病毒或細菌的新型穩定方法

病毒或細菌的新型穩定方法
【專利摘要】本發明涉及一種穩定病毒或細菌的方法，所述方法包括將所述病毒或細菌包埋在水溶液中，其中，所述溶液包含：(i)至少3種不同氨基酸或(ii)至少一種二肽或三肽，并且其中所述溶液不含或基本上不含糖、硅烷和蛋白。
【專利說明】病毒或細菌的新型穩定方法
[0001] 本發明涉及一種穩定病毒或細菌的方法，所述方法包括將所述病毒或細菌包埋在水溶液中，其中，所述溶液包含:(i)至少3種不同氨基酸；或(ii)至少一種二肽或三肽，并且其中所述溶液不含或基本上不含糖、硅烷和蛋白。
[0002]在本說明書中，引用了多篇文獻，包括專利申請和制造商的手冊。這些文獻的公開內容雖然據認為與本發明的專利性無關，但還是通過參考方式整體并入本文。更具體而言，所參考的所有文獻以等同于各篇文獻明確且單獨指出通過參考方式整體并入本文的方式并入本文。
[0003]所有病毒的共性在于它們需要宿主細胞以進行復制。因此，病毒需要感染細胞或細菌，并在細胞或細菌中立即啟動宿主細胞的復制機構或保持不確定時間的靜默。為了感染宿主細胞，病毒已經進化出了附著至細胞膜的機制，在細胞膜處病毒包膜或衣殼中的分子與宿主細胞膜的特異性分子相互作用，這是后續入侵步驟的先決條件。在該步驟中，病毒可利用不同策略。例如，在具有包膜的RNA和DNA病毒的情況下，病毒的包膜融合形成含有病毒基因組的亞細胞區室。然后病毒基因組被釋放到宿主細胞中，在那里(例如在DNA病毒如皰疹病毒的情形中)病毒DNA可合并到宿主細胞DNA中。當基因組由基因組型RNA組成時，例如脊髓灰質炎病毒的情形，RNA被直接翻譯以合成病毒特異性蛋白和病毒聚合酶。有一些已經得到充分描述的細胞侵襲的機制和復制機制，其可用于病毒分類。此外，在不同病毒類型之間，病毒的合成步驟和病毒由宿主細胞釋放所涉及的機制(如細胞溶解)也有差異。
[0004]宿主細胞入侵和復制均取決于病毒和宿主細胞之間的分子相互作用。在附著過程中，病毒包膜上的粘附分子可以例如與宿主細胞膜上的相應配對物通過緊密結合而相互作用。例如，鼻病毒的分子可結合至宿主細胞膜上的細胞間附著分子-1。在甲型流感的情況下，病毒分子神經氨酸酶和血凝素對于宿主細胞膜相互作用和病毒基因組解包是重要的。
[0005]換言之,病毒攜帶大量的分子，這些分子使得感染和復制以復雜順序的生物分子反應來進行。因此，當單一的分子反應不發生或不正確地發生時，這些反應是不充分的。一般來說，病毒在如離體等非生理狀態下非常不穩定。如高溫等物理條件、干燥條件或照射通常導致病毒滅活，而包膜病毒通常比非包膜病毒對這些條件更敏感。
[0006]病毒已經進化出免疫逃逸機制，以便在成功感染宿主細胞和復制之后避免被宿主免疫系統殺害。類似地，免疫系統也已經進化出了識別病毒或病毒感染的細胞的機制。重要作用的是通過主要組織相容性復合體(MHC)系統將病毒抗原肽呈遞在抗原呈遞細胞如樹突狀細胞或單核細胞/巨噬細胞等的表面膜上。對于許多病毒而言，已經鑒定了具有抗原潛力的分子，并用于疫苗的開發。這些抗原被宿主的抗原呈遞細胞加工以與表面上的MHC分子一起呈遞。如⑶4和⑶8淋巴細胞等免疫細胞識別所呈遞的病毒肽，并且通過抗原呈遞細胞表面膜上的共刺激分子的支撐，病毒特異性淋巴細胞擴增以形成對抗病毒的防線。因此，與疫苗開發相關的病毒抗原需要處于天然條件下，從而在宿主中引發強力的免疫反應。
[0007]作為另一種選擇，已開發出了經遺傳修飾的生物(GMO)如攜帶疫苗相關基因的病毒載體。例如，腺病毒、巨細胞病毒、牛痘病毒被用于細胞轉染和免疫療法。病毒載體可以攜帶對具有較高作為抗病毒或抗癌疫苗的潛力的蛋白進行編碼的基因。用于接種的GMO應該在體外和體內均保持其感染性，并且必須使所轉染基因的蛋白生物合成能觸發靶特異性蛋白的表達和免疫反應。
[0008]在疫苗的開發和生產中需要考慮的基本方面有(Morefield GL,A rationaleapproach for the development of vaccine formulations,AAPS Journal,2011 ；DO1:10.1208/sl2248-011-9261-l):(1)進行病毒的體外繁殖和儲存的正確條件，以避免感染性和復制的喪失、機械損傷或物理損壞。在這方面，期望的是產生大量的具有高穩定性、感染性、復制和抗原性的病毒。(2)出于安全原因，滅活步驟(即減毒)是重要的，但缺點是抗原改變繼而導致抗原性喪失的可能性增加。(3)儲存條件應該允許大量的病毒能夠恢復。(4)在使用適當的佐劑和穩定劑配制疫苗時需要確保病毒疫苗的安全和療效。(5)疫苗的生產應越經濟越好。
[0009]US2011/0081380描述了一種疫苗組合物，其包含滅活的全病毒和包含有多種成分的復雜的穩定用賦形劑，所述多種成分包括緩沖溶液、必需和非必需氨基酸的混合物、二糖、多元醇、螯合劑、脲或脲衍生物和非離子型表面活性劑。據描述此組合物具有優點，因為它取代了含有動物來源的產品(如蛋白)的現有技術的賦形劑，以便降低可能的生物安全問題和/或與使用這樣產品相關的過敏風險。
[0010]EP2119451A1描述了流感疫苗的冷凍干燥制劑，其中所述疫苗得到穩定化。如EP2119451A1的實施例所示，在特定的pH和成分比例的條件下，在冷凍干燥制劑中可維持流感HA疫苗的活性。EP0090886A2也顯示蛋白水解物、氨基酸及其組合對病毒疫苗成分(即神經氨酸酶)有穩定化效果。然而，EP2119451A1和EP0090886A2均關注病毒組分(即，流感HA疫苗或神經氨酸酶)的穩定，而不是針對保持其感染性、復制能力和/或抗原性的整個病毒的穩定。
[0011]W02010/115835描述了一種包含氨基酸或二肽/三肽的組合物，其用于穩定固定在固體載體上的生物分子，其中，生物分子可以是包含在例如細胞、組織、病毒以及其片段(例如細胞器、膜或衣殼)等`結構中或所述結構上的分子等等。另外，國際申請W02010/112576描述了封閉的無菌容器，其包含作為穩定劑的載體和可逆地附著至所述載體的至少一種生物分子。所述生物分子例如可以是包含在例如細胞、組織、病毒以及其片段等結構中或所述結構上的分子。然而，這些申請中尚未設想對于全病毒或細菌的穩定，特別是對其生活力和生物活性(例如繁殖、感染性及抗原性)的維持。
[0012]W02009/059784描述了制造攜帶有生物材料的固體涂布載體的方法，其中，所述生物材料是通過硅烷或類似的適當偶聯劑與載體偶聯。因此，該生物材料包埋在載體上的保護性基質中，其例如用于治療(如體液的解毒)，或用于診斷(例如體液中毒素或特定的細胞群的檢測)。由于生物材料固定在固體載體上，因此所附著的生物材料無需釋放進入體液中即可實現所述治療或診斷效果，從而將由活性生物物質的循環所引起的藥代動力學的問題最小化。
[0013]盡管為提供適當的存儲病毒和細菌的方法進行了大量的研究，但現有技術中已知方法有相關的顯著缺點，例如，它們涉及使用動物來源的物質或未明確限定的組分，要求困難的制備步驟，是成本密集型的，而且最重要的是不能保持病毒或細菌的所需特性。因此，仍然需要提供用于儲存此類生物體(例如在免疫制劑和疫苗中應用的生物體)的制劑，所述生物體可長時間地在各種應激條件下存儲，而不會喪失生活力和/或生物體復制的能力和/或生物體感染的潛力。
[0014]該需要通過提供權利要求書中限定的實施方式而得到解決。
[0015]因此，本發明涉及一種穩定病毒或細菌的方法，所述方法包括將所述病毒或細菌包埋在水溶液中，其中，所述溶液包含:(i)至少3種不同氨基酸；或(ii)至少一種二肽或三肽，并且其中所述溶液不含或基本上不含糖、硅烷和蛋白。
[0016]本文所用的術語“病毒”是指只能在生物體的活細胞內復制的小型感染劑。病毒感染從動物和植物到細菌和古細菌的所有類型的生物。病毒顆粒有不同的形狀和大小(0.02微米至0.3微米)，并包含形成病毒基因組的雙鏈或單鏈的RNA或DNA。病毒有不同的結構，但核酸總位于由蛋白外衣(衣殼或外殼)包圍的病毒粒子內。核酸和蛋白的復合物(核苷酸衣殼)可以是病毒的整個結構(例如φ6 (RNA細菌病毒)或φΧ174 (DNA細菌病毒))，但也存在更復雜的結構。該包膜病毒可以具有圍繞衣殼的脂質和蛋白膜，而復雜的病毒不僅具有二十面體頭部也具有螺旋尾部，在該尾部內有多達20種蛋白。病毒的非限制性實例包括流感病毒、脊髓灰質炎病毒、和腺病毒、蟲媒病毒、星狀病毒、噬菌體、腸病毒、胃腸炎病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、皰疹病毒(例如，愛潑斯坦巴爾病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)和單純皰疹病毒ES(HSV))、諾瓦克病毒、脊椎動物痘病毒亞科(即，5型正痘病毒、牛痘病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、ALVAC、ALVAC(2)、禽痘病毒)、彈狀病毒、呼腸孤病毒、鼻病毒、輪狀病毒、逆轉錄病毒、桿狀病毒科、杯狀病毒科、花椰菜花葉病毒科、冠狀病毒科、絲狀病毒科、黃病毒科、嗜肝病毒科、野田村病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳頭瘤毒科、細小病毒科、藻類去氧核糖核酸病毒科、微小核糖核酸病毒科和披膜病毒科，以及源自這些病毒的修飾病毒。其它適合的病毒是本領域中已知的，例如 Fields 等在 Virology (第 34 版，L ippincott ffilliams&ffilkins (2001))中所描述。
[0017]如本文所用，術語“細菌”涉及通常只有幾微米長度的原核細胞，其具有寬范圍的形狀，包括例如球狀、棒狀和螺旋狀。一些細菌物種以單細胞形式存在，另一些以特定方式締合:奈瑟菌屬例如形成二重體(對)，鏈球菌屬形成鏈，葡萄球菌屬成簇團聚在一起。細菌也可以伸長形成絲狀，例如放線菌屬。絲狀細菌往往由含有許多個體細胞的鞘包圍。細菌通常被表征為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌，并且大多數細菌可被分類為屬于以下四組中的一組:革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陽性桿菌、革蘭陰性球菌和革蘭氏陰性桿菌。細菌的非限制性實例包括埃希氏菌屬物種、克雷伯氏菌屬物種、沙門氏菌屬物種、芽孢桿菌屬物種、鏈霉菌屬物種、鏈球菌屬物種、志賀氏菌屬物種、葡萄球菌屬物種和假單胞菌屬物種。這些屬的物種的非限制性實例包括埃希氏大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌、金色鏈霉菌、變異鏈球菌、肺炎鏈球菌和丁香假單胞菌。
[0018]術語病毒和細菌在本文中也稱為〃本發明的生物體〃。
[0019]根據本發明，術語“穩定”涉及本發明的生物體的生物活性的維持。對病毒或細菌的這種保護在存儲過程中特別有用，例如在冷凍或干燥本發明的生物體時。當本發明的生物體在包埋到本發明溶液中后具有與所述生物的天然存在的活性相同或基本相同的活性時，所述本發明的生物體被認為保持它的“生物活性”。生物活性取決于所采用的特定的病毒或細菌，并且包括例如復制的能力和/或它們的感染能力和/或它們的抗原性。術語“基本上相同的生物活性”是指所述生物的生物活性是該生物天然存在的生物活性的至少75%、更優選至少85%、最優選至少95%。更優選地，該生物的生物活性是該生物天然存在的生物活性的至少98%，更優選100%。測試生物是否穩定的方式是本領域技術人員公知的，包括但不限于:測試的病毒傳染性潛力(感染性)；培養中的病毒或細菌(即復制速率)或其抗原性。示例性方法在如所附實施例中所示。
[0020]如本文使用的術語“包埋(embedding) ”涉及將本發明的生物體插入到所述溶液中。優選地，所述材料被完全包埋在該溶液中。 [0021]如本文使用的術語“水溶液”是本領域技術人員眾所周知的，涉及其中溶劑是水的溶液。
[0022]術語“氨基酸”根據本發明涉及具有羧基、氨基和側鏈的有機分子，側鏈隨不同的氨基酸而不同。氨基酸是蛋白的基本構成單位。按照本發明，術語“氨基酸”是指至未相互結合形成低聚或聚合物(如二肽、三肽、寡肽或多肽)的游離氨基酸。
[0023]本發明的溶液所含的氨基酸可選自天然存在的氨基酸以及人工氨基酸或這些天然存在或人工氨基酸的衍生物。
[0024]天然存在的氨基酸例如有20種蛋白氨基酸:甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、纈氨酸、酪氨酸、蘇氨酸和色氨酸。其他天然存在的氨基酸例如有肉毒堿、肌酸、肌酸酐、胍基乙酸、鳥氨酸、羥基脯氨酸、同型半胱氨酸、瓜氨酸、羥基賴氨酸或β -丙氨酸。
[0025]人工氨基酸是具有不同側鏈長度和/或側鏈結構和/或在不同于a -C原子的位
置具有胺基的氨基酸。
[0026]氨基酸的衍生物包括但不限于N-乙酰基色氨酸、膦酰基絲氨酸、膦酰基蘇氨酸、膦酰基酪氨酸、黑色素、精氨琥珀酸及它們的鹽以及D0PA。
[0027]在與本發明相關聯時，所有術語還包括各氨基酸的鹽。
[0028]根據本發明，溶液中包含3種以上彼此不同的氨基酸。例如，術語“至少3種不同氨基酸”還涉及至少4種不同的氨基酸，如至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種不同的氨基酸或更多，例如至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17或至少18種不同的氨基酸。該術語還包括恰好3種、恰好4種、恰好5種、恰好6種、恰好7種、恰好8種、恰好9種、恰好10種、恰好11種、恰好12種、恰好13種、恰好14種、恰好15種、恰好16種、恰好17種或恰好18種不同的氨基酸。本領域技術人員容易理解的是，當本文提到氨基酸時，涵蓋了多于一個分子的所述氨基酸。因此，所敘述種數的不同氨基酸是為了限制不同類型的氨基酸的種數，而非限制一類氨基酸的分子數目。因此，例如術語“3種不同氨基酸”是指3種不同類型的氨基酸，其中，單獨每種氨基酸的量沒有特別的限制。優選的是，不同的氨基酸的種數不超過18種不同的氨基酸。
[0029]如本文所用的術語“二肽或三肽”分別涉及由2個或3個氨基酸構成的肽。示例性二肽有甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln，與單獨的谷氨酰胺相比穩定性增加)、甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr，與單獨酪氨酸相比在水中的溶解度增加)、丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln，與單獨的谷氨酰胺相比在水中的溶解度增加)和甘氨酰甘氨酸。
[0030]天然存在的二肽的其它非限制性實例是肌肽(β -丙氨酰-L-組氨酸)、Ν_乙酰基肌肽(N-乙酰基(β -丙氨酰-L-組氨酸))、鵝肌肽(β -丙氨酰-N-甲基組氨酸)、同型鵝肌肽(N-(4-氨基丁酰)-L-組氨酸)、京都啡肽(L-酪氨酰-L-精氨酸)、蛇肌肽(或蛇肉肽)(β -丙氨酰-N τ -甲基組氨酸)、格里肽(N-丙酰基-Y -L-谷氨酰-L-鳥氨酸-δ -乳酸乙酯)和巴蒂肽(環[(6-溴-8-烯色氨酸)精氨酸])。
[0031]人工二肽的實例包括但不限于:阿斯巴甜(N-L-a-天冬氨酰-L-苯丙氨酸1_甲酯)和假脯氨酸。
[0032]示例性三肽是谷胱甘肽(Y-谷氨酰基半胱氨酰甘氨酸)及其類似物眼晶體酸(L-Y-谷氨酰-L-α-氨基丁酰甘氨酸)以及去甲眼晶體酸(Y-谷氨酰基丙氨酰基甘氨酸)。三肽的其它非限制性實例包括異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)、甘脯谷肽(Gly-PiO-Glu)、促甲狀腺激素釋放激素(TRH，促甲狀腺素釋放素或普羅瑞林)(L-焦谷氨基-L-組氨酸基-L-脯氨酰胺)、促黑素抑制素(脯氨酰亮氨酰甘氨酰胺)、亮抑酶肽(N-乙酸基_L_売氨酸-L-売氨酸-L-精氨醒)和Eisenin 二妝(pGlu-GLN-ALA_0H)。優選所述至少一種二肽或三肽、更優選的是所有二肽或三肽在結合醫學應用使用時，不發揮任何的藥理學性質。
[0033]優選的是，至少一種二肽選自由肌肽、甘氨酰酪氨酸、甘氨酰甘氨酸和甘氨酰谷氨酰胺組成的組。
[0034]根據本發明，該溶液包含一種或多種二肽或三肽。例如，術語“至少一種二肽或三肽”還涉及至少2種二肽或三肽，如至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種或至少9種二肽或三肽。該術語還包括恰好I種、恰好2種、恰好3種、恰好4種、恰好5種、恰好6種、恰好7 種、恰好8種或恰好9種二肽或三肽。當溶液中包含超過一種二肽或三肽時，其明確涵蓋了二肽和三肽的混合物。二肽和三肽的種數可彼此獨立地選擇，例如該溶液可能包含2種二肽和3種三肽。本領域技術人員容易理解，當本文提及一定種數的二肽和三肽時，所述種數的目的是限制不同類型的二肽和三肽的量，而不是二肽或三肽中某一種的分子數目。因此，例如，術語“4種二肽或三肽”是指4種不同類型的二肽和/或三肽，其中，每種單獨的二肽和/或三肽的量沒有特別的限制。優選的是，(不同的)二肽或三肽的種數不超過9種二肽或三肽。
[0035]所采用的氨基酸、二肽和/或三肽的優選量為0.lmg/ml至150mg/ml/,優選Img/ml至100mg/ml,更優選10mg/ml至50mg/ml,進而更優選20mg/ml至35mg/ml,最優選的量是 25mg/ml。
[0036]術語“不含或基本上不含糖”，按照本發明是指溶液避免或基本上避免了任何類型的糖，即，糖類的單糖、二糖或低聚糖形式以及糖醇。病毒配制方法中常用但不存在于本發明中的糖的例子包括但限于蔗糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇或甘露糖醇。如果溶液包含小于0.1% (重量/體積)的糖，更優選小于0.01% (重量/體積)、甚至更優選小于0.001% (重量/體積)且最優選小于0.0001% (重量/體積)，則該溶液被認為基本上不含糖。
[0037]本文使用的術語“不含或基本上不含硅烷”是指溶液不含或基本上不含任何硅烷，例如烷氧基硅烷、有機官能性硅烷、氫硅(氧)烷、硅氧烷和有機硅烷(包括帶有其它官能團的甲硅烷基化合物)。如果溶液包含小于0.01%(重量/體積)硅烷、更優選小于0.001%(重量/體積)、最優選小于0.0001% (重量/體積)，則該溶液被認為是基本上不含硅烷。[0038]如本文所用的術語“不含或基本上不含蛋白”是指除了與本發明的生物體天然相關的蛋白之外，溶液不包含或基本上不包含任何其他蛋白。本領域技術人員可以理解，可以存在例如與溶液污染物相關的微量的蛋白，對溶液不含蛋白的要求并不排除這種情況。因此，如果溶液包含小于0.1% (重量/體積)的所要保護的生物體非天然相關的蛋白、更優選小于0.01% (重量/體積)、甚至更優選小于0.001% (重量/體積)、最優選小于0.0001% (重量/體積)，則認為該溶液基本上不含蛋白。 [0039]按照本發明，令人驚奇地發現，如本文所定義的溶液在貯存期間穩定病毒或細菌。換句話說，該材料在存儲期間得到保護從而避免喪失生活力、喪失其復制能力和/或喪失抗原性。本領域中已知的病毒的存儲介質，例如由Hardy Diagnostics提供的病毒輸送介質(目錄號 R99)或 Millipore 提供的 Universal Transport Medium(UTM-RT)(目錄號350CM)可提供最高至4天的最大保持時間。不過，本發明的溶液在各種溫度(例如在37°C或在-20°C )提供了更長的貯存時間。如下面實施例1所示，本發明的溶液提供長達4周的保護，而當病毒被存儲在PBS中時則實現顯著較少的保護。
[0040]改善的穩定性、尤其是在升高的溫度(如37°C )的改善的穩定性使得可以在不制冷的條件長期儲存，例如在熱氣候和保持維護本領域產品狀態所需要的冷鏈的可能性不足的國家中。
[0041]此外，在真核細胞存儲中測試溶液時，發現當二甲亞砜(DMSO)完全或部分地由本發明的溶液代替來穩定病毒或細菌時，懸浮于同一溶液中的真核細胞在冷凍和解凍后不能存活。已知DMSO可防止在冷凍干燥過程中形成結晶，從而減少了細胞內結構損傷和細胞死亡。因此，本發明溶液對病毒和細菌的保護效果的發現更令人驚訝。不希望被理論束縛，本發明人推測，水的量以及真核細胞與病毒和細菌之間在細胞內細胞器和結構的復雜性上的差異可能對以下作出解釋:在冷凍和解凍真核細胞時本發明溶液缺乏保護效果，從而導致真核細胞內這些結構的破壞，與本發明溶液在胞外的存在無關。
[0042]然而，也已知病毒對物理應激極其敏感。尤其是包膜病毒(如HSV-1)的滴度在冷凍和解凍后通常迅速下降。因此，本文所觀察到的對病毒和細菌的感染性、復制和抗原性的穩定代表了本領域技術人員不能預期的令人驚訝的發現。
[0043]最后，本發明的溶液的另一優點在于缺少本領域通常采用的添加劑，這帶來的額外優點在于，使用病毒或細菌之前不必去除所述添加劑，以及穩定用溶液的制備簡化且成本更低。
[0044]優選的是，該溶液還不含明膠和/或磷酸鹽緩沖液。最優選的是，該穩定病毒或細菌的方法包括將病毒或細菌包埋在水溶液中，其中，該溶液由(i)至少3種不同氨基酸或
(ii)至少一種二肽或三肽以及皂苷或脂肪酸組成。甚至更優選的是，所述穩定病毒或細菌的方法包括將病毒或細菌包埋在水溶液中，其中，該溶液由(i)至少3種不同氨基酸或(ii)至少一種二肽或三肽組成。
[0045]本發明的方法的另一優選的實施方式中，所述至少3種氨基酸選自由(a)具有非極性的脂肪族R基團的氨基酸；(b)具有極性的不帶電荷的R基團的氨基酸；(c)具有帶正電荷的R基團的氨基酸；(d)具有帶負電荷的R基團的氨基酸和(e)具有芳香族R基團的氨基酸組成的組。
[0046]天然存在的氨基酸，以及除了天然存在的氨基酸之外的氨基酸，例如人工氨基酸，可以分類為以上特征組(Nelson D.L.&Cox Μ.Μ., ^Lehninger Biochemie^ (2005),第122-127頁)，從中可以選擇至少三種氨基酸以用于本發明的溶液。
[0047]在更優選的實施方式中，所述至少三種氨基酸選自(a)~(e)的不同組。換言之，在該優選實施方式中，當溶液中包含三種氨基酸時，所述三種氨基酸可以選自至少兩個不同組，更優選的是，選自三個不同組，以使一個來自(a)組，一個來自(b)組，一個來自(C)組。本文還明確設想諸如(b)-(c)-(d), (c)-(d)-(e)、(e)-(a)-(b)、(b)-(d)-(e)等另外的組合。當溶液中包含四種氨基酸時適用相同的考慮，在該情況下氨基酸必須來自選自(a)~(e)中的至少兩個不同組，更優選選自至少三個不同組，最優選選自至少四個不同組。特別是，當溶液中包含五種氨基酸時，氨基酸必須來自選自(a)~(e)中的至少兩個不同組，更優選選自至少三個不同組，更優選選自至少四個不同組，最優選選自至少五個不同組。當溶液中包含超過五種氨基酸(例如六種或七種氨基酸)時適用相同的考慮，在該情況下這些氨基酸選自(a)~(e)中的至少兩個不同組，更優選選自至少三個不同組，還更優選選自至少四個不同組，最優選選自至少五個不同組。
[0048]在本發明方法的更優選實施方式中，溶液包含選自以下每組的至少一種氨基酸:(a)具有非極性的脂肪族R基團的氨基酸；(b)具有極性的不帶電R基團的氨基酸；(c)具有帶正電R基團的氨基酸；(d)具有帶負電R基團的氨基酸；和(e)具有芳香族R基團的氨基酸。
[0049]本領域技術人員還理解，在根據本發明使用的溶液中不必要存在相同數量的各組氨基酸。相反，可以選擇氨基酸的任何組合，只要存在每組中的至少一種氨基酸即可。
[0050]此外，在溶液中氨基酸可以以單分子和/或以二肽和/或三肽的形式存在。
[0051]在本發明方法的另一優選實施方式中，溶液包含至少以下氨基酸:(a)丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸；(b)天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸；(C)脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨`酸和苯丙氨酸；(d)酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和纈氨酸；或(e)精氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、色氨酸。在另一優選實施方式中，溶液包含至少以下氨基酸:(f)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸。
[0052]根據該實施方式，在本發明的溶液中至少存在(a)、(b)、(c)、(d)或(e)組中的上述氨基酸。換言之，當在本發明溶液中可以包含多于上述氨基酸時，需要存在至少所述氨基酸。更優選的是，溶液正好包含所述氨基酸，不包含其他氨基酸。相同的考慮比照適用(f)組的氨基酸。
[0053]在本發明的另一優選實施方式中，一種或多種氨基酸選自由天然非蛋白氨基酸和合成氨基酸組成的組。
[0054]根據本發明，術語“非蛋白氨基酸”涉及未被天然引入多肽和蛋白質中的氨基酸。非蛋白性氨基酸可以通過翻譯后修飾由蛋白氨基酸(其是L-α-氨基酸)衍生。此類非蛋白氨基酸例如是羊毛硫氨酸、2-氨基異丁酸、脫氫丙氨酸和神經遞質(Y-氨基丁酸)。蛋白L-氨基酸的D-對映異構體也代表非蛋白氨基酸。此外，非蛋白氨基酸的非限制實例包括是肉毒堿、肌酸、肌苷酸、胍基乙酸、鳥氨酸、羥脯氨酸、同型半胱氨酸、瓜氨酸、羥賴氨酸或丙氨酸。
[0055]本文所用的術語“合成氨基酸”涉及不是自然中天然存在的氨基酸。合成氨基酸的非限制性實例包括(2R)-氨基-5-膦酰基戊酸、D-苯基甘氨酸或(S)-和(R)-叔亮氨酸。[0056]在本發明的方法另一優選的實施方式中，所述溶液還包含兩性分子。
[0057]根據本發明，術語“兩性分子”涉及同時具有親水性(即，近水性)和親脂性(即，近脂性)的分子。兩性分子的非限制性實例包括皂苷、脂肪酸、磷脂、膽固醇、糖脂和膽汁酸。優選的是穩定用溶液中所用的兩性分子在與醫藥應用結合使用時，不表現任何藥學性質。
[0058]皂苷是一類形成二級代謝物的化學化合物，其見于天然來源中、衍生自天然來源或能夠化學合成。據發現，皂苷在各種植物物種中特別豐富。皂苷是兩性糖苷，在現象學上通過其在水性溶液中搖晃時所產生的肥皂樣泡沫歸類，而在結構上通過其組成(一種或多種親水性糖苷部分與親脂性留體或三萜類苷元的結合)而歸類。他們的結構多樣性反映在他們的物理化學性質和生物性質上。皂苷的實例有甘草次酸、甘草酸、葡萄糖醛酸、七葉皂苷、常春藤苷(hederacoside)和洋地黃阜苷。
[0059]脂肪酸是具有長的無支鏈的脂肪鏈(尾部)的羧酸，所述脂肪鏈可以是飽和或不飽和的。他們是重要的能量來源，因為他們的代謝產生大量的ATP。大多數天然存在的脂肪酸具有偶數碳原子(4~28)的鏈，通常源自三甘油酯或磷酯。脂肪酸具有不同長度，其用于將脂肪酸分類成短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸(SCFA)是具有小于6個碳的脂肪族尾部的脂肪酸，中鏈脂肪酸(MCFA)是具有6~12個碳的脂肪族尾部的脂肪酸(其可形成中鏈甘油酯)，長鏈脂肪酸(LCFA)是具有大于12個碳的脂肪族尾部的脂肪酸，超長鏈脂肪酸(VLCFA)是具有大于22個碳的脂肪族尾部的脂肪酸。脂肪酸的非限制性實例包括諸如肉豆蘧油酸、棕櫚油酸、杉皮酸、油酸、亞油酸、α -亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸等不飽和脂肪酸，以及諸如月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山箭酸、木臘酸(lignoceric acid)和臘酸等飽和脂肪酸。
[0060]磷脂是這樣一類脂質:其是所有細胞膜的主要組分，這是因為它們能形成脂雙層。大部分的磷脂含有甘油二酯、 磷酸基團和簡單的有機分子，如膽堿。一個例外是鞘磷脂，它是由鞘氨醇代替甘油而衍生出。磷脂的非限制性實例是磷脂酰膽堿(卵磷脂)、磷脂酸(磷脂)、磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇磷酸、磷脂酰肌醇二磷酸、磷脂酰肌醇三磷酸、神經酰胺磷酸膽堿和神經酰胺磷酸甘油。
[0061]膽固醇是存在于細胞膜和在所有動物的血漿中運輸的類固醇代謝產物。它是哺乳動物細胞膜的重要結構組分，在其中需要它建立適當的膜滲透性和流動性。此外，膽固醇是制造膽汁酸、類固醇激素和維生素D的重要組分。膽固醇具有以下結構:
[0062]
【權利要求】
1.一種穩定病毒或細菌的方法，所述方法包括將所述病毒或細菌包埋在水溶液中，其中，所述溶液包含: (i)至少3種不同氨基酸；或 (?)至少一種二肽或三肽， 并且其中，所述溶液不含或基本上不含糖、硅烷和蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述至少3種氨基酸選自以下組: (a)具有非極性的脂肪族R基團的氨基酸； (b)具有極性的不帶電荷的R基團的氨基酸； (c)具有帶正電荷的R基團的氨基酸； (d)具有帶負電荷的R基團的氣基酸；和 (e)具有芳香族R基團的氨基酸。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述溶液包含選自以下每組的至少一種氨基酸: (a)具有非極性的脂肪族R基團的氨基酸； (b)具有極性的不帶電荷的R基團的氨基酸； (c)具有帶正電荷的R基團的氨基酸`； (d)具有帶負電荷的R基團的氣基酸；和 (e)具有芳香族R基團的氨基酸。
4.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述溶液至少包含以下氨基酸: (a)丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸； (b)天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸； (C)脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸； (d)酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸；或 (e)精氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、色氨酸；或 (f)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸。
5.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述氨基酸中的一種或多種選自由天然的非蛋白氨基酸和合成氨基酸組成的組。
6.如權利要求1至5中任一項所述的方法，其中，所述溶液還包含兩性分子。
7.如權利要求6所述的方法，其中，所述兩性分子選自由皂苷或者脂肪酸或其衍生物組成的組。
8.如權利要求7所述的方法，其中，所述皂苷是甘草酸或其衍生物。
9.如權利要求7所述的方法，其中，所述脂肪酸選自由短鏈和中鏈脂肪酸組成的組。
10.如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中，所述溶液的賦形劑與所述病毒或細菌之間的重量比為1:1至500:1。
11.如權利要求1至10中任一項所述的方法，其中，經穩定的病毒或細菌保持其感染性和/或其復制的能力和/或其抗原性。
12.如權利要求1至11中任一項所述的方法，所述方法還包括隨后將經穩定的病毒或細菌儲存在選自約_90°C至約45°C的溫度的步驟。
13.如權利要求1至12中任一項所述的方法，其中，經穩定的病毒或細菌以液體制劑供儲存。
14.如權利要求1至12中任一項所述的方法，其中，經穩定的病毒或細菌以干燥制劑供儲存。
15.如權利要求1至14中任一項所述的方法，所述方法還包括后續的滅活步驟。
16.如權利要求1至15中任一項所述的方法，其中，所述病毒選自由流感病毒、脊髓灰質炎病毒、單純皰疹病毒-1、牛痘病毒和腺病毒組成的組。
17.如權利要求1至15中任一項所述的方法，其中，所述細菌選自由百日咳菌、破傷風菌、白喉菌、腦膜炎雙球菌、肺炎雙球菌、流感嗜血桿菌、霍亂菌、傷寒菌和炭疽菌組成的組。
18.如權利要求1至17中任一項所述的方法，其中，權利要求1的(ii)中所述的至少一種二肽選自由肌肽、甘氨酰酪氨酸、甘氨酰甘氨酸和甘氨酰谷氨酰胺組成的組。
【文檔編號】C12N7/02GK103620025SQ201280032093
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年6月28日 優先權日:2011年6月28日
【發明者】馬丁·肖爾茨, 延斯·阿爾特里克特, K·克姆特 申請人:白血球保健股份有限公司