包括: 表達重組抗體的細胞；以及 一種包括至少大約2g/L賴氨酸和/或精氨酸的培養基。
30.如權利要求29所述的細胞培養，其中該培養包括ΚΟ、K1、或K2賴氨酸變體中的一種或多種的目標值。
31.一種包括權利要求29的細胞培養的生物反應器。
32.—種生產重組抗體的方法，該方法包括: 在包括至少大約2g/L組氨酸的培養基中，在其中一種細胞表達一種重組抗體的條件下培養該細胞； 分離該重組抗體；并且 測量該分離的重組抗體上的ΚΟ、K1、或K2賴氨酸殘基中的一種或多種的水平。
33.一種生產重組抗體的方法，該方法包括: 在包括至少大約0.5g/L葡萄糖至大約2g/L葡萄糖的培養基中，在其中一種細胞表達一種重組抗體的條件下培養該細胞； 分離該重組抗體；并且 測量該分離的重組抗體上K0、K1、或Κ2賴氨酸殘基中的一種或多種的水平。
34.一種生產重組抗體的方法，該方法包括: 在包括大約2mM NH4Cl至大約IOmM NH4Cl的培養基中，在其中一種細胞表達一種重組抗體的條件下培養該細胞； 分離該重組抗體；并且 測量該分離的重組抗體上的K0、K1、或Κ2賴氨酸殘基中的一種或多種的水平。
35.一種生產重組抗體制品的方法，該方法包括:· 在一種培養基中培養細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(i)至少大約2g/L組氨酸；(ii)大約0.5g/L葡萄糖至大約2g/L葡萄糖；以及(iii)大約2mM至大約IOmMNH4Cl ;在其中這些細胞表達重組抗體的條件下；以及 將這些重組抗體從這些細胞或該培養基中分離以生產一種包括這些重組抗體的K0、K1、和/或K2賴氨酸變體的目標值的制品。
36.如權利要求35所述的方法，其中該目標值是在產品說明書中闡明的水平。
37.如權利要求35所述的方法，其中該目標值是在相應的重組抗體的制品中KO、K1、和/或K2賴氨酸變體的水平。
38.如權利要求35所述的方法，進一步包括測量該制品中ΚΟ、K1、和/或K2賴氨酸變體的水平。
39.一種生產重組抗體制品的方法，該方法包括: 在一種培養基中培養細胞，該培養基包括以下各項中的一個或多個:(i)至少大約2g/L組氨酸；(ii)大約0.5g/L葡萄糖至大約2g/L葡萄糖；以及(iii)大約2mM至大約IOmMNH4Cl ;在其中這些細胞表達重組抗體的條件下； 從這些細胞或該培養基中分離這些重組抗體以生產一種制品； 測量該制品中這些重組抗體的K0、K1、和/或Κ2賴氨酸變體的水平；以及如果ΚΟ、Κ1、和/或Κ2賴氨酸變體的水平是目標值，則將該制品配制進入一種藥物產品中。
40.一種制造藥物抗體制品的方法，該方法包括: 提供用于一種治療性重組抗體的C端賴氨酸變體的目標值， 提供包括編碼一種重組抗體的輕鏈和重鏈的核酸的一種宿主細胞， 在以下條件下培養該宿主細胞(i)其中該細胞表達該編碼的輕鏈和重鏈以形成該重組抗體并且Qi)增加該細胞的胞內pH，從該細胞或細胞培養中分離該治療性重組抗體的群，以及 如果該群包括C端賴氨酸變體的提供的目標值，那么將該分離的群配制進入一種藥物廣品中， 由此制造一種藥物抗體制品。
41.如權利要求40所述的方法，其中相對于該群中的總重鏈，C端賴氨酸變體的目標值是C端包含賴氨酸的重鏈的預選擇水平。
42.如權利要求40所述的方法，其中C端賴氨酸變體的目標值是該群中Kl賴氨酸變體和/或K2賴氨酸變體的預選擇水平。
【文檔編號】C12P21/00GK103717729SQ201280032554
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年7月6日 優先權日:2011年7月8日
【發明者】H·普仁泰斯 申請人:動量制藥公司